CN109234383A

CN109234383A - 与抗精神疾病药相关的试剂盒、目标基因及其制备、snp标记、snp识别和应用

Info

Publication number: CN109234383A
Application number: CN201811318666.6A
Authority: CN
Inventors: 何熲; 石忆湘; 魏宁; 黄成琛; 何宗顺; 顾孝平
Original assignee: Shanghai Kangli Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Shanghai Kangli Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2019-01-18
Also published as: WO2020177433A1; CN109777870B; CN109777870A

Abstract

本发明涉及一种与抗精神疾病药相关的试剂盒，用与抗精神疾病药相关的试剂盒锁定与抗精神疾病药相关的目标基因，并且对与抗精神疾病药相关的目标基因进行PCR扩增，获取与抗精神疾病药相关的目标基因。对与抗精神疾病药相关的目标基因进行单碱基延伸反应，获得目标基因SNP的分子标记、并且对分子标记进行检测以识别与抗精神疾病药相关的目标基因是否发生变异。最后，指明将与抗精神疾病药相关的目标基因的试剂应用。

Description

与抗精神疾病药相关的试剂盒、目标基因及其制备、SNP标记、 SNP识别和应用

技术领域

本发明涉及一种与抗精神疾病药相关的试剂盒，用与抗精神疾病药相关的试剂盒获得与抗精神疾病药相关的目标基因，并对与抗精神疾病药相关的目标基因进行制备，对与抗精神疾病药相关的目标基因SNP进行标记、识别和对与抗精神疾病药相关的目标基因进行应用。

背景技术

抑郁、精神分裂、焦虑、癫痫是精神疾病的表现。精神疾病与人体新陈代谢异常密切相关。抗精神疾病药的服用影响新陈代谢。新陈代谢实质是一系列的体内化学反应过程。这些体内化学反应过程，由体内蛋白质和外来摄入物质参与。抗精神疾病药的服用实质是将外来药物引入新陈代谢过程，而参与新陈代谢过程的蛋白质来源于从DNA转录所生成的mRNA在核糖体内与tRNA配合作用。某种蛋白质的生成过程本质也是一系列的人体内化学反应过程。因此，可以从对一系列的人体内化学反应过程的模拟来揭示精神疾病现象。特别是，可以通过对蛋白质合成发挥重要作用的DNA和所服用的抗精神疾病药对一系列的人体内化学反应过程的影响来系统、精确地认识、治疗精神疾病现象。这其中，对与抗精神疾病药相关的基因进行测序是首要任务。对与抗精神疾病药相关的基因进行测序离不开相关的试剂，本发明将提供一种检测与抗精神疾病药相关基因的试剂盒。

发明内容

本发明涉及一种与抗精神疾病药相关的试剂盒，包括：至少装有一对寡核苷酸，所述一对寡核苷酸是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2,SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,SEQ ID No.5和SEQ ID No.6,SEQ ID No.7和SEQ ID No.8,SEQ ID No.9和SEQ ID No.10,SEQ ID No.11和SEQ ID No.12,SEQ ID No.13和SEQ ID No.14,SEQ ID No.15和SEQ ID No.16,SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18,SEQ ID No.19和SEQ ID No.20,SEQ ID No.21和SEQ ID No.22,SEQID No.23和SEQ ID No.24,SEQ ID No.25和SEQ ID No.26,SEQ ID No.27和SEQ ID No.28,SEQ ID No.29和SEQ ID No.30,或SEQ ID No.31和SEQ ID No.32。

与抗精神疾病药相关的目标基因，是SEQ ID No.33至SEQ ID No.48所列至少一种基因。

与抗精神疾病药相关的目标基因的制备，对提取自人体的DNA样本用与抗精神疾病药相关的试剂盒进行PCR扩增生成第一反应液的步骤。

与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的标记，包括对第一反应液进行SAP消化得到第二反应液的步骤，对第二反应液分别用ddNTP或者荧光dNTP配合探针进行单碱基延伸反应获得含有分子标记的第三反应液的步骤。

与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，包括对所述第三反应液进行分离获取分子标记的步骤。

与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，包括对分子标记进行飞行时间质谱分析的步骤。

与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，包括对所述第三反应液和探针分别置于样品、对照组泳道进行电泳的步骤。

可以采用飞行时间质谱分析进行抽样检测来评估电泳结果。

SEQ ID No.33至SEQ ID No.48中任意一种基因作为精神疾病症基因电泳检测的对比试剂。

一种抗精神疾病药的筛选方法，包括所述与抗精神疾病药相关的目标基因的SNP识别步骤。

与抗精神疾病药相关的试剂盒能够针对SEQ ID No.33至SEQ ID No.48至少一条基因进行识别和扩增。可以采用这种与抗精神疾病药相关的试剂盒，复合识别与抗精神疾病药相关的基因。因此，也可以看作是复合PCR试剂盒。

与抗精神疾病药相关的试剂盒至少装有一对寡核苷酸作为PCR中的引物，决定对SEQ ID No.33至SEQ ID No.48中的至少一条基因进行扩增，得到第一反应液。第一反应液中含有SEQ ID No.33至SEQ ID No.48中的至少一条基因。

对第二反应液分别用ddNTP或者荧光dNTP配合探针进行单碱基延伸反应，获得含有分子标记的第三反应液，分子标记携带生物信息。

采用电泳对照探针分析第三反应液，从而提取分子标记所携带的生物信息。或者对第三反应液进行分离，获取分子标记；然后，采用飞行时间质谱分析分子标记，以提取分子标记所携带的生物信息来判断SEQ ID No.33至SEQ ID No.48任意序列的SNP。

具体实施方式

该发明专利申请通过具体实施方式进一步详细说明的技术方案并不构成对该发明内容的任何限制。任何人在该发明权利要求范围内限制性地修改该发明的内容，这种新修改的内容仍然落入该发明权利要求的保护范围之内。

基因序列与药效具有作用关系。基因序列决定人体内所合成的蛋白质。蛋白质是人体内化学反应过程中的重要物质。治疗精神疾病的药物影响人体内化学反应过程，即治疗精神疾病的药物与参与人体内化学反应过程中的重要物质之间有相互作用。因此，同一种药对具有不同基因型的患者的作用是不同的。CYP1A2酶参与部分5-羟色胺再吸收抑制剂类精神药物(以下用SSRI表示)、三环类精神药物的代谢。CYP1A2基因rs762551、或者rs2069514位点的突变会改变CYP1A2酶的代谢活性，从而改变部分SSRI类精神药物、三环类精神药物的血药浓度状态。CYP2D6酶的活性与SSRI类药物和三环类精神药物在体内的代谢速度具有密切关系。CYP2D6基因rs1058164、rs1065852、或者rs1135840位点突变是导致中国人群中CYP2D6酶活性降低的主要因素。CYP2D6酶活性的减弱会导致SSRI类药物和三环类精神药物血药浓度和峰值的升高。CYP2C19酶参与部分SSRI类药物和三环类精神药物的代谢。CYP2C19基因rs4244285位点突变是导致中国人群中常见的CYP2C19酶活性降低的原因，从而使血药浓度和峰值的升高。CYP3A5酶主要参与抗焦虑药物阿普唑仑的代谢，而CYP3A5基因rs776746位点的突变导致是东亚人群中CYP3A5酶活性丧失，显著影响对阿普唑仑的代谢，改变其血药浓度。DRD2基因rs1079597，rs1799978,rs1800497位点的多态性对多种治疗精神分裂症药物的疗效有影响。FKBP5酶影响多种SSRI类药物的治疗效果。FKBP5的rs1360780位点多态性可以帮助预测多种SSRI类药物的疗效。HTR2A基因rs7997012位点的多态性帮助对SSRI类药物治疗效果进行预测。MC4R基因rs489693位点的多态性与使用多种抗精神分裂药物后导致体重增加的副反应相关，对精神分裂药物的使用导致体重增加的副作用具有预测作用。NAT2酶在代谢氯硝西泮过程中具有重要作用，NAT2基因rs1041983、rs1799930位点突变导致对氯硝西泮的代谢明显减慢，从而影响氯硝西泮的治疗效果和毒副作用。UGT2B15酶在代谢苯二氮卓类药物中发挥主要作用，UGT2B15基因rs1902023位点突变导致UGT2B15酶活性降低，从而使劳拉西泮，奥沙西泮等药物的代谢变慢。另外，如果FKBP5基因rs1360780从TT变为CC,影响文拉法辛、米氮平、阿米替林、氯丙咪嗪、奋乃静的使用。如果FKBP5基因rs1360780从TT变为CC，并且MC4R基因rs489693从CC变为AA，则影响文拉法辛、米氮平、奋乃静的使用。总结以上酶与药物代谢过程，可以将精神疾病或者精神疾病的治疗归结为研究人体内的化学反应过程。特别是，对参与治疗精神疾病药物代谢酶的来源进行研究离不开对DNA和RNA的研究。从而，可以通过模拟人体内的化学反应过程来研究参与治疗精神疾病药的作用效果。本发明首先提供一种与抗精神疾病药相关的试剂盒，利用与抗精神疾病药相关的试剂盒锁定与抗精神疾病药相关的基因，然后制备与抗精神疾病药相关的基因，并针对与抗精神疾病药相关的基因进行SNP标记和SNP识别以确定同位点碱基的形态。最后指明对与抗精神疾病药相关的基因进行应用，这对药物选择和药效模型的建立具有重要意义。

为此，本发明首先提供一种与抗精神疾病药相关的试剂盒，装有至少一对寡核苷酸，可以是用于识别CYP1A2基因rs762551位点碱基类型的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；用于识别CYP1A2基因rs2069514位点碱基类型的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；用于识别CYP2D6基因rs1058164位点碱基类型的SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；用于识别CYP2D6基因rs1065852位点碱基类型的SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；用于识别CYP2D6基因rs1135840位点碱基类型的SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；用于识别CYP2C19基因rs4244285位点碱基类型的SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；用于识别CYP3A5基因rs776746位点碱基类型的SEQ IDNo.13和SEQ ID No.14；用于识别DRD2基因rs1079597位点碱基类型的SEQ ID No.15和SEQID No.16；用于识别DRD2基因rs1799978位点碱基类型的SEQ ID No.17和SEQ ID No.18；用于识别DRD2基因rs1800497位点碱基类型的SEQ ID No.19和SEQ ID No.20；用于识别FKBP5基因rs1360780位点碱基类型的SEQ ID No.21和SEQ ID No.22；用于识别HTR2A基因rs7997012位点碱基类型的SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；用于识别MC4R包含rs489693位点碱基类型的SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；用于识别NAT2基因rs1041983位点碱基类型的SEQ ID No.27和SEQ ID No.28；用于识别NAT2基因rs1799930位点碱基类型的SEQ IDNo.29和SEQ ID No.30；和用于识别UGT2基因rs1902023位点碱基类型的SEQ ID No.31和SEQ ID No.32。优选的，所述序列3’端接有g、gt、gta、gtag、gtagg、gtaggt、gtaggtt、gtaggttg、gtaggttgc、或者gtaggttgca能够增加引物的质量或者改变引物的构象。第一，引物质量的改变使得引物不能够被飞行时间质谱仪读取，或者使飞行时间质谱仪更容易区分扩增反应引物和单碱基延伸引物。第二，引物的构象改变能够改变引物在聚丙烯酰氨泳道或者毛细管泳道上的位置。这样，使这些扩增引物与后续的延伸引物具有明显不同的性质。第三，能够阻止延伸反应。优选gtaggttgca序列。

其中，可以用每对寡核苷酸作为引物单独组成一种与抗精神疾病药相关的试剂盒。

样本DNA基因组是从人体口腔黏膜细胞、口腔脱落细胞、血液、组织或者干血片中提取的，并且DNA A260/A280比值应介于1.8到2.0之间。口腔黏膜细胞DNA提取，利用康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒进行口腔黏膜细胞DNA提取。在GW1和GW2试剂中加入一定量的无水乙醇。从采样管中取500μL口腔黏膜细胞样本，加入300μL GR、20μL Proteinase K和300μL GL，震荡混匀，56℃震荡孵育15min，加入300μL无水乙醇，震荡混匀；将750μL该溶液加入到收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW1，12000rpm离心1min，弃液；向吸附柱中加入400μL GW2，12000rpm离心1min，弃液；12000rpm离心2min，静置晾干；将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，悬空加入40μL GE，静置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，质检A260/A280比值应介于1.8到2.0之间，4℃保存。

对样本DNA进行PCR扩增。将样本的DNA组分别加入到384孔板中，用SEQ ID No.1至SEQ ID No.32作为引物进行多重PCR扩增，制备第一反应液,第一反应液含有SEQ ID No.33至SEQ ID No.48。按照多重PCR扩增的反应体系(5μL)加入到每个反应孔中，反应体系：

模板DNA 1ng/μL，1uL，

SEQ ID No.1至SEQ ID No.32引物mix 1μL，

10×Buffer 0.5μL，

MgCl₂(25mmol/L)0.4μL，

dNTP(25mmol/L)1μL，

ddH₂O 1μL，

Hotstar Tag酶(5U/μL)0.1μL。

反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应，反应条件：95℃预变性12min，然后进行(95℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸60s)45个循环，最后在72℃保温5min，获得第一反应液。4℃保存第一反应液，离心备用。

对第一反应液进行SAP消化，获取第二反应液。利用Agena平台配套试剂和操作步骤，按照SAP消化的反应体系(2μL)加入到每个反应孔中，反应体系：

SAP×Buffer 0.17μL，

SAP Enzyme(1U/μL)0.3μL，

ddH₂O 1.53μL；

反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应，反应条件：37℃恒温40min，85℃恒温5min，得到第二反应液。4℃保存第二反应液，离心备用。第二反应液是对第一反应液用虾碱基磷酸酶进行消化去除第一反应液中未反应的PCR引物和dNTP后的PCR产物。

对第二反应液进行单碱基延伸反应，获取含有分子标记的第三反应液。利用Agena平台配套试剂和操作步骤，分子标记携带CYP1A2基因rs762551位点、rs2069514位点，CYP2D6基因rs1058164位点、rs1065852位点、rs1135840位点，CYP2C19基因rs4244285位点，CYP3A5基因rs776746位点、DRD2基因rs1079597位点、rs1799978位点、rs1800497位点，FKBP5基因rs1360780位点，HTR2A基因rs7997012位点，MC4R基因rs489693位点，NAT2基因rs1041983位点、rs1799930位点，UGT2基因rs1902023位点的碱基类型生物信息。将第二反应液，按照单碱基延伸反应体系(2μL)加入到对应的每个反应孔中，反应体系：

SEQ ID No.49至SEQ ID No.64至少一种延伸引物作为分子探针mix 0.94μL，

Gold×Buffer 0.2μL，

Extension mix 0.1μL，

iPLEX Enzyme 0.0205μL，

ddH₂O 0.7395μL；

其中，Extension mix可以是ddNTP，也可以是荧光dNTP。

反应体系配制好后使用PCR封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于ABI9700PCR仪上反应，反应条件：94℃预变性30s，然后进行(94℃变性5s→(52℃退火5s→80℃延伸5s)×5个内循环)×40个外循环，72℃保温3min，最后提升将温度提升至94℃，然后迅速置于0℃的冰水中，获得第三反应液。4℃保持第三反应液，离心备用。

对第三反应液进行树脂纯化，获得分子标记。利用Agena平台配套试剂和操作步骤。将第三反应液的384孔板，轻轻撕下封口膜后，每孔加入16μL ddH2O；取干净的A4纸将6MG 384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂；用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6MG 384板上，两板对调，6MG板在上，敲打6MG板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封口膜封好后，15rpm上下颠倒混匀30min，充分纯化，获得带有SNP生物信息的分子标记。分子标记是由SEQ ID No.49至SEQ ID No.64中任意一条序列与ddNTP或者荧光dNTP之中A、C、G或者T组成的。

对携带有SNP生物信息的分子标记进行飞行时间质谱分析。离心带有分子标记的384孔板，启动

MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将经树脂纯化后的分子标记移至384孔SpectroCHIP芯片上；点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果。

分子标记经飞行质谱时，如果SEQ ID No.49至SEQ ID No.64没有发生单碱基延伸，那么飞行时间质谱仪根据SEQ ID No.49至SEQ ID No.64各自质量给出第一特征峰。如果SEQ ID No.49至SEQ ID No.64发生单碱基延伸生成SNP分子标记，并且由于投入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP或者荧光dATP、荧光dCTP、荧光dGTP、荧光dTTP的质量不同，那么飞行时间质谱仪根据带有SNP标记的SEQ ID No.49至SEQ ID No.64分子标记的质量给出各自的特征峰。通过碱基互补配对原则和获取分子标记特征峰，判断CYP1A2基因rs762551是否由C变为A、rs2069514位点由G变为A，CYP2D6基因rs1058164由G变为C、rs1065852由G变为A、rs1135840位点由G变为C，CYP2C19基因rs4244285位点由G变为A，CYP3A5基因rs776746位点由C变为T，DRD2基因rs1079597由C变为T、rs1799978由T变为C、rs1800497位点由G变为A，FKBP5基因rs1360780位点由T变为C，HTR2A基因rs7997012位点由A变为G，MC4R基因rs489693位点由C变为A，NAT2基因rs1041983由C变为T、rs1799930位点由G变为A，UGT2基因rs1902023位点由A变为C是否发生变异。

另一种方法是将第二反应液均分成四份，分别用荧光dATP、荧光dCTP、荧光dGTP、荧光dTTP进行标记，或者分别用ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP进行标记；得到分子标记。然后采用聚丙烯酰胺电泳或者毛细管理电泳分析分子标记。以聚丙烯酰胺电泳为例,将用带有荧光dATP、荧光dCTP、荧光dGTP、荧光dTTP分子标记分别置于第一A、C、G、T四个泳道，将SEQID No.49至SEQ ID No.64泳道置于分别置于1至16号泳道，进行电泳，比较泳道位置读取上述各位点的生物信息。

对分子标记进行飞行时间质谱分析和电泳分析之间可以相互印证。因此，对分析结果更有把握。

对SEQ ID No.33至SEQ ID No.48任意基因进行染色或者用荧光素进行修饰作为电泳检测试剂，所述的荧光素可以是Indodicarbocyanine、Indodicarbocyanine、或者6-carboxy-fluorescein。因此，SEQ ID No.33至SEQ ID No.48任意基因可以作为基因检测试剂应用。这样经荧光素修饰后的SEQ ID No.33至SEQ ID No.48能够为聚丙烯酰胺电泳检测方法或者毛细管电泳检测方法提供新型对比试剂。对新的对比试剂，可以提供飞行时间质谱分析以保障其可以有把握地使用，这样就为模拟基因的体内化学反应提供了新的手段。

一种抗精神疾病药的筛选方法，用与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别获得的碱基类型生物信息，在建立体外药效模型时，指导正确地选择所有药品试剂。

SEQ ID No.1至SEQ ID No.32可以通过上海生工所购买。

SEQ ID No.49至SEQ ID No.64可以通过上海生工所购买。

SEQ ID No.33至SEQ ID No.48可以依照说明书制备。

Claims

1.与抗精神疾病药相关的试剂盒，其特征在于，至少装有一对寡核苷酸，所述一对寡核苷酸是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2,SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6,SEQ ID No.7和SEQ ID No.8,SEQ ID No.9和SEQ ID No.10,SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12,SEQ ID No.13和SEQ ID No.14,SEQ ID No.15和SEQ ID No.16,SEQ ID No.17和SEQID No.18,SEQ ID No.19和SEQ ID No.20,SEQ ID No.21和SEQ ID No.22,SEQ ID No.23和SEQ ID No.24,SEQ ID No.25和SEQ ID No.26,SEQ ID No.27和SEQ ID No.28,SEQ IDNo.29和SEQ ID No.30,或SEQ ID No.31和SEQ ID No.32。

2.与抗精神疾病药相关的目标基因，其特征在于，包括SEQ ID No.33至SEQ ID No.48中至少一条基因。

3.与抗精神疾病药相关的目标基因的制备，其特征在于，包括对提取自人体的DNA样本用权利要求1所述与抗精神疾病药相关的试剂盒进行PCR扩增生成第一反应液的步骤。

4.与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的标记，其特征在于，包括权利要求3所述与抗精神疾病药相关的目标基因的制备步骤，对所述第一反应液进行SAP消化得到第二反应液的步骤，对所述第二反应液分别用ddNTP或者荧光dNTP配合探针进行单碱基延伸反应获得带有分子标记的第三反应液的步骤。

5.与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，其特征在于，包括权利要求4所述与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的标记步骤，对所述第三反应液进行分离获取所述分子标记的步骤。

6.根据权利要求5所述与抗精神疾病药相关的目标基因的SNP识别，其特征在于，包括对所述分子标记进行飞行时间质谱分析的步骤。

7.与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，其特征在于，包括权利要求4所述与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的标记步骤，对所述第三反应液、探针分别放置于样品、对照组泳道进行电泳的步骤。

8.根据权利要求7所述与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别，其特征在于，包括用权利要求7所述与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别进行评价的步骤。

9.SEQ ID No.33至SEQ ID No.48中任意一种基因作为精神疾病症基因电泳检测的对比试剂。

10.一种抗精神疾病药的筛选方法，其特征在于，包括权利要求6或者7所述与抗精神疾病药相关的目标基因SNP的识别步骤。