CN110904226A - 基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体 - Google Patents

基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，包括以下步骤：步骤（1）.提取待检测样本的DNA，采用Qubit 3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；步骤（2）.基因组 DNA 打断后进行末端修复；步骤（3）.接头连接和接头连接产物纯化步骤（4）.预文库扩增后将扩增的预文库纯化；步骤（5）.预文库杂交步骤（6）.捕获洗脱、终文库制备、终文库纯化。本发明基于NGS的SNP分析技术方法使得在70％的正常细胞的背景肿瘤组织中也能可靠地检测1p和/或19q缺失，比基于微卫星的LOH分析更敏感，并且需要更少的DNA，非常适合常规胶质瘤诊断和其他诊断分子病理学应用。

Description

基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体
技术领域
本发明涉及疾病检测技术领域，具体为一种基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体。
背景技术
目前常用于检测脑胶质瘤1p/19q染色体缺失的技术方法主要有：FISH技术、MPLA和微卫星分析。
FISH技术即原位杂交技术，该技术的原理是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。该技术需要1p/19q探针，试验流程是：样本准备-脱蜡-预处理-消化-冲洗-杂交-洗涤-DAPI染色。值得一提的是，该技术是检测胶质瘤1p/19q缺失情况的金标准。
MLPA技术即多重连接探针扩增技术，该技术的原理是探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。目前已经开发了用于脑胶质瘤1p/19q缺失检测的MLPA试剂盒。
实时荧光定量PCR微卫星分析技术，该方法首先选取1号染色体短臂检测区域1p35.1-p36.3，选取D1S214、D1S468、D1S514和D1S2783四个微卫星位点，19号染色体长臂检测区域是19q13.2-q13.42，选取D19S408、D19S418和D19S926三个微卫星位点。探针序列：5’-Fam-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-Tamra-3’。实验采用TaqMan法，使用荧光定量PCR仪进行扩增反应，然后计算出Ct值和标准差，根据相关参考文献可知正常组织DNA Ct95%置信区间为1.58-2.63。循环数低于1.58认为存在缺失。
FISH技术检测胶质瘤1p/19q染色体缺失虽然是检测该分子标志物的金标准，但对胶质瘤的诊断存在几点不足：第一，FISH检测1p/19q染色体缺失流程较为繁琐，所需时间较长；第二FISH检测1p/19q染色体缺失的结果判断过程费时费力，各需要计算100个细胞中的荧光个数。第三胶质瘤的诊断不仅需要用FISH技术检测1p/19q这一分子标志物，还需用别的检测技术检测IDH、TERT、EGFR等分子标志物，单个FISH技术不能满足胶质瘤主要分子标志物的一次性检测。MLPA技术检测胶质瘤1p/19q染色体缺失虽然具有高效、特异、快速和简便的优点，但是该技术对胶质瘤的诊断仍然存在以下缺陷：第一，MLPA的检测需要精准测量DNA的浓度，对样本DNA的要求比较高；第二MLPA只能用于检测基因的缺失或者重复，如1p/19q的缺失，但不能满足胶质瘤其他分子标志的检测，如IDH、TERT和EGFR等。实时荧光定量PCR微卫星分析技术检测胶质瘤1p/19q染色体缺失缺点同样是不能满足一次性进行胶质瘤其他分子标志物IDH、TERT和EGFR等检测。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，包括以下步骤：
步骤（1）. 提取待检测样本的DNA，采用Qubit 3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；
步骤（2）. 基因组 DNA 打断后进行末端修复；
步骤（3）. 接头连接和接头连接产物纯化；
步骤（4）. 预文库扩增后将扩增的预文库纯化；
步骤（5）. 预文库杂交，用排枪 P10 加入转移 6.6μL B 组分至 48 孔板，P10吹打 10次混匀，短暂离心，盖上 8 连管盖，放入 S1000 PCR 仪； 95℃下 5 分钟,至第二步 65℃开始；将相应的 A 组分加到新的 8 连管里，每个样本 13μL, 盖上 8 连管盖，放入 PCR仪另一侧启动程序 65℃孵育 5 分钟；打开 A 组分管盖，将相应的 C 组分，每个样本 1.5μL；加到已含有 A 组分的孔里，吹打 5 次混匀，盖上管盖，65℃ 2 分钟；打开双侧 PCR 仪盖子及相应 8 连管盖，将 A+C 组分一共按每个样本 14μL的体积用 P20 排枪迅速转移到已含有 B 组分的杂交板孔，吹打 5 次混匀，每次取样 A+C 需更换枪头。将八连管在板上盖紧，再贴上剪切成一半的 micro seal B 贴膜以防止蒸干；热盖为 105℃，65℃孵育 16-24 小时；
步骤（6）. 捕获洗脱、终文库制备、终文库纯化。
所述步骤（2）中基因组 DNA 打断采用Covaris 打断仪，检查 Covaris 水槽中注入新的去离子水的液面在 12 刻度水平，确保水面没过打断管玻璃部分；设置冷却温度在2℃~5 ℃，确保使用时温度显示水温在 5 ℃；使用前最少 30min 打开控制面板上的排气按钮，参考 Covaris 仪器使用说明进行实验操作；在 1.5ml 的 PCR 管中将样品使用 1XLow TE Buffer稀释为 50μl/500ng将稀释好的样品小心的加入打断管中。
所述步骤（2）中末端修复方法为依据 Qubit dsDNA HS 试剂盒标准流程，在1.5mL Eppendorf LoBind 管中准备 30~80ng cfDNA 或 200ng 白细胞打断样样本；在1.5mL 管中加入 ddH2O 将样本稀释到 50µL；涡旋振荡 1.5mL 管，台式微型离心机离心1-3 秒；将 1.5mL 管中的 50µL 样本用单通道移液器 P100 转移到 48 孔板中，样本加至管底，做好记录标记样本顺序；在一个新的 1.5mL Eppendorf LoBind 管中配制末端修复和加 A 反应体系混匀液；按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹 1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器 P200 取相应的混匀液均匀分到八连管管底，避免产生气泡；使用八通道移液器 P20 从八连管中吸取 10µL 混匀液至 48 孔板中，上下吹打 10 次，贴膜、刮板至紧密贴合；确保管内无气泡，使用甩板机瞬时离心至 1000rpm 保持 3s。48 孔板放入 PCR仪 Bio-Rad T100或AB Veriti 中， 使用程序 ”ERA”，具体为85℃热盖，20℃下30 分钟，65℃下30 分钟， 4℃ Hold；2 小时内进入下一步。
所述步骤（3）将完成反应程序”ERA“的 48 孔板从 PCR 仪取出，置于 PCR 管架上，甩板机离心至 1000rpm 保持 3s，小心撕去封膜，冰上备用；冰上1.5mL Eppendorf LoBind管中配制接头连接反应体系混匀液，按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹 1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器 P200 取相应的混匀液到八连管中；使用八通道移液器P200从八连管中吸取 50µL 混匀液至上述 48 孔板中，上下吹打 10 次，贴膜（micro seal B）刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心 1000rpm 3s；
将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本需要 88 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入2400µL磁珠；从 PCR 仪上取出 48 孔板，置与 PCR 管架上，1000rpm 3s，小心撕去贴膜。用八通道移液器 P200 从加样槽中吸取 88 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中；八通道移液器 P200 调至量程 180 µL，上下吹打 10 次；48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s、置于室温 10 min；10 min 后，弃膜。48 孔板置于 96 孔板磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上；采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入 200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇；将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准。在加样槽中加入适量的 EB 洗脱液。用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入 28µL EB 溶液，盖上八连管盖，vortex 5s 左右，瞬离 1000rpm 3s； 将 48 孔板置于室温孵育 2 min；小心撕去八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清。移取上清 27.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
所述步骤（4）中准备反应体系混匀液，手指轻弹 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机瞬离 3s，均匀分装至八连管中；在“接头连接产物纯化”这一步中的 48 孔板中，含 27.5μL 纯化产物，每孔用八通道移液器 P200 加入 22.5 μL 反应混匀液，上下吹打 10 次；贴膜、刮板至紧密贴合。管内无气泡，甩板机离心 1000rpm3s；将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中；每个样本加入 60 µL SPB 磁珠；从 PCR 仪上取出 48 孔板，1000rpm 3s，小心撕去贴膜。用八通道移液器P200 从加样操中吸取 60 µLSPB 磁珠加入到 48 孔板中，上下吹打 10 次；孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s，置于室温 10min；48 孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上，采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入 200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗。待1 min，弃乙醇，将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准；在加样槽中加入适量的 ddH2O，用八通道移液器P200 在48 孔板中加入16µL ddH2O，该上八连管盖，vortex，5s 左右，瞬离 1000rpm 3s，将 48 孔板置于室温孵育 2 min，弃膜，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 15.5 µL至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
所述步骤（5）中如果预文库产量大于 1500ng，移取 7.5 μL 纯化后预文库到新的48 孔板中；如果预文库产量大于 750ng 但小于 1500ng，则取 750ng 纯化后预文库浓缩到 7.5μL，然后移到新的 48 孔板中；如果预文库产量小于 750ng，但大于 300ng，可尝试杂交，则将全部纯化后预文库浓缩到 7.5μL，然后移到新的 48 孔板中。
所述步骤（5）中组分 A：SureSelect Hyb #1(orange cap) 6.63 μL、SureSelectHyb #2(red cap) 0.27μL、SureSelect Hyb #3(yellow cap） 2.65 μL、SureSelect Hyb #4(black cap) 3.45 μL；
组分 B: SureSelect Indexing Block #1(green cap) 2.5 μL、SureSelect Block #2(blue cap) 2.5 μL、SureSelect Block #3(brown cap) 0.6 μL、BLK 1 μL；
组分 C: 25%RNase Block solution 0.5 μL、SureSelect Capture Library 1 μL。
所述步骤（6）中按600µL /样本的用量将SureSelect Wash Buffer 2 置于 15mL锥形管内金属加热器 65℃孵育，取出 SCB /T1 磁珠，上下颠倒混匀 5 次，涡旋混匀 10秒，室温静置半小时以上，涡旋混匀 10 秒, 按样品数分装入 1.5ml LoBind 管，每个样品需 25 µL，每个 Lobind 管最多放 150µL，静置磁力架上 3 分钟，弃上清；每 25µL 原始磁珠加 150 µL SureSelect Binding Buffer，涡旋混匀 3 秒，短暂离心，静置磁力架上 3分钟，弃上清；重悬 SCB，加入加样槽中，排枪分装 150µL /管于 48 孔板，含 28µL 杂交液中，吹打 10下，贴膜，1000rpm 瞬离，置于恒温金属浴上，室温 300rpm 孵育 30 分钟，甩板机上瞬离 2000rpm 1min 后，置于磁力架上静置 5 min，弃上清；将 SureSelect WashBuffer 1 倒入加样槽中，使用 P200 排枪每个样本孔中加 150 µL SureSelect WashBuffer 1，移液器调到 140µL 上下吹打混匀 10 次，贴膜，甩板机瞬离 2000rpm 3 s，放置常温金属浴上孵育， 300 rpm 15 min，2000rpm 1min，磁力架上静置 5 分钟，弃上清；将已预热至 65℃的适量 SureSelect Wash Buffer 2 倒入加样槽中。使用P200 排枪每个样本孔中加 150 µL SureSelect Wash Buffer2，移液器调到130µL 上下吹打混匀 10次。贴膜，甩板机瞬离 1000rpm 3 s。放置 PCR仪上 65℃孵育 10 min， 甩板机瞬离 2000rpm 1min，置于磁力架上，八通道移液器 P200 吸取并弃掉上清，重复 SureSelect Wash Buffer2 操作三次，共四次；甩板机瞬离 2000rpm 1 min，置于磁力架上，使用 P20 排枪吸取残留液体。样本孔中加 19 µL EB，排枪吹打混匀，重悬 SCB 磁珠；
将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化，将PCR 产物置于微型离心机快速离心 1s，静置在 96 孔磁力架上 5 分钟，吸取 50 µL 上清加入到新的 48 孔板中。在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本加入 50 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入1800µL 左右磁珠，用八通道移液器 P200 从加样操中吸取 50 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中，八通道移液器P200调至量程 80 µL，上下吹打 10 次，48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s，置于室温 10 min；48孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清，弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上。采用移八通道移液器P200 在样本孔中加入200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2-5 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准，在加样槽中加入适量的 EB，用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入20µL EB，盖上八连管盖，vortex,5s 左右，1000rpm 3s， 将 48 孔板置于室温孵育 2 min，小心弃掉八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 19.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠，取 2µL 纯化后的文库到一个新的 1.5mL EP 管中，加入 10µLddH2O（1µL）用作 Qubit 定量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于NGS的SNP分析技术方法使得在70％的正常细胞的背景肿瘤组织中也能可靠地检测1p和/或19q缺失，比基于微卫星的LOH分析更敏感，并且需要更少的DNA。 这种特异性和灵敏的SNP测定广泛适用于多个基因组区域的同时等位基因失衡分析，并且可以容易地并入NGS突变分析的panel中。 这种整合NGS分析中的panel突变和染色体不平衡分析非常适合常规胶质瘤诊断和其他诊断分子病理学应用。
附图说明
图1为本发明的SNP选点示意图。
图2为本发明的微卫星标记引物示意图。
具体实施方式
为了使本发明的实现技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明，在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接可以是机械连接，也可以是电连接;可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以两个元件内部的连通。
如图1、图2所示，基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，包括以下步骤：
步骤（1）. 提取待检测样本的DNA，采用Qubit 3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；
步骤（2）. 基因组 DNA 打断后进行末端修复；基因组 DNA 打断采用Covaris 打断仪，检查 Covaris 水槽中注入新的去离子水的液面在 12 刻度水平，确保水面没过打断管玻璃部分；设置冷却温度在 2℃~5 ℃，确保使用时温度显示水温在 5 ℃；使用前最少 30min打开控制面板上的排气按钮，参考 Covaris 仪器使用说明进行实验操作；在 1.5ml 的PCR 管中将样品使用 1X Low TE Buffer稀释为 50 μl/500ng将稀释好的样品小心的加入打断管中。末端修复方法为依据 Qubit dsDNA HS 试剂盒标准流程，在 1.5mL EppendorfLoBind 管中准备 30~80ng cfDNA 或 200ng 白细胞打断样样本；在 1.5mL 管中加入ddH2O 将样本稀释到 50µL；涡旋振荡 1.5mL 管，台式微型离心机离心 1-3 秒；将 1.5mL管中的 50µL 样本用单通道移液器 P100 转移到 48 孔板中，样本加至管底，做好记录标记样本顺序；在一个新的 1.5mL Eppendorf LoBind 管中配制末端修复和加 A 反应体系混匀液；按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器P200 取相应的混匀液均匀分到八连管管底，避免产生气泡；使用八通道移液器 P20 从八连管中吸取 10µL 混匀液至 48 孔板中，上下吹打 10 次，贴膜、刮板至紧密贴合；确保管内无气泡，使用甩板机瞬时离心至 1000rpm 保持 3s。48 孔板放入 PCR 仪 Bio-Rad T100或AB Veriti 中， 使用程序 ”ERA”，具体为85℃热盖，20℃下30 分钟，65℃下30 分钟， 4℃ Hold；2 小时内进入下一步。
步骤（3）. 接头连接和接头连接产物纯化；将完成反应程序”ERA“的 48 孔板从 PCR仪取出，置于 PCR 管架上，甩板机离心至 1000rpm 保持 3s，小心撕去封膜，冰上备用；冰上1.5mL Eppendorf LoBind 管中配制接头连接反应体系混匀液，按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹 1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器 P200 取相应的混匀液到八连管中；使用八通道移液器P200 从八连管中吸取 50µL 混匀液至上述 48 孔板中，上下吹打10 次，贴膜（micro seal B）刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心 1000rpm 3s；
将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本需要 88 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入2400µL磁珠；从 PCR 仪上取出 48 孔板，置与 PCR 管架上，1000rpm 3s，小心撕去贴膜。用八通道移液器 P200 从加样槽中吸取 88 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中；八通道移液器 P200 调至量程 180 µL，上下吹打 10 次；48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s、置于室温 10 min；10 min 后，弃膜。48 孔板置于 96 孔板磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上；采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入 200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇；将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准。在加样槽中加入适量的 EB 洗脱液。用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入 28µL EB 溶液，盖上八连管盖，vortex 5s 左右，瞬离 1000rpm 3s； 将 48 孔板置于室温孵育 2 min；小心撕去八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清。移取上清 27.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
步骤（4）. 预文库扩增后将扩增的预文库纯化；准备反应体系混匀液，手指轻弹3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机瞬离 3s，均匀分装至八连管中；在“接头连接产物纯化”这一步中的 48 孔板中，含 27.5μL 纯化产物，每孔用八通道移液器 P200 加入 22.5 μL 反应混匀液，上下吹打 10 次；贴膜、刮板至紧密贴合。管内无气泡，甩板机离心 1000rpm3s；将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中；每个样本加入 60 µL SPB 磁珠；从 PCR 仪上取出 48 孔板，1000rpm 3s，小心撕去贴膜。用八通道移液器P200从加样操中吸取 60 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中，上下吹打 10 次；孔板贴膜，瞬离1000rpm 3 s，置于室温 10 min；48 孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上，采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入 200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动48 孔板使磁珠充分浸洗。待 1 min，弃乙醇，将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准；在加样槽中加入适量的 ddH2O，用八通道移液器P200 在48 孔板中加入16µL ddH2O，该上八连管盖，vortex，5s 左右，瞬离1000rpm 3s，将 48 孔板置于室温孵育 2 min，弃膜，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 15.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
步骤（5）. 预文库杂交，用排枪 P10 加入转移 6.6μL B 组分至 48 孔板，P10吹打 10 次混匀，短暂离心，盖上 8 连管盖，放入 S1000 PCR 仪； 95℃下 5 分钟,至第二步65℃开始；将相应的 A 组分加到新的 8 连管里，每个样本 13μL, 盖上 8 连管盖，放入PCR 仪另一侧启动程序 65℃孵育 5 分钟；打开 A 组分管盖，将相应的 C 组分，每个样本1.5μL；加到已含有 A 组分的孔里，吹打 5 次混匀，盖上管盖，65℃ 2 分钟；打开双侧 PCR仪盖子及相应 8 连管盖，将 A+C 组分一共按每个样本 14μL的体积用 P20 排枪迅速转移到已含有 B 组分的杂交板孔，吹打 5 次混匀，每次取样 A+C 需更换枪头。将八连管在板上盖紧，再贴上剪切成一半的 micro seal B 贴膜以防止蒸干；热盖为 105℃，65℃孵育16-24 小时；
步骤（6）. 捕获洗脱、终文库制备、终文库纯化；按600µL /样本的用量将SureSelectWash Buffer 2 置于 15mL 锥形管内金属加热器 65℃孵育，取出 SCB /T1 磁珠，上下颠倒混匀 5 次，涡旋混匀 10 秒，室温静置半小时以上，涡旋混匀 10 秒, 按样品数分装入1.5ml LoBind 管，每个样品需 25 µL，每个 Lobind 管最多放 150µL，静置磁力架上 3 分钟，弃上清；每 25µL 原始磁珠加 150 µL SureSelect Binding Buffer，涡旋混匀 3 秒，短暂离心，静置磁力架上 3 分钟，弃上清；重悬 SCB，加入加样槽中，排枪分装 150µL /管于 48 孔板，含 28µL 杂交液中，吹打 10下，贴膜，1000rpm 瞬离，置于恒温金属浴上，室温300rpm 孵育 30 分钟，甩板机上瞬离 2000rpm 1min 后，置于磁力架上静置 5 min，弃上清；将 SureSelect Wash Buffer 1 倒入加样槽中，使用 P200 排枪每个样本孔中加 150µL SureSelect Wash Buffer 1，移液器调到 140µL 上下吹打混匀 10 次，贴膜，甩板机瞬离 2000rpm 3 s，放置常温金属浴上孵育， 300 rpm 15 min，2000rpm 1min，磁力架上静置5 分钟，弃上清；将已预热至 65℃的适量 SureSelect Wash Buffer 2 倒入加样槽中。使用P200 排枪每个样本孔中加 150 µL SureSelect Wash Buffer2，移液器调到130µL 上下吹打混匀 10次。贴膜，甩板机瞬离 1000rpm 3 s。放置 PCR仪上 65℃孵育 10 min， 甩板机瞬离 2000rpm 1 min，置于磁力架上，八通道移液器 P200 吸取并弃掉上清，重复SureSelect Wash Buffer 2 操作三次，共四次；甩板机瞬离 2000rpm 1 min，置于磁力架上，使用 P20 排枪吸取残留液体。样本孔中加 19 µL EB，排枪吹打混匀，重悬 SCB 磁珠；
将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化，将PCR 产物置于微型离心机快速离心 1s，静置在 96 孔磁力架上 5 分钟，吸取 50 µL 上清加入到新的 48 孔板中。在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本加入 50 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入1800µL 左右磁珠，用八通道移液器 P200 从加样操中吸取 50 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中，八通道移液器P200调至量程 80 µL，上下吹打 10 次，48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s，置于室温 10 min；48孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清，弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上。采用移八通道移液器P200 在样本孔中加入200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2-5 min，使磁珠干燥。以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准，在加样槽中加入适量的 EB，用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入20µL EB，盖上八连管盖，vortex,5s 左右，1000rpm 3s， 将 48 孔板置于室温孵育 2 min，小心弃掉八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 19.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠，取 2µL 纯化后的文库到一个新的 1.5mL EP 管中，加入 10µLddH2O（1µL）用作 Qubit 定量。
所述步骤（5）中如果预文库产量大于 1500ng，移取 7.5 μL 纯化后预文库到新的48 孔板中；如果预文库产量大于 750ng 但小于 1500ng，则取 750ng 纯化后预文库浓缩到 7.5μL，然后移到新的 48 孔板中；如果预文库产量小于 750ng，但大于 300ng，可尝试杂交，则将全部纯化后预文库浓缩到 7.5μL，然后移到新的 48 孔板中。
所述步骤（5）中组分 A：SureSelect Hyb #1(orange cap) 6.63 μL、SureSelectHyb #2(red cap)0.27μL、SureSelect Hyb #3(yellow cap） 2.65 μL、SureSelect Hyb #4(black cap) 3.45 μL；
组分 B: SureSelect Indexing Block #1(green cap) 2.5 μL、SureSelect Block #2(blue cap) 2.5 μL、SureSelect Block #3(brown cap) 0.6 μL、BLK 1 μL；
组分 C: 25%RNase Block solution 0.5 μL、SureSelect Capture Library 1 μL。
本发明利用AmpliSeq Designer2.0设计一个专门针对染色体1p和19q上的SNP引物panel。通过NCBI SNP数据库选择两条染色体上的高度多态性SNP，其具有至少45％的全局次要等位基因频率，以在每个测定中获得大量信息性SNP。染色体1p和19q的平均SNP密度任意设定为每3.5Mb约1个SNP和每2Mb 1个SNP，在染色体1p上产生总共29个SNP，在染色体19q上产生16个SNP，覆盖整个染色体臂（见图1）。选择的SNP及其染色体定位（SNP数据库138）如图2所示。
使用Ion Torrent Personal Genome Machine和供应商的材料和方案（LifeTechnologies，Carlsbad，CA）通过半导体测序进行下一代测序。使用的DNA在1到10 ng之间变化，取决于可用的组织或DNA的量。使用AmpliSeq Library Kit 2.0-384 LV和IonPersonal Genome Machine Template OT2 200 kit连续进行文库和模板制备。使用Ion318v2芯片上的Ion Personal Genome Machine Sequencing 200 Kit v2对模板进行测序。使用Variant Caller v3.6（Life Technologies）分析序列信息，并使用ANNOVAR在本地Galaxy管道中注释变体。
由于NGS分析的半定量性质，甚至更低的DNA质量，当杂合SNP的变体B等位基因频率高于55％或低于45％时，SNP被认为是不平衡的或相对丢失的。所有变异频率在45％和55％之间被认为不是异常的。如果没有另外说明，截止线表示为5％和95％。这些值不是绝对的，但有助于解释结果。 典型的1p和19q的少突胶质细胞共同缺失定义为两条染色体上相似程度的所有信息性SNP的不平衡。仅当至少两个连续的信息性SNP显示不平衡以最小化表观缺失或不平衡是优先扩增其中一个等位基因的结果时，才考虑部分等位基因失衡或缺失。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）. 提取待检测样本的DNA，采用Qubit 3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；
步骤（2）. 基因组 DNA 打断后进行末端修复；
步骤（3）. 接头连接和接头连接产物纯化；
步骤（4）. 预文库扩增后将扩增的预文库纯化；
步骤（5）. 预文库杂交，用排枪 P10 加入转移 6.6μL B 组分至 48 孔板，P10吹打 10次混匀，短暂离心，盖上 8 连管盖，放入 S1000 PCR 仪； 95℃下 5 分钟,至第二步 65℃开始；将相应的 A 组分加到新的 8 连管里，每个样本 13μL, 盖上 8 连管盖，放入 PCR仪另一侧启动程序 65℃孵育 5 分钟；打开 A 组分管盖，将相应的 C 组分，每个样本 1.5μL；加到已含有 A 组分的孔里，吹打 5 次混匀，盖上管盖，65℃ 2 分钟；打开双侧 PCR 仪盖子及相应 8 连管盖，将 A+C 组分一共按每个样本 14μL的体积用 P20 排枪迅速转移到已含有 B 组分的杂交板孔，吹打 5 次混匀，每次取样 A+C 需更换枪头；将八连管在板上盖紧，再贴上剪切成一半的 micro seal B 贴膜以防止蒸干；热盖为 105℃，65℃孵育 16-24 小时；
步骤（6）. 捕获洗脱、终文库制备、终文库纯化。
2.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（2）中基因组 DNA 打断采用Covaris 打断仪，检查 Covaris 水槽中注入新的去离子水的液面在 12 刻度水平，确保水面没过打断管玻璃部分；设置冷却温度在 2℃~5 ℃，确保使用时温度显示水温在 5 ℃；使用前最少 30min 打开控制面板上的排气按钮，参考 Covaris 仪器使用说明进行实验操作；在 1.5ml 的 PCR 管中将样品使用 1X LowTE Buffer稀释为 50 μl/500ng将稀释好的样品小心的加入打断管中。
3.根据权利要求2所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（2）中末端修复方法为依据 Qubit dsDNA HS 试剂盒标准流程，在 1.5mLEppendorf LoBind 管中准备 30~80ng cfDNA 或 200ng 白细胞打断样样本；在 1.5mL 管中加入 ddH2O 将样本稀释到 50µL；涡旋振荡 1.5mL 管，台式微型离心机离心 1-3 秒；将1.5mL 管中的 50µL 样本用单通道移液器 P100 转移到 48 孔板中，样本加至管底，做好记录标记样本顺序；在一个新的 1.5mL Eppendorf LoBind 管中配制末端修复和加 A 反应体系混匀液；按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹 1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器 P200 取相应的混匀液均匀分到八连管管底，避免产生气泡；使用八通道移液器P20 从八连管中吸取 10µL 混匀液至 48 孔板中，上下吹打 10 次，贴膜、刮板至紧密贴合；确保管内无气泡，使用甩板机瞬时离心至 1000rpm 保持 3s；48 孔板放入 PCR 仪Bio-Rad T100或AB Veriti 中， 使用程序 ”ERA”，具体为85℃热盖，20℃下30 分钟，65℃下30 分钟， 4℃ Hold；2 小时内进入下一步。
4.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（3）将完成反应程序”ERA“的 48 孔板从 PCR 仪取出，置于 PCR 管架上，甩板机离心至 1000rpm 保持 3s，小心撕去封膜，冰上备用；冰上1.5mL Eppendorf LoBind管中配制接头连接反应体系混匀液，按 1：1.1 的比例配制混匀液，如 24 个样本建库，则配制 27 份混匀液；手指轻弹 1.5mL 管 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机离心1-3 秒；用单通道移液器 P200 取相应的混匀液到八连管中；使用八通道移液器P200从八连管中吸取 50µL 混匀液至上述 48 孔板中，上下吹打 10 次，贴膜（micro seal B）刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心 1000rpm 3s；
将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本需要 88 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入2400µL磁珠；从 PCR 仪上取出 48 孔板，置与 PCR 管架上，1000rpm 3s，小心撕去贴膜；用八通道移液器 P200 从加样槽中吸取 88 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中；八通道移液器 P200 调至量程 180 µL，上下吹打 10 次；48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s、置于室温 10 min；10 min 后，弃膜；48 孔板置于 96 孔板磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上；采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入 200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇；将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥；以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准；在加样槽中加入适量的 EB 洗脱液；用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入 28µL EB 溶液，盖上八连管盖，vortex 5s 左右，瞬离 1000rpm 3s； 将 48 孔板置于室温孵育 2 min；小心撕去八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 27.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
5.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（4）中准备反应体系混匀液，手指轻弹 3-5 次，上下颠倒混匀 2-3 次，台式微型离心机瞬离 3s，均匀分装至八连管中；在“接头连接产物纯化”这一步中的 48 孔板中，含 27.5μL 纯化产物，每孔用八通道移液器 P200 加入 22.5 μL 反应混匀液，上下吹打 10 次；贴膜、刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心 1000rpm3s；将 SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化；在用单通道移液器 P1000吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中；每个样本加入 60 µL SPB 磁珠；从 PCR 仪上取出 48孔板，1000rpm 3s，小心撕去贴膜；用八通道移液器P200 从加样操中吸取 60 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中，上下吹打 10 次；孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s，置于室温 10 min；48孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上，采用移八通道移液器 P200 在样本孔中加入200µL 新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1min，弃乙醇，将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2 min，使磁珠干燥；以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准；在加样槽中加入适量的 ddH2O，用八通道移液器P200 在48 孔板中加入16µL ddH2O，该上八连管盖，vortex，5s 左右，瞬离 1000rpm 3s，将 48 孔板置于室温孵育 2 min，弃膜，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 15.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠。
6.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（5）中如果预文库产量大于 1500ng，移取 7.5 μL 纯化后预文库到新的 48孔板中；如果预文库产量大于 750ng 但小于 1500ng，则取 750ng 纯化后预文库浓缩到7.5μL，然后移到新的 48 孔板中；如果预文库产量小于 750ng，但大于 300ng，可尝试杂交，则将全部纯化后预文库浓缩到 7.5μL，然后移到新的 48 孔板中。
7.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（5）中组分 A：SureSelect Hyb #1(orange cap) 6.63 μL、SureSelect Hyb#2(red cap) 0.27μL、SureSelect Hyb #3(yellow cap） 2.65 μL、SureSelect Hyb #4(black cap) 3.45 μL；
组分 B: SureSelect Indexing Block #1(green cap) 2.5 μL、SureSelect Block #2(blue cap) 2.5 μL、SureSelect Block #3(brown cap) 0.6 μL、BLK 1 μL；
组分 C: 25%RNase Block solution 0.5 μL、SureSelect Capture Library 1 μL。
8.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（6）中按600µL /样本的用量将SureSelect Wash Buffer 2 置于 15mL 锥形管内金属加热器 65℃孵育，取出 SCB /T1 磁珠，上下颠倒混匀 5 次，涡旋混匀 10 秒，室温静置半小时以上，涡旋混匀 10 秒, 按样品数分装入 1.5ml LoBind 管，每个样品需25 µL，每个 Lobind 管最多放 150µL，静置磁力架上 3 分钟，弃上清；每 25µL 原始磁珠加 150 µL SureSelect Binding Buffer，涡旋混匀 3 秒，短暂离心，静置磁力架上 3 分钟，弃上清；重悬 SCB，加入加样槽中，排枪分装 150µL /管于 48 孔板，含 28µL 杂交液中，吹打 10下，贴膜，1000rpm 瞬离，置于恒温金属浴上，室温 300rpm 孵育 30 分钟，甩板机上瞬离 2000rpm 1min 后，置于磁力架上静置 5 min，弃上清；将 SureSelect WashBuffer 1 倒入加样槽中，使用 P200 排枪每个样本孔中加 150 µL SureSelect WashBuffer 1，移液器调到 140µL 上下吹打混匀 10 次，贴膜，甩板机瞬离 2000rpm 3 s，放置常温金属浴上孵育， 300 rpm 15 min，2000rpm 1min，磁力架上静置 5 分钟，弃上清；将已预热至 65℃的适量 SureSelect Wash Buffer 2 倒入加样槽中；使用P200 排枪每个样本孔中加 150 µL SureSelect Wash Buffer2，移液器调到130µL 上下吹打混匀 10次；贴膜，甩板机瞬离 1000rpm 3 s；放置 PCR仪上 65℃孵育 10 min， 甩板机瞬离 2000rpm 1min，置于磁力架上，八通道移液器 P200 吸取并弃掉上清，重复 SureSelect Wash Buffer2 操作三次，共四次；甩板机瞬离 2000rpm 1 min，置于磁力架上，使用 P20 排枪吸取残留液体；样本孔中加 19 µL EB，排枪吹打混匀，重悬 SCB 磁珠；
SPB 磁珠上下颠倒 2-3 次，在 VORTEX 最大转速下混匀 5-10 s，使其均一化，将 PCR产物置于微型离心机快速离心 1s，静置在 96 孔磁力架上 5 分钟，吸取 50 µL 上清加入到新的 48 孔板中；在用单通道移液器 P1000 吸取相应的 SPB 磁珠到加样槽中，每个样本加入 50 µL SPB 磁珠，如 24 个样本则在加样槽中加入1800µL 左右磁珠，用八通道移液器 P200 从加样操中吸取 50 µL SPB 磁珠加入到 48 孔板中，八通道移液器P200 调至量程 80 µL，上下吹打 10 次，48 孔板贴膜，瞬离 1000rpm 3 s，置于室温 10 min；48 孔板置于 96 孔磁力架上，待溶液澄清，弃膜，使用八通道移液器 P200 调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48 孔板仍置于磁力架上；采用移八通道移液器P200 在样本孔中加入200µL新鲜配制的 75%乙醇；在磁力架上来回水平移动 48 孔板使磁珠充分浸洗；待 1 min，弃乙醇；将 48 孔板静置在磁力架上 1min，使用八通道移液器 P20 除净残留乙醇，将 48 孔板从磁力架上取下，置于 PCR 板架上室温 2-5 min，使磁珠干燥，以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准，在加样槽中加入适量的 EB，用八通道移液器 P200 在 48 孔板中加入20µL EB，盖上八连管盖，vortex,5s 左右，1000rpm 3s， 将 48 孔板置于室温孵育 2 min，小心弃掉八连管盖，将 48 孔板置于磁力架 2min，直至溶液澄清，移取上清 19.5 µL 至新的 48 孔板中，勿吸磁珠，取 2µL 纯化后的文库到一个新的 1.5mL EP 管中，加入 10µLddH2O（1µL）用作 Qubit 定量。
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