CN103820553A - 用于指导华法林个体化用药的多重pcr联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法 - Google Patents
用于指导华法林个体化用药的多重pcr联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法，涉及华法林。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述检测方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。通过检测影响华法林个体剂量差异的最主要因素，即VKORC1和CYP2C9的重要基因多态性位点，具体为VKORC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3，达到指导需要服用华法林者使用个体化剂量进行治疗，以降低副作用的目的。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检验领域，涉及华法林，尤其涉及一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法。
背景技术
华法林是一种双香豆素衍生物，华法林通过抑制维生素K及其2，3-环氧化物(维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。虽为最古老的口服抗凝药物，华法林仍然是目前需要长期抗凝治疗患者的最常用药物[1]。华法林的临床应用包括静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动(房颤)血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成的预防等[2,3]。非瓣膜病房颤研究荟萃分析显示，华法林可使卒中的相对危险度降低64％，全因死亡率显著降低26％[4]。但是，华法林临床应用存在有效血药浓度范围狭窄和个体间稳定剂量差异显著（不同患者个体间剂量差异可达数十倍）两大问题。这两个问题直接导致出血或血栓形成等副作用的发生：在美国，华法林的致死性副反应一度居所有药物之首[5]。
造成华法林个体剂量差异的原因包括非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要指身高、年龄、体重、饮食、药物相互作用等，非遗传因素是华法林用药剂量差异的次要原因。遗传因素是影响华法林个体剂量差异的关键因素。其中最重要的遗传因素为与华法林药效动力学和药代动力学相关的酶或靶蛋白的基因发生变异导致此关键酶或靶蛋白的含量或活性的变化，进而增强或降低华法林的敏感性，影响到华法林的剂量。
华法林代谢的关键酶为细胞色素P450超家族的第二亚家族的CYP2C9蛋白，该酶将华法林代谢为无活性成分，并且已知CYP2C9基因单核苷酸多态性对华法林用药剂量的个体差异有显著影响[6]。CYP2C9包含CYP2C9*1—CYP2C9*15等多种基因型，而其中的CYP2C9*2（rs1799853）和CYP2C9*3（rs1057910）基因型对华法林代谢影响最大。例如，CYP2C9*3的1075A>C突变导致该酶359位氨基酸由异亮氨酸变为亮氨酸，酶活性失活（突变型酶活性仅为野生型5%），导致华法林的清除率低于正常，血药浓度升高。因此，此类人群需要降低临床用药剂量，以防止药物过量导致的出血等不良反应的发生。华法林作用的靶蛋白为维生素K还原酶复合物（VKORC），该酶正常的生理功能为将环氧化形式的维生素K转化为氢醌形式，后者则在维生素K依赖的凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活化中起重要作用。同样的，编码VKORC蛋白的VKORC1基因的SNP多态性也会导致VKORC酶的活性改变，进而影响到华法林的抗凝效果，并且在亚洲人群VKORC1对华法林剂量的影响更为重要，可达16—30%[7]。其中又以VKORC1基因启动子区-1639G>A（rs9923231，也被称为VKORC1*2基因型）最为重要，G基因型比A基因型的酶活性高40%，因此A基因型突变时华法林剂量较G基因型要低。
可见CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多态性是影响华法林个体剂量差异的主要因素。而且基于这些基因多态性位点的检测以分层用药剂量或联合患者的身高、体重等信息做的剂量预测方程预测具体剂量以在有检测条件的发达国家和地区应用，并表现了优于传统固定剂量给药方式的高疗效和低副作用[8,9]。目前检测上述华法林个体化剂量相关基因多态性的方法较多，包括实时荧光PCR法、限制性内切酶片段多态性分析（RFLP）、基因芯片、Sanger测序法、普通PCR联合电泳分析等等，但是这些方法存在灵敏度不够、耗时、交叉污染和成本昂贵等问题。
焦磷酸测序技术是基于实时反应、边合成边测序的新型核酸序列分析技术，该技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行华法林个体化治疗剂量相关基因多态性检测试剂盒的开发和应用。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法。
所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒包括：
（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB等。
（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：
PCR引物1（Seq NO1）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）上游引物5’-GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）下游引物5’-GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C9*2（rs1799853）上游引物5’-TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C9*2（rs1799853）下游引物5’-CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’；
PCR引物5（Seq NO5）：
CYP2C9*3（rs1057910）上游引物5’-TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’；
PCR引物6（Seq NO6）：
CYP2C9*3（rs1057910）下游引物5’-GGGGACTTCGAAAACATGG-3’；
其中引物2、引物4、引物5的5’端均进行生物素标记。
（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR MasterMix”，来自德国QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit试剂盒。具体成分主要包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution。
（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂，主要包括购自美国通用健康公司GE Healthcare的高性能链霉亲和素琼脂糖和购自德国QIAGEN公司的PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液。
（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：
测序引物1（Seq NO7）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）测序引物5’-CCTGAAAAACAACCATTG-3’；
测序引物2（Seq NO8）：
CYP2C9*2（rs1799853）测序引物5’-GAGGAGCATTGAGGAC-3’；
测序引物3（Seq NO9）：
CYP2C9*3（rs1057910）测序引物5’-TGGGGAGAAGGTCAA-3’。
（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，购自德国QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐。
（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序的检测方法，采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，包括如下步骤：
（1）人类全血基因组DNA提取：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质。
（2）多重PCR扩增反应：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示。
表1多重PCR扩增反应体系
表2多重PCR扩增反应条件
（3）单链DNA样本分离和纯化：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70%乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本。
（4）焦磷酸测序与结果分析：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1、测序引物2和测序引物3中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMarkQ24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和四种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行AQ模式进行结果分析。
本发明所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒整合从DNA提取到焦磷酸测序四个步骤的所有试剂成份，利于商品化生产和临床应用推广。PCR引物1～6和测序引物1～3为发明的试剂盒的关键成份，能够保证多重PCR反应时无交叉干扰，同时生成3种扩增产物，分别为VKORC1基因扩增产物片段252bp，CYP2C9*2基因型扩增产物228bp，CYP2C9*3基因型扩增产物234bp；测序能对VKORC1-1639G>A（rs9923231）野生型序列（Seq NO10）GCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATC和突变型序列（SeqNO11）GCCAGGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATC、CYP2C9*2（rs1799853）野生型序列（SeqNO12）CGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCT和突变型序列（Seq NO13）TGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCT和CYP2C9*3（rs1057910）野生型序列（Seq NO14）TGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACC和突变型序列（Seq NO15）TGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACA进行分析。如何进行华法林个体化剂量治疗降低出血等毒副作用提高抗凝有效性和安全性仍是目前临床急需解决的难题，而这一发明的实际应用就是应用到临床上指导华法林个体化治疗。与现有方法相比较，多重PCR扩增核酸可达到降低实验成本的目的；焦磷酸测序技术应用于短序列已知突变位点的检测具有快速、准确、可高通量等优点。
本发明主要通过检测影响华法林个体剂量差异的最主要因素，即VKORC1和CYP2C9的重要基因多态性位点，具体为VKORC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3，达到指导需要服用华法林者使用个体化剂量进行治疗，以降低副作用的目的。
附图说明
图1为本发明所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒实施例的结构结成示意图。
图2为本发明VKORC1基因扩增产物熔解曲线图。
图3为本发明CYP2C9*2基因型扩增产物熔解曲线图。
图4为本发明CYP2C9*3基因型扩增产物熔解曲线图。
图5为本发明VKORC1-1639G>A（rs9923231）野生型纯合子焦磷酸测序结果图。
图6为本发明VKORC1-1639G>A（rs9923231）突变杂合子焦磷酸测序结果图。
图7为本发明VKORC1-1639G>A（rs9923231）突变纯合子焦磷酸测序结果图。
图8为本发明CYP2C9*2（rs1799853）野生型纯合子焦磷酸测序结果图。
图9为本发明CYP2C9*3（rs1057910）野生型纯合子焦磷酸测序结果图。
图10为本发明CYP2C9*3（rs1057910）突变杂合子焦磷酸测序结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
参见图1，本发明所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒实施例设有盒体1、全血基因组DNA提取试剂2、多重PCR扩增引物3、多重PCR扩增反应试剂4、单链DNA分离和纯化试剂5、焦磷酸测序引物6、焦磷酸测序试剂7，全血基因组DNA提取试剂2、多重PCR扩增引物3、多重PCR扩增反应试剂4、单链DNA分离和纯化试剂5、焦磷酸测序引物6、焦磷酸测序试剂7设在盒体1内。
实施例1
试剂盒关键的引物成分和序列如下：
PCR引物1（Seq NO1）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）上游引物5’-GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）下游引物5’-GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C9*2（rs1799853）上游引物5’-TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C9*2（rs1799853）下游引物5’-CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’；
PCR引物5（Seq NO5）：
CYP2C9*3（rs1057910）上游引物5’-TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’；
PCR引物6（Seq NO6）：
CYP2C9*3（rs1057910）下游引物5’-GGGGACTTCGAAAACATGG-3’；
测序引物1（Seq NO7）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）测序引物5’-CCTGAAAAACAACCATTG-3’；
测序引物2（Seq NO8）：
CYP2C9*2（rs1799853）测序引物5’-GAGGAGCATTGAGGAC-3’；
测序引物3（Seq NO9）：
CYP2C9*3（rs1057910）测序引物5’-TGGGGAGAAGGTCAA-3’。
取二尖瓣换瓣术后拟选择华法林作为长期抗凝治疗的患者A外周静脉血2mL，应用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测。
1、人类全血基因组DNA提取：采用一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的全血基因组DNA提取试剂。
1.1试剂配置：在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上标签。
1.2提取步骤：
1)取200μL全血样本加入1.5mL离心管中,加入20μL蛋白酶K，混匀。
2)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃水浴放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，若溶液未变清亮，应延长裂解时间直至溶液清亮为止。
3)加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀。
4)将上一步所得溶液和絮状沉淀转入吸附柱CB3中，吸附柱CB3放入收集管中，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)重复步骤6)。
8)12,000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
9)将吸附柱CB3转入1.5mL离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加100μL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12,000r/min离心2min。
10）将离心洗脱后的溶液再次加入吸附柱CB3，室温放置5min，12,000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
2、多重PCR扩增反应
2.1试剂准备：从-20℃冰箱中取出本发明一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的多重PCR扩增试剂及多重PCR引物，待其自然解冻后即可使用。
2.2扩增系统构建：
1)每份样本需要加入的试剂如下，将配置好的总反应体系分装到各PCR反应管中，再分别加入DNA模版，具体见表3。
表3多重PCR扩增反应体系
2)将加好的PCR扩增体系放入博日GenePro TC-E-48D基因扩增仪，旋紧盖子，使用表4程序进行扩增：
表4多重PCR扩增反应条件
多重PCR反应体系得到VKORC1基因和CYP2C9*2、CYP2C9*3基因型扩增产物，三种扩增产物熔解曲线分析结果分别如图2～4所示，VKORC1和CYP2C9*2的扩增片段的熔解曲线分析峰单一，CYP2C9*3的熔解曲线分析图4有小的引物二聚体峰，但是杂峰峰高远低于产物峰，加上后续测序中有特异性测序引物，非特异扩增的产物不影响后续检测和结果分析。因此，多重PCR反应体系和条件达到实验预期。
3、单链DNA样本分离和纯化：使用本发明一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂。
3.1PyroMark Q24真空工作站测试试验：在使用PyroMark Q24真空工作站之前，进行如下测试试验，以检查过滤探针是否正常工作：
1)添加100μL高纯度水到八联管中。
2)用70mL高纯度水注满试剂槽。
3)启动真空泵。
4)打开真空开关，在真空制备装置中施加真空。
5)将过滤探针降至试剂槽中。保持位置不变约20s。确保水被转移至废物容器中，即已施加了真空。如不能转移，检查管路连接。
6)将过滤探针降至八联管中，检查所有管是否均一地被抽水，且于10s内排空。
7)如果10s后八联管未排空，从第一步开始重复。若功能验证失败两次，需更换过滤探针。
3.2微珠固定PCR产物：将生物素标记的PCR产物固定到高性能链霉亲和素琼脂糖上。
1)轻摇高性能链霉亲和素琼脂糖，直至获得均质溶液。
2)在一个试管中混合高性能链霉亲和素琼脂糖（2μL/样品）与结合缓冲液（40μL/样品）。然后添加高纯度水23μL。
3)将制备好的溶液添加至八联管中，每个样品65μL。
4)根据孔板设置，添加15μL生物素标记的PCR产物至相应的八联管中。
5)密封八联管，确保无泄漏。
6)使用振荡器（1400r/min）振荡10min，让高性能链霉亲和素琼脂糖与生物素标记的PCR产物结合完全。
3.3分离DNA单链并将样本释放到PyroMark Q24孔板中
1)确保PyroMark Q24真空工作站正确和牢固地装配。电源接头应当至于容易触及的地方，以备能迅速将真空泵从电源断开。
2)在试剂槽中添加如下物质：
EtOH槽加入50mL70%乙醇溶液；
DS槽加入40mL PyroMark变性溶液；
WB槽加入50mL1xPyroMark洗脱缓冲液；
H2O槽1加入50mL高纯度水；
H2O槽2加入70mL高纯度水。
3)打开真空泵。
4)打开真空开关，在真空装置中施加真空。
5)降下探针至高纯度水（试剂槽5），清洗过滤探针。用70mL高纯度水冲洗探针。确保水被转移至废液容器。
6)关闭真空装置上的真空开关，并将其置于静止位置。
7)用70mL高纯度水重新填充试剂槽5。
8)使用PyroMark退火缓冲液分别稀释测序引物1、测序引物2和测序引物3至0.3μmol/L。添加25μL稀释好的测序引物至待使用的PyroMark Q24孔板的每个反应孔中。
9)固定后，立即将八联管与PyroMark Q24孔板放置到工作台上。确保孔板位置与装载样本时的位置一致。
10)打开真空开关，在真空装置中施加真空。
11)小心降下过滤探针至八联管中，以捕获含有固定模板的微珠。保持探针位置15s。小心取出真空装置。
12)确保所有八联管中的液体被吸出且所有微珠已被捕获到过滤探针顶端。
13)将真空装置移至含有70%乙醇的EtOH槽中冲洗过滤探针5s。
14)将真空装置移至含有PyroMark变性溶液的DS槽中冲洗过滤探针5s。
15)将真空装置移至含有1xPyroMark洗脱缓冲液的WB槽中冲洗过滤探针10s。
16)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。
17)握持真空装置到PyroMark Q24孔板上时，应关闭装置上的真空开关。
18)通过左右轻摇真空装置，释放微珠至含待测引物的孔板中。
19)在真空开关关闭时，将真空装置转移至含高纯度水的H2O槽1中并振荡10s。
20)放下探针至含高纯度水的H2O槽2中并施加真空，清洗探针。用70mL高纯度水冲洗过滤探针。
21)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。
22)关闭真空装置上的真空开关，并将其置于静止位。
23)如果一次制备超过一块孔板，重新填充试剂槽并从第8步开始重复。
24)关闭真空泵。
25)在工作结束时，应当丢弃液体废弃物和任何剩余溶液。同时检查PyroMark Q24真空工作站有无灰尘和泄漏。
3.4测序引物退火
1)使用PyroMark Q24孔板底座与一个加热模块来加热含有样本的PyroMark Q24孔板至80℃持续2min。
2)从孔板座上取下孔板，使样本在室温（15-25℃）下冷却至少5min。此时孔板方可在PyroMark Q24仪器中进行处理。
4、焦磷酸测序与结果分析：使用本发明一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的焦磷酸测序试剂和焦磷酸测序引物。
4.1试剂的准备
1)打开试剂盒并取出酶复合物和底物复合物冻干粉的小瓶，用高纯度水按试剂瓶的标示体积溶解酶和底物。
2)根据PyroMark Q24软件计算所得的试剂体积向PyroMark Q24试剂仓中相应位置分别加入酶复合物、底物复合物和α-硫代脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸。
4.2在PyroMark Q24仪器上运行测序程序
4.2.1启动仪器
1)在打开仪器开关之前，确保电源插头连接到适当接地的并有正确电压和频率的电源插座上，并且电源插头容易触及，已被迅速将仪器从电源断开之需。
2)打开仪器开关。电源开关位于仪器背面。
4.2.2装载试剂仓和孔板：
1)当仪器待机时，打开仪器盖。
2)打开试剂仓活门并插入填充好试剂的试剂仓，标签向外。先完全推入试剂仓后再将其下压。
3)确保试剂仓适当插入，试剂仓前面的线保持可见，然后关闭活门。
4)打开孔板座架，并将孔板放置在仪器内的加热模块上。
5)关闭孔板座架和仪器盖。
4.2.3选择运行文件并启动运行
1)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。
2)使用▲和▼屏幕按钮，在主菜单中选择“Run（运行）”并按“OK”。
3)使用▲和▼屏幕按钮选择运行文件。要浏览文件夹的内容，选择文件夹并按“Select（选择）”。要返回前一视图，按“Back（后退）”。
4)选择运行文件时，按“Select（选择）”启动运行。
4.2.4监测运行
当分配器压力、混合器速度、加热模块温度、处理仓盖子以及冷却液达到预设水平，仪器将开始分配试剂。
4.2.5运行后
1)当仪器确认运行文件已经保存至U盘，按“Close（关闭）”。
2)取出U盘。
3)打开仪器盖。
4)打开试剂仓的活门，提起并拉出试剂仓。
5)关闭活门。
6)打开孔板座架，从加热快上取下孔板。
7)关闭孔板座架和仪器盖。
8)废弃孔板。
9)清洁试剂仓。
A清除试剂仓中剩余的任何溶液。
B采用高纯度水冲洗试剂仓的隔室4次。
C使用高纯度水喷洒针头外部。
D试剂仓用高纯度水彻底填充隔室淋洗针头。握持试剂仓在试剂槽或烧杯上方，同是用一根手指紧紧地按压在每一个隔室顶部（佩戴无粉手套）。
E检查针头是否洁净。水束将直接从每个针头的顶端射来。若针头阻塞，如果针头阻塞，则用高纯度水充填隔室，然后将试剂仓浸没在有足够高纯度水的烧杯中，覆盖针头。将试剂仓放置于烧杯中1小时，清洗，并重复D。
F检查水束是否直接从针头方向射出。若其成角度流出，用水重新充填隔室并重复。若其仍然成角度流出，则废弃试剂仓。
G当所有针头都经过淋洗和测试后，倒掉水，将试剂仓侧过来放在无粉纸上晾干。
H试剂仓晾干后，将其保存在无尘的地方。
4.2.6分析运行
1)将运行文件从U盘移至运行PyroMark Q24软件的计算机中。
2)双击打开快捷浏览器中的运行文件。若包括了几种检测类型，选择打开的对话框中的分析模式。
3)在“Overview（概述）”标签中，采用当前分析模式的有效分析设置来分析所有反应孔或一组反应孔。
4)要在模式间切换，则在工具栏中选择“AQ”、“CpG”或“SQA”。
患者A检测结果为VKORC1-1639G>A如图5为G/G基因型，CYP2C9*2如图8为C/C基因型，CYP2C9*3如图9为A/A基因型，结合患者的年龄50岁、身高160cm、体重65kg和未联合使用胺碘酮等药物的情况，根据国际华法林药物基因组联合为IWPC的预测公式可得该患者的推荐华法林用药剂量为41mg/周。
实施例2
取心房纤颤拟选择华法林作为长期一级抗凝预防治疗的患者B外周静脉血2mL，应用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测。所有操作均同实施例1，该患者的检测结果为VKORC1-1639G>A如图6为G/A基因型，CYP2C9*2如图8为C/C基因型，
CYP2C9*3如图9为A/A基因型，结合患者的年龄45岁、身高175cm、体重75kg和联合使用胺碘酮的情况，根据国际华法林药物基因组联合为IWPC的预测公式可得该患者的推荐华法林用药剂量为30mg/周。
实施例3
取深静脉血栓拟选择华法林抗凝治疗的患者C外周静脉血2mL，应用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测。
所有操作均同实施例1，该患者的检测结果为VKORC1-1639G>A如图7为A/A基因型，CYP2C9*2如图8为C/C基因型，CYP2C9*3如图10为A/C基因型，结合患者的年龄70岁、身高158cm、体重70kg和未联合使用胺碘酮等药物的情况，根据国际华法林药物基因组联合为IWPC的预测公式可得该患者的推荐华法林用药剂量为11mg/周。
实施例4
24例心脏瓣膜置换术后长期服用华法林患者使用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测结果如表5。
表524例心脏瓣膜置换术后患者华法林个体化用药基因检测结果
实施例5
10例心房纤颤拟长期服用华法林患者使用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测结果如表6。
表610例心房纤颤患者华法林个体化用药基因检测结果
实施例6
表73例深静脉血栓患者华法林个体化用药基因检测结果
3例深静脉血栓拟服用华法林患者使用本发明试剂盒和方法进行华法林个体化用药基因的检测结果如表7。
Claims (2)
1.用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，其特征在于包括：
（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；
（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：
PCR引物1（Seq NO1）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）上游引物5’-GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT-3’；
PCR引物2（Seq NO2）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）下游引物5’-GCCTCCAGGGTTCAAGTGG-3’；
PCR引物3（Seq NO3）：
CYP2C9*2（rs1799853）上游引物5’-TACAGAGCTCCTCGGGCAGA-3’；
PCR引物4（Seq NO4）：
CYP2C9*2（rs1799853）下游引物5’-CAGCGGGCTTCCTCTTGA-3’；
PCR引物5（Seq NO5）：
CYP2C9*3（rs1057910）上游引物5’-TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3’；
PCR引物6（Seq NO6）：
CYP2C9*3（rs1057910）下游引物5’-GGGGACTTCGAAAACATGG-3’；
其中引物2、引物4、引物5的5’端均进行生物素标记；
（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR MasterMix”，PyroMark PCR Kit试剂盒，成分包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+、钠离子Na+以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution；
（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液；
（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：
测序引物1（Seq NO7）：
VKORC1-1639G>A（rs9923231）测序引物5’-CCTGAAAAACAACCATTG-3’；
测序引物2（Seq NO8）：
CYP2C9*2（rs1799853）测序引物5’-GAGGAGCATTGAGGAC-3’；
测序引物3（Seq NO9）：
CYP2C9*3（rs1057910）测序引物5’-TGGGGAGAAGGTCAA-3’；
（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐；
（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。
2.用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序的检测方法，其特征在于采用如权利要求1所述用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，包括如下步骤：
（1）人类全血基因组DNA提取：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质；
（2）多重PCR扩增反应：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示；
表1多重PCR扩增反应体系
表2多重PCR扩增反应条件
（3）单链DNA样本分离和纯化：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70%乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本；
（4）焦磷酸测序与结果分析：采用所述一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1、测序引物2和测序引物3中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMarkQ24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和四种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行AQ模式进行结果分析。
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