CN107447035A

CN107447035A - 华法林药物遗传学基因cyp2c9和vkorc1多态性检测试剂盒

Info

Publication number: CN107447035A
Application number: CN201710850171.7A
Authority: CN
Inventors: 邵敏华; 黄迅威
Original assignee: Suzhou Kgene Diagnostic Co Ltd
Current assignee: Suzhou Kgene Diagnostic Co Ltd
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2017-12-08

Abstract

华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，属于基因测试诊断技术领域，用于辅助确定患者法华林施药量的确定；本发明的试剂盒包括用于检测rs1057910和rs9923231位点的突变的特异性引物及特异性探针；特异性引物包括上游引物和下游引物，所述特异性探针包括阳性探针和阴性探针；rs1057910的特异性引物及特异性探针分别为上游引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3，下游引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4，阳性特异性SEQ ID NO.5，阴性特异性荧光探针SEQ IDNO.6；本发明根据遗传基因能够用于法华林药物的个体化治疗，对后续的研究具有重要意义。

Description

华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒

技术领域

本发明涉及华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，属于基因测试诊断技术领域，用于辅助确定患者法华林施药量的确定。

背景技术

华法林（warfarin）是香豆素类口服抗凝药，常用于人工瓣膜置换、血栓栓塞性疾病（如肺栓塞）及房颤的抗凝治疗。由于华法林有的较窄治疗窗口，在临床使用过程中，稳定治疗剂量在不同个体间的也不尽相同，如果给药量不足会导致血栓形成，同时，给药量过大将会增加出血风险，甚至危及生命。因此，为不同个体选择合适的抗凝方案，已成为心脏术后患者远期疗效重要的影响因素之一。近年来，随着华法林的药物基因组学研究的深入，人们发现某些基因的遗传变异，特别是华法林的药代学途径和药效学通路上的变异，可能是造成个体间华法林剂量差异的主要原因之一。

相关研究发现，CYP2C9 基因存在野生型（AA）、突变杂合型（AC）及突变纯和型（CC）三种分型；VKORC1-1639A/G 基因有野生型（GG）、突变杂合型（GA）及突变纯和型（AA）三种分型；VKORC1-1173C/T 基因有野生型（TT）、突变杂合型（CT）及突变纯和型（CC）三种分型。在国内，研究主要集中于 CYP2C9 基因及VKORC1-1639A/G 基因，并且针对 VKORC1 基因单个位点的研究较多，而对该基因多个位点同时研究相对较少。但晚近研究发现，VKORC1-1173C/T 基因多态性与华法林维持剂量存在密切联系，可能会是另一个影响华法林维持剂量的重要影响因素。因此，同时研究CYP2C9基因及VKORC1 基因相关基因片段的多态性对华法林维持剂量影响的研究显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，用于辅助确定患者法华林施药量的确定。

本发明所述的华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，包括用于检测rs1057910和rs9923231位点的突变的特异性引物及特异性探针；所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述特异性探针包括阳性探针和阴性探针；

所述rs1057910的特异性引物及特异性探针分别为上游引物SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3，下游引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4，阳性特异性SEQ ID NO.5，阴性特异性荧光探针SEQ IDNO.6；

所述rs9923231的特异性引物及特异性探针分别为上游引物SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.9，下游引物SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，阳性特异性荧光探针SEQ ID NO.11，阴性特异性荧光探针SEQ IDNO.12。

试剂盒内还包括荧光定量PCR 检测液、含rs1057910和rs9923231位点的突变和未突变的DNA标准品。

所述PCR 检测液包括PCR缓冲液、25mM氯化镁溶液、25mM的dNTP混合溶液、5U/μl的Taq溶液和纯化水，各成分的分数比为7:3:1:1:25。

rs1057910基因片段的PCR引物浓度为13pmol / L；

rs9923231基因片段的PCR引物浓度为13pmol / L；

rs1057910基因片段的探针浓度为0.5pmol/L；

rs9923231基因片段的探针浓度为0.5pmol/L。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果，制备简单、使用方便；灵敏度高，特异性好，能够准确的检测rs1057910和rs9923231，根据遗传基因能够用于法华林药物的个体化治疗，对后续的研究具有重要意义。

附图说明

图1 为采用试剂盒中的检测基因rs1057910位点的两个上游引物以及两个下游引物检测样品得到凝胶电泳图，其中M为DNA的marker，1、3、5位上游引物的电泳图，2/4/6位下游引物电泳图；

图2 为采用试剂盒中的检测基因rs9923231位点的两个上游引物以及两下游引物检测样品得到凝胶电泳图，其中M为DNA的marker，2、4、6位上游引物的电泳图，2/4/6位下游引物电泳图。

具体实施方式

本实施例所述的用于鼻咽癌发病风险预测的试剂盒，是通过检测上述的2个SNP位点及EBV分型信息来进行鼻咽癌发病风险预测的试剂盒。

本发明所述的试剂盒包括：检测人基因组的2个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述2个SNP位点是rs1057910和rs9923231；

一、涉及合成初级PCR扩增引物和延伸引物以及探针序列：

1、设计和合成所述SNP位点rs1057910的初级PCR扩增引物和延伸引物：

SEQ ID NO:1 GCTTGAGGGGCTTTAGAGTTG；

SEQ ID NO:2 AGGGTTGACGGACGTTGGGTT；

次级PCR扩增引物和延伸引物：

SEQ ID NO:3 AGAAGGCGTAGAGCATGTCCAG；

SEQ ID NO:4 GAGTACGACTGTGAGGTGGGCG。

探针序列如下：

SEQ ID NO:5 CATCCTTCTGTCCTACTT

SEQ ID NO:6 CTTAAGCATCCTTCTTTC

设计和合成所述SNP位点rs9923231的初级PCR扩增引物和延伸引物：

SEQ ID NO:7 GATTGGTTGGCGCATAGGTTG；

SEQ ID NO:8 GAGGTGGTACGCTGGTTATGG；

次级PCR扩增引物和延伸引物：

SEQ ID NO:9 AGGGGTAAATGTCAGACGAGCC；

SEQ ID NO:10 GGGTGCGAAGTACGGGATCGGT；

探针序列如下：

SEQ ID NO:11 CTTCCTGTTTTCATAAAT；

SEQ ID NO:12 CTTCCTGTTTTCATAAAT。

二、检测方法：

1、DNA提取

提取组织、细胞或血样中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。

2、初级PCR扩增

PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行。

（1）在一个新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。

所述PCR 检测液包括PCR缓冲液0.7μl、25mM氯化镁溶液0.3μl、25mM的dNTP混合溶液0.1μl、5U/μl的Taq溶液0.1μl和纯化水2.5μl，PCR引物混合物为10μl。

（2）使用24通道加样器，调节加样体积为5μl，在384孔板的每个加样孔中加入PCR缓冲液，所述384孔板即为PCR反应板。

（3）在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：95℃ 2分钟； 94℃ 20秒，55℃25秒，60℃ 1分钟，35个循环；72℃ 3分钟；4℃保持，将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。

3、PCR产物碱性磷酸酶处理

（1）在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP（shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶）处理，以去除体系中游离的dNTPs。

（2）配制碱性磷酸酶处理反应液，对于每个反应体的酶处理反应液，需纯化水1.6μl，10%的SAP缓冲液0.2μl、1.5U/μl的SAP酶0.4μl。

（3）使用24通道加样器，将碱性磷酸酶处理反应液加入384孔PCR 反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔。

（4）将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃ 46分钟；85℃ 5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。

4、单碱基延伸

（1）在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。

（2）配制单碱基延伸反应液，对于每个反应孔，纯化水0.42μl、延伸引物混合物1μl、iPLEX 缓冲液 0.2μl、iPLEX酶 0.03μl。

（3）将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：

94℃，30秒；94℃，5秒；52℃，5秒；80℃，5秒；4次或以上；循环39次；72℃，3分钟；4℃恒定；

启动PCR仪进行单碱基延伸反应。

5、树脂纯化

（1）将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

（2）加16μl水到延伸产物的对应孔内；

（3）将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；

（4）离心使树脂沉入孔底部。

6、芯片点样

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

7、次级PCR扩增

次级PCR扩增反应物包括缓冲液10μl、MgCl2 溶液 3μl、dNTP溶液 1μl、次级PCR引物混合液 1μl、初级PCR反应产物混合液 3μl、Taq聚合酶 0.2μl、纯化水 30μl。

次级PCR扩增过程 94℃，30秒；94℃，30秒；58℃，30秒；80℃，70秒；循环45次；72℃，50秒；4℃恒定；

最终的PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察和挑选符合大小片段者的PCR产物进行测序，比对多核甘酸链序列，得到分型情况。

三、结果分析：

采用检测基因VKORC1的SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图1的左侧所示，只在Ass泳道中有产物，说明患者是VKORC1突变纯合子，患者对华法林极为敏感，该患者甲在使用华法林时应降低剂量，该结果可以通过DNA测序图附图证实。

采用检测基因CYP2C9位点的引物得到的凝胶电泳如附图的左侧所示，只在Ass泳道中有产物，说明患者是CYP2C9野生纯合子，患者对华法林的代谢能力正常，患者不对华法林敏感，该结果可以通过DNA测序图附图证实。

特异性和灵敏性：基于本发明所述的2个SNP位点的遗传因素模型的灵敏度为65.31%，比遗传CYP2C9和VKORC1基因这一涵盖有部分遗传因素在内的预测模型灵敏度（13.57%）要高51.47个百分点，而包含了基于2个SNP位点的遗传因素在内的综合预测模型灵敏度和特异度分别达到了较高的值。

综上所述，本发明所述的试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，通过芯片检测得到2个SNP位点及EBV分型信息，结合药物基因组学信息和临床相关因素，建立华法林计量运算预测模型，能够用来更准确的估计法华林的计量，降低治疗引导阶段法华林过量或不足的风险，缩短华法林达到稳定治疗的时间。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

<110> 苏州康吉诊断试剂有限公司

<120> 华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒

<130> 233794074

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<210> 1

<211> 21

<212> 人工合成

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<212> 人工合成

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Claims

1.华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测rs1057910和rs9923231位点的突变的特异性引物及特异性探针；所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述特异性探针包括阳性探针和阴性探针；

所述rs1057910的特异性引物及特异性探针分别为上游引物SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3，下游引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4，阳性特异性荧光探针SEQ ID NO.5，阴性特异性荧光探针SEQ IDNO.6；

2.根据权利要求1所述华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，其特征在于：试剂盒内还包括荧光定量PCR 检测液、含rs1057910和rs9923231位点的突变和未突变的DNA标准品。

3.根据权利要求2所述华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，其特征在于：所述PCR 检测液包括PCR缓冲液、25mM氯化镁溶液、25mM的dNTP混合溶液、5U/μl的Taq溶液和纯化水，各成分的分数比为7:3:1:1:25。

4.根据权利要求1所述华法林药物遗传学基因CYP2C9和VKORC1多态性检测试剂盒，其特征在于：rs1057910基因片段的PCR引物浓度为13pmol / L；

rs9923231基因片段的PCR引物浓度为13pmol / L；

rs1057910基因片段的探针浓度为0.5pmol/L；

rs9923231基因片段的探针浓度为0.5pmol/L。