CN112626214A - 检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诊断学领域,具体而言,涉及一种检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法。该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~45所示的上游引物,以及与其依次对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:46~90所示的下游引物。本发明所提供的引物组可以在一个扩增体系下进行扩增,特异性好,灵敏度高;能够简便、快速、准确地对脑胶质瘤进行检测,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及诊断学领域,具体而言,涉及一种检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。年发病率约为3-8人/10万人口。脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的46%。脑肿瘤中胶质细胞瘤发病率最高,综合发病年龄高峰在30-40岁,或10-20岁。大脑半球发生的胶质瘤约占全部胶质瘤的51.4%,以星形细胞瘤为最多,其次是胶质细胞瘤和少枝胶质细胞瘤,脑室系统也是胶质瘤较多的发生部位,占胶质瘤总数的23.9%,主要为管膜瘤,髓母细胞瘤,星形细胞瘤,小脑胶质瘤占胶质瘤总数的13%,主要为星形细胞瘤。脑胶质瘤由成胶质细胞衍化而来,具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低的特点。
目前对于胶质瘤的治疗,包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等手段。手术往往是胶质瘤治疗的第一步。手术不仅可以提供最终的病理诊断,而且可以迅速去除大部分的肿瘤细胞,缓解患者症状,并为下一步的其他治疗提供便利。在接受外科手术治疗后,对于高级别胶质瘤患者,往往需要进一步的放疗。对于低级别胶质瘤患者,若存在高危因素(例如肿瘤体积超过6厘米、手术切除不完全等因素),也要考虑进行放疗。化疗及靶向治疗在胶质瘤的治疗中,逐渐发挥重要作用。对于高级别胶质瘤,替莫唑胺的应用,可以显著延长患者的生存预后。目前,替莫唑胺是治疗胶质瘤唯一有明确疗效的化疗药物。对于初治高级别胶质瘤患者,替莫唑胺在与放疗同时应用后(同步放化疗阶段),还应继续单独服用一段时间(6-12周期)。其他的化疗药物(如尼莫司丁),对于复发胶质瘤的治疗,可能有一定疗效。新近出现的血管靶向药物,阿伐斯丁,对于复发高级别胶质瘤,有明确疗效,可以显著延长患者的生存期。最近大规模三期研究的中期分析表明,对于初治高级别胶质瘤患者,阿伐斯丁与放疗、替莫唑胺的联用,可以显著提高患者的无进展生存期,并有望成为标准治疗方案之一。
脑胶质瘤的分子病理研究取得了重大进展,已发现了一系列有助于脑胶质瘤临床诊断子标志物,例如1p/19q杂合性缺失突变(loss ofheterozygosity,LOH)。染色体1p/19q杂合性缺失是指肿瘤细胞中一条1号染色体短臂或/和一条19号染色体长臂发生缺失。目前认为1p/19q杂合性缺失是少突胶质细胞瘤的分子特征,是其诊断性分子标志物。通常对疑似少突胶质细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤均应进行1p/19q杂合性缺失的检测,从而协助组织学的诊断。存在1p/19q杂合性缺失的少突胶质细胞瘤生长速度较慢,并对化疗敏感。
目前临床上对于脑胶质瘤患者1p/19q杂合性缺失,常用的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、基于杂合性缺失分析的聚合酶链式反应(PCR-LOH)、阵列比较基因组杂交(CGH)。FISH技术可通过荧光信号直接显示1p/19q的状态,但是探针结合区域的局限性使得小范围的缺失检出率低,而且整个操作流程比较复杂,对操作和结果分析人员的经验要求高,同时检测周期长、配套仪器和试剂价格昂贵。PCR-LOH对1p和19q上的多个微卫星区域进行扩增,再通过变性聚丙烯酰胺电泳方法来检测扩增产物,整个实验流程操作复杂、结果分析掺杂因素多且容易发生污染,不利于临床使用。CGH方法需使用进口的基因芯片,配套的仪器和试剂耗材成本较高。因此,目前对于胶质细胞瘤患者的1p/19q杂合性缺失,缺乏一种操作简便、快速、准确、价格便宜的检测方法。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种引物组,其包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~45所示的上游引物,以及与其依次对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:46~90所示的下游引物。
本发明的第二方面涉及一种接头引物组,其由如上所述的上游引物以及下游引物分别添加接头片段得到。
本发明的第三方面涉及一种引物组,其含有如上所述的接头引物组,以及测序引物;
所述测序引物包括与所述接头片段相同的区段或者其互补区段和与测序通道附有的DNA引物配对的序列,以及任选地index序列。
本发明的第四方面涉及用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,其含有如上所述的引物组。
可选的,如上所述的试剂盒,所述试剂盒还包括如上所述的含有接头引物组和测序引物的引物组。
可选的,如上所述的试剂盒,其还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水以及DNA聚合酶中的至少一种。
本发明的第五方面涉及用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,其包含第一方面所定义的引物组,其还含有分子量marker、修复酶、连接缓冲液、连接酶、dNTP、水、DNA聚合酶以及接头片段中的至少一种。
本发明的第六方面涉及如上所述的引物组和/或如上所述的接头引物组在用于制备脑胶质瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明的第七方面涉一种检测1p/19q杂合性缺失的方法,包括:
a)使用如上所述的引物组对待检测样品中的基因组DNA进行扩增;
b)对扩增产物进行测序,根据扩增产物中突变位点所占的比例判定该位点是否为杂合性缺失状态;
所述方法为非诊断目的。
可选的,如上所述的检测1p/19q杂合性缺失的方法,所述方法基于高通量测序技术;
步骤a)还包括使用如上所述的接头引物组对上一步扩增所得产物进行扩增。
可选的,如上所述的检测1p/19q杂合性缺失的方法,所述待检测样品为血液、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织或组织裂解液。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的引物组可以在一个扩增体系下进行扩增,特异性好,灵敏度高;能够简便、快速、准确地对脑胶质瘤进行检测,具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1和图2为本发明一个实施例中的FISH验证结果,图1中所用探针用于与19q上的核酸片段杂交,图2中所用探针用于与1p上的核酸片段杂交;
图3为本发明一个实施例中的FISH验证结果,所用探针用于与1p上的核酸片段杂交;
图4为本发明一个实施例中的FISH验证结果,所用探针用于与19q上的核酸片段杂交;
图5和图6为本发明一个实施例中的FISH验证结果,图5中所用探针用于与1p上的核酸片段杂交,图6中所用探针用于与19q上的核酸片段杂交。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的第一方面涉及一种引物组,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~45所示的上游引物,以及与其依次对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:46~90所示的下游引物。
在本发明中,上述45个引物对用于扩增含有如下所示的45个SNP位点(与上游引物的编号依次对应),它们在人类基因组上的物理位置(GRCh37)如表1所示:
表1
本发明的第二方面涉及一种接头引物组,其由如上所述的上游引物以及下游引物分别添加接头片段得到。
根据本发明的再一方面,本发明的第三方面涉及一种引物组,其含有如上所述的接头引物组,以及测序引物;
所述测序引物包括与所述接头片段相同的区段或者其互补区段和与测序通道附有的DNA引物配对的序列,以及任选地index序列。
本发明还涉及用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,所述试剂盒含有如上所述的引物组。
在一些实施方式中,所述试剂盒还包括如上所述的接头引物组。
在一些实施方式中,所述试剂盒还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水以及DNA聚合酶中的至少一种。
本发明还涉及用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,其包含第一方面所定义的引物组,其还含有分子量marker、修复酶、连接缓冲液、连接酶、dNTP、水、DNA聚合酶以及接头片段中的至少一种。
如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物,当酸或碱加入该溶液或组合物中时,所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此,显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反,它们一般能够维持在特定范围内的pH,例如pH7–pH 9。一般地,缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如,Mohan,Buffers,A guide for the preparation and use of buffers in biological systems,CALBIOCHEM,1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
在一些实施方式中,所述水为无核酸酶的水,例如双蒸水或去离子水。
在一些实施方式中,所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中,试剂盒中还含有阳性对照。
在一些实施方式中,试剂盒中还含有DNA提取试剂。
所述DNA提取试剂用于执行酚氯仿法、NaOH法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、FTA卡法、硅珠法或磁珠提取法。其中:
酚氯仿法通常是指通过酚氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质,保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。
NaOH法一般是强碱溶解、变性蛋白质,破坏细胞膜及核膜,变性核酸酶,释放DNA,NaOH不破坏DNA一级结构。
树脂提取法常用Chelex100法,通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子,使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。
盐析法通常是将细胞破碎并离心后,用约6M的饱和NaCl沉淀蛋白质,离心上清中DNA用无水乙醇沉淀,用TE溶解。
十六烷基三甲基溴化胺法通常是通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织,并与DNA形成复合物,分离DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。
硅胶膜吸附法通常指通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA,并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。
FTA卡法通常指通过FTA卡裂解细胞释放DNA,从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。
硅珠法通常是指在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下,通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。
磁珠法通常是指在胍盐存在条件下,通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠,特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。
在一些实施方式中,所述试剂盒中还含有核酸分选试剂,分选可基于接头进行,例如通过固相载体进行捕获分选。
本文使用的“固相载体”,优选是“富集颗粒”,可以由任何数量的已知材料制造。这种材料的实例包括:无机物、天然聚合物和合成聚合物。这些材料的具体实例包括:纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、葡聚糖、橡胶、硅胶、塑料、硝化纤维素、天然海绵、硅胶、对照孔玻璃(control pore glass)、金属、交联葡聚糖(例如Sephadex TM)、琼脂糖凝胶(Sepharose TM)和本领域技术人员已知的其它固相支持物。
如本文所使用的,“颗粒”是指可以是各种形状的离散的小物体、例如球体(例如珠)、胶囊、多面体等。颗粒可以是宏观的或微观的,例如微粒或纳米颗粒。颗粒可以是非磁性或磁性的。磁性颗粒可以包含铁磁性物质,并且铁磁性物质可以是Fe,Ni,Co,氧化铁等。
根据本发明的再一方面,本发明还提供如上所述的引物组和/或如上所述的接头引物组在用于制备脑胶质瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供检测1p/19q杂合性缺失的方法,所述包括:
a)使用如上所述的引物组对待检测样品中的基因组DNA进行扩增;
b)对扩增产物进行测序,根据扩增产物中突变位点所占的比例判定该位点是否为杂合性缺失状态。
在本发明的一些实施方式中,所述测序法是高通量测序,也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序),后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用于本发明的NGS的测序平台可以是商用可得的,包括但不限于Illumina MiniSeq、NextSeq 550等。
术语“扩增(ampIifying或amplification)”在“核酸”此用语的上下文中共同出现时,指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的部分,通常从少量的多核苷酸开始(例如,少至单个多核苷酸分子),其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促方法。
在一些实施方式中,步骤a)还包括使用如上所述的接头引物组对上一步扩增所得产物进行扩增。
在一些实施方式中,所述待检测样品为血液、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织或组织裂解液。
在一些实施方式中,所述待检测样品来自组织或组织裂解液,组织可以选择例如羊水、绒毛、骨骼、肌肉或毛发等。本文使用的"组织裂解物"、"细胞裂解物"、"裂解物"、"裂解的样品"、"组织提取物"或"细胞提取物"表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料,即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物,通常用酶和/或化学试剂处理所述材料,以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语"裂解"包括。
该方法可以是非诊断目的的,例如遗传学研究、人种分布、人类进化学等领域的研究中进行应用(典型的如SNP的应用),或者是脑胶质瘤相关疾病的细胞和动物模型的鉴定。
当然,该方法也可以用于脑胶质瘤的诊断。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
本实施例提供一种检测1p/19q杂合性缺失的方法。
1,样本中DNA的提取
1)新鲜组织切碎,75%乙醇浸泡五分钟,振荡数次,离心后弃上清,无水乙醇浸泡5分钟,震荡数次,弃上清后尽可能的吹干,再用1×PBS洗两次,留待提取;
2)加入180μl GTL,涡旋震荡混匀,再加入20μl PK酶(20mg/ml),涡旋振荡;
3)56℃孵育1小时,直到样本完全溶解;90℃孵育1小时,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;
4)加入200μl GL,涡旋震荡彻底混匀,短暂离心,加入200μl无水乙醇,涡旋震荡彻底混匀,短暂离心;
5)将所得的上清液全部加入有收集管的吸附柱中,12000rpm离心1min,弃收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
6)加500μl GW1,12000rpm离心1min,弃废液;
7)加500μl GW2,12000rpm离心1min,弃废液,重复洗一次GW2,弃废液;
8)12000rpm离心2min,将收集管丢弃,过滤柱放入新的1.5ml离心管中,置于超净工作台,吹干10min;
9)向过滤柱滤膜上悬空滴加60μl Tris-HCl,静候5min,12000rpm离心2min,丢弃过滤柱,收集滤液即为组织DNA。
2,多重PCR建库
所需样本DNA:至少10ng,浓度在1.8-2.0(A260/280);
第一轮PCR:
SEQ ID NO:1~45所示的上游引物,以及SEQ ID NO:46~90所示的下游引物。其中上游引物的5’端都连接有ACGACGCTCTTCCGATCT接头序列,上游引物的5’端都连接有CGTGTGCTCTTCCGATCT接头序列。
24.5微升1st Mix+0.5微升ACE TAQ酶+10ngDNA,引物浓度为1.5μm,混匀;
①95℃10分钟;
②95℃30秒;
③55℃30秒;
④72℃30秒;
重复步骤②~④30个循环;
⑤72℃5分钟。
结束后进行第二轮PCR
22.5微升2st Mix+0.5微升ACE TAQ酶+5微升第一轮PCR产物+2微升接头引物,引物浓度为1.5μm,混匀。
所用引物分别为:
AP5:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT;
AP7:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT;
其中“IIIIIIII”为index序列,根据需要进行设置。
扩增条件为:
扩增条件为:
①95℃10分钟;
②95℃30秒;
③55℃30秒;
④72℃30秒;
重复步骤②~④20个循环;
⑤72℃5分钟。
3,电泳检测
1)切取合适量的琼脂糖凝胶,放入1×TAE中,大概2min,使TAE侵入孔中。
2)点染色液于一次性手套上,每个1μL左右。
3)取出1×TAE溶液中的琼脂糖凝胶,放置于手套上,取扩增产物3μL与染色液混合,并加入凝胶孔中,第一个孔空出来。
4)取5μL 50bp-Ⅱmaker于第一个凝胶孔中,将凝胶放入电泳槽中,轻缓放入防止孔中样本溢出,进行电泳,恒定电流100mA。
5)5min后将凝胶板取出,放置于照射仪中看DNA条带,保存结果。
6)再将凝胶板取出,继续电泳15min后,再次照胶,观察条带长度,若出现无条带、条带在300bp以下和在300bp到500bp之间没条带,条带不合格。
4,磁珠分选
将磁珠提前半小时拿出平衡到室温。吸取70μL无RNA酶水与30μL扩增产物中。
吸取80μL磁珠(bead2)于100μL上述扩增产物中,涡旋震荡混匀。
室温孵育5min(此时配80%乙醇),短暂离心,放置于磁力架上。
待溶液澄清后,吸取165μL上清于新的PCR单管中,加入25μL磁珠,涡旋震荡混匀,室温孵育5min。将PCR单管短暂离心并置于磁力架上,待溶液澄清后(约3min),小心吸弃上清。
在上述PCR管中加入200μL新配80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30s,待溶液澄清后吸弃上清。
重复上述步骤一次(总共漂洗两次)。
将PCR单管始终置于磁力架中,干燥磁珠5-10min中至无乙醇残留(在干燥3min后吸弃PCR管底部残留液体)。将PCR单管从磁力架上取出,加入30μL无RNA酶水,弹匀,室温放置5min,PCR管置于磁力架上,待溶液澄清后吸取28μL上清液于1.5mlEP管中。
5,浓度检测
6,上机测序,Illumina nextseq500测序仪
7,结果分析与解读
对分布在1p染色体上的29个位点及19q染色体上的16个位点的杂合性进行统计分析。位点状态判定标准如下:当突变的reads数的比例在40%-60%时该位点为杂合状态,当比例大于95%或小于5%时为纯合状态,否则则判定该位点为杂合性缺失状态。
1p/19q杂合性缺失状态判定标准:1p或19q染色体在该范围内无杂合位点,且有5个位点处于杂合性缺失状态。
申请人对临床样本进行分析,其中,代表性的分析结果见表2。
表2
注:物理位置标号所以代表的物理物质与表1是相对应的;结果中1代表该位点为杂合性缺失状态,2代表纯合状态,0代表杂合状态。
其中,每组当中1的数量大于等于5个代表缺失,只要有一个0就代表是杂合的,没有0、均为2则代表纯合。
从表2可知:1组1p19q均未缺失,2组为1p缺失,3组为19q缺失,4组为1p19q均缺失。
图1~6为FISH对上述结果进行验证的结果,其中图1和图2为1组的检测结果,图1中所用探针用于与19q上的核酸片段杂交,图2中所用探针用于与1p上的核酸片段杂交;可见19q和1p均未缺失;图3为2组的检测结果,所用探针用于与1p上的核酸片段杂交,结果显示1p缺失;图4为3组的检测结果,所用探针用于与19q上的核酸片段杂交,结果显示19q缺失;图5和图6为4组的检测结果,图5中所用探针用于与1p上的核酸片段杂交,图6中所用探针用于与19q上的核酸片段杂交,结果显示1p19q均缺失。
图中红色信号点代表1p,19p信息,绿色信号代表1q,19q信息。
杂合性缺失的阳性标准:
1p缺失:1p:1q<0.75;
19q缺失:19q:19p<0.75。
从FISH实验结果看,其与本申请方法结论一致。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
序列表
<110> 嘉兴允英医学检验有限公司
<120> 检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法
<160> 90
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
cattttgtac ggcacggaca a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ggtgccagag ccagatttgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
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<400> 3
ctcactaggc tcccctgatg 20
<210> 4
<211> 17
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<400> 4
ggagccacct gcatccc 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
atctctgcct gttggaatct tcag 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
gacctgagtt caacccctgt 20
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
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<400> 7
tgcctaaaag catttatcct tcatacca 28
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ctgacacagg ccagcctt 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
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<400> 9
gggaatggag tacaagggct at 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
gcagcctaag ctttcattct catc 24
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
atgtggttaa catggattaa tgtggga 27
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
agcatttagt tagaggagag gagagg 26
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 13
tgggctgttt cctcccttct a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 14
gactgaaccc ctgccaacta a 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
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<400> 15
gcagctcgca aatttcaaag tct 23
<210> 16
<211> 22
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<400> 16
ttcccatgca gccctttgaa ta 22
<210> 17
<211> 25
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<400> 17
gcaggttata agggtcttct cgagt 25
<210> 18
<211> 21
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<400> 18
ctgagaggat tctggcacct g 21
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 19
tcaagttaga atgaccactt tccgtatg 28
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 20
gggagatgag ctgaaagttc ca 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 21
caatttgggt agtcacaaac tccat 25
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 22
aaatgacttt ctggaaaatg aggtctattc a 31
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 23
gggacttatt ccacgcttca g 21
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 24
tcttgccttc atcacaggtt gg 22
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 25
ttcacctgtc tcttaccccc ata 23
<210> 26
<211> 27
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<400> 26
acttgctaat tttgtccaaa gggagta 27
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
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<400> 27
ggtaaacaga ggcctagtta agaattcc 28
<210> 28
<211> 19
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<400> 28
gtcgtgtggc agagtgagt 19
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<211> 27
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<400> 29
caaatagaat taccacagca gcctaca 27
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<211> 28
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tgctctatga taaatcagtt gcatctgt 28
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<211> 24
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gagagccatt gtcccaaata tgga 24
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<211> 20
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<400> 32
caccagcctg ctcagtctac 20
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cccaatacct aataaggcat gcgaaa 26
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ctctctcaat tgctaaagcc ataccta 27
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gctcccatgt taccccctag at 22
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cagcacgtag aggtccgt 18
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<400> 37
tttattcatt cctccaaaga gcacca 26
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ccaagctgca tgattgctct tt 22
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ctacggaagc gggagtga 18
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ccctgaggtg gcagcat 17
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cgtgtctttt caaacccaca tcctaa 26
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ggcctggctt tagtcctgt 19
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ggcctggctt tagtcctgt 19
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gtgtgaccct ctccaggatt t 21
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ggtcgagggt gattcgct 18
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<211> 20
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ctctaggctc agggcaagac 20
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aggaagggag atgttaggat gacc 24
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ctaaggttgg tttctgacta agacctaa 28
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ggttgctcag ctccttcct 19
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<400> 50
actcatgtct ctcattcatt cacacaa 27
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<400> 51
gccactttct tgtaaaggtg tgtt 24
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<211> 22
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<400> 52
aggtgcccat cagtttctct tc 22
<210> 53
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<400> 53
tttcacaaat aaagcacagc aagactt 27
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<400> 54
ccccattttc ttccttttct tccatac 27
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<400> 55
tgtatagaca gcacttggct cct 23
<210> 56
<211> 24
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<213> artificial sequence
<400> 56
ctcaggtctc cataagggtc ttct 24
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<211> 20
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<213> artificial sequence
<400> 57
ccagtgtgca ctccagagta 20
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<211> 27
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<213> artificial sequence
<400> 58
gctttccttc tttctggaat ttctgtt 27
<210> 59
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<400> 59
tggataaaga ttgaagagcc acagg 25
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<400> 60
tgagccacat attgggagtt ctagat 26
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<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 61
ccaaggtgtt acattttgtt tcactaca 28
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 62
gcccctgaaa atctggcaac a 21
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
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<400> 63
tcatttgtgt ggaaagtcag aggaa 25
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 64
ctgaggataa agaggtctct tcaactg 27
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 65
catatggccc acctcatgtt ct 22
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 66
acagcaaatt agctcctaac ctaacaaa 28
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 67
tgcaggccta tgggaaatgt tc 22
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 68
ctgcttactt cctcggctct t 21
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 69
tggtgtgaaa gtaggatgaa aacctt 26
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 70
tcctctgtgt ggtttggtaa attacat 27
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 71
ctcctaggtc ccaaagaaat gtgg 24
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 72
tgcatcaatt cattcttaag gttgccta 28
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 73
ggaaagcagg aagaagtcct ca 22
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 74
cggcaagact tctgaaaaga caattta 27
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 75
gccatccaat ggacctttgg g 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 76
tcaactggtc ctctcctacc c 21
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 77
tgctagtcct tcagcaatga gac 23
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 78
tgtttgaggg ataaaacggc atga 24
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 79
tgggaaaacc ttcagatatg gttcag 26
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 80
cgcggtgagg ttgtctagtc 20
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 81
ggctacctct tcgttctgat tgg 23
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 82
ggcatggaaa acttgggtga gt 22
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 83
ccatccgggc tggagga 17
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 84
gttcaggaga ggtcaagcgt 20
<210> 85
<211> 17
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<400> 85
atccagggag ccgcttc 17
<210> 86
<211> 21
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<400> 86
ccagggttgg gaatgcttct c 21
<210> 87
<211> 19
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<213> artificial sequence
<400> 87
ggcctggctt tagtcctgt 19
<210> 88
<211> 28
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<213> artificial sequence
<400> 88
gtgaggaata attcagtcta gttgtgct 28
<210> 89
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 89
cagtcttgtg attctgtctt tctaggatt 29
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 90
aacaccagcc agagcttatt cat 23
Claims (10)
1.引物组,其特征在于,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~45所示的上游引物,以及与其依次对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:46~90所示的下游引物。
2.接头引物组,其特征在于,由权利要求1中所述的上游引物以及下游引物分别添加接头片段得到。
3.引物组,其特征在于,含有权利要求2所述的接头引物组,以及测序引物;
所述测序引物包括与所述接头片段相同的区段或者其互补区段和与测序通道附有的DNA引物配对的序列,以及任选地index序列。
4.用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,其特征在于,含有权利要求3所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,还含有分子量marker、扩增反应液、dNTP、水以及DNA聚合酶中的至少一种。
6.用于检测1p/19q杂合性缺失的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的引物组,还含有分子量marker、修复酶、连接缓冲液、连接酶、dNTP、水、DNA聚合酶以及接头片段中的至少一种。
7.权利要求1或3所述的引物组和/或权利要求2所述的接头引物组在用于制备脑胶质瘤诊断试剂盒中的应用。
8.检测1p/19q杂合性缺失的方法,其特征在于,包括:
a)使用权利要求1或3所述的引物组对待检测样品中的基因组DNA进行扩增;
b)对扩增产物进行测序,根据扩增产物中突变位点所占的比例判定该位点是否为杂合性缺失状态;
所述方法为非诊断目的。
9.根据权利要求8所述的检测1p/19q杂合性缺失的方法,其特征在于,所述方法基于高通量测序技术;
步骤a)还包括使用权利要求2所述的接头引物组对上一步扩增所得产物进行扩增。
10.根据权利要求8所述的检测1p/19q杂合性缺失的方法,其特征在于,所述待检测样品为血液、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织或组织裂解液。
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