CN104988223A - 同时检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物与方法 - Google Patents

同时检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物与方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现VKORC1和CYP2C9基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。

Description

同时检测 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的引物与方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物与方法。
背景技术
目前已发现的CYP2C9等位基因有30种，其中以CYP2C9*l(野生型)、CYP2C9*2(c.430C>T，Argl44Cys，rs1799853)、CYP2C9*3(c.1075A>C，Ile359Leu，rs1057910)最为常见。
CYP2C9*2和CYP2C9*3基因频率在不同人种和不同民族之间差异较大，在中国人群中的等位基因频率远远低于白种人。研究表明，CYP2C9基因突变状态与华法林类药物临床用药敏感性及毒性关系密切，携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明显低于野生型，并且其出血的危险性增加2-3倍，CYP2C9*1/*3和CYP2C9*3/*3患者与野生型患者相比，华法林用药分别要减少33.7%和78.1%。
维生素K环氧化物还原酶(VKOR)能够促进一系列级联反应引起血液凝固。VKOR主要由VKORC1基因编码，其活性与VKORC1 多态性位点关系密切。VKORC1启动子区域-1639 位G>A变异导致其启动子活性不同。VKORC1 GG和AG基因型与AA基因型相比，GG和AG基因型由于其启动子活性高，VKORC1 mRNA表达增加，VKORC1蛋白也相应增加，引起VKORC1活性增高，从而凝血因子生成较多。
中国专利申请201310533548.8公开了一种用于CYP2C9和VKORC1基因芯片检测的特异性引物对和探针，但基因芯片的设计成本高，检测费用昂贵。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、可实现多个位点同时检测的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测引物及其方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物与方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了VKORC1、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的同时检测。本发明同时检测的位点包括VKORC1(-1639G>A，rs9923231)、CYP2C9*2(430C>T，Argl44Cys，rs1799853)以及CYP2C9*3(1075A>C，Ile359Leu，rs1057910)。
本发明提供一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对VKROC1-1639G>A的上游引物5’-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物5’-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3’(SEQ ID NO.2)，针对CYP2C9*2的上游引物5’- CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3’(SEQ ID NO.3)和下游引物5’-CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG -3’(SEQ ID NO.4)以及针对CYP2C9*3的上游引物5’-CAGGAAGAGATTGAACGTGTGAT-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物5’-TAATGTCACAGGTCACTGCATGG -3’(SEQ ID NO.6)；所述SNaPshot PCR引物包括：针对VKROC1-1639G>A的SNaPshot PCR引物5’-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3’(SEQ ID NO.7)，针对CYP2C9*2的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGGAC-3’(SEQ ID NO.8)以及针对CYP2C9*3的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3’
(SEQ ID NO.9)。
采用上述技术方案，本发明提供的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，可以实现VKORC1和CYP2C9基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。
优选地，所述PCR扩增引物中，VKROC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，VKROC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1。
相应地，本发明还提供一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C）采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D）毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
优选地，述步骤B）中的多重PCR扩增反应条件包括：Step 1: 98℃ for 3min；Step 2: 98℃for 10 s；Step 3: 58℃ for 30s；Step 4: 72℃ for 1min；Step 5: Go to step 2，29 times；Step 6: 72℃ for 5min；Step 7: 25℃ forever。
优选地，所述步骤C）中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：Step 1: 96℃for 10s；Step 2: 55℃for 5 s；Step 3: 60℃for 30s；Step 4: Go to step 1，25 times；Step 5: 4℃forever。
优选地，所述步骤D）中，采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
此外，本发明还提供同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物在制备检测VKORC1和CYP2C9基因多态性试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了VKORC1、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的同时检测，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为华法林的临床用药提供指导。
附图说明
图1 本发明提供的VKORC1和CYP2C9基因引物的扩增片段。
图2 VKORC1和CYP2C9基因引物扩增产物的部分测序图。
图3 样品的VKORC1和CYP2C9基因多态性检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一 引物
发明人针对VKORC1和CYP2C9的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且PCR反应条件非常接近的引物。本发明提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。针对VKROC1-1639G>A，上游引物为5’-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物为5’-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3’(SEQ ID NO.2)，SNaPshot PCR引物为5’-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3’(SEQ ID NO.7)。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
实施例二 引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：VKORC1-1639G>A扩增片段位于chr16: 31107523-31107812，长度为290bp；CYP2C9*2扩增片段位于chr10:96701959-96702133间，长度为 175bp；CYP2C9*3扩增片段位于chr10:96740948-96741101，长度为154bp；结果如图1所示，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点：VKORC1 -1639G>A、CYP2C9*2及CYP2C9*3，无其它同源基因。
使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与VKORC1及CYP2C9基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
实施例二 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的检测
提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
配制PCR扩增引物混合物，VKROC1-1639G>A、 CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1，VKROC1-1639G>A的引物浓度为5pmol/uL，震荡混匀，PCR扩增采用Q5™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示。多重PCR扩增反应条件包括：Step 1: 98℃ for 3min；Step 2: 98℃for 10 s；Step 3: 58℃ for 30s；Step 4: 72℃ for 1min；Step 5: Go to step 2，29 times；Step 6: 72℃ for 5min；Step 7: 25℃ forever。PCR扩增结束后，取2.0μL ExoSAP-IT（购自Affymetrix，货号78205）和3.0μL ddH2O，混匀，加入PCR扩增产物2.0μL，混匀微离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：37℃，15 min；80℃，15min；4℃，保温。
配置SNaPshot PCR引物混合物，VKROC1-1639G>A、 CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1，VKROC1-1639G>A的引物浓度为5pmol/uL，震荡混匀，采用SNaPshot® Multiplex Kit（购自ABI 公司，货号4323151）进行扩增，反应体系如表3所示。SNaPshot PCR反应条件包括：Step 1: 96℃for 10s；Step 2: 55℃for 5 s；Step 3: 60℃for 30s；Step 4: Go to step 1，25 times；Step 5: 4℃forever。
在SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，60min；75℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
实施例三 检测 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的方法的特异性
本检测方法的特异性定义为阴性符合率。VKORC1 -1639 A/A基因型占绝大部分(82.1%)，VKORC1-1639 A/G基因型占17.9%，CYP2C9*2 430 C/C基因型占绝大部分，CYP2C9*3 1075A/A基因型占绝大部分。因此，本检测将VKORC1 -1639 A/A基因型的检出定义为阴性结果，CYP2C9*2 430 C/C基因型的检出定义为阴性结果，CYP2C9*3 1075 A/A基因型的检出定义为阴性结果。
采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品进行检测，同时采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出无突变(阴性)的样品共9例，与Sanger测序法显示的结果相符，如表4所示。本检测方法的特异性为100%。
实施例四 检测 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的方法的灵敏度
本检测方法的灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品进行检测，同时采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出突变(阳性)的样品共9例，与Sanger测序法结果相符，如表5所示。本检测方法的灵敏度高。
以CYP2C9*3位点为例验证本检测方法的检测下限。使用CYP2C9*3 C/C基因型样本(纯合突变型)与A/A基因型样本(野生型)分别按1：9，2：8，3：7，4：6，5：5比例混合后进行检测，结果如表6所示。结果显示，突变型与野生型比例为1:9(突变型比例为10%)时本检测方法也能检测到突变型。CYP2C9*3多态性为胚系突变，在杂合基因型A/C中突变等位基因为50%，因此，本检测方法的检测灵敏度100%。
实施例五 检测 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的方法的准确度
本检测方法的准确度定义为不同方法检测结果的一致性。18例样品经SNaPshot法和Sanger测序法，不同方法检测结果一致，如表7所示。本检测方法的准确度为100%。
实施例六 检测 VKORC1 和 CYP2C9 基因多态性的方法的精密度
本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表8a和8b所示，所有结果均显示一致，本检测精密度为100%。其中，位点1：VKORC1-1639G>A；位点2：CYP2C9*2 430C>T；位点3：CYP2C9*3 1075A>C。
因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了VKORC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3进行准确分型鉴定问题，发挥PCR-SNaPshot PCR对所述基因位点基因分型结果精确、高通量操作的特点，可以对华法林的个体化用药起到很大的指导作用，减少华法林的不良反应。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域医学检验中心有限公司、广州医科大学
<120> 同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物与方法
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> VKROC1-1639G>A_F
gccagcagga gagggaaata 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> VKROC1-1639G>A_R
agtttggact acaggtgcct 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*2_F
cagcaatgga aagaaatgga agg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*2_R
cagtaaggtc agtgatatgg agtag 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*3_F
caggaagaga ttgaacgtgt gat 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*3_R
taatgtcaca ggtcactgca tgg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> VKROC1-1639G>A
ataggcgtga gccaccgcac c 21
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*2
tttttttttg gaagaggagc attgaggac 29
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> CYP2C9*3
tttttttttt tttttttttg gctggtgggg agaaggtcaa 40

Claims (8)

1.一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对VKROC1-1639G>A的上游引物5’-GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3’和下游引物5’-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3’，针对CYP2C9*2的上游引物5’- CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3’和下游引物5’-CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG -3’以及针对CYP2C9*3的上游引物5’-CAGGAAGAGATTGAACGTGTGAT-3’和下游引物5’-TAATGTCACAGGTCACTGCATGG -3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对VKROC1-1639G>A的SNaPshot PCR引物5’-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3’，针对CYP2C9*2的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGGAC-3’以及针对CYP2C9*3的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3’。
2.根据权利要求1所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其特征在于：所述PCR扩增引物中，VKROC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，VKROC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓度比为1：1：1。
3.一种同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C）采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D）毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
4.根据权利要求3所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
5.根据权利要求3所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤B）中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
6.根据权利要求3所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤C）中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
7.根据权利要求3所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤D）中，采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
8.根据权利要求1或2所述的同时检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物在制备检测VKORC1和CYP2C9基因多态性试剂中的用途。
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