CN111690736A - 一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种华法林用药基因检测试剂盒，包括用于检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；所述待测位点为CYP2C9*2(430C>T)基因的rs1799853位点、CYP2C9*3(1075A>C)基因的rs1057910位点、CYP4F2*3(1297G>A)基因的rs2108622位点和VKORC1(‑1639G>A)基因的rs9923231位点中的至少一种。本发明还提供了一种华法林用药基因检测试剂盒的使用方法。解决了基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题。

Description

一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法。

背景技术

华法林是一种双香豆素衍生物类口服抗凝药，通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，从而发挥抗凝作用，在临床上广泛应用于血栓性疾病的预防和治疗。临床实践发现，服用华法林的患者中，每年有15.2％发生出血副作用，其中致命大出血占3.5％。研究表明，主要是因为个体之间药物代谢基因不同，进而导致华法林用药剂量有差异，不同个体之间差异可达20倍以上。

研究发现，华法林的代谢主要和CYP2C9*2(c.430C>T)、CYP2C9*3(c.1075A>C)、CYP4F2*3(c.1297G>A)、VKORC1(-1639G>A)这三个基因的四个位点相关。其中，CYP2C9*3还与塞来昔布、洛沙坦等用药相关，CYP4F2*3也与香豆素类抗凝药(醋硝香豆素、苯丙香豆素)等相关。CYP2C9*2和CYP2C9*3突变型编码的代谢酶活性较低，使相应患者口服华法林的抗凝剂量减少。CYP4F2*3(c.1297G>A)可导致酶活性降低，导致维生素K浓度升高，华法林的抗凝效果增强，可减少药物用量。VKORC1突变型引起环氧化型维生素K还原成氢琨型维生素K减少，间接影响华法林的抗凝敏感性，突变型只需要很少剂量就能达到抗凝效果，过量反而导致溶血等严重副反应。

目前针对基因多态性检测的技术有很多，最常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、一代测序、二代测序和基因芯片法等技术，但是这些技术有各自的应用缺陷，有的操作繁琐，检测周期长，无法进行高通量多位点同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题，提供一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法。本试剂盒具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对华法林个体化用药基因多态性进行检测。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

一种华法林用药基因检测试剂盒，包括用于检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；所述待测位点为CYP2C9*2(430C>T)基因的rs1799853位点、CYP2C9*3(1075A>C)基因的rs1057910位点、CYP4F2*3(1297G>A)基因的rs2108622位点和VKORC1(-1639G>A)基因的rs9923231位点中的至少一种。

进一步的，所述检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如下：

用于检测CYP2C9*2(430C>T)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ IDNO.1到SEQ ID NO.6所示；

用于检测CYP2C9*3(1075A>C)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ IDNO.7到SEQ ID NO.12所示；

用于检测CYP4F2*3(1297G>A)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ IDNO.13到SEQ ID NO.18所示；

用于检测VKORC1(-1639G>A)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ IDNO.19到SEQ ID NO.24所示。

进一步的，所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。

进一步的，所述探针5’端荧光基团为FAM或VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。

进一步的，用于检测CYP2C9*2、CYP4F2*3的所述探针5’端荧光基团为FAM，用于检测CYP2C9*3、VKORC1的所述探针5’端荧光基团为VIC。

进一步的，所述抑制剂3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。

进一步的，所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。

一种上述华法林用药基因检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)取含有EDTA抗凝剂的真空血液样本进行核酸提取，使用商业化试剂盒进行核酸提取；

2)预混分装基因检测试剂分别得到PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4，共同组成PCR反应体系；

3)将步骤1)得到的DNA加入步骤2)中的PCR反应体系中，混匀后进行PCR扩增；

4)反应结束后进行基因分型判读。

进一步的，步骤2)中所述基因检测试剂包括热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。

进一步的，步骤3)中所述PCR扩增的条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。

PCR反应体系中检测位点如下表。

PCR反应液	FAM信号	VIC信号
			PCR反应液1	CYP2C9*2(430>C)	CYP2C9*3(1075>A)
PCR反应液2	CYP2C9*2(430>T)	CYP2C9*3(1075>C)
			PCR反应液3	CYP4F2*3(1297>G)	VKORC1(-1639>G)
PCR反应液4	CYP4F2*3(1297>A)	VKORC1(-1639>A)

进一步的，步骤4)中基因分型判读的方法为：在上述PCR反应体系和循环程序条件下，阳性质控品1-4号FAM和VIC荧光检测信号应该形成对数扩增“S”型曲线；阴性质控品1-4号应无扩增曲线或者Ct值为0；观察1-4号的FAM和VIC荧光检测信号是否形成对数扩增“S”型曲线。

以上满足的情况下，观察待测样本反应管扩增曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线，该待检测样本含有相应的碱基突变；如果无对数扩增“S”型曲线或者Ct值为0，则无相应的碱基突变。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明将4种相关基因分装在一个8联PCR反应条中，每个反应条包括2人份检测试剂，预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时提升了检测效率；

(2)本发明具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对华法林用药相关基因进行检测。

附图说明

图1为本发明一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法中阳性质控品扩增曲线。

图2为本发明一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法中阴性质控品扩增曲线。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。

发明人通过分析临床上华法林的使用和代谢及药效的个体差异，筛选出与华法林代谢及药效发挥密切相关基因的4个多态性位点，并制备出检测该4个多态性位点的组合物和使用该组合物的检测试剂盒，并建立准确的检测方法用以对华法林实现有效的用药指导。

实施例1：引物和探针组合设计及使用

一种华法林用药基因检测试剂盒，包括用于检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；待测位点为CYP2C9*2(430C>T)基因的rs1799853位点、CYP2C9*3(1075A>C)基因的rs1057910位点、CYP4F2*3(1297G>A)基因的rs2108622位点和VKORC1(-1639G>A)基因的rs9923231位点中的至少一种。本发明经过大规模实验进行筛选，优选引物和探针序列如下：

1、用于识别CYP2C9*2(430>C)的引物和探针组合：

R144C-WF:GGAAGAGGAGCATTGAGGGAC(SEQ ID NO.1)

R144C-R:ACAACCAGGACTCATAATGAAAG(SEQ ID NO.3)

R144C-P:FAM-AAAACCAAGGGTGGGTGACCCTACTCCA-TRAMA(SEQ ID NO.4)

R144C-WB:GGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACTG(SEQ ID NO.5)

用于识别CYP2C9*2(430>T)的引物和探针组合：

R144C-MF:GGAAGAGGAGCATTGAGGGAT(SEQ ID NO.2)

R144C-R:ACAACCAGGACTCATAATGAAAG(SEQ ID NO.3)

R144C-P:FAM-AAAACCAAGGGTGGGTGACCCTACTCCA-TRAMA(SEQ ID NO.4)

R144C-MB:GGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCG(SEQ ID NO.6)

上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。

2、用于识别CYP2C9*3(1075>A)的引物和探针组合：

I359L-WF:CTGGTGGGGAGAAGGTCCGT(SEQ ID NO.7)

I359L-R:TGTCTTATCAGCTAAAGTCCAGGAA(SEQ ID NO.9)

I359L-P:VIC-CCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCC-TRAMA(SEQ ID NO.10)

I359L-WB:TGGGGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAGGTA(SEQ ID NO.11)

用于识别CYP2C9*3(1075>C)的引物和探针组合：

I359L-MF:CTGGTGGGGAGAAGGTCCGG(SEQ ID NO.8)

I359L-R:TGTCTTATCAGCTAAAGTCCAGGAA(SEQ ID NO.9)

I359L-P:VIC-CCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCC-TRAMA(SEQ ID NO.10)

I359L-MB:TGGGGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAATGTA(SEQ ID NO.12)

上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。

3、用于识CYP4F2*3(1297>G)的引物和探针组合：

V433M-WF:CTCAGGGTCCGGCCATAC(SEQ ID NO.13)

V433M-R:TTGTGCTCCCAGACGGCCGGGTCAT(SEQ ID NO.15)

V433M-P:FAM-CCTTCACTGAGGGGCCCCTCTTCCTACC-TRAMA(SEQ ID NO.16)

V433M-WB:CGCACCTCAGGGTCCGGCCACATAGCTGG(SEQ ID NO.17)

用于识别CYP4F2*3(1297>A)的引物和探针组合：

V433M-MF:CTCAGGGTCCGGCCATAT(SEQ ID NO.14)

V433M-R:TTGTGCTCCCAGACGGCCGGGTCAT(SEQ ID NO.15)

V433M-P:FAM-CCTTCACTGAGGGGCCCCTCTTCCTACC-TRAMA(SEQ ID NO.16)

V433M-MB:CGCACCTCAGGGTCCGGCCACACAGCTGG(SEQ ID NO.18)

上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。

4、用于识别VKORC1(-1639>G)的引物对、探针和抑制剂：

1639-WF:ACCTGAAAAACAACCATTGGTAG(SEQ ID NO.19)

1639-R:GGTGCCTGCCACCATGTCTGGCTAATTT(SEQ ID NO.21)

1639-P:VIC-CTAGGATTATAGGCGTGAGCCACC-TRAMA(SEQ ID NO.22)

1639-WB:CCAGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCC-ddC(SEQ ID NO.23)

用于识别VKORC1(-1639>A)的引物和探针组合：

1639-MF:ACCTGAAAAACAACCATTGGTAA(SEQ ID NO.20)

1639-R:GGTGCCTGCCACCATGTCTGGCTAATTT(SEQ ID NO.21)

1639-P:VIC-CTAGGATTATAGGCGTGAGCCACC-TRAMA(SEQ ID NO.22)

1639-MB:CCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCC-ddC(SEQ ID NO.24)

上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。

上述引物和探针可用于特异性地检测样本中的华法林用药相关基因突变类型，如下表所示。

编号	基因	RS编号	核酸变异
				1	CYP2C9*2	rs1799853	c.430C>T
2	CYP2C9*3	rs1057910	c.1075A>C
				3	CYP4F2*3	rs2108622	(c.1297G＞A)
4	VKORC1	rs9923231	c.-1639G>A

实施例2：试剂盒的制备方法

1、阳性质控品的获取

阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为阳性质控品。

2、阴性质控品制备

本发明中采用的阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。

3、PCR反应体系的配置

本发明试剂盒采用8联PCR反应条设计，每个反应条可以完成2人份的检测，1-4号管由基因检测试剂组成，分别指示CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1不同基因型。1-4号管的反应液分别对应PCR反应液1-4，PCR反应液1-4的组成如表2。

表2 PCR反应液

仪器通道及反应体积选择：

①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；

②反应体积(Sample Volume)为20μL。

③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。

实施例3：基因检测试剂盒的使用

下面结合具体附图对本发明试剂盒的使用方法进行详细描述。

1、样本收集

本实施例收集了10例患者外周血，分别编号为1-10。使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。

2、样本核酸提取

对步骤1收集的真空血液样本进行核酸提取，使用商业化试剂盒进行核酸提取；本发明采用美基生物生产的HiPure Blood DNA Mini Kit(货号：D3111)，实验步骤参考以下说明进行。

在1.5ml离心管中，加入25μl Proteinase K，转移10-250μl抗凝血液，血清，血浆，牛奶，唾液，或其它液体样品至装有蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀，加入250μl BufferAL至样品中，颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋30秒混匀，70℃水浴10分钟，其间涡旋混匀一次。加入250μl无水乙醇至样品中，涡旋30秒混匀，短暂离心收集管壁的液滴。把DNA柱装在新的收集管中，转移混合液至柱子中。10000×g离心1分钟，丢弃收集管和流出液。把DNA柱装在新的收集管中，加入500μl Buffer DW1至柱子上，颠倒混匀几次，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入650μl Buffer DW2(已用乙醇稀释)至柱子中，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10000×g离心2分钟，可彻底去除柱子中残留的乙醇。将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入30-100μl预热至70℃Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟后，10000×g离心1分钟。再加入30-100μl预热至70℃ Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟，10000×g离心1分钟，丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

3、PCR反应

预混分装基因检测试剂分别得到PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4，共同组成PCR反应体系，反应体系的配置及组成具体按照实施例2的方法进行。

将样本提取的DNA加入配制好的PCR反应体系中，加入的模板量1-200ng。在进行PCR反应时需要将待测样本、阳性质控品和阴性质控品一起平行上机检测，每个样本需要同时加入1-4号管进行反应。

4、仪器通道及反应体积选择

①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；

②反应体积(Sample Volume)为20μL。

③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。

5、PCR反应程序

预变性的条件为：95℃，2分钟；

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。

6、结果分析

反应程序结束后保存结果并进行判读。

阳性质控品1-4号反应管中FAM和VIC荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线(见附图1)；

阴性质控品1-4号管无扩增曲线(见附图2)。

根据前面所述的判读标准，1-10号样本的结果如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司

<120> 一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaagaggag cattgaggga c 21

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagaggag cattgaggga t 21

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acaaccagga ctcataatga aag 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaaaccaagg gtgggtgacc ctactcca 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatggggaa gaggagcatt gaggactg 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatggggaa gaggagcatt gaggaccg 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctggtgggga gaaggtccgt 20

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ctggtgggga gaaggtccgg 20

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tgtcttatca gctaaagtcc aggaa 25

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ccggagcccc tgcatgcaag acaggagcc 29

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggggcaggc tggtggggag aaggtcaagg ta 32

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tggggcaggc tggtggggag aaggtcaatg ta 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccaggtgcgg tggctcacgc ctataatcc 29

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccgggtgcgg tggctcacgc ctataatcc 29

Claims (10)

1.一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；所述待测位点为CYP2C9*2(430C>T)基因的rs1799853位点、CYP2C9*3(1075A>C)基因的rs1057910位点、CYP4F2*3(1297G>A)基因的rs2108622位点和VKORC1(-1639G>A)基因的rs9923231位点中的至少一种。

2.如权利要求1所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述检测CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因待测位点多态性的引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如下：

用于检测CYP2C9*2(430C>T)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.6所示；

用于检测CYP2C9*3(1075A>C)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.12所示；

用于检测CYP4F2*3(1297G>A)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ IDNO.13到SEQ ID NO.18所示；

用于检测VKORC1(-1639G>A)引物对、探针和抑制剂的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.19到SEQ ID NO.24所示。

3.如权利要求1或2所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。

4.如权利要求3所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端荧光基团为FAM或VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。

5.如权利要求4所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：用于检测CYP2C9*2、CYP4F2*3的所述探针5’端荧光基团为FAM，用于检测CYP2C9*3、VKORC1的所述探针5’端荧光基团为VIC。

6.如权利要求4所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述抑制剂3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。

7.如权利要求1所述一种华法林用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP4F2*3和VKORC1基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述华法林用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取含有EDTA抗凝剂的真空血液样本进行核酸提取，使用商业化试剂盒进行核酸提取；

2)预混分装基因检测试剂分别得到PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4，共同组成PCR反应体系；

3)将步骤1)得到的DNA加入步骤2)中的PCR反应体系中，混匀后进行PCR扩增；

4)反应结束后进行基因分型判读。

9.如权利要求8所述一种华法林用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤2)中所述基因检测试剂包括热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。

10.如权利要求8所述一种华法林用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤3)中所述PCR扩增的条件为：

预变性的条件为：95℃，2分钟；

第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。

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