CN102251043A - 检测华法林个体化用药相关snp位点的试剂盒及其多重pcr扩增方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒对华法林用药相关的四个SNP位点进行分型，包括：VKORC1基因上的rs9934438 SNP位点、CYP2C9基因上的rs1799853和rs1057910 SNP位点及CYP4F2基因上的rs2108622 SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述四个SNP位点的分型，从而达到对华法林合理用药提供分子生物学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
背景技术
华法林是一种双香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子II、VII、IX、X，从而发挥抗凝作用。在临床上主要用于防治血栓栓塞性疾病，如治疗血栓栓塞性静脉炎，降低肺栓塞的发病率和死亡率，减少外科大手术，如髋关节固定术、人工置换心脏瓣膜手术等的静脉血栓发生率，以及作为心肌梗塞的辅助用药。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、种族、体重、饮食等临床因素影响外，华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而当前确定华法林需求剂量是无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。
含有γ-谷氨酸残基的维生素K依赖性凝血因子II、VII、IX、X，以及蛋白C和S，必须经过维生素K依赖性羧化酶(γ-谷氨酸基羧化酶)的羧化作用才能成为有活性的凝血因子。在羧化成过程中，耦联氢醌型维生素K被氧化成环氧型维生素K。香豆素类抗凝药(华法林)作为维生素K拮抗剂通过阻断维生素K还原，使得含有谷氨酸残基的凝血因子II、VII、IX、X，以及蛋白C和蛋白S停留在没有抗凝血生物活性的前体阶段。这类蛋白与氧化失活的维生素K结合，进一步阻碍维生素K环氧化物由环氧型向氢醌型转变。体内环氧型维生素K被还原为氢醌型维生素K由维生素K环氧化物还原酶复合体(VKORC)完成，药理学研究表明，VKORC是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，VKORC由VKORC1激活，VKORC1不但主导维生素K依赖性凝血因子的生成，而且是香豆素类抗凝药物-华法林的作用靶点。
中国台湾学者Yuan HY报道，华法林维持剂量与VKORC1启动子区域多态性有关。VKORC1-1639位G/A(rs9934438)变异导致其启动子活性不同。VKORC1GG和AG基因型与AA基因型相比，GG和AG基因型由于其启动子活性高，VKORC1mRNA表达增加，VKORC1蛋白也相应增加，引起VKORC活性增高，从而凝血因子生成较多，由于VKORC1蛋白是华法林作用靶点，所有华法林敏感者(≤1.5mg)全是基因型为AA的纯合子，而华法林抵抗的个体其基因型为AG或GG。Geiser等研究表明，VKORC1-1639G/A基因多态性存在民族差异，VKORC1-1639G/A基因多态性是民族之间华法林剂量差异的主要原因。
华法林在体内的代谢主要通过肝脏细胞色素氧化酶P450(CYP)系，华法林含S型和R型2种异构体，S型主要经肝脏CYP2C9代谢，R型由CYP3A4代谢，其中S型华法林的抗凝活性比R型强3～5倍，因此CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。国外文献报道86％的CYP2C9突变病例仅需要很低的维持剂量(≤1.5mg.d-1)，而需要低维持剂量的普通患者为38％，以此具有CYP2C9突变等位基因的个体需要减量给药以较少不良反应的发生。在我国汉族人群中，该基因的突变型以CYP2C9*3为主，但频率较低，野生纯合型为92.7％、CYP2C9*2/CYP2C9*3型为6.6％、CYP2C9*3纯合型为0.7％。两种突变型都与华法林代谢酶的损伤有关，从而导致个体在抗凝治疗中所需的华法林剂量较正常人低。CYP2C9*3纯合子以及CYP2C9*2和*3的突变型杂合子(CYP2C9*2/*3)者华法林需要剂量比野生型纯合子低60％～75％；与野生型比较，CYP2C9*2、CYP2C9*3突变型者的需要剂量明显降低，达到稳态时间延长。在同等剂量时INR值偏高，发生危及生命的严重出血事件的风险增大。因此，用药前进行CYP2C9基因型检测，有助于预测患者的最佳华法林负荷剂量，降低出血事件的发生率。
CYP4F2是代谢花生四烯酸产生二十四烯酸最主要的代谢酶，近来发现CYP4F2基因的一个V433M突变使花生四烯酸代谢能力下降，二十四烯酸的产生减少，即此突变降低了CYP4F2的酶活性。CYP4F2为维生素K的单氧酶，可氧化底物生成ω-羟基衍生物，而且不同基因型的人肝脏微粒显示出不同的维生素K代谢活性，野生型CC基因肝微粒代谢活性最高，而突变纯合型TT基因肝微粒体代谢活性最低，为CC基因型的75％从而减少维生素K的代谢，使维生素K的浓度升高，进而影响华法林的作用。为了达到相同的抗凝效果，CYP4F2 V433M(rs2108622)位点突变型TT患者需要提高华法林剂量。
发明内容
华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9、CYP4F2的基因遗传多态性直接或间接影响华法林在体内的抗凝效果和代谢过程。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
本发明采用的技术方案：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒可同时对VKORC1基因rs9934438 SNP位点、CYP2C9基因rs1799853和rs1057910 SNP位点及CYP4F2基因rs2108622SNP位点进行扩增分型检测，以ALB基因为内参来检测扩增条件；野生型2×缓冲包含上述4个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2×缓冲液包含上述4个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。
所属检测VKORC1基因rs9934438 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT
正向突变型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC
反向共用引物：GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC
所属检测CYP2C9基因rs1799853 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：
正向野生型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC
正向突变型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT
反向共用引物：ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT
所属检测CYP2C9基因rs1057910 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT
正向突变型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG
反向共用引物：ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA
所属检测CYP4F2基因rs2108622位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTA
正向突变型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTG
反向共用引物：ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT
本发明试剂盒的组分和含量包括：
细胞裂解液，野生型2×扩增缓冲混合液，突变型2×扩增缓冲混合液，高保真聚合酶，液体石蜡油
本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
(1)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对4个包含SNP位点的DNA片段和1个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。
(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。
(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。
(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。
(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。
(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2×扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。
(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2×扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，避免人为错误。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因VKORC1 rs9934438 SNP位点的引物、检测基因CYP2C9 rs1799853和rs1057910 SNP位点的引物及检测基因CYP4F2 rs2108622 SNP位点的引物。
所述试剂盒包括检测基因VKORC1 rs9934438 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP2C9 rs1799853 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP2C9 rs1057910 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物和检测基因CYP4F2 rs2108622 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物。
所述检测基因VKORC1 rs9934438位点的引物碱基序列如下所示(SEQ IDNO.1-12)：
正向野生型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT
正向突变型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC
反向共用引物：GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC
所述检测基因CYP2C9 rs1799853位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC
正向突变型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT
反向共用引物：ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT
所述检测基因CYP2C9 rs1057910位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT
正向突变型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG
反向共用引物：ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA
所述检测基因CYP4F2 rs2108622位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTA
正向突变型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTG
反向共用引物：ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT。
所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法：对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对4个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照1086bp，CYP2C9 rs1799853 766bp，CYP4F2 rs2108622 463bp，CYP2C9 rs1799853 290bp，VKORC1 rs9934438 136bp；扩增后经凝胶电泳即可在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断4个SNP位点的基因型。
所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒多重PCR扩增方法：
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为1分钟；
PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段有32次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为58℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
第一阶段有32次循环构成，其条件为：
延伸：温度为72℃，时间为7分钟；
保存：温度为4℃。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例一
步骤1：全血细胞裂解液的制备
取受检者外周静脉血300μl，加入700μl细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300μl双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。
步骤2：PCR扩增反应
1、配置野生型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×野生型扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20μl液体石蜡油封闭体系，具体见下表：
| 2×野生型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 细胞裂解悬液 | 4.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
| 液体石蜡油 | 20μl |
2、配置突变型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×突变型扩增缓冲液和0.2聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20μl液体石蜡油封闭体系，具体见下表：
| 2×突变型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 细胞裂解悬液 | 4.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
| 液体石蜡油 | 20μl |
3、对上述两个反应体系同时进行PCR反应，PCR程序见下表：
步骤3：扩增产物凝胶电泳
配置1.5％琼脂糖电泳凝胶，取扩增产物6-8μl直接加入加样孔内，每行另选一孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳，电泳条件为稳压6V/cm胶长，时间40分钟。
步骤4：观测结果
应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。
四条区带由大到小依次是：内对照1086bp，CYP2C9*2 766bp，CYP4F2463bp，CYP2C9*3 290bp，VKORC1 136bp。
如果在野生型扩增产物中136bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为VKORC1野生型个体；反之为VKORC1突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中136bp位置都出现阳性条带，则为VKORC1杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中290bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C9野生型个体；反之为CYP2C9*3突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中290bp位置都出现阳性条带，则为CYP2C9*3杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中463bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP4F2野生型个体；反之为CYP4F2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中463bp位置都出现阳性条带，则为CYP4F2杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中766bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C9野生型个体；反之为CYP2C9*2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中766bp位置都出现阳性条带，则为CYP2C9*2杂合型个体。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
实施例二
步骤1：全血基因组DNA的提取和稀释
取受检者外周静脉血300μl，按照全血基因组DNA提取试剂盒的说明提取全血基因组DNA。用分光光度计测量DNA的浓度，并稀释到15-20ng/μl。
步骤2：PCR扩增反应
1、配置野生型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×野生型扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20μl液体石蜡油封闭体系，具体见下表：
| 2×野生型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 全血DNA溶液 | 2μl |
| 双蒸水 | 2.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
| 液体石蜡油 | 20μl |
2、配置突变型反应体系：PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μl、加入5μl2×突变型扩增缓冲液和0.2聚合酶(2.5U/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20μl液体石蜡油封闭体系，具体见下表：
| 2×突变型扩增缓冲溶液 | 5μl |
| 全血DNA溶液 | 2μl |
| 双蒸水 | 2.8μl |
| 聚合酶(2.5U/μl) | 0.2μl |
| 液体石蜡油 | 20μl |
3、对上述两个反应体系同时进行PCR反应，PCR程序见下表：
步骤3：扩增产物凝胶电泳
配置1.5％琼脂糖电泳凝胶，取扩增产物6-8μl直接加入加样孔内，每行另选一孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳，电泳条件为稳压6V/cm胶长，时间40分钟。
步骤4：观测结果
应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。
五条区带由大到小依次是：内对照1086bp，CYP2C9*2 766bp，CYP4F2V433M 463bp，CYP2C9*3 290bp，VKORC1 136bp。
如果在野生型扩增产物中136bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为VKORC1野生型个体；反之为VKORC1突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中136bp位置都出现阳性条带，则为VKORC1杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中290bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C9野生型个体；反之为CYP2C9*3突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中290bp位置都出现阳性条带，则为CYP2C9*3杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中463bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP4F2野生型个体；反之为CYP4F2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中463bp位置都出现阳性条带，则为CYP4F2杂合型个体。
如果在野生型扩增产物中766bp位置出现阳性条带，突变型扩增产物对应位置无条带，则判读为CYP2C9野生型个体；反之为CYP2C9*2突变型纯合子个体；如果野生型和突变型扩增产物中766bp位置都出现阳性条带，则为CYP2C9*2杂合型个体。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因VKORC1 rs9934438 SNP位点的引物、检测基因CYP2C9 rs1799853和rs1057910 SNP位点的引物及检测基因CYP4F2rs2108622 SNP位点的引物。
2.根据权利要求1所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因VKORC1 rs9934438 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP2C9 rs1799853 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP2C9 rs1057910 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物和检测基因CYP4F2 rs2108622 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物。
3.根据权利要求2所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述检测基因VKORC1 rs9934438位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT
正向突变型引物：CCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC
反向共用引物：GGAACCAGGTTAGGACTGTCAACCC
所述检测基因CYP2C9 rs1799853位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACC
正向突变型引物：GATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT
反向共用引物：ATTTCACAGAATTATGCTACAGGATGTATT
所述检测基因CYP2C9 rs1057910位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAT
正向突变型引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG
反向共用引物：ACCATCCTCTCTTTAAGTTTGCATATA
所述检测基因CYP4F2 rs2108622位点的引物碱基序列如下所示：
正向野生型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTA
正向突变型引物：CGGAACCCATCACAACCCAGCTG
反向共用引物：ACCAACCCAACCGTACTCTATGGACCT。
4.一种权利要求1所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对4个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是：内对照1086bp，CYP2C9 rs1799853766bp，CYP4F2 rs2108622 463bp，CYP2C9 rs1799853 290bp，VKORC1rs9934438 136bp；扩增后经凝胶电泳即可在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断4个SNP位点的基因型。
5.一种采用权利要求1所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒多重PCR扩增方法，其特征在于，
预变性由1次循环构成，其条件为：温度为94℃，时间为1分钟；
PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段有32次循环构成，其条件为：
变性：温度为94℃，时间为30秒；
退火：温度为58℃，时间为30秒；
延伸：温度为72℃，时间为90秒；
第一阶段有32次循环构成，其条件为：
延伸：温度为72℃，时间为7分钟；
保存：温度为4℃。
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| CN2011102111240A CN102251043A (zh) | 2011-07-27 | 2011-07-27 | 检测华法林个体化用药相关snp位点的试剂盒及其多重pcr扩增方法和检测方法 |
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| CN2011102111240A CN102251043A (zh) | 2011-07-27 | 2011-07-27 | 检测华法林个体化用药相关snp位点的试剂盒及其多重pcr扩增方法和检测方法 |
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