CN109880889B

CN109880889B - 华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物及其方法

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Publication number: CN109880889B
Application number: CN201910275393.XA
Authority: CN
Inventors: 叶辉铭; 何世伟; 陈小丽; 赵丽
Original assignee: Xiamen Maternal And Child Health Hospital Xiamen Eugenics Service Center Xiamen University Affiliated Women's And Children's Hospital Xiamen Linqiaozhi Women's And Children's Hospital
Current assignee: Xiamen Maternal And Child Health Hospital Xiamen Eugenics Service Center Xiamen University Affiliated Women's And Children's Hospital Xiamen Linqiaozhi Women's And Children's Hospital
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: CN109880889A

Abstract

华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物及其方法，涉及华法林药物靶点基因。华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物包括全血基因组DNA提取试剂、基因组重亚硫酸盐转化试剂、PCR扩增引物、PCR扩增反应试剂、琼脂糖凝胶电泳、单链DNA分离与纯化试剂、焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂。检测方法：人类全血基因组DNA提取；基因组重亚硫酸盐转化；PCR扩增反应；琼脂糖凝胶电泳；DNA单链样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。可在临床上在指导华法林的个体化用药，降低不良反应发生率的目的。

Description

华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物及其方法

技术领域

本发明涉及华法林药物靶点基因，尤其是涉及一种基于焦磷酸测序技术的华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域和VKORC1L1基因Body区域甲基化水平定量检测的引物及其方法。

背景技术

华法林是一种香豆素类抗凝剂，在体内拮抗维生素K，抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝脏的合成进而发挥抗凝作用^[1,2]。华法林作为目前最常用的抗凝药，临床指南^[3,4]推荐起用于静脉血栓栓塞性疾病、人工心脏瓣膜置换术、房颤患者的静脉血管栓塞等疾病的防治。临床研究^[5]表明，华法林稳定剂量存在显著的个体差异，并且有效血药浓度范围狭窄，这两大问题导致出血或血栓形成等严重不良反应的发生，严重影响华法林临床使用的安全性。

经研究证实^[6-9]，华法林通过抑制VKORC1(Vitamin K Epoxide ReductaseComplex subunit1)和VKORC1Ll1(Vitamin K Epoxide Reductase Complex subunit 1-Like protein 1)的活性，减少了作为凝血蛋白辅助因子维生素K的含量，从而发挥抗凝作用。既往研究^[7,9]认为凝血机制中，维生素K还原主要通过两种酶催化，分别由VKORC1基因和VKORC1L1基因编码。其中，VKORC1是维生素K循环中的关键酶，是华法林作用的主要靶标，是与内质网相关的一种163个氨基酸的整合膜蛋白，通过将维生素K环氧化物还原为其活性形式，从而参与维生素K循环，这是维生素K回收过程中重要的限速步骤^[7,8]。另外，VKORC1L1是VKORC1的同工酶，和VKORC1一样，参与维生素K依赖性蛋白质中存在的谷氨酸残基的羧化，催化维生素K 2,3-环氧化物的去环氧化，从而参与维生素K代谢^[9,10]。维生素K环氧化物的减少是造成某些血液凝固蛋白中谷氨酸残基羧化的原因，包括凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ^[7]。华法林正是通过抑制VKORC1和VKORC1L1酶活性，干扰上述的维生素K凝血机制，进而发挥了抗凝作用。

DNA甲基化是重要的表观修饰调控机制，常被描述为“沉默”表观遗传标志物^[11,12]。启动子区域的甲基化可以通过影响转录调控元件发挥作用，进而干扰转录过程；Body区域的甲基化水平改变可能会对转录的延伸、调节外显子和内含子的剪接产生影响^[13]。DNA甲基化通过对转录进程的干扰，影响不同基因的表达。既往研究^[14,15]认为，可以通过检测药物的吸收、代谢、作用靶点等相关基因的甲基化水平，指导临床用药剂量，保证有效性的同时，避免不良反应的发生。因此检测VKORC1基因启动子区域和VKORC1L1基因Body区域甲基化水平，可以在临床抗凝治疗中指导华法林用药，在保证有效抗凝作用的同时，又可以减少诸如出血、血栓等不良发应的发生，促进用药安全。

目前，DNA甲基化检测方法主要有甲基化特异性PCR(MSP)、荧光定量PCR法(QMSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)、重亚硫酸盐测序PCR(BSP)等。上述这些方法往往存在着假阳性高，单核苷酸水平检测难以实现、检测周期长等缺陷，不适于临床诊断^[16]。

焦磷酸测序技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合已知短序列的测序分析，目前研究^[17]认为焦磷酸测序技术为定量检测单核苷酸水平DNA甲基化的金标准，具有很好的临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行华法林药物靶点基因VKORC1基因启动子区域和VKORC1L1基因Body区域甲基化水平定量检测的引物及其方法的开发和应用。

参考文献：

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发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于焦磷酸测序技术的华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因的Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的引物。

本发明的第二目的在于提供VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的检测方法。

本发明的华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物，所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物为华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因的Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的引物，所述华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因的Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的引物包括全血基因组DNA提取试剂、基因组重亚硫酸盐转化试剂、PCR扩增引物、PCR扩增反应试剂、琼脂糖凝胶电泳、单链DNA分离与纯化试剂、焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂。

所述全血基因组DNA提取试剂可为血液基因组提取试剂盒，所述血液基因组提取试剂盒可来源于商品化血液基因组提取试剂盒，商品化血液基因组提取试剂盒可购自天根生化科技(北京)有限公司，成分包括缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB等。

所述基因组重亚硫酸盐转化试剂可为基因组转化试剂盒，所述基因组转化试剂盒可来源于商品化基因组转化试剂盒，商品化基因组转化试剂盒可购自德国QIAGEN公司，成分包括Bisulfite Mix、缓冲液BL、缓冲液BW、缓冲液BD等。

所述PCR扩增引物可包括：

PCR引物1(Seq NO1)

VKORC1启动子区域上游引物5’-AGTGTGTTAGTGTGGTTAATAGTA -3’；

PCR引物2(Seq NO2)

VKORC1启动子区域下游引物5’-CCTCATCTAACCCACAACTTAAA -3’；

PCR引物3(Seq NO3)

VKORC1L1Body区域上游引物5’-TGTGTTATTTAAAGATGATGGTGATGTGA-3’；

PCR引物4(Seq NO4)

VKORC1L1Body区域下游引物5’-ATTCCAAACCAATTTTATTACCAACATA-3’；

其中，引物2、引物4的5’端均进行生物素标记。

所述PCR扩增反应试剂记为2X PyroMark PCR Master Mix，所述2X PyroMark PCRMaster Mix可来自德国QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit试剂盒，具体成分包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg2+以及钠离子Na+。

所述琼脂糖凝胶电泳：配好的2.5％琼脂糖凝胶、20X TAE溶液和2kb Marker等。

所述单链DNA分离与纯化试剂可包括购自美国通用健康公司GE Healthcare的高性能链霉亲和素琼脂糖和购自德国QIAGEN公司的PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液。

所述焦磷酸测序引物可包括：

测序引物1(Seq NO5)：VKORC1启动子区域测序引物：

5’-GAGATTAGAGGATTAGGG-3’；

测序引物2(Seq NO6)：VKORC1L1Body区域测序引物：

5’-ATATAATTAGTTTTGAATTGGGT-3’。

所述焦磷酸测序仪器及软件均购自德国QIAGEN公司，所述焦磷酸测序仪器包括PyroMarkQ24试剂仓、PyroMark Q24真空工作站、PyroMark Q24测序仪等；所述软件为PyroMark Q24测序仪配套的PyroMark Q24分析软件，主要包括CpG检测模式。

所述焦磷酸测序试剂可为DNA焦磷酸测序的常规试剂，购自德国QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐。

所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的检测方法，根据所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物包括的试剂，所述检测方法包括以下步骤：

1)人类全血基因组DNA提取；

在步骤1)中，所述人类全血基因组DNA提取的具体方法可为：采用一种用于所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞、缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质。

2)基因组重亚硫酸盐转化；

在步骤2)中，所述基因组重亚硫酸盐转化的具体方法可为：采用一种用于所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的基因组重亚硫酸盐转化试剂，包括利用重亚硫酸盐转化混合试剂Bisulfite Mix孵育转化基因组DNA、缓冲液BL调整溶液pH、缓冲液BD、BW去除剩余重亚硫酸盐等杂质，最后以缓冲液EB洗脱得到转化后的基因组DNA，整个反应以EpiTect离心柱为DNA与重亚硫酸盐等化学成分分离的介质。

3)PCR扩增反应，PCR反应体系如表1所示，PCR扩增反应条件如表2所示：

表1

表2

4)琼脂糖凝胶电泳：取步骤3)中的扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳(浓度2.5％)，根据VKORC1和VKORC1L1的产物条带是否肉眼可见，并且是否分别位于250～500bp和100～250bp的标记条带之间来判断扩增是否成功；

5)DNA单链样本分离和纯化；

在步骤5)中，所述DNA单链样本分离和纯化的具体方法可为：采用一种用于所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70％乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本；

6)焦磷酸测序与结果分析。

在步骤6)中，所述焦磷酸测序与结果分析的具体方法可为：采用一种所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1和测序引物2中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMarkQ24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和4种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行CpG模式进行结果分析。

本发明所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测方法整合了从DNA提取到焦磷酸测序五个步骤的所有试剂成份，利于商品化生产和临床应用推广。PCR引物1～4和测序引物1～2为本发明所述VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平定量检测方法的关键成份，能够生成2种扩增产物，分别为VKORC1启动子区域扩增产物383bp，VKORC1L1Body区域扩增产物134bp；测序能对重亚硫酸盐转化后的VKORC1基因启动子区域CpG岛(前半段)(Seq NO7)GATTTAGYGAATAYGGYGAT TYGATTYGGG AATT和VKORC1L1基因Body区域CpG岛(后半段)(Seq NO8)AAAAYGATGA GAATTATGTT GGTAA进行分析(注：依据IUPAC编码其中Y为C/G，在软件中为DNA甲基化水平的定量检测位置)。

本发明的实际用途就是在临床上指导华法林的个体化用药，在保证华法林有效性的同时，降低发生出血、血栓等不良反应的风险。焦磷酸测序技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合已知短序列的测序分析，目前研究认为焦磷酸测序技术为定量检测单核苷酸水平DNA甲基化的金标准。

本发明主要通过检测VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因Body区域CpG位点甲基化水平，可在临床上在指导华法林的个体化用药，降低不良反应发生率的目的。

附图说明

图1为本发明VKORC1基因启动子区域待测目的片段；

图2为本发明VKORC1基因启动子区域琼脂糖凝胶电泳条带；

图3为本发明VKORC1基因启动子区域焦磷酸测序结果图；

图4为本发明VKORC1L1基因Body区域待测目的片段；

图5为本发明VKORC1L1基因Body区域琼脂糖凝胶电泳条带；

图6为本发明VKORC1L1基因Body区域焦磷酸测序结果图；

图7为PyroMark Q24真空工作站试剂槽示意图(来源：PyroMark Q24配套说明书)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

检测方法关键的引物成分和序列如下：

PCR引物1(Seq NO1)

VKORC1启动子区域上游引物5’-AGTGTGTTAGTGTGGTTAATAGTA-3’；

PCR引物2(Seq NO2)

VKORC1启动子区域下游引物5’-CCTCATCTAACCCACAACTTAAA-3’；

PCR引物3(Seq NO3)

VKORC1L1Body区域上游引物5’-TGTGTTATTTAAAGATGATGGTGATGTGA-3’；

PCR引物4(Seq NO4)

VKORC1L1Body区域下游引物5’-ATTCCAAACCAATTTTATTACCAACATA-3’。

其中，引物2、引物4的5’端均进行生物素标记。

测序引物1(Seq NO5)：VKORC1启动子区域测序引物：

5’-GAGATTAGAGGATTAGGG-3’，测序位置见图1；

测序引物2(Seq NO6)：VKORC1L1Body区域测序引物：

5’-ATATAATTAGTTTTGAATTGGGT-3’，测序位置见图4。

1、人类全血基因组DNA提取

1.1试剂配制：在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上标签。

1.2提取步骤：

1)取400μL全血样本,加入800μL细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，震荡至彻底混匀，再加入20μL Proteinase K(蛋白酶K)溶液，混匀。

2)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，若溶液未变清亮，应延长裂解时间直至溶液清亮为止。

3)加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀。

4)将步骤2)所得溶液和步骤3)所得絮状沉淀转入吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)重复步骤6)。

8)12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9)将吸附柱CB3转入1.5mL离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加100μL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12,000rpm离心2min。

10)将离心洗脱后的溶液再次加入吸附柱CB3，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2、基因组重硫酸盐转化：

2.1试剂准备：

1)缓冲液BW中加入30mL的(96％～100％)酒精，室温保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。

2)缓冲液BD中加入27mL的(96％～100％)酒精，2～8℃下保存，在使用前上下颠倒试剂瓶数次混匀。使用完后立即关上瓶盖。

3)往lyophilized carrier RNA(310μg)中加入310μL的RNase-free水，涡旋震荡使其溶解。分装溶解了的carrier RNA(如50μL/管)。carrier RNA能增强EpiTect柱对DNA的吸附作用(特别是DNA量少时)，若DNA＞100ng时，则不需要carrier RNA。

2.2操作步骤：

1)DNA样品解冻。取相应数量的Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加800μL的RNase-free水溶解。涡旋至Bisulfite Mix完全溶解(5min左右)(注意：不要将BisulfiteMix放到冰上；必要时可以放至60℃孵育再涡旋溶解)。

2)在200μL的PCR管中准备重亚硫酸盐反应液。重亚硫酸盐反应液成分见表3。

表3

成分	每反应体积(μL)
		DNA溶液(1ng～2μg)	10
无酶水	10
		Bisulfite Mix(已溶解)	85
DNA Protect Buffer	35
		总体积	140

3)盖上PCR管，完全混匀反应液，室温存放(DNA Protect Buffer在加入BisulfiteMix后有绿色变为蓝色，表明转化反应充分且pH正确)。

4)放至PCR仪上反应，耗时约5h。

程序见表4。

表4

步骤	时间(min)	温度(℃)
			变性	5	95
孵育	25	60
			变性	5	95
孵育	85	60
			变性	5	95
孵育	175	60
			维持	无限	20

5)开始运行PCR程序。

6)瞬离PCR管的转化液，转移至1.5mL的离心管中(若有沉淀，也将其转移)。

7)每管加入现配的560μL缓冲液BL(含carrier RNA)，涡旋混匀后瞬离。

8)准备对应数量的EpiTect离心柱和收集管，将步骤7)中的液体转移至离心柱中。

9)最大转速离心1min，弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。

10)每个离心柱中加入500μL的缓冲液BW，最大转速离心1min。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。

11)每个离心柱中加入500μL的缓冲液BD，室温15min(注意：若缓冲液BD中有沉淀，要避免将沉淀转移进去，加完缓冲液BD后要及时盖上盖子)。

12)最大转速离心1min，弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。

13)每个离心柱中加入500μL的缓冲液BW，最大转速离心1min，弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中。

14)重复步骤13)一次。

15)将离心柱放至新的2mL收集管上，最大转速离心1min。

16)推荐步骤：将离心柱开盖，放在新的1.5mL离心管上(自备)，56℃孵育5min。(注：蒸发残余液体)

17)将离心柱放至新的1.5mL离心管上(自备)，加入20μL缓冲液EB(小心滴在中央膜上)，15000g(12000rpm)1min(注：再用20μL缓冲液EB重复步骤17)以提高DNA产量)。

3、PCR扩增反应

3.1试剂准备：从-20℃冰箱中取出本发明所需的PCR扩增试剂及其引物，待其自然解冻后即可使用。

3.2扩增系统构建：

1)每份样本需要加入的PCR反应体系如表5所示，将配制好的总反应体系分装到各PCR反应管中，再分别加入DNA模版。

表5

2)将PCR扩增体系放入Bio-Rad T100PCR仪，旋紧盖子，使用如下程序进行扩增，PCR扩增反应条件见表6。

表6

反应步骤	反应温度(℃)	反应时间(min)	备注
				PCR反应激活	95	15	无
变性	94	0.5	45个循环
				退火	56	0.5
延伸	72	0.5
				最终延伸	72	10	无

4、琼脂糖凝胶电泳

取3.2中的扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳，根据VKORC1和VKORC1L1的产物条带是否肉眼可见，并且是否分别位于250～500bp和100～250bp的标记条带之间来判断扩增是否成功。见图2和图5的图例。

5、DNA单链样本分离和纯化

5.1PyroMark Q24真空工作站测试试验：在使用PyroMark Q24真空工作站之前，进行如下测试试验，以检查过滤探针是否正常工作：

1)添加100μL高纯度水到八联管中。

2)用70mL高纯度水注满试剂槽。

3)启动真空泵。

4)打开真空开关，在真空制备装置中施加真空。

5)将过滤探针降至试剂槽中。保持位置不变约20s。确保水被转移至废物容器中，即已施加了真空。如不能转移，检查管路连接。

6)将过滤探针降至八联管中，检查所有管是否均一地被抽水，且于10s内排空。

7)如果10s后八联管未排空，从第一步开始重复。若功能验证失败两次，需更换过滤探针。

5.2微珠固定PCR产物：将生物素标记的PCR产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠上。

1)轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液。

2)在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠(2μL/样品)与结合缓冲液(40μL/样品)。然后添加高纯度水23μL。

3)将制备好的溶液添加至八联管中，每个样品65μL。

4)根据孔板设置，添加15μL生物素标记的PCR产物至相应的八联管中。

5)密封八联管。确保无泄漏。

6)使用振荡器(1400rpm)振荡10min，让微珠与生物素标记的PCR产物结合完全。

5.3分离DNA单链并将样本释放到PyroMark Q24孔板中(参见图7)

1)确保PyroMark Q24真空工作站正确和牢固地装配，电源接头应当至于容易触及的地方，以备能迅速将真空泵从电源断开。

2)在试剂槽中添加如下物质

50mL乙醇溶液(70％)(EtOH槽)

40mL变性溶液(DS槽)

50mL 1x洗涤缓冲液(WB槽)

50mL高纯度水(H₂O槽4)

70mL高纯度水(H₂O槽5)

3)打开真空泵。

4)打开真空开关，在真空装置中施加真空。

5)降下探针至高纯度水(试剂槽5)，清洗过滤探针。用70mL高纯度水冲洗探针。确保水被转移至废液容器。

6)关闭真空装置上的真空开关，并将其至于静止位置。

7)用70mL高纯度水重新填充试剂槽5。

8)使用退火缓冲液稀释测序引物至0.3μm，添加25μL稀释好的测序引物至待使用的PyroMark Q24孔板的每个反应孔中。

9)固定后，立即将八联管与PyroMark Q24孔板放置到工作台上，确保孔板位置与装载样本时的位置一致。

10)打开真空开关，在真空装置中施加真空。

11)小心降下过滤探针至八联管中，以捕获含有固定模板的微珠，保持探针位置15s，小心取出真空装置。

12)确保所有八联管中的液体被吸出且所有微珠已被捕获到过滤探针顶端。

13)将真空装置移至含有70％乙醇的试剂槽中(试剂槽1)，冲洗过滤探针5s。

14)将真空装置移至含有变性溶液的试剂槽中(试剂槽2)，冲洗过滤探针5s。

15)将真空装置移至含有洗脱缓冲液的试剂槽中(试剂槽3)，冲洗过滤探针10s。

16)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。

17)握持真空装置到PyroMark Q24孔板上时，应关闭装置上的真空开关。

18)通过左右轻摇真空装置，释放微珠至含待测引物的孔板中。

19)在真空开关关闭时，将真空装置转移至含高纯度水的试剂槽中(试剂槽4)，并振荡10s。

20)降下探针至含高纯度水的第二个试剂槽(试剂槽5)中并施加真空，清洗探针，用70mL高纯度水冲洗过滤探针。

21)抬高真空装置超过90°垂线5s，从过滤探针中排液。

22)关闭真空装置上的真空开关，并将其置于静止(P)位。

23)如果一次制备超过一块孔板，重新填充试剂槽并从第8步开始重复。

24)关闭真空泵。

25)在工作结束时，应当丢弃液体废弃物和任何剩余溶液，同时检查PyroMark Q24真空工作站有无灰尘和泄漏。

5.4测序引物退火

1)使用PyroMark Q24孔板底座与一个加热模块来加热含有样本的PyroMark Q24孔板至80℃持续2min。

2)从孔板座上取下孔板，使样本在室温(15～25℃)下冷却至少5min。此时孔板方可在PyroMark Q24仪器中进行处理。

6、焦磷酸测序与结果分析

6.1 PyroMark Gold Q24试剂的准备

1)打开PyroMark Gold Q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管。用高纯度水溶解酶和底物。

2)根据系统计算所得的试剂体积填充PyroMark Q24试剂仓至正确仓位。

6.2在PyroMark Q24仪器上运行

6.2.1启动仪器

1)在打开仪器开关之前，确保电源插头连接到适当接地的并有正确电压和频率的电源插座上，并且电源插头容易触及，已被迅速将仪器从电源断开之需。

2)打开仪器开关。电源开关位于仪器背面。

6.2.2启动运行

装载试剂仓和孔板：

1)当仪器待机时，打开仪器盖。

2)打开试剂仓活门并插入填充好试剂的试剂仓，标签向外，先完全推入试剂仓后再将其下压。

3)确保试剂仓适当插入，试剂仓前面的线保持可见，然后关闭活门。

4)打开孔板座架，并将孔板放置在仪器内的加热模块上。

5)关闭孔板座架和仪器盖。

选择运行文件并启动运行：

1)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。

2)使用▲和▼屏幕按钮，在主菜单中选择“Run(运行)”并按“OK”。

3)使用▲和▼屏幕按钮选择运行文件。要浏览文件夹的内容，选择文件夹并按“Select(选择)”。要返回前一视图，按“Back(后退)”。

4)选择运行文件时，按“Select(选择)”启动运行。

6.2.3监测运行

当分配器压力、混合器速度、加热模块温度、处理仓盖子以及冷却液达到预设水平，仪器将开始分配试剂。

6.2.4运行后

1)当仪器确认运行文件已经保存至U盘，按“Close(关闭)”。

2)取出U盘。

3)打开仪器盖。

4)打开试剂仓的活门，提起并拉出试剂仓。

5)关闭活门。

6)打开孔板座架，从加热快上取下孔板。

7)关闭孔板座架和仪器盖。

8)废弃孔板。

9)清洁试剂仓。

A清除试剂仓中剩余的任何溶液

B采用高纯度水冲洗试剂仓的隔室4次。

C使用高纯度水喷洒针头外部。

D试剂仓用高纯度水彻底填充隔室淋洗针头。握持试剂仓在试剂槽或烧杯上方，同是用一根手指紧紧地按压在每一个隔室顶部(佩戴无粉手套)。

E检查针头是否洁净。水束将直接从每个针头的顶端射来，若针头阻塞，则用高纯度水充填隔室，然后将试剂仓浸没在有足够高纯度水的烧杯中，覆盖针头，将试剂仓放置于烧杯中1h，清洗，并重复D。

F检查水束是否直接从针头方向射出，若其成角度流出，用水重新充填隔室并重复。若其仍然成角度流出，则废弃试剂仓。

G当所有针头都经过淋洗和测试后，倒掉水，将试剂仓侧过来放在无粉纸上晾干。

H试剂仓晾干后，将其保存在无尘的地方。

6.2.5分析运行

1)将运行文件从U盘移至运行PyroMark Q24软件的计算机中。

2)双击打开快捷浏览器中的运行文件。若包括了几种检测类型，选择打开的对话框中的分析模式。

3)在“Overview(概述)”标签中，采用当前分析模式的有效分析设置来分析所有反应孔或一组反应孔。

4)要在模式间切换，则在工具栏中选择“CpG”。

5)分析结果如图3和图6所示，可从图中发现不同序列的峰值高度及DNA甲基化定量结果。

序列表

<110> 厦门市妇幼保健院（厦门市计划生育服务中心）

<120> 华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物及其方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (31106675）)..(31106698）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1基因启动子区域，位于16号染色体，位于正向链上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码。

<400> 1

agtgtgttag tgtggttaat agta 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (31107035）)..(31107057）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1基因启动子区域，位于16号染色体，位于正向链的反向互补区域上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码。

<400> 2

cctcatctaa cccacaactt aaa 23

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (65375583）)..(65375611）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1L1基因body区域，位于7号染色体，位于反向链上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码。

<400> 3

tgtgttattt aaagatgatg gtgatgtga 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (65375362）)..(65375391）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1L1基因body区域，位于7号染色体，位于反向链的互补区域上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码。

<400> 4

attccaaacc aattttatta ccaacata 28

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (31106754）)..(31106771）)

<400> 5

gagattagag gattaggg 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (65375521）)..(65375543）)

<400> 6

atataattag ttttgaattg ggt 23

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> promoter

<222> (31106772）)..(31106805）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1基因启动子区域，位于16号染色体，位于正向链上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码，测序CpG位点分别位于：3110677931106785311067883110679331106798

<400> 7

gatttagyga atayggygat tygattyggg aatt 34

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (65375519）)..(65375495）)

<223> 引物设计模板位于VKORC1L1基因body区域，位于7号染色体，位于反向链上，按照UCSC(hg19/Human）的位置编码，测序CpG位点位于：65375515

<400> 8

aaaaygatga gaattatgtt ggtaa 25

Claims

1.华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物，其特征在于所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物为华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因的Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的引物，所述华法林靶点基因VKORC1基因启动子区域及VKORC1L1基因的Body区域CpG位点甲基化水平定量检测的引物包括PCR扩增引物和焦磷酸测序引物；

所述PCR扩增引物包括：

PCR引物1：

VKORC1启动子区域上游引物5’-AGTGTGTTAGTGTGGTTAATAGTA-3’；

PCR引物2：

VKORC1启动子区域下游引物5’-CCTCATCTAACCCACAACTTAAA-3’；

PCR引物3：

VKORC1L1 Body区域上游引物5’-TGTGTTATTTAAAGATGATGGTGATGTGA-3’；

PCR引物4：

VKORC1L1 Body区域下游引物5’-ATTCCAAACCAATTTTATTACCAACATA-3’；

其中，引物2、引物4的5’端均进行生物素标记；

所述焦磷酸测序引物包括：

测序引物1：VKORC1启动子区域测序引物：

5’-GAGATTAGAGGATTAGGG-3’；

测序引物2：VKORC1L1 Body区域测序引物：

5’-ATATAATTAGTTTTGAATTGGGT-3’。

2.华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的试剂盒，其特征在于所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的试剂盒包括权利要求1所述的华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的引物、全血基因组DNA提取试剂、基因组重亚硫酸盐转化试剂、PCR扩增反应试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂、单链DNA分离与纯化试剂和焦磷酸测序试剂；

所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP；所述脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP包括人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸以及未修饰的脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐。

3.如权利要求2所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的试剂盒，其特征在于所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化血液基因组提取试剂盒，成分包括缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；

所述基因组重亚硫酸盐转化试剂来源于商品化基因组转化试剂盒，成分包括Bisulfite Mix、缓冲液BL、缓冲液BW和缓冲液BD。

4.如权利要求2所述华法林药物靶点基因特定位点甲基化水平定量检测的试剂盒，其特征在于所述PCR扩增反应试剂为2X PyroMark PCR Master Mix，具体成分包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg²⁺ 以及钠离子Na⁺ ；

所述琼脂糖凝胶电泳试剂包括：配好的质量百分比浓度2.5％琼脂糖凝胶、20X TAE溶液和2kb Marker；

所述单链DNA分离与纯化试剂包括链霉亲和素琼脂糖和PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液。