CN103805707A - 检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒，本发该扩增体系包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物，通用—特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；通用引物是FluD5-Up，通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；本发明的复合扩增体系及其检测试剂盒克服了不同引物需多种荧光标记的不足，在一个PCR体系内采用单荧光标记一次检测6个1p19q基因位点，结果直观可靠，省时高效，可有效的对染色体1p19q杂合性缺失进行检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR扩增体系，以及使用该扩增体系的检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤（胶质细胞瘤），占颅脑肿瘤的40～50%，是最常见的颅内恶性肿瘤，年发病率约为3～8人/10万人口。世界卫生组织（WHO）将胶质瘤分为4级，恶性度从低度到高度，WHOI级为良性，WHOII级为低度恶性，WHOIII级和WHOIV级为高度恶性。近年来有关胶质瘤(glioma)发生发展的分子生物学研究日渐深入，胶质瘤的神经病理学评估，不再局限于为临床提供关于肿瘤的组织学类型和恶性级别的信息，可能需要越来越多的以组织学为基础的分子标志物的便捷检测。
少突胶质细胞瘤占胶质瘤的5～18%，是胶质瘤的一种独立类型。大多数少突胶质细胞肿瘤存在1号染色体短臂（1p）和19号染色体长臂（19q）的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。1p和19q杂合性缺失检测可用于对肿瘤初发的早期诊断。总体而言，大约80％的WHOII级的少突胶质细胞瘤，60％的WHOIII级的间变型少突胶质细胞瘤，30％～50％的少突星形细胞瘤和20％～30％的间变型少突星形细胞瘤出现1p和19q的缺失，另外小于10％的弥漫性星形细胞瘤，包括胶质母细胞瘤中携带这种遗传改变。研究还发现，恶性胶质瘤的一种亚类具有少突胶质瘤源性，而这种亚类与其他的恶性胶质瘤在基因型上最大的不同在于这种亚类的1p和19q具有较高的杂合性缺失率，分别为40%和60%。
1p和19q杂合性缺失检测还可用于肿瘤复发的诊断，且具有这一分子遗传学改变的病人，其放化疗敏感性较高，预后较好。Caimcross（1988）和Macdonald（1990）研究表明lp/19q杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)是预后良好和PCV化疗方案(甲基苄肼+洛莫司汀+长春新碱)敏感的重要标志。三个前瞻性随机Ⅲ期试验也证实lp/19q联合性缺失在WHOIV级的胶质瘤中是一个强有力的预后指标。研究显示染色体1p/19q杂合性缺失的少突胶质瘤患者对化疗敏感，预后好，生存期长，手术后先行PCV方案或TMZ（替莫唑胺）组成的方案化疗，放疗可推迟，作为复发时的挽救治疗。
2009年NCCN颅内肿瘤临床治疗指南建议lP LOH或lp/19q LOH的少突胶质瘤切除后可以选择单纯化疗。2012年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会中专家称，1p/19q联合缺失的肿瘤患者，联合放化疗是最新的标准治疗。鉴于lp/19q缺失在少突胶质细胞瘤接受辅助治疗的患者中无可争议的预后意义，国外目前已经将1p/19q LOH检测作为常规检测，而国内近几年刚开展1p/19q LOH的检测。
目前，常用于检测lp19q LOH的方法包括：荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)和以PCR为基础的杂合性缺失检测(polymerasechain reaction-loss of heterozygosity，PCR—LOH)，三者的检测结果具有良好的一致性。FISH检测时仅需很小的肿瘤样本，且不需要外周血作对照，但在分析时要考虑细胞断面对结果的影响，同时不同于血液系统肿瘤，实体瘤染色体的制备和显带都比较困难，需要有丰富经验的专业人员操作。CGH检测是比肿瘤细胞核型分析更敏感的检测基因组获得与缺失的方法，但非肿瘤细胞的掺杂会显著降低CGH的敏感性，因此使用时需要结合纤维切割技术，而不能实现便捷、简单的检测。PCR—LOH检测是一项比较成熟的分子生物学技术，以检测者的淋巴细胞或正常组织DNA作对照，通过有无扩增片断的出现判断是否存在某种缺失。常用的判断方法包括：限制性酶切法、银染变性聚丙酰胺凝胶电泳法、荧光标记测序、凝胶电泳法和定量PCR电泳法。但是，由于限制性酶切法与银染凝胶电泳法操作相当繁杂，且结果分析掺杂因素较多，不能便捷、准确的判定测试结果。
鉴于上述情况，提供一种改良的、便捷的、高灵敏度的染色体1p19q杂合性缺失检测试剂盒的发明是势在必行的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有特定核苷酸序列的通用—特异嵌合引物组合，可以有效地减弱引物间的竞争与干扰因素，检测结果准确性和灵敏度高的检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒，该扩增体系可以实现在一个PCR体系内采用单荧光标记一次检测6个1p19q基因位点。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测染色体缺失的复合扩增体系，包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物；
所述通用—特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；所述通用—特异嵌合引物对中的正向引物是Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902，相应的反向引物是D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R；
所述通用引物是FluD5-Up，所述通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；
所述通用—特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下：
Prime Name Prime Sequences（5’-3’）
Up-D1S468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC
D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC
Up-D1S436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC
D1S436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT
Up-D1S489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA
D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC
Up-D19S112 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA
D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT
D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA
D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG
FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。
上述技术方案的一种优选是：上述引物FluD5-Up的浓度是0.9μM～2.0μM。
一种上述技术方案的进一步优选是：所述引物Up-D1S468、Up-D19S217的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶25至1∶15；所述引物Up-D1S436和Up-D1S489的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶200至1∶150；所述引物Up-D19S902的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶120至1∶70；所述引物Up-D19S112的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶300至1∶250；所述引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶5至1∶4。
一种上述技术方案的更进一步优选是：所述引物FluD5-Up的浓度是1.8μM，引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度是0.4μM，引物Up-D1S468和Up-D19S217的浓度是0.08μM，引物Up-D1S436、Up-D1S489的浓度是0.01μM，Up-D19S902的浓度是0.02μM，引物Up-D19S112的浓度是0.007μM。
上述FluD5-Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
上述扩增体系的总体积为10μl～20μl。
上述检测染色体缺失的复合扩增体系还包括PCR缓冲液、1.5mM～2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U～0.6U的热启动酶和10ng～200ng的DNA模板。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述复合扩增体系的检测染色体缺失的试剂盒。
本发明的积极效果在于：
1）本发明检测染色体缺失的复合扩增体系利用荧光标记通用引物结合6对特异性引物建立的多重PCR-CE体系，克服了普通PCR只能在一个反应体系内检测一个基因位点的不足，实现了在一个PCR体系内同时检测6个1p19q基因位点，节约了成本，提高了效率。由于采用了特定的通用—特异嵌合引物，并且应用非生物源性通用引物做单荧光标记，避免了普通多重PCR需进行引物多种荧光标记的繁琐，既减弱了引物间的竞争与干扰因素，又节约了费用。
2）本发明的扩增体系中通用-特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度会直接影响多重PCR的结果，尤为重要。本发明的扩增体系在配制时，使得正向引物Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902的浓度低于通用引物FluD5-Up浓度，并且各个引物的浓度控制在适宜的范围内。引物FluD5-Up的浓度优选1.8μM，引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度优选0.4μM，引物Up-D1S468和Up-D19S217的浓度优选0.08μM，引物Up-D1S436、Up-D1S489的浓度优选0.01μM，Up-D19S902的浓度优选0.02μM，引物Up-D19S112的浓度优选0.007μM，该浓度配比可以有效地减弱了引物间的竞争与干扰因素，使得多重PCR的结果更加可靠。
3） 本发明试剂盒进行片段分析应用的毛细管电泳片段分析技术不同于传统凝胶电泳分析模式，使PCR结果分析更直观、简洁、可靠，易于识别判断，更有利于标准化操作。
4） 本发明检测试剂盒结构简单、操作便捷、使用条件可以模式化，便于大规模推广应用。
附图说明
图1是本发明的检测试剂盒的多重PCR反应原理示意图；
图2是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样的分型图谱；
图3是实施例1的检测试剂盒检测样本1的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图4是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱；
图5是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样的分型图谱；
图6是实施例1的检测试剂盒检测样本2的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图7是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱。
具体实施方式
实施例1
本实施例的检测染色体缺失的检测试剂盒至少由固定在纸质包装盒内的六只装有相应试剂的试管组成，六只试管分别是扩增缓冲液试管、Mg2+试管、dNTP试管、热启动酶试管、引物混合物试管和超纯水试管。上述试管在包装盒内的排列放置的顺序没有特别要求，只要清楚标示即可。
本实施例的检测试剂盒的开发原理及使用方法为：
A.脑胶质瘤1p19q LOH基因位点引物设计、合成及筛选：
根据国际癌症学会推荐的脑胶质瘤1p19q的6个基因（D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217、D19S902）位点进行引物设计。收集脑胶质瘤者静脉全血（抗凝全血）及组织标本（新鲜肿瘤组织或石蜡切片），使用DNA裂解液和蛋白酶K提取上述两种不同性质的人源基因组DNA，获得样本浓度区间为10ng/μl～100ng/μl，高浓度样本用水稀释至100ng/μl；以上述2例待测DNA样品先进行单重扩增筛选，再进行多重扩增，使用Oligo7.0软件进行性能评价，筛选出六对引物。
通用-特异嵌合引物对中的正向引物（Up-STR-F）5’端为通用引物FluD5-Up的序列，3’端为特异引物序列段，分别命名为Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902；其反向引物（STR-R）采用1p19q基因位点特异引物即可，分别命名为D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R。
通用引物采用文献上已记载的引物。通用引物5’端做荧光素标记，分别使用FAM、CY3和CY5报告基团均可，此通用引物命名为FluD5-Up。
B.1p19q LOH基因位点多重PCR-CE体系构建：
本实施例的试剂盒采用的PCR反应体系为多重PCR反应体系，即6个基因位点特异引物和荧光标记通用引物放在同一个PCR管内进行扩增。采用10μl～20μl体系均可较好进行扩增。在考虑成本因素及经过PCR实验反复调整和优化后，优选的多重PCR反应体系总体积为10μl，包括10ng～200ng基因组DNA、PCR缓冲液、2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.5U的热启动酶，以及引物FluD5-Up 1.8μM，D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R、D19S902-R各0.4μM，Up-D1S468、Up-D19S217各0.08μM，Up-D1S436、Up-D1S489各0.01μM，Up-D19S902 0.02M，Up-D19S112 0.007μM。
在多重PCR反应体系中，通用—特异嵌合引物对中的正向引物Up-STR-F的浓度为通用引物FluD5-Up浓度的数分之一，其浓度因各个基因PCR扩增效率的不同来调整。由于Up-STR-F具有1p19q位点互补的基因序列，故PCR反应过程中，引物Up-STR-F和STR-R在热启动酶作用下首先对1p19q基因进行5～10个循环的扩增，产生5’端带有Up的互补片段。当Up-STR-F耗尽后，FluD5-Up和STR-R在热启动酶作用下对上述PCR扩增产物进行后续扩增，产生5’端带有荧光标记的互补基因片段。上述PCR反应的原理如图1所示。
本实施例的检测试剂盒优选的PCR反应条件为：95℃预热5分钟；然后94℃变性10秒，54℃退火10秒，72℃延伸30秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。
经上述步骤所得的PCR产物进行毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)。利用多重荧光PCR结合毛细管电泳技术检测1p19q基因位点，具有高效、稳定、灵敏度高、分析结果可靠等优点。优选的毛细管电泳方案为：每个样本CE体系总体积为20μl，包括上述PCR产物1μl～5μl、DNA-Size标准液0.2μl～0.5μl，及上样缓冲液（Sample Loading Solution，SLS），最后覆盖1滴石蜡油。电泳所得荧光图谱进行片段分析。
C.脑胶质瘤1p19q LOH基因片段分析判断：
将全血和肿瘤组织标本DNA经扩增后进行毛细管电泳，所得图谱进行比对。根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形比较，若肿瘤组织较全血样本出现某一基因条带荧光信号减少50%以上或条带缺失即判断为1p或19q杂合性缺失。
本实施例的检测试剂盒的使用步骤是：先进行脑胶质瘤患者肿瘤组织及对照的DNA提取；再应用多重扩增体系进行扩增；最后扩增产物经毛细管电泳后所得图谱进行1p19q LOH分析判断。
以下是对两例脑胶质瘤患者进行1p/19q LOH检测的具体实施情况：
1、全血和肿瘤组织石蜡切片DNA提取：
取样本1或2全血样本400μl，加入1ml双蒸水，混匀后离心5分钟，弃去上层液1ml，加入400μl裂解液和20μl蛋白酶K，70℃金属浴10分钟，过离心柱，500μl清洗液先后清洗两次后，加入50μl洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值。
取样本1或2的肿瘤组织石蜡切片5片，刮片入1.5ml离心管，加1ml二甲苯脱蜡，1ml乙醇清洗两次后，加400μl裂解液和20μl蛋白酶K，60℃金属浴16小时，过离心柱，500μl清洗液先后清洗两次后，加入50μl洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值。
2、1p/19q LOH检测，具体操作步骤如下：
A.每个反应体系中加入10×PCR缓冲液1μl、100mM Mg2+0.2μl、2.5mM dNTP 0.8μl、5U热启动酶0.1μl；10μM 的Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902分别按1:5、1:40、1:40、1:60、1:5、1:20的稀释比例稀释后各取0.4μl；10μM的D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R各取0.4μl；50μM的FluD5-Up取0.36μl；上述DNA模板2μl；最后补水至10μl。
所采用引物的序列如下（5’-3’）：
D1S468引物
Up-D1S468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC
D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC
D1S436引物
Up-D1S436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC
D1S436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT
D1S489引物
Up-D1S489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA
D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC
D19S112引物
Up-D19S112 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA
D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA
D19S217引物
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT
D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT
D19S902引物
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA
D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG
带荧光标记的通用引物
FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。
B.将PCR反应管置于扩增仪上，运行的PCR反应程序为：95℃预热5分钟；然后94℃变性10秒，54℃退火10秒，72℃延伸30秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟。4℃保存。
C.所得PCR产物置于Beckman GenomelabGeXP遗传分析仪上，按仪器使用说明进行毛细管电泳，每个CE体系总体积为20μl，包括上述PCR产物1μl、DNA-Size标准液0.5μl、Sample Loading Solution 18.5μl，最后覆盖1滴石蜡油。CE所得荧光图谱进行基因片段分析。
3、脑胶质瘤1p19q基因片段分析：
将上述样本1或2的全血和肿瘤组织样本CE图谱进行基因片段分析，根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形作同步比较，如图2至图7所示，横坐标为基因片段碱基数值，纵坐标为荧光数值，横坐标从左到右的基因片段顺序依次为针对D19S112、D1S489、D1S468、D1S436、D19S217、D19S902的扩增片段，其中图2和图5为全血样本基因片段分析图，图3和图6为肿瘤组织样本片段分析图，图4和图7为叠加后的比较图。其中样本1均未出现基因片段的缺失现象，故判定为1p和19q未缺失；样本2的肿瘤组织样本D19S902基因片段出现条带缺失现象，故此判定为19q LOH。
对样本1和2的血样和肿瘤组织样本，分别采用：（1）D1S468引物+通用引物；（2）D1S436引物+通用引物；（3）D1S489引物+通用引物；（4）D19S112引物+通用引物；（5）D19S217引物+通用引物；（6）D19S902引物+通用引物，进行单重PCR扩增后采用毛细管电泳分析，判定结果与上述多重PCR结果一致。
实施例2
本实施例的检测染色体缺失的复合检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
实施例3
本实施例的检测染色体缺失的复合检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
对比例1至对比例3
对比例1至对比例3的检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于：通用—特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
实施例1至3以及对比例1至3的检测试剂盒中的正向引物和反向引物的浓度如表1所示：
表1 引物浓度表
实施例2和3的检测试剂盒的检测结果与实施例1的检测结果相一致，对比例1至3的检测试剂盒的检测结果与实施例1的检测结果有所偏差，如表2所示，由此可知，扩增体系在配制时，使得正向引物Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217、Up-D19S902的浓度必须低于通用引物FluD5-Up浓度，否则会使荧光信号太弱；且各个引物的浓度应控制在适宜的范围内，否则会导致引物间的干扰，在某些组织样本浓度偏低的情况下，更易使某些位点的扩增效率太低而无法辨识，导致无法判定。
实施例1至实施例3通过优化引物浓度使各位点扩增片段的峰型之间达到了平衡。若不同组织基因扩增效率相当，可以将电泳图叠加在一起以便分析，如图4和图7；若其中某一组织扩增效率较低，可以相应放大若干倍数以便分析，放大倍数以目的片段清晰可辨识为标准。
表2 检测结果表
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物；
所述通用—特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；所述通用—特异嵌合引物对中的正向引物是Up-D1S468、Up-D1S436、Up-D1S489、Up-D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902，相应的反向引物是D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R；
所述通用引物是FluD5-Up，所述通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；
所述通用—特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下：
Prime Name Prime Sequences（5’-3’）
Up-D1S468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC
D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC
Up-D1S436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC
D1S436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT
Up-D1S489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA
D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC
Up-D19S112 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA
D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT
D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA
D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG
FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。
2.根据权利要求1所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：所述引物FluD5-Up的浓度是0.9μM～2.0μM。
3.根据权利要求2所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：所述引物Up-D1S468、Up-D19S217的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶25至1∶15；所述引物Up-D1S436和Up-D1S489的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶200至1∶150；所述引物Up-D19S902的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶120至1∶70；所述引物Up-D19S112的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶300至1∶250；所述引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1∶5至1∶4。
4.根据权利要求3所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：所述引物FluD5-Up的浓度是1.8μM，引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度是0.4μM，引物Up-D1S468和Up-D19S217的浓度是0.08μM，引物Up-D1S436和Up-D1S489的浓度是0.01μM，Up-D19S902的浓度是0.02μM，引物Up-D19S112的浓度是0.007μM。
5.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：所述FluD5-Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
6.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：所述扩增体系的总体积为10μl～20μl。
7.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于：还包括PCR缓冲液、1.5mM～2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U～0.6U的热启动酶和10ng～200ng的DNA模板。
8.一种采用如权利要求1所述的复合扩增体系的检测染色体缺失的试剂盒。
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