CN105506095A

CN105506095A - 一种检测cyp2d6基因多态性的引物与方法

Info

Publication number: CN105506095A
Application number: CN201511006952.5A
Authority: CN
Inventors: 梁耀铭; 于世辉; 赵薇薇; 燕启江; 胡昌明; 罗锦霞
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Technology Co ltd
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测CYP2D6基因多态性的引物与方法。本发明提供的CYP2D6基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物。本发明提供的CYP2D6基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了CYP2D6基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降低不良反应具有非常重要的意义。

Description

一种检测CYP2D6基因多态性的引物与方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测CYP2D6基因多态性的引物与方法。

背景技术

CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22号染色体上，其含有9个外显子和8个内含子，总长为7kb左右，是一个完整的功能性基因。有研究发现，CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P基因与CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性，而且带有TATA盒，但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶（T），从而改变了读码框架，使转录提前终止；CYP2D8P基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达，只有CYP2D6在肝、肠、肾和人脑中表达。

现代研究发现，肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2%，但是，它却参与代谢约25%的临床用药，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要是单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及多基因拷贝，这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其代谢表型的多样性，使酶的活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型。

杨汐等人发表了一篇题目为“CYP2D6基因多态性与他莫昔芬治疗”的论文，该论文表明不同基因型的CYP2D6对他莫昔芬的代谢不同，产生的活性代谢产物(4-羟基他莫昔芬和 Endoxifen)浓度不同，其中PMs(含两个无效等位基因致CYP2D6活性缺失) 血浆中活性代谢产物浓度最低，而UMs(含两个以上正常功能等位基因，即多基因拷贝致CYP2D6活性增强)血浆活性代谢产物浓度最高。因此，CYP2D6的多态性研究对临床具有重要的意义，成为目前研究的热点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测CYP2D6基因多态性的引物与方法，该引物检测CYP2D6基因C2850T (rs16947)、CYP2D6基因G3183A (rs59421388)、CYP2D6基因G1846A (rs3892097)、CYP2D6基因G4180C (rs1135840)、CYP2D6基因C100T(rs1065852)、CYP2D6基因G1661C (rs1058164)位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性高等优点，为CYP2D6基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。

本发明提供了一种检测CYP2D6基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5’- CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’（SEQ ID NO.1）和下游引物5’- CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3’（SEQ ID NO.2）；所述巢式B轮PCR扩增引物包括：针对CYP2D6_C2850T的上游引物5’- GCTCACGCTGCACATCCGGA-3’（SEQ IDNO.3）和下游引物5’-GGGCAAGGGTGGTGGGTTGA -3’（SEQ ID NO.4），针对CYP2D6_G3183A的上游引物5’-CATAGGAGGCAAGAAGGAGTGTC-3’（SEQ ID NO.5）和下游引物5’-TTCGATGTCACGGGATGTCA -3’（SEQ ID NO.6），针对CYP2D6_G1846A的上游引物5’-CGCAGGTGAGGGAGGCGATC-3’（SEQ ID NO.7）和下游引物5’-AGGGTTGGAGTGGGTGGTGG -3’（SEQID NO.8），针对CYP2D6_G4180C的上游引物5’-GCAGCACTTCAGCTTCTCG -3’（SEQ ID NO.9）和下游引物5’-TACCCCTGTCTCAAATGCG -3’（SEQ ID NO.10），针对CYP2D6_C100T的上游引物5’-CAGAGGAGCCCATTTGGTAG -3’（SEQ ID NO.11）和下游引物5’-CCTGGTCGAAGCAGTATGGT-3’（SEQ ID NO.12），针对CYP2D6_G1661C的上游引物5’- CGCAGGTGAGGGAGGCGATC-3’（SEQ IDNO.13）和下游引物5’-AGGGTTGGAGTGGGTGGTGG -3’（SEQ ID NO.14）；所述SNaPshot PCR引物包括：针对CYP2D6_C2850T的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC-3’（SEQ ID NO.15），针对CYP2D6_G3183A的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCCAACAGGAGATCGACGAC-3’（SEQ ID NO.16），针对CYP2D6_G1846A的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGCATCTCCCACCCCCA-3’（SEQ ID NO.17），针对CYP2D6_G4180C的SNaPshot PCR引物5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3’（SEQ ID NO.18），针对CYP2D6_C100TSNaPshot PCR引物5’- ACGCTGGGCTGCACGCTAC-3’（SEQ ID NO.19），针对CYP2D6_G1661C的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT-3’（SEQ ID NO.20）。

进一步地，所述巢式B轮PCR扩增引物中，CYP2D6_C2850T、CYP2D6_G3183A、CYP2D6_G1846A、CYP2D6_G4180C、CYP2D6_C100T和CYP2D6_G1661C的引物浓度比为1：1：1：1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，CYP2D6_C2850T、CYP2D6_G3183A、CYP2D6_G1846A、CYP2D6_G4180C、CYP2D6_C100T和CYP2D6_G1661C的引物浓度比为10:1:10:10:10:10。

另外，本发明还提供了一种检测CYP2D6基因多态性的方法，包括如下步骤：

S1提取DNA样品；

S2采用权利要求1或2中所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对巢式A轮PCR扩增产物进行纯化；

S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1或2中所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重PCR扩增；

S4采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；

S5毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。

进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。

进一步地，所述步骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：72℃ 3min；阶段4：返回到阶段2，24个循环；阶段5：72℃ 5min；阶段6：25℃ 保温。

进一步地，所述步骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

进一步地，所述步骤S4中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。

进一步地，所述步骤S5中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。

除此之外，本发明提供的CYP2D6基因多态性的引物在制备检测CYP2D6基因多态性试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供了一种检测CYP2D6基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了CYP2D6基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降低不良反应具有非常重要的意义。

附图说明

图1- 图5分别为本发明提供的CYP2D6_C2850T，CYP2D6_G3183A，CYP2D6_G4180C，CYP2D6_C100T，CYP2D6_G1846A/CYP2D6_G1661C的扩增片段；

图6-图11分别为CYP2D6_C2850T，CYP2D6_G3183A，CYP2D6_G4180C，CYP2D6_C100T，CYP2D6_G1846A/CYP2D6_G1661C引物扩增产物的部分测序图；

图12为样品的CYP2D6基因多态性检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一、引物

本发明提供的引物如表1所示，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物，所述巢式B轮PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。

表1 本发明提供的引物

实施例二、引物的特异性

将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：

1)CYP2D6基因特异引物于UCSC中进行Blast，无其它同源基因。2）CYP2D6_C2850T扩增片段位于chr22:42127836+42128150，长度为315bp，扩增序列如图1；CYP2D6_G3183A扩增片段位于chr22:42127471-42127709，长度为239bp，扩增序列如图2；CYP2D6_G4180C扩增片段位于chr22:42126391-42126685，长度为295bp，扩增序列如图3；CYP2D6_C100T扩增片段位于chr22:42130611-42130821，长度为211bp，扩增序列如图4；CYP2D6_G1846A/CYP2D6_G1661C扩增片段位于chr22:42128876+42129258，长度为383bp，扩增序列如图5。

使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与CYP2D6基因参考序列吻合，结果如图6-图11所示。使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图12所示。从图12可知，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。

实施例三、CYP2D6基因多态性的检测

1）提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。

2）配制引物混合物：配制巢式A轮PCR引物混合物，CYP2D6-Fwd:CYP2D6-Rev:H2O=1:1:3，引物终浓度为1 pmol/μL，震荡混匀，短暂离心后备用；配制B轮PCR引物混合物，将5对引物如下，CYP2D6_C2850T-Fwd/CYP2D6_C2850T-Rev，CYP2D6_C100T-Fwd/CYP2D6_C100T-Rev，CYP2D6(1661/1846)-Fwd/CYP2D6(1661/1846)-Rev，CYP2D6_G3183A-Fwd/CYP2D6_G3183A-Rev，CYP2D6_G4180C-Fwd/CYP2D6_G4180C-Rev等体积混合，引物终浓度为0.5pmol/μL；短暂离心后备用；PCR扩增采用Q5^™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示。A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃10s；阶段3：72℃ 3min；阶段4：返回到阶段2，24个循环；阶段5：72℃ 5min；阶段6：25℃ 保温。巢式B轮PCR以A轮PCR产物为模板，巢式B轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。PCR扩增结束后，取2.0μL ExoSAP-IT（购自Affymetrix，货号78205）和3.0μL ddH₂O，混匀，加入PCR扩增产物2.0μL，混匀微离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：37℃，15 min；80℃，15min；4℃，保温。

表2、PCR试剂配制表格

3）配置SNaPshot PCR引物混合物，SNECYP2D6-100C>T:SNE-CYP2D6-2850C>T:SNE-CYP2D6_3183G>A:SNE-CYP2D6-1661G>C:SNE-CYP2D6-1846G>A:SNE-CYP2D6_4180G>C=10:10:1:10:10:10，引物终浓度为0.8 pmol/μL，SNE-CYP2D6_3183G>A探针终浓度为0.08pmol/μL，采用SNaPshot^®Multiplex Kit（购自ABI 公司，货号4323151）进行扩增，反应体系如表3所示。SNaPshot PCR反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。

表3、SNaPshot试剂配制表格

在SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，15min；80℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERIDV4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图12所示。

实施例四、检测CYP2D6基因多态性的方法的特异性

本发明方法的特异性定义为阴性符合率。本发明对22例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果与Sanger法显示的结果相符(见表4-表9）。本发明的检测特异性为100%。

表4、CYP2D6 C2850T位点检测特异性试验数据

表5、CYP2D6 G3183A位点检测特异性试验数据

表6、CYP2D6 G1846A位点检测特异性试验数据

表7、CYP2D6 G4180C位点检测特异性试验数据

表8、CYP2D6 C100T位点检测特异性试验数据

表9、CYP2D6 G1661C位点检测特异性试验数据

实施例五、检测CYP2D6基因多态性的方法的灵敏度

本发明方法的灵敏度定义为阳性符合率。本发明对22例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger法显示的结果相符(见表10-表15），CYP2D6 G3183A位点尚未检测到阳性标本。本发明的检测灵敏度为100%。

表10、CYP2D6 C2850T位点检测灵敏度

表11、CYP2D6 G3183A位点检测灵敏度

表12、CYP2D6 G1846A位点检测灵敏度

表13、CYP2D6 G4180C位点检测灵敏度

表14、CYP2D6 C100T位点检测灵敏度

表15、CYP2D6 G1661C位点检测灵敏度

实施例六、检测CYP2D6基因多态性的方法的准确度

本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对22例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。不同方法检测结果一致，如表16所示。本发明的准确度为100%。

表16、CYP2D6基因6SNPs位点检测准确度

实施例七、检测CYP2D6基因多态性的方法的精密度

本发明的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。本发明进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验(见表17和表18)，所有结果均显示一致，本发明精密度为100%。

表17、批间精密度实验数据

表18、批内精密度实验数据

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州金域检测科技股份有限公司

<120> 一种检测CYP2D6基因多态性的引物与方法

<130> 20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccagaaggct ttgcaggctt ca 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgagccctg ggaggtaggt ag 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctcacgctg cacatccgga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggcaagggt ggtgggttga 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cataggaggc aagaaggagt gtc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcgatgtca cgggatgtca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcaggtgag ggaggcgatc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agggttggag tgggtggtgg 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcagcacttc agcttctcg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tacccctgtc tcaaatgcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaggagcc catttggtag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctggtcgaa gcagtatggt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcaggtgag ggaggcgatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agggttggag tgggtggtgg 20

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttttttttt ttttcaggtc agccaccact atgc 34

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tttttttttt ttttttttgt ccaacaggag atcgacgac 39

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttc cgcatctccc accccca 57

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttacca tggtgtct 48

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgctgggct gcacgctac 19

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttttttttt tttttttttt tttttcgagc agaggcgctt ctccgt 46

Claims

1.一种检测CYP2D6基因多态性的引物，其特征在于：包括巢式PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5’- CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’和下游引物5’- CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3’；所述巢式B轮PCR扩增引物包括：针对CYP2D6_C2850T的上游引物5’- GCTCACGCTGCACATCCGGA-3’和下游引物5’-GGGCAAGGGTGGTGGGTTGA -3’，针对CYP2D6_G3183A的上游引物5’-CATAGGAGGCAAGAAGGAGTGTC-3’和下游引物5’-TTCGATGTCACGGGATGTCA -3’，针对CYP2D6_G1846A的上游引物5’- CGCAGGTGAGGGAGGCGATC-3’和下游引物5’-AGGGTTGGAGTGGGTGGTGG -3’，针对CYP2D6_G4180C的上游引物5’-GCAGCACTTCAGCTTCTCG -3’和下游引物5’-TACCCCTGTCTCAAATGCG -3’，针对CYP2D6_C100T的上游引物5’-CAGAGGAGCCCATTTGGTAG -3’和下游引物5’-CCTGGTCGAAGCAGTATGGT-3’，针对CYP2D6_G1661C的上游引物5’- CGCAGGTGAGGGAGGCGATC-3’和下游引物5’-AGGGTTGGAGTGGGTGGTGG -3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对CYP2D6_C2850T的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC-3’，针对CYP2D6_G3183A的SNaPshotPCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCCAACAGGAGATCGACGAC-3’，针对CYP2D6_G1846A的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGCATCTCCCACCCCCA-3’，针对CYP2D6_G4180C的SNaPshot PCR引物5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3’，针对CYP2D6_C100TSNaPshotPCR引物5’- ACGCTGGGCTGCACGCTAC-3’，针对CYP2D6_G1661C的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT-3’。

2.根据权利要求1所述的检测CYP2D6基因多态性的引物，其特征在于：所述巢式B轮PCR扩增引物中，CYP2D6_C2850T、CYP2D6_G3183A、CYP2D6_G1846A、CYP2D6_G4180C、CYP2D6_C100T和CYP2D6_G1661C的引物浓度比为1：1：1：1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，CYP2D6_C2850T、CYP2D6_G3183A、CYP2D6_G1846A、CYP2D6_G4180C、CYP2D6_C100T和CYP2D6_G1661C的引物浓度比为10:1:10:10:10:10。

3.一种检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1提取DNA样品；

S2采用权利要求1或2中所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对A轮PCR扩增产物进行纯化；

4.根据权利要求3所述的检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。

5.根据权利要求3所述的检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：72℃ 3min；阶段4：返回到阶段2，24个循环；阶段5：72℃ 5min；阶段6：25℃ 保温。

6.根据权利要求3所述的检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

7.根据权利要求3所述的检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S4中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。

8.根据权利要求3所述的检测CYP2D6基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S5中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。

9.根据权利要求1或2所述的CYP2D6基因多态性的引物在制备检测CYP2D6基因多态性试剂中的用途。