CN110511993B - 用于检测儿童药物代谢相关snp位点的引物组、应用、产品及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法，涉及生物技术领域，本发明提供的儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，能够用于检测热镇痛药代谢能力、呼吸系统药代谢能力、神经与精神病药代谢能力、心脑血管药代谢能力、抗感染药代谢能力、内分泌药代谢能力、消化系统药代谢能力、麻醉药代谢能力和化疗与免疫抑制剂代谢能力，该引物组可以对儿童常见药物代谢相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，并且，检测结果既可以对某一项药物代谢的需求进行预测，又可以综合评估多种药物的代谢能力，为儿童的个体化用药提供科学参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法。
背景技术
在全球范围内，每年约1/3患者的死亡与不合理用药有关。在我国，每年约有200万人因药物不良反应住院，约20万人因药物不良反应死亡，儿童占因药物不良反应死亡人数的1/3。不合理用药与其他原因所致的药物不良反应已成为继癌症、脑血管病和心脏疾病外的第四大死因。儿童处于生长发育阶段，组织器官生理功能发育尚未完全，对药物具有特殊反应。与成年人相比，儿童用药存在更多的安全隐患，需更加谨慎对待。
药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。
目前检测手段众多且各具特色，以PCR为基础的检测手段，诸如ARMS-PCR，荧光定量PCR、数字PCR等，操作简便，快速，数据分析简单，但是由于通量的限制，无法满足临床对多个基因、多位点检测的需求。而高通量基因检测技术，如高通量测序技术等，解决了通量的局限，但其成本高、检测周期长，且对实验操作及数据分析人员的技术要求门槛高，因此尚未得到普及性地应用于临床检测。
综上，目前市场上与儿童个体化安全用药相关的检测并不能完整的覆盖儿童常见药物，无法综合全面的评估儿童常见药物在治疗中的有效性和安全性。因此，亟需一种经济、快速、易操作的检测方法，为不同儿童个体制定相应的安全用药方案，已达到精准的用药和治疗需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组在制备儿童个体化安全用药检测产品中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种用于儿童个体化安全用药检测的产品，以缓解现有技术中缺少能够高通量、易操作且低成本的针对儿童个体化安全用药进行检测的产品的技术问题。
本发明的第四个目的在于提供一种检测儿童个体化安全用药相关SNP位点的方法，以缓解现有的检测方法通量较低、操作繁琐、价格昂贵等技术问题。
本发明提供了一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，所述药物代谢的能力包括：解热镇痛药代谢能力、呼吸系统药代谢能力、神经与精神病药代谢能力、心脑血管药代谢能力、抗感染药代谢能力、内分泌药代谢能力、消化系统药代谢能力、麻醉药代谢能力和化疗和免疫抑制剂代谢能力。
进一步地，所述儿童药物代谢相关SNP位点包括：rs1045642、rs1057910、rs1065852、rs11212617、rs137852327、rs1799853、rs1800462、rs1801280、rs20417、rs2298771、rs2304016、rs2571375、rs267606618、rs4149056、rs4961、rs5219、rs776746、rs1142345、rs1799930、rs1801253、rs1876828、rs267606617、rs267606619、rs3814055、rs4713916、rs489693、rs4986893、rs730012、rs7412、rs4646994、rs1042713、rs113994095、rs116855232、rs1799931、rs1799971、rs1800460、rs1800584、rs2108622、rs4244285、rs429358、rs72554665、rs9923231、rs1042640、rs10484555、rs113994097、rs11568482、rs12248560、rs12979860、rs144012689、rs1800497、rs2011425、rs2306283、rs28371725、rs3892097、rs5030865、rs72554664和rs761142。
进一步地，所述引物组的序列如SEQ ID NO.1-117所示，或者与SEQ ID NO.1-117具有至少85％同一性。
进一步地，所述引物组还包括SEQ ID NO.120-177所示的58个延伸引物。
本发明还提供了上述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组在制备儿童个体化安全用药检测产品中的应用。
本发明还提供了一种用于儿童个体化安全用药检测的产品，所述产品包括上述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组。
进一步地，所述用于儿童个体化安全用药检测的产品还包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备；
优选地，所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCREnzyme和超纯水；
优选地，所述设备包括应用MassARRAY对SNP位点核苷酸进行检测的设备。
本发明还提供了一种检测儿童个体化安全用药相关SNP位点的方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测。
进一步地，应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增及碱基延伸反应，然后应用MassARRAY对反应得到的产物进行检测，确定所述待测样品基因组中SNP位点的核苷酸；
优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤；
优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应后对所述反应得到的产物进行纯化的步骤，然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。
进一步地，将所述引物组分为如下4组：
(a)组包括检测rs267606618、rs2304016、rs1799853、rs5219、rs2298771、rs776746、rs20417、rs11212617、rs1800462、rs1801280、rs2571375、rs4149056、rs1065852、rs1057910、rs137852327、rs1045642和rs4961的引物组；
(b)组包括检测rs267606619、rs267606617、rs730012、rs4986893、rs4713916、rs7412、rs1876828、rs4646994、rs489693、rs1142345、rs3814055、rs1799930和rs1801253的引物组；
(c)组包括检测rs2108622、rs1042713、rs113994095、rs1799971、rs429358、rs116855232、rs1800460、rs1800584、rs4244285、rs72554665、rs1042640、rs1799931和rs9923231的引物组。
(d)组包括检测rs113994097、rs3892097、rs12979860、rs28371725、rs144012689、rs72554664、rs11568482、rs5030865、rs761142、rs1800497、rs2306283、rs4646994、AMEL、rs12248560、rs10484555和rs2011425的引物组；
优选地，所述(d)组还包括检测AMEL的引物组。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供的儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，能够用于检测热镇痛药代谢能力、呼吸系统药代谢能力、神经与精神病药代谢能力、心脑血管药代谢能力、抗感染药代谢能力、内分泌药代谢能力、消化系统药代谢能力、麻醉药代谢能力和化疗与免疫抑制剂代谢能力，该引物组针对儿童药物代谢相关的主要突变位点进行设计，可以对儿童常见药物代谢相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，且检测结果覆盖热镇痛药、呼吸系统药、神经与精神病药、心脑血管药、抗感染药、内分泌药、消化系统药、麻醉药和化疗与免疫抑制剂等常见的9大类儿童用药的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，并且，检测结果既可以对某一项药物代谢的需求进行预测，又可以综合评估多种药物的代谢能力，为儿童的个体化用药提供科学参考。
2)本发明提供的引物组是通过更改优化获得，包括了引物靶向区段的调整、延伸引物方向调整、引物序列优化以及引物分孔优化等，同时经大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确的分型，并且达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY系统也能够对待测样品的儿童药物的代谢能力进行快速有效的检测。
3)本发明提供的用于儿童个体化安全用药检测的产品，包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备以及本发明提供的引物组，该产品用于为儿童疾病治疗与防治提供较全面的个体化安全用药提示，能够对与儿童安全用药相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，目前已投放市场，且经市场检验效果显著，获得极大商业上的回报，具有极大临床应用价值及更开阔的市场推广。
4)本发明提供的儿童个体化安全用药检测相关SNP位点的方法，包括应用上述的引物组检测待测样品基因组中SNP位点的核苷酸。该方法应用本发明提供的引物组能够对9大类儿童常见药物，包括热镇痛药、呼吸系统药、神经与精神疾病药、心脑血管疾病药、感染药、内分泌药、消化系统药、麻醉药和免疫化疗领域药所涉及38个药物代谢相关基因和57个多态性位点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等特点。
5)本发明首次将核酸质谱平台运用于多达9大类至少140种儿童常见药物的基因检测中，具有广谱适用性，极大提高了检测效率，特别适用于批量检测。本发明克服了现有技术中一次性检测SNP位点较少的缺陷，且成本低廉，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，外周血和口腔脱落细胞均能较好的检出；发明适用于所有儿童，不仅可以对患病儿童提供精准用药指导，从剂量、药效、不良反应等多方面给予个性化用药提示，改善患者疗效并减少或避免严重副作用，还可以对健康儿童提供风险评估，有效规避潜在用药的不当风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的优化PCR反应条件前后rs2571375位点的聚类图；
图2为本发明实施例1提供的优化PCR反应条件前后rs1057910位点的聚类图；
图3为本发明实施例1提供的优化PCR反应条件前后12248560位点的聚类图；
图4为本发明实施例1提供的更改引物前后的聚类图；
图5为本发明实施例1提供的优化分孔前rs4986893位点的峰图；
图6为本发明实施例1提供的优化分孔后rs4986893位点的峰图；
图7为本发明实施例1提供的优化分孔前后rs5030865位点的聚类图；
图8为本发明实施例1提供的W4孔中rs4646994位点的峰图；
图9为本发明实施例1提供的W2孔中rs4646994位点的峰图；
图10为本发明实施例2提供的rs1042713位点的聚类图；
图11为本发明实施例2提供的rs1799930位点的聚类图；
图12为本发明实施例2提供的rs116855232位点的聚类图；
图13为本发明实施例2提供的rs11212617位点的聚类图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，所述药物代谢的能力包括：解热镇痛药代谢能力、呼吸系统药代谢能力、神经与精神病药代谢能力、心脑血管药代谢能力、抗感染药代谢能力、内分泌药代谢能力、消化系统药代谢能力、麻醉药代谢能力和化疗和免疫抑制剂代谢能力。
本发明提供的用于检测儿童个体化安全用药相关SNP位点的引物组，针对与儿童个体化安全用药相关的主要突变位点进行设计，可以对儿童安全用药相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，且检测结果覆盖了热镇痛药、呼吸系统药、神经与精神病药、心脑血管药、抗感染药、内分泌药、消化系统药、麻醉药和化疗与免疫抑制剂酸等常见的9大类儿童用药的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本；并且，检测结果既可以对某一项药物代谢的需求进行预测，又可以综合评估多种药物的代谢能力，为个体的安全化用药提供科学参考。此外，本发明提供的引物组是通过更改优化及大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY平台对儿童个体化安全用药进行快速有效的检测。
需要说明的是，在本发明中，儿童的年龄段为0-12岁。儿童药物例如可以为，但不限于阿司匹林、阿替洛尔、阿托伐他汀、埃索美拉唑、艾司西酞普兰、氨苯砜、氨磺必利、氨氯地平、胺碘酮等解热镇痛药；珠氯噻醇、阿巴卡韦、阿立哌唑、阿米卡星、阿米替林、阿莫西林、阿司匹林等呼吸系统药；卡马西平、卡那霉素、卡托普利、卡维地洛、可待因、可乐定、奎尼丁、奎宁、喹硫平、拉莫三嗪、赖诺普利、兰索拉唑、劳拉西泮、雷贝拉唑、利巴韦林、利多卡因、利福平、利培酮、链霉素、硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、罗格列酮、罗库溴铵、螺内酯、氯胺酮、氯巴占、氯吡格雷、氯丙咪嗪、氯丙嗪、氯氮平、氯喹、氯沙坦、吗啡、美芬妥英、美沙酮、美托洛尔、孟鲁司特、咪达唑仑、米氮平、纳洛酮、奈韦拉平、萘啶酮酸、诺氟沙星、帕利哌酮、帕罗西汀；用于心脑血管疾病的羟考酮、氢氯噻嗪、庆大霉素、巯嘌呤、曲安奈德、曲马多、去甲替林、瑞芬太尼、瑞格列奈、瑞舒伐他汀、塞来昔布、噻吗洛尔、沙丁胺醇、沙美特罗、舍曲林、舒马曲坦、双氯芬酸、他克莫司、头孢噻亏、托吡酯、托拉塞米、妥布霉素、文拉法辛、西罗莫司、西酞普兰、硝苯地平、辛伐他汀、新霉素、伊潘立酮、依那普利、乙胺丁醇、乙琥胺、异烟肼、茚地那韦、右美沙芬、重组人干扰素α2a、重组人干扰素α2b等神经与精神疾病药；奥氮平、奥卡西平、奥美拉唑、苯巴比妥、苯妥英、吡格列酮、吡嗪酰胺、丙胺卡因、丙泊酚、丙咪嗪、丙戊酸、伯氨喹、布地奈德、布洛芬、布美他尼、地尔硫卓、地高辛、地西泮、地昔帕明、对乙酰氨基酚、多塞平、二甲双胍、芬太尼、奋乃静、呋喃妥因、呋塞米、伏立康唑、氟伐他汀、氟伏沙明、氟卡尼、氟氯西林、氟哌啶醇等抗感染药；磺胺米隆、磺胺嘧啶、甲氧氯普胺、肼屈嗪、聚乙二醇干扰素α2a、聚乙二醇干扰素α2b等内分泌药；帕罗西汀、泮托拉唑、匹伐他汀、普伐他汀、普罗帕酮、普罗替林、普萘洛尔、羟考酮等消化系统药；氟哌啶醇、氟西汀、格列本脲、格列吡嗪、格列美脲等麻醉药；格列美脲、格列齐特、红霉素、华法林、环孢素、磺胺甲噁唑、磺胺甲基异噁唑等化疗与免疫抑制剂。
在一些优选的实施方式中，所述儿童药物代谢相关SNP位点包括：rs1045642、rs1057910、rs1065852、rs11212617、rs137852327、rs1799853、rs1800462、rs1801280、rs20417、rs2298771、rs2304016、rs2571375、rs267606618、rs4149056、rs4961、rs5219、rs776746、rs1142345、rs1799930、rs1801253、rs1876828、rs267606617、rs267606619、rs3814055、rs4713916、rs489693、rs4986893、rs730012、rs7412、rs1042713、rs113994095、rs116855232、rs1799931、rs1799971、rs1800460、rs1800584、rs2108622、rs4244285、rs429358、rs72554665、rs9923231、rs1042640、rs10484555、rs113994097、rs11568482、rs12248560、rs12979860、rs144012689、rs1800497、rs2011425、rs2306283、rs28371725、rs3892097、rs5030865、rs72554664，rs761142和rs4646994。
在一些优选的实施方式中，所述引物组的序列如SEQ ID NO.1-117所示，或者与SEQ ID NO.1-117具有至少85％同一性。
需要进行说明的是，术语“同一性”指的是序列的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.119所示的单链DNA具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、90％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
在一些优选的实施方式中，所述引物组还包括SEQ ID NO.120-177所示的58个延伸引物。
可以理解的是，本发明中引物对和延伸引物一一对应，且对应的引物对和延伸引物用于检测同一位点的核苷酸。例如，第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.120所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第二引物对包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ IDNO.121所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸等。
可以理解的是，引物对及延伸引物的编号与上述SNP位点的顺序对应，即第一引物对及第一延伸引物对应检测rs1045642位点，第二引物对及第二延伸引物对应检测rs1057910位点，第三引物对及第三延伸引物对应检测rs1065852位点。
需要说明的是，rs4646994位点包含SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.115和SEQ IDNO.116所示的核苷酸序列的三条上游引物，SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.117所示的核苷酸序列的下游引物以及SEQ ID NO.149和SEQ ID NO.177所示的核苷酸序列的延伸引物。
进一步的，列举各位点的基因型，具体见下表：
表1各位点基因型对应表
检测位点及药物种类的对应关系如下表2所示：
表2检测位点及对应的药物种类
本发明还提供了上述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组在制备儿童个体化安全用药检测产品中的应用。
儿童个体化安全用药指的是在充分考虑每个需用药儿童的遗传因素(即药物代谢基因类型)、性别、年龄、体重、生理病理特征以及正在服用的其它药物等综合情况的基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。在已知性别、年龄、体重、生理病理特征以及正在服用的其它药物等客观条件的基础上，应用本发明提供的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，能够快速、准确、有效地检测药物代谢基因类型，从而能够提高儿童用药的药物疗效，降低药物的毒副作用，减少医疗费用。
本发明还提供了一种用于儿童个体化安全用药检测的产品，所述产品包括上述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组。
该产品能够对与检测儿童个体化安全用药相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，具有极大的临床应用价值及非常开阔的市场推广前景。
在一些优选的实施方式中，用于检测儿童个体化安全用药的产品还包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备。
可以理解的是，所述用于检测SNP位点的试剂和/或设备可以是可通过市售购得的、本领域用于检测SNP位点核苷酸的常规通用试剂和/或设备，例如，可以是用于检测SNP位点核苷酸的试剂或试剂盒，或者为用于检测SNP位点核苷酸的包括试剂的试剂盒。
在一些优选的实施方式中，所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCR Enzyme和超纯水；
优选地，所述设备包括应用MassARRAY对SNP位点核苷酸进行检测的设备。所述设备典型的包括MassARRAY CPM。
另外，本发明还提供了一种检测儿童个体化安全用药相关SNP位点的方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测。
该方法应用本发明提供的引物组能够对热镇痛药、呼吸系统药、神经与精神病药、心脑血管药、抗感染药、内分泌药、消化系统药、麻醉药和化疗与免疫抑制剂等9大类儿童常见用药代谢相关的36个基因的57个SNP位点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等特点。
可以理解的是，本发明可以对待测样品的全基因组进行检测，也可以筛选特定基因进行检测(例如对rs1045642、rs1057910、rs1065852、rs11212617、rs137852327、rs1799853、rs1800462、rs1801280、rs20417、rs2298771、rs2304016、rs2571375、rs267606618、rs4149056、rs4961、rs5219、rs776746、rs1142345、rs1799930、rs1801253、rs1876828、rs267606617、rs267606619、rs3814055、rs4713916、rs489693、rs4986893、rs730012、rs7412、rs4646994、rs1042713、rs113994095、rs116855232、rs1799931、rs1799971、rs1800460、rs1800584、rs2108622、rs4244285、rs429358、rs72554665、rs9923231、rs1042640、rs10484555、rs113994097、rs11568482、rs12248560、rs12979860、rs144012689、rs1800497、rs2011425、rs2306283、rs28371725、rs3892097、rs5030865、rs72554664和rs761142特定的基因进行检测)，当对特定的基因进行检测时，干扰更小，检测结果更加精确。
在一些优选的实施方式中，应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增和碱基延伸反应，然后应用MassARRAY系统对反应得到的产物进行检测，确定所述待测样品基因组中SNP位点的核苷酸。
MassARRAY基因分析技术基于MALDT-TOF飞行时间质谱技术，先通过PCR扩增目标序列，然后根据需要加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上进行单个碱基的延伸。该技术应用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序列区别开，进而推测出SNP分型。
在本发明的优选实施方式中采用MassARRAY系统进行检测，实现了运用单一平台对多基因位点的检测方法，极大的提高了检测效率，特别适用于批量检测，为儿童的个体化用药提供了参考。并且，所需样本的适应性强，外周血和口腔脱落细胞均能较好的检出。
优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤。具体地，使用虾碱性磷酸酶对PCR产物进行去磷酸化。
优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应后对所述反应产物进行纯化的步骤，然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。具体地，可使用树脂盐脱的方式对反应产物进行纯化。
在一些优选的实施方式中，将所述引物组分为如下4组：
(a)组包括检测rs267606618、rs2304016、rs1799853、rs5219、rs2298771、rs776746、rs20417、rs11212617、rs1800462、rs1801280、rs2571375、rs4149056、rs1065852、rs1057910、rs137852327、rs1045642和rs4961的引物组；
(b)组包括检测rs267606619、rs267606617、rs730012、rs4986893、rs4713916、rs7412、rs1876828、rs4646994、rs489693、rs1142345、rs3814055、rs1799930和rs1801253的引物组；
(c)组包括检测rs2108622、rs1042713、rs113994095、rs1799971、rs429358、rs116855232、rs1800460、rs1800584、rs4244285、rs72554665、rs1042640、rs1799931和rs9923231的引物组。
(d)组包括检测rs113994097、rs3892097、rs12979860、rs28371725、rs144012689、rs72554664、rs11568482、rs5030865、rs761142、rs1800497、rs2306283、rs4646994、AMEL、rs12248560、rs10484555和rs2011425的引物组；
优选地，所述(d)组还包括检测AMEL的引物组。
该分组综合考虑到延伸引物大小，保证了每组内引物间互相无干扰。
需要说明的是，AMEL为性别鉴定，通过对性别鉴定位点进行检测，能够使检测结果更加准确。用于检测AMEL的引物组具有如SEQ ID NO.118所示的上游引物和如SEQ IDNO.119所示的下游引物，以及如SEQ ID NO.178所示的延伸引物。
具体地，采用如下方式进行分组：通过MassARRAY网址在线设计引物(AssayDesign Suite)，调整相关参数：首先是Preset设置为Moderate Multiplexing iPLEX，然后Advanced Settings中Retrieve and Format Sequences的Flank size设为500，IdentifyOptimal Primer Areas的Maximum Amplicon Length设为300bp，Maximu Test设为1000；Design Assays/Multiple的Min Peak Separation改为20，Extend Primer的Oligo Length设为15；最后点击运行，最终57个位点被分为四组。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：
实施例1引物的设计和优化，以及反应体系的建立
通过MassARRAY网址的引物设计软件，调整相关参数，完成57个位点的PCR和UEP的引物设计，导出设计好的引物及各参数文件，并合成引物。按照引物配置表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：
(1)将基因组DNA样本稀释至10ng/μL，按下表配制PCR反应MIX(以下为单个样本量)
表3 PCR反应体系
封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
(2)虾碱性磷酸酶消化(SAP)
取出PCR板，4000rpm离心1分钟，按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)：
表4 SAP反应体系
每个反应孔加2μL SAP混液，封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
| 温度(℃) | 时间 |
| 37 | 40min |
| 85 | 5min |
| 4 | 保温 |
(3)单碱基延伸(EXT)
取出PCR板，4000rpm离心1分钟，按下表配制EXT反应体系，其中Extend PrimerMix为四组位点不同的延伸引物混液(以下为单个样本量)：
表5 EXT反应体系
每个反应孔加入2μL延伸混液，封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：
(4)树脂脱盐
①把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；
②样本板取出，板式离心机4000rpm离心1分钟；
③样本板每一个有样本的孔里加入16μL水，封板；
④板式离心机(ThermoFisher)4000rpm离心30秒；
⑤轻轻将样本板凌空翻转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimpleplate连样本板一起翻转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；
⑥取下dimple plate，样本板封板，旋转器上颠倒摇匀15-30分钟；
⑦4000rpm离心5分钟。
(5)Dispensing点样
使用MassARRAY CPM将样本点到对应的SpectroCHIP(芯片)上。
(6)MALDI-TOF
使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据。
以PCR反应条件优化为例(PCR退火温度的调整)：
最初所采用的扩增条件中，退火温度为60℃，用该反应条件扩增后，发现体系出现不稳定的现象，多个位点扩增效率低，其中rs2571375，rs1057910和12248560位点不能够稳定的报出基因型。经过对PCR反应条件的优化(更改退火温度为56℃)，并通过多轮测试后，发现新体系的位点扩增效率较好，所有位点都可以正确的稳定的报出基因型。图1，图2和图3分别列举了rs2571375，rs1057910和12248560位点在更改扩增条件前及更改扩增条件后的具体的聚类峰图(纵坐标代表UEP引物转化效率百分比)。从图中可以看出所示的3个位点在更改扩增条件后PCR引物的扩增效率优于更改前，使得UEP有更多的底物进行延伸反应。
以rs2304016位点引物优化为例(靶向区域调整、UEP引物方向调整)：
rs2304016位点出现出峰较低现象，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGGACTGGCAGCTCTTTCTTAATGT，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGACTTATCCTGGCTATTCTGAGAGT)和更改UEP引物方向(更改前UEP序列为：cAAGGAATAGAAAGAATCA)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试效果更好，出峰较低现象改善。通过对50例样本进行测试均未出现no call，更改引物前及更改引物后的具体的聚类峰图如图4所示。从图中可以看出更改引物前的聚类集中在右下角且均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。
以rs4986893位点优化分孔为例(位点分孔排布调整)：
最初所设计的rs4986893位点位于W4孔中，经过测试发现该位点的检出假阳的现象。经过比对分析后，发现rs4986893位点的UEP引物的3’末端与rs5030865的PCR下游引物的3’末端完全互补，本实施例通过将rs4986893位点移至W2孔后，该位点出峰正常没有假阳的出现。同一例样本的rs4986893位点在分孔前和分孔后的峰图分别如图5和图6所示。所取样本为已知的A基因型，从图中可以看出更改前该样本的rs4986893位点检测峰上A型峰和G型峰都出现明显出峰，软件报出样本的rs4986893为AG基因型，而更改后该样本的检测峰上只有A型峰，软件报出为A基因型，这与该样本的已知基因型一致。此外，通过比较45例样本在更改分孔前后的变化，可以发现将rs4986893与rs5030865位点位于不同孔中时，rs5030865位点的出峰效率得到了明显提高，如图7所示。从图中可以看出更改前，rs5030865位点UEP的转化效率为10％～30％，更改后UEP的转化效率均达到100％，说明更改分孔后避免了rs4986893和rs5030865引物间的相互影响，从而提高了rs5030865位点引物的扩增效率，使得UEP有更多的底物进行延伸反应。
以rs4646994位点优化引物为例(引物间分孔调整)：
rs4646994位点属于ACE基因，用于检测常染色体的插入和缺失，本实施例通过设计两条上游引物F1，F2和共有的一条下游引物R，分别用以WT基因型和INS基因型扩增并检测，检测结果发现杂合样本的INS出峰较低，影响软件对rs4646994位点基因型的判读和真实位点的检出。通过对rs4646994位点的序列和引物进行软件分析，发现杂合样本中F2引物会与WT序列进行非特异结合，从而影响该引物特异性扩增的效率，后续重新设计F2引物，但检测结果没有明显的改善。最终，经过多次尝试后，本实施例在另一个孔W2中加入F2和R引物，使其只扩增rs4646994位点的INS，用以对原W4孔中INS的报出结果进行修正。测试后发现，结合W2孔和W4孔中rs4646994的检出结果，可以达到本项目的检出要求，通过多例已知的杂合样本的验证，所检出结果完全一致，证明了单独检测INS基因型并对原检测结果进行修正的方案可行。在已知WT/INS杂合突变的样本中，rs4646994位点在W4孔和W2孔的检测峰图分别如图8和图9所示。从图中可以看出W4孔中的检测峰上INS型峰出峰较低，不能达到项目的检出要求，而W2孔中的检测峰上INS型峰出峰明显，可能达到项目的检出要求，用W2的INS检出结果作为W4的修正，使rs4646994位点的判读结果为WT/INS杂合突变。
经过引物的多次更改和反复优化测试，筛选出最优PCR扩增引物及单碱基延伸(UEP)引物，具体引物序列参见表6和7的引物序列。
表6 PCR引物序列
表7 UEP引物序列
实施例2反应体系的验证
本实施例在体系优化过程中，每个检测位点都有2～3个样本经过Sanger测序的验证，经比对结果都一致，确认本实施例检测的结果准确无误。本实施例在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性、精密度以及人员比对和不同批次引物间的比对实验。具体的验证方案如下：
(1)准确性实验验证方案：57个位点各选取一例样本进行Sanger测序，并比对sanger测序与MassARRAY的结果，一致性大于95％则验证通过。
(2)精密度实验验证方案：挑取3例外周血样本和对应的3例口腔拭子样本，每个样本重复3次进行一个批次的检测，共检测3个批次，外周血和口腔拭子结果一致性100％，批间精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。
(3)人员比对和试剂比对实验验证方案：上述(2)中配制两个批次的引物(批次A和批次B)，操作员甲使用引物批次A检测批次1，使用引物批次B检测批次2，操作员乙使用引物批次B检测批次3，比较人员和试剂间的结果，一致性大于95％则验证通过。
具体的验证过程如下：首先按照本发明实施例1提供的体系加量表配制两个批次的扩增引物MIX和延伸引物MIX，分别命名为批次A和批次B。然后按照实施例1中的操作步骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、树脂脱盐和MassARRAY CPM点样分析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表，因精密度实验批次内和批次间的结果均一致，故只列出6个样本的检测结果。
表8准确性的验证结果
经57例样本的MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。
表9精密度的验证结果
经3例外周血样本和对应3例口腔拭子样本的3个批次的检测结果比对，可知本发明的体系的批间精密度、批内精密度以及人员间比对和试剂间比对的一致性均为100％。
因本发明检测位点较多，故在此随机选取4个位点rs1042713、rs1799930、rs116855232和rs11212617进行展示，上述4个位点的聚类图分别如图10、图11、图12和图13所示。从上述附图结果中同样可以得出，本发明的体系的批间精密度、批内精密度以及人员间比对和试剂间比对的一致性均为100％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏先声医疗器械有限公司
南京先声医学检验有限公司
江苏先声医学诊断有限公司
<120> 用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法
<160> 178
<170> PatentIn version 3.5
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acgttggatg tttagctcag agcggtcaag tta 33
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgttggatg gagaccacga ttgagcaaac 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
acgttggatg tcacctgaag acaactgtgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acgttggatg taacctctct ggactcctac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acgttggatg cctaacgaga tagtgaggag 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
acgttggatg ctgcctaccg gtctaaaatc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttggatg acgcggccct gttccacca 29
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttggatg cctgtcaacc agaactggga 30
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttggatg gggtcaactt gtcccactta 30
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttggatg gaatccctga tgtcattctt c 31
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<213> 人工序列
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acgttggatg gagcatggcc tgcacctcg 29
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttggatg aatcaggacc ccaacaccac 30
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg acatgatgcc ctgctttcgg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg gctccacaca acacctatga 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
acgttggatg tacatgctga tttgctaggt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg gatgctctat tgagtgata 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg gatgttctta cagttacagg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg cccgttctgt cccgagtatg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg ccctgacact ccttcttgcc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg ggagaccagg gggagcata 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
acgttggatg gctcacggct ttgtccaaga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg ggagaccagg gggagcata 29
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<213> 人工序列
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acgttggatg tctccagctc aatctggtgc 30
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg aagcaacagt tggttctagc 30
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acgttgattg agaccatccc ggctaaaacg 30
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<213> 人工序列
<400> 117
acgttggact ggagaccact cccatccttt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg gagcttaaac tgggaagctg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
acgttggatg cagctatgag gtaatttttc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgttggcct cctttgctgc cctcac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
tgggtgcacg aggtccagag atac 24
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
ccccaacgct gggctgcacg ctac 24
<210> 123
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
ccttttttat ccgctctgac a 21
<210> 124
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
ggcacctctg agatgcattt caaca 25
<210> 125
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
agaggagcat tgaggac 17
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
tgtatgattt tatgcaggtt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
aaccttctcc tgcaggtgac ca 22
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
gaggagaatt tacctttccc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
agatctttcc caatttctg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
ttgctgaagt gttttacagg atttta 26
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
ttattattct caccttcacc ttt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
ataccccact atgct 15
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
agcgaagcat attacccatg aac 23
<210> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
aagacttggg actgcttcca ttctgcc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
cggcacggta cctgggct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
tccaaacagg gaagagata 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
ctcatttact tttctgtaag taga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
cccacactta tttacgcttg aacctc 26
<210> 139
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
ggcactgcgc gcgcagcaga gcagtc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
ctgtctgcct ctctccctcc ctg 23
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
atttatatag aggag 15
<210> 142
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
gaagtatact tgaggag 17
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
gcttgagcaa acaggtagaa aaga 24
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
acggactcct acattttcct ct 22
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
cttcattctg ttgtcattag ttcc 24
<210> 146
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
attgtaagca ccccctg 17
<210> 147
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
ccaccttatc tgttccc 17
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
atgccgatga cctgcagaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
ttgctgccta tacagtcact ttt 23
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
gtccggcgca tggcttc 17
<210> 151
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
ctggcaggca tcattgg 17
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
ccagcttttc tggggactg 19
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
ccttattcta aatagtaagg gat 23
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
tgcatgggtc ggacaggt 18
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
acatgatttg ggatagagga 20
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
atgttactct ttcttgtttc a 21
<210> 157
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
tactcagggt ccggccaca 19
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
aagtaatttg ttatgggttc c 21
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
gcggacatgg aggacgtg 18
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttttaaaata cgccaggcct ca 22
<210> 161
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
ccagtatagg cgtgagccac cgcacc 26
<210> 162
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
ggaaatttgc agtaggggca gc 22
<210> 163
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
cacggcttta taatatgtct ctctat 26
<210> 164
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
acatccctgg ctgct 15
<210> 165
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
ctcaacctgc agaaggag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
agtttgtgtc ttctgttctc aaag 24
<210> 167
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
cggcgtgcaa ttcaaccctg gttc 24
<210> 168
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
ctgcgttagc ccctgtg 17
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
gccatcctca aagtgctggt c 21
<210> 170
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
ggggcctctg gcatggagct cccgca 26
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
gatgttgaat tttctgatga at 22
<210> 172
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
cccccgcctg taccctt 17
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
cgcgaaaggg gcgtc 15
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
gccttctgcc catcacccac 20
<210> 175
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
gcagtggggt gaaaata 17
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
gacaactatt gtttgggcca 20
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
ttgctgccta tacagtcact ttt 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
ggtattcttt acagagccca ggg 23
Claims (7)
1.一种用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组，其特征在于，所述儿童药物代谢的能力包括：解热镇痛药代谢能力、呼吸系统药代谢能力、神经与精神病药代谢能力、心脑血管药代谢能力、抗感染药代谢能力、内分泌药代谢能力、消化系统药代谢能力、麻醉药代谢能力和化疗和免疫抑制剂代谢能力；
所述儿童药物代谢相关SNP位点为：rs1045642、rs1057910、rs1065852、rs11212617、rs137852327、rs1799853、rs1800462、rs1801280、rs20417、rs2298771、rs2304016、rs2571375、rs267606618、rs4149056、rs4961、rs5219、rs776746、rs1142345、rs1799930、rs1801253、rs1876828、rs267606617、rs267606619、rs3814055、rs4713916、rs489693、rs4986893、rs730012、rs7412、rs1042713、rs113994095、rs116855232、rs1799931、rs1799971、rs1800460、rs1800584、rs2108622、rs4244285、rs429358、rs72554665、rs9923231、rs1042640、rs10484555、rs113994097、rs11568482、rs12248560、rs12979860、rs144012689、rs1800497、rs2011425、rs2306283、rs28371725、rs3892097、rs5030865、rs72554664、rs761142和rs4646994；
所述引物组的序列如SEQ ID NO.1-117所示；
所述引物组还包括SEQ ID NO.120-177所示的58个延伸引物。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组分为如下4组：
(a)组包括检测rs267606618、rs2304016、rs1799853、rs5219、rs2298771、rs776746、rs20417、rs11212617、rs1800462、rs1801280、rs2571375、rs4149056、rs1065852、rs1057910、rs137852327、rs1045642和rs4961的引物组；
(b)组包括检测rs267606619、rs267606617、rs730012、rs4986893、rs4713916、rs7412、rs1876828、rs4646994、rs489693、rs1142345、rs3814055、rs1799930和rs1801253的引物组；
(c)组包括检测rs2108622、rs1042713、rs113994095、rs1799971、rs429358、rs116855232、rs1800460、rs1800584、rs4244285、rs72554665、rs1042640、rs1799931和rs9923231的引物组；
(d)组包括检测rs113994097、rs3892097、rs12979860、rs28371725、rs144012689、rs72554664、rs11568482、rs5030865、rs761142、rs1800497、rs2306283、rs4646994、AMEL、rs12248560、rs10484555和rs2011425的引物组，以及检测AMEL的引物组。
3.如权利要求1或2所述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组在制备儿童个体化安全用药检测产品中的应用。
4.一种用于儿童个体化安全用药检测的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的用于检测儿童药物代谢相关SNP位点的引物组。
5.根据权利要求4所述的用于儿童个体化安全用药检测的产品，其特征在于，所述用于儿童个体化安全用药检测的产品还包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备。
6.根据权利要求5所述的用于儿童个体化安全用药检测的产品，其特征在于，所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl2、Primer Mix、PCR Enzyme和超纯水。
7.根据权利要求5所述的用于儿童个体化安全用药检测的产品，其特征在于，所述设备包括应用MassARRAY对SNP位点核苷酸进行检测的设备。
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