CN110684833A - 一种评价促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,包括如下步骤:(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;(2)质检合格后进行多重目的基因变异位点的扩增或采用特异性核酸探针对目的基因进行富集,根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行一代测序,采用一代测序对特定位点进行扩增和检测;(3)根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行二代测序或基因芯片分析,对多重PCR产物进行测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;(4)通过药物基因组数据库和优生贝基因数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体地说涉及一种评价促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法。
背景技术
无排卵是引起不孕症的常见原因,占不孕症20%-40%左右,导致无排卵的原因繁多,根据世界卫生组织建议,无排卵病因可归纳为以下3类:下丘脑-垂体功能衰竭导致的性腺功能低落,其特点是血LH、FSH及雌激素水平低下,称为低促性腺素性性腺功能低落;下丘脑-垂体功能失调,特点是促性腺激素LH:FSH分泌比例异常,如多囊卵巢综合征,LH分泌频率及幅度异常增加,而FSH分泌相对不足,造成血LH/FSH比例倒置的一类,这类患者雌激素水平相对于卵泡早、中期水平;卵巢功能衰竭,其特点是血FSH水平升高、雌激素水平低下,并引起先天性性腺发育不全或卵巢发育不良及卵巢早衰等。此外,还有一类特殊类型,即高泌乳素血症性无排卵,包括垂体微腺瘤引起的高泌乳素血症。对于单纯因无排卵所致的不孕症,分析其原因,针对性的选择促排卵药物,常可获得理想的排卵率及妊娠率。
近20年来,相关药物诱发排卵研究进展喜人,目前临床引用诱导排卵常用的药物和激素有克罗米芬、促性腺激素类、促性腺激素释放激素类、多巴胺受体激动剂、芳香化酶抑制剂-来曲唑、胰岛素增敏剂、中药复方等。促排卵药物和方案不断应用,促进了辅助生殖技术(IVF)的快速进步。控制性促排卵和辅助生殖技术为不孕不育症的治疗带来了希望。然而,临床研究发现不同的人群促排卵效果具有较大的差异,辅助生殖的预期结果很大程度上取决于促排卵的效果,即卵子获取数量。促排卵药物有很多种,其中外源性促性腺激素用于诱导卵泡发生,女性人群中对该激素的刺激反应差异很大,很难预测促排卵效果。目前,有报道称通过使用母亲年龄和卵巢储备能力作为促排卵药物效果的预测因子,但是由于年龄和卵巢储备能力缺乏特异性,难以精准地预测个体对促排卵药物的敏感性和副作用。因此,迫切需要寻找一个或一些最佳的预测因子。药物遗传学研究表明个体遗传变异对控制性促排卵的结果有显著的影响,所以根据患者个体化的遗传背景检测情况,制定精准的促排卵用药方案是可能的,也是十分必要的。
现有技术中还没有根据药物基因组和个体化遗传学差异进行基因检测结果评估促排卵药物个体敏感性和副反应的成熟的方案。
发明内容
为了克服现有技术中这部分的缺失及不足,本发明提供一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,通过基因检测技术,评价不同个体口服或注射促排卵药物敏感性差异;通过基因检测技术,对不同类型的促排卵药副反应进行评价;指导临床医生制定个体化的促排卵用药方案,降低过度刺激综合征、肿瘤发生风险等副反应。
本发明的目的在于提供一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,包括如下步骤:
(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;
(2)质检合格后进行多重目的基因变异位点的扩增或采用特异性核酸探针对目的基因进行富集,根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行一代测序,采用一代测序对特定位点进行扩增和检测;
(3)根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行二代测序或基因芯片分析,对多重PCR产物进行测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;
(4)通过药物基因组数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
优选地,所述步骤(1)包括:采用吸附柱或磁珠法针对唾液、外周血、口腔黏膜细胞、血卡多种样本类型进行DNA提取、纯化和定量,使用Nanodrop分光光度计进行定量,吸光度OD260/OD280在1.6-2.2之间,OD260/OD230在 1.5-3.0之间即为合格,取适量DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测,以出现单一条带且位于目标DNA长度范围内为合格;通过多重PCR扩增配合sanger测序、基因芯片检测、qPCR和质谱检测技术进行检测,所述sanger测序包括:在所述电泳检测合格后进行测序,按照样品接收单填写的样本类型、样本名称、片段长度、引物名称及备注切胶纯化进行sanger测序;针对待检测基因和位点序列,设计正向引物和反向引物;对设计好的引物进行合成和质检。
优选地,所述步骤(2)包括:取适量的DNA模板,建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增,多重PCR实验完成后,取1微升扩增产物DNA 进行凝胶电泳质检。
优选地,建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增包括:将如下组分加到0.2mL PCR管或八联排管中,所述组分包括10μL含染料的2× GoldStar Best MasterMix,1μL COS-1或COS-2Prime,每个反应0.4pM引物, 30ng DNA模板以及上限为20μL ddH2O,其中PCR反应程序包括:
步骤1,95℃下进行预变性5~15分钟循环1次;
步骤2,首先在95℃下进行变性20~40秒,然后58℃下进行退火20~40秒,最后72℃下进行延伸40~100秒;该步骤2循环35次进行;
步骤3,72℃下进行延伸5~10分钟,循环1次;
步骤4,4℃下进行保存。
优选地,所述凝胶电泳质检的条件为电压95V,具体包括如下步骤:
步骤1,琼脂糖凝胶的制备:称取1.5g琼脂糖,加入到100mL 1×TAE中,置于微波炉中加热至完全溶解,取出摇匀,灯光下观察无白色细小晶体颗粒,冷却至60℃左右即可,其中所述琼脂糖凝胶浓度为1-1.5%,所述琼脂糖凝胶浓度的改变方法为:配制n%的琼脂糖凝胶,即向100mL 1×TAE中加入n g琼脂糖,置于微波炉中加热溶解即可;
步骤2,灌胶:向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入8μL Goldview,摇匀,轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中,然后立即在特定位置插入25齿的梳子,所述灌胶过程迅速,以防琼脂糖凝胶凝固造成灌胶失败,当灌胶过程中产生气泡,则小心震动制胶器或用移液器吸头将气泡戳破,以保证所制得的琼脂糖凝胶不能有气泡,待琼脂糖凝胶凝固后,拔出所述梳子,将琼脂糖凝胶置于电泳槽中,所述电泳槽内放置1×TAE缓冲液,缓冲液要没过胶面,点样孔充满液体,然后进行步骤3的操作;
步骤3,加样:用微量移液器将扩增产物加到点样孔中,每槽加5μL,记录样品的点样次序;
步骤4,电泳:盖上电泳槽上盖,安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至95V,电泳30-40min,当条带移到距凝胶前沿2-3cm时,停止电泳;
步骤5,观察:取出凝胶,在凝胶成像系统下观察,并保存和记录电泳图谱。
优选地,所述步骤(2)和所述步骤(3)中的所述一代测序,或二代测序,或基因芯片分析包括:
步骤一,测序PCR模板的制备;
步骤二,将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化;
步骤三,纯化后的PCR产物的测序反应;
步骤四,测序反应产物纯化。
优选地,所述步骤一包括:
(1)预先制备适量冰;
(2)在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix;
(3)按照一定的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;
(4)将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
95℃5min→(95℃30秒,67℃30秒-0.5℃/循环,72℃1分钟)×14 循环→(95℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟)×30循环→72℃7分钟→保持4℃
(5)琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TAE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1-1.5%的琼脂糖凝胶,在微波炉上加热溶化,待温度降至60℃ -70℃左右加入荧光染料,温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却,待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中,取少量PCR 产物上样电泳,将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
优选地,所述步骤二包括:根据核酸外切酶I(Exo I),碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度,加入到PCR反应产物中,37℃消化15分钟,85℃使酶失活15分钟。
优选地,所述步骤三包括:
(1)纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释,若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮,可以适当增大稀释倍数;
(2)测序反应用引物稀释到1μM。
优选地,所述步骤四测序反应产物纯化采用96孔板纯化方法,所述96孔板纯化方法包括步骤:
(1)每管加入2.5μL 125mM EDTA,pH=8,加到管底;
(2)加入30μL 100%酒精,封严,震荡4次,室温放置15分钟;20℃最大转速离心45分钟,马上倒置96孔板,倒置最小转速离心10秒;
(3)加入60μL 70%酒精,最大转速4℃离心15分钟,马上倒置96孔板,最小转速离心1分钟;
(4)70%酒精重复洗涤1次或2次;
(5)让残余的酒精在室温挥发干,加入10μL Hi-Di甲酰胺,95℃变性4 分钟,迅速置冰上4分钟,上样电泳。
所述步骤四测序反应产物纯化采用单个0.2mL离心管离心方法,包括步骤:
(1)每孔加入2.5μL125 mM EDTA到溶液中,再加入30μL 100%酒精,盖好,震荡4次,室温15分钟;
(2)台式离心机12000×g离心30分钟,马上用枪吸尽上清液;
(3)每孔加入60μL 70%酒精,12000×g 4℃离心15分钟,马上用枪吸尽上清液,将此步骤再重复1次;
(4)让酒精在室温挥发干净,加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA;
(5)在PCR仪上变性:95℃4分钟,4℃4分钟,上机电泳。
本发明的有益效果:
本检测方法可以从激素受体基因型、药物代谢相关基因型等结合受检测人的临床表型信息,选择适合个体的促排卵药和制定并优化个性化促排卵方案。
附图说明
附图1(a),(b),(c),(d)和(e)分别展示了ESR1-c.453-397F/R (624bp)扩增产物一代测序结果,LHCGR-c.935F/R(327bp)扩增产物一代测序结果,FSHB-g.1078F/R(89bp)扩增产物一代测序结果,FSHR-c.2039F/R (768bp)扩增产物一代测序结果以及vβLH-c.82F/R(310bp)扩增产物一代测序结果。
具体实施方式
实施例一:使用多重PCR结合一代测序进行促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,基因和位点见表1,包括如下步骤:
(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;
(2)质检合格后进行多重目的基因变异位点的扩增或采用特异性核酸探针对目的基因进行富集,根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行一代测序,采用一代测序对特定位点进行扩增和检测;
(3)根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行二代测序或基因芯片分析,对多重PCR产物进行测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;
(4)通过药物基因组数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
步骤(1)包括:采用吸附柱或磁珠法针对唾液、外周血、口腔黏膜细胞、血卡多种样本类型进行DNA提取、纯化和定量,使用Nanodrop分光光度计进行定量,吸光度OD260/OD280在1.6-2.2之间,OD260/OD230在1.5-3.0之间即为合格,取适量DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测,以出现单一条带且位于目标 DNA长度范围内为合格;通过多重PCR扩增配合sanger测序、基因芯片检测、 qPCR和质谱检测技术进行检测,所述sanger测序包括:在所述电泳检测合格后进行测序,按照样品接收单填写的样本类型、样本名称、片段长度、引物名称及备注切胶纯化进行sanger测序;针对待检测基因和位点序列(基因位点序列见表1),设计正向引物和反向引物;对设计好的引物进行合成和质检(引物序列见表2)。
表1
表2
步骤(2)包括:取适量的DNA模板,建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增,多重PCR实验完成后,取1微升扩增产物DNA进行凝胶电泳质检。
建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增包括:将如下组分加到 0.2MlPCR管或八联排管中,所述组分包括10μL含染料的2×GoldStar Best MasterMix,1μL COS-1或COS-2Prime,每个反应0.4pM引物,30ng DNA 模板以及上限为20μL ddH2O,其中PCR反应程序包括:
步骤1,95℃下进行预变性5~15分钟循环1次;
步骤2,首先在95℃下进行变性20~40秒,然后58℃下进行退火20~40 秒,最后72℃下进行延伸40~100秒;该步骤2循环35次进行;
步骤3,72℃下进行延伸5~10分钟,循环1次;
步骤4,4℃下进行保存。
凝胶电泳质检的条件为电压95V,具体包括如下步骤:
步骤1,琼脂糖凝胶的制备:称取1.5g琼脂糖,加入到100mL 1×TAE中,置于微波炉中加热至完全溶解,取出摇匀,灯光下观察无白色细小晶体颗粒,冷却至60℃左右即可,其中所述琼脂糖凝胶浓度为1-1.5%,所述琼脂糖凝胶浓度的改变方法为:配制n%的琼脂糖凝胶,即向100mL 1×TAE中加入ng琼脂糖,置于微波炉中加热溶解即可;
步骤2,灌胶:向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入8μL Goldview,摇匀,轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中,然后立即在特定位置插入25齿的梳子,所述灌胶过程迅速,以防琼脂糖凝胶凝固造成灌胶失败,当灌胶过程中产生气泡,则小心震动制胶器或用移液器吸头将气泡戳破,以保证所制得的琼脂糖凝胶不能有气泡,待琼脂糖凝胶凝固后,拔出所述梳子,将琼脂糖凝胶置于电泳槽中,所述电泳槽内放置1×TAE缓冲液,缓冲液要没过胶面,点样孔充满液体,然后进行步骤3的操作;
步骤3,加样:用微量移液器将扩增产物加到点样孔中,每槽加5μL,记录样品的点样次序;
步骤4,电泳:盖上电泳槽上盖,安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至95V,电泳30-40min,当条带移到距凝胶前沿2-3cm时,停止电泳;
步骤5,观察:取出凝胶,在凝胶成像系统下观察,并保存和记录电泳图谱。
步骤(2)和所述步骤(3)中的所述一代测序,或二代测序,或基因芯片分析包括:
步骤一,测序PCR模板的制备;
步骤二,将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化;
步骤三,纯化后的PCR产物的测序反应;
步骤四,测序反应产物纯化。
步骤一包括:
(1)预先制备适量冰;
(2)在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix;
(3)按照一定的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;
(4)将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
95℃5min→(95℃30秒,67℃30秒-0.5℃/循环,72℃1分钟)×14 循环→(95℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟)×30循环→72℃7分钟4℃保温
(5)琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TAE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-1.5%的琼脂糖凝胶,在微波炉上加热溶化,待温度降至60℃ -70℃左右加入荧光染料,温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却,待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中,取少量PCR 产物上样电泳,将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
反应体系如表3所示,包括:
表3
步骤二包括:根据核酸外切酶I(Exo I),碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度,加入到PCR反应产物中,37℃消化15分钟,85℃使酶失活15分钟。
纯化体系如表4所示,如下:
表4
PCR产物 | 5μl |
Exo I | 0.5μl |
碱性磷酸酶 | 1μl |
步骤三包括:
(1)纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释(若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮,可以适当增大稀释倍数);
(2)测序反应用引物稀释到1μM;
其中,PCR产物测序反应体系(10μl),如表5所示:
表5
成分 | 加入量 |
纯化并稀释好的PCR产物 | 1μl(也可参考下表) |
引物(上游或者下游)1μM | 1μl |
BigDye(2.5x)10倍稀释 | 8μl |
总体积 | 10μl |
PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表6所示:
DNA纯度:OD260/OD280=1.6~1.8;DNA含量(ng/μl)=OD260×50
表6
PCR产物片段大小 | 加入量 |
100-200bp | 1-3ng |
200-500bp | 3-10ng |
500-1000bp | 5-20ng |
1000-2000bp | 10-40ng |
2000bp以上 | 20-50ng |
BigDye(2.5x)稀释10倍配方:
成分 | 加入量 |
BigDye(2.5x) | 50μL |
SeqBuffer | 225μL |
ddH<sub>2</sub>O | 725μL |
测序PCR循环条件:
96℃1分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟×25循环→4℃保温。
优选地,所述步骤五测序反应产物纯化采用酒精/EDTA法,包括96孔板纯化方法和单个0.2mL离心管离心方法。其中:
96孔板纯化方法包括步骤:
(1)每管加入2.5μL 125mM EDTA(pH=8),加到管底;
(2)加入30μL 100%酒精,封严,震荡4次,室温放置15分钟;20℃最大转速离心45分钟,马上倒置96孔板,倒置最小转速离心10秒;
(3)加入60μL 70%酒精,最大转速4℃离心15分钟,马上倒置96孔板,最小转速离心1分钟;
(4)70%酒精重复洗涤1次或2次;
(5)让残余的酒精在室温挥发干,加入10μL Hi-Di甲酰胺,95℃变性4 分钟,迅速置冰上4分钟,上样电泳。
单个0.2mL离心管离心方法包括步骤:
(1)每孔加入2.5μL 125mM EDTA到溶液中,再加入30μL 100%酒精,盖好,震荡4次,室温15分钟;
(2)台式离心机12000×g离心30分钟,马上用枪吸尽上清液;
(3)每孔加入60μL 70%酒精,12000×g 4℃离心15分钟,马上用枪吸尽上清液。此步可以重复1次;
(4)让酒精在室温挥发干净,加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA;
(5)在PCR仪上变性:95℃4分钟,4℃4min。上机电泳。
本实施例检测方法可以从激素受体基因型、药物代谢相关基因型等结合受检测人的临床表型信息,选择适合个体的促排卵药和制定并优化个性化促排卵方案。
结果图片如图1所示,图1(a),(b),(c),(d)和(e)分别展示了ESR1-c.453-397F/R(624bp)扩增产物一代测序结果,LHCGR-c.935F/R (327bp)扩增产物一代测序结果,FSHB-g.1078F/R(89bp)扩增产物一代测序结果,FSHR-c.2039F/R(768bp)扩增产物一代测序结果以及vβLH-c.82F/R (310bp)扩增产物一代测序结果。
实施例二:使用基因芯片的方法对促排卵药物敏感性和副作用进行检测,包括如下步骤:
(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;
(2)根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的基因组DNA,进行基因芯片分析,对基因组DNA进行测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;
(3)通过药物基因组数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
步骤(1)包括:采用吸附柱或磁珠法针对唾液、外周血、口腔黏膜细胞、血卡多种样本类型进行DNA提取、纯化和定量,使用Nanodrop分光光度计进行定量,吸光度OD260/OD280在1.6-2.2之间,OD260/OD230在1.5-3.0之间即为合格,取适量DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测,以出现单一条带且位于目标 DNA长度范围内为合格。
基因组DNA转版定量包括:将500ng基因组DNA转至96孔板对应位置,加适当灭菌水将每个样品体积补至10μL。稀释后的DNA进行NanoDrop检测,将样品浓度标定至50ng/μL。
制备MSA3板包括:将基因组DNA样品加入MSA3板,变性、中和、过夜扩增,具体步骤包括:
步骤一,在post-amp区域将Illumina杂交炉预热至37℃;
步骤二,室温解冻MA1、MA2、MSM,充分解冻后280g离心1分钟;
步骤三,将MSA3条形码贴在96-well 0.8mL microtiter plate(MIDI)上;
步骤四,在MSA3板每个孔中加20μL MA1,再加4μL DNA样本,再加 4μL 0.1N NaOH;
步骤五,用96cap sealing mats将MSA3板封上。(确保盖子与板上的孔对应),1600rpm涡旋分钟,280×g离心1分钟,室温放置10分钟;
步骤六,在MSA3板每个孔中加34μL MA2,再加入38μL MSM;
步骤七,用96cap sealing mats封板,1600rpm涡旋1分钟,280×g离心 1分钟,在杂交炉中37℃孵育20–24小时;
MSA3片段化是将gDNA酶切成一定大小的片段,具体步骤包括:
步骤一,将加热块预热至37℃;
步骤二,室温解冻FMS,280×g离心1分钟,室温解冻RA1(注:RA1 不可反复冻融,第二天所用可放于4℃保存);
步骤三,MSA3板50×g离心1分钟;
步骤四,每个样本孔加50μL FMS;
步骤五,用96cap sealing mats封板,1600rpm涡旋1分钟,室温下50× g离心1分钟;
步骤六,将板子放入加热块,37℃孵育1小时,若不立即进行下一步操作, -15°~-25℃保存MSA3板。
MSA3沉淀包括用异丙醇和PM1使DNA样本沉淀,具体步骤包括:
步骤一,将加热块预热至37℃;
步骤二,室温解冻PM1,280×g离心1分钟;
步骤三,向MSA3板的每个样本孔中加入50μL PM1;
步骤四,用96cap sealing mats封板,1600rpm涡旋1分钟,37℃孵育5分钟,室温下280×g离心1分钟;
步骤五,将低温离心机设置4℃进行预冷;
步骤六,向MSA3板的每个样本孔中加入155μL异丙醇;
步骤七,另取新96cap sealing mats,小心封板,颠倒MSA3板10次,保证充分混匀,4℃孵育30分钟,4℃下3000g离心20分钟;
步骤八,小心取出板,立即将板子快速倒扣在吸水纸上,拍打1分钟,使孔内的液体尽量流出来。(注:若离心后有延迟,需重新离心);
步骤九,将板子室温放置60分钟,晾干蓝色沉淀,若不立即进行下一步操作,-15°~-25℃保存MSA3板。
MSA3重悬包括用RA1使DNA沉淀重新悬浮,具体步骤包括:
步骤一,将Illumina杂交炉预热至48℃;
步骤二,打开热封仪,预热20分钟;
步骤三,室温解冻RA1,颠倒溶液,使晶体溶化,直至溶液均匀透明;
步骤四,向MSA3板的每个样本孔中加入23μL RA1;
步骤五,用铝箔在热封仪上封板,5秒,用刮板刮平铝箔,确保密封;
步骤六,将MSA3板放在杂交炉中48℃孵育60分钟;
步骤七,取出MSA3板,1800rpm涡旋1分钟,280×g离心1分钟,若不立即进行下一步操作,-15°~-25℃保存MSA3板。RA1-15°~-25℃保存。
芯片杂交包括将重悬的DNA片段加到芯片上进行杂交,具体步骤包括:
步骤一,将加热块预热至95℃,杂交炉预热至48℃;
步骤二,将垫圈、hyb chamber insert放进杂交盒;
步骤三,在杂交盒的8个加湿缓冲液槽中各加400μL PB2;
步骤四,将MSA3板在95℃加热块上孵育20分钟,使样本变性;
步骤五,提前30分钟从4℃冰箱取出芯片,不要打开包装,室温放置;
步骤六,将MSA3板从加热块上拿下,室温放置30分钟,冷却,MSA3板 280×g离心1分钟;
步骤七,打开包装,取出芯片,放于hyb chamber insert上,注意条码面朝上,且与hyb chamber insert竖条在同一端;
步骤八,吸取14μL MSA3板里的样品,对应加到芯片的加样孔里,注意枪头不要碰触芯片,加液缓慢并持续,避免产生气泡。记录样本在芯片上的位置,以及每组样本对应的芯片条码,观察每个加样孔,确保没有气泡,液体均匀覆盖;
步骤九,将杂交盒盖上,四个卡子按对角线的顺序扣紧,确保杂交盒是密封的;
步骤十,将杂交盒横着放在杂交炉中,转速5,48℃孵育16~24小时;
步骤十一,配制XC4:在XC4瓶中加330ml无水乙醇,用力振荡15秒混匀,室温放置过夜;
洗片包括准备进行芯片染色,具体步骤包括:
步骤一,将水循环恒温系统设为适当温度,使实际温度为44℃;
步骤二,室温解冻RA1、LX1、LX2、EML、SML、ATM、95%甲酰胺/1mM EDTA;
步骤三,从杂交炉中取出杂交盒,室温放置30分钟冷却;
步骤四,在两个玻璃洗槽中各加200mL PB1,在aligment fixture中加 150mLPB1;
步骤五,取出芯片,撕去表膜,注意不要碰到芯片表面,小心溅液;立即将芯片插进洗片架,放入玻璃洗槽中,打破液面上下提洗1分钟;
步骤六,换至另一玻璃洗槽中按上述方法再洗1分钟,洗完在洗槽中放置;
步骤七,黑框卡入aligment fixture,依次放进芯片、spacer、黑色卡条、玻璃背板(背板凹槽在条码一端,并朝向芯片),用2个夹子卡住,分别距黑色卡条和背板凹槽5mm;
步骤八,将芯片连背板取出,剪掉spacer多余。
染色包括洗去芯片上未杂交和非特异性杂交的DNA样本,加上标记的寡核苷酸,与DNA杂交上的引物进行单碱基延伸,芯片染色和洗片、包被。上述单碱基延伸的操作为:向背板的凹槽中加液,注意不要让枪头碰触芯片。具体步骤包括:
步骤1,加150μL RA1,孵育30秒。再重复5次;
步骤2,加225μL LX1,重复1次,孵育10分钟;
步骤3,加225μL LX2,重复1次,孵育10分钟;
步骤4,加300μL EML,孵育15分钟;
步骤5,加250μL 95%甲酰胺/1mM EDTA,孵育1分钟,重复2次;
步骤6,孵育5分钟;
步骤7,将水循环系统的温度设置32℃;
步骤8,加250μL XC3,孵育1分钟,重复2次;
步骤9,等待水循环系统稳定至所需的温度。
芯片染色的具体步骤包括:
步骤1,加250μL SML,孵育10分钟;
步骤2,加250μL XC3,孵育1分钟。重复2次,孵育5分钟;
步骤3,加250μL ATM,孵育10分钟;
步骤4,加250μL XC3,孵育1分钟。重复2次,孵育5分钟;
步骤5,加250μL SML,孵育10分钟;
步骤6,加250μL XC3,孵育1分钟。重复2次,孵育5分钟;
步骤7,加250μL ATM,孵育10分钟;
步骤8,加250μL XC3,孵育1分钟。重复2次,孵育5分钟;
步骤9,加250μL SML,孵育10分钟;
步骤10,加250μL XC3,孵育1分钟。重复2次,孵育5分钟;
步骤11,立即将芯片连背板取出,在实验台上放置。
洗片和包被的具体步骤包括:
步骤1,加310mL PB1于白色塑料洗盒中;
步骤2,用刀片撬开夹子,取下背板和spacer;
步骤3,将芯片插入locking arm,放进310mL PB1洗盒中,注意locking arm 凸起面朝向操作者,芯片放在远离操作者一端,条码背向操作者;
步骤4,手提locking arm缓慢上下提洗10次,浸泡5分钟;
步骤5,在另一洗盒中加310mL XC4;
步骤6,将芯片放入XC4洗盒中,上下提洗10次,静置5分钟;
步骤7,取出locking arm,用镊子取下芯片,放在芯片架上,条码面朝上;
步骤8,将芯片和芯片架放于真空泵中,508mm Hg(0.90bar)抽真空1 小时;
步骤9,取出芯片,用无水乙醇小心擦净芯片背面和两边残留的XC4。
本实施例检测方法可以从激素受体基因型、药物代谢相关基因型等结合受检测人的临床表型信息,选择适合个体的促排卵药和制定并优化个性化促排卵方案。
结果图片
实施例三
使用靶向捕获法结合新一代高通量测序对促排卵药物敏感性和副作用进行检测
包括如下步骤:
(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;
(2)质检合格后进行多重目的基因变异位点的扩增或采用特异性核酸探针对目的基因进行富集,根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物进行二代测序文库构建,对文库进行二代测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;
(3)通过药物基因组数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
步骤(1)包括:采用吸附柱或磁珠法针对唾液、外周血、口腔黏膜细胞、血卡多种样本类型进行DNA提取、纯化和定量,使用Nanodrop分光光度计进行定量,吸光度OD260/OD280在1.6-2.2之间,OD260/OD230在1.5-3.0之间即为合格,取适量DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测,以出现单一条带且位于目标DNA长度范围内为合格
步骤(2)包括:取适量的DNA模板,建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增,多重PCR实验完成后,取1μL扩增产物DNA进行凝胶电泳质检。
建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增包括:将如下组分加到0.2mLPCR管或八联排管中,所述组分包括10μL含染料的2×GoldStar Best Master Mix,1μL COS-1或COS-2Prime,每个反应0.4pM引物,30ng DNA 模板以及上限为20μL ddH2O,其中PCR反应程序包括:
步骤1,95℃下进行预变性5~15分钟循环1次;
步骤2,首先在95℃下进行变性20~40秒,然后58℃下进行退火20~40 秒,最后72℃下进行延伸40~100秒;该步骤2循环35次进行;
步骤3,72℃下进行延伸5~10分钟,循环1次;
步骤4,4℃下进行保存。
凝胶电泳质检的条件为电压95V,具体包括如下步骤:
步骤1,琼脂糖凝胶的制备:称取1.5g琼脂糖,加入到100mL 1×TAE中,置于微波炉中加热至完全溶解,取出摇匀,灯光下观察无白色细小晶体颗粒,冷却至60℃左右即可,其中所述琼脂糖凝胶浓度为1-1.5%,所述琼脂糖凝胶浓度的改变方法为:配制n%的琼脂糖凝胶,即向100mL 1×TAE中加入n g琼脂糖,置于微波炉中加热溶解即可;
步骤2,灌胶:向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入8μL Goldview,摇匀,轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中,然后立即在特定位置插入25齿的梳子,所述灌胶过程迅速,以防琼脂糖凝胶凝固造成灌胶失败,当灌胶过程中产生气泡,则小心震动制胶器或用移液器吸头将气泡戳破,以保证所制得的琼脂糖凝胶不能有气泡,待琼脂糖凝胶凝固后,拔出所述梳子,将琼脂糖凝胶置于电泳槽中,所述电泳槽内放置1×TAE缓冲液,缓冲液要没过胶面,点样孔充满液体,然后进行步骤3的操作;
步骤3,加样:用微量移液器将扩增产物加到点样孔中,每槽加5μl,记录样品的点样次序;
步骤4,电泳:盖上电泳槽上盖,安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至95V,电泳30-40min,当条带移到距凝胶前沿2-3cm时,停止电泳。
步骤5,观察:取出凝胶,在凝胶成像系统下观察,并保存和记录电泳图谱。
步骤(2)中的所述多重PCR、二代测序文库构建和测序包括:
步骤一,多重PCR模板的制备;
步骤二,将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化;
步骤三,纯化后的PCR产物的测序文库制备;
步骤四,测序文库上机测序;
步骤五,下机数据拆分。
步骤一包括:
(1)预先制备适量冰;
(2)在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix;
(3)按照一定的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;
(4)将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
95℃5分钟→(95℃30秒,67℃30秒-0.5℃/循环,72℃1分钟)× 14循环→(95℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟)×30循环→72℃7分钟→保持4℃
(5)琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TAE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-1.5%的琼脂糖凝胶,在微波炉上加热溶化,待温度降至60℃ -70℃左右加入荧光染料,温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却,待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中,取少量PCR 产物上样电泳,将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
反应体系如表3所示,包括:
表3
步骤二包括:
(1)根据核酸外切酶I(Exo I),碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度,加入到PCR 反应产物中,37℃消化15分钟,85℃使酶失活15分钟。
纯化体系如表4所示,如下:
表4
PCR产物 | 5μl |
Exo I | 0.5μl |
碱性磷酸酶 | 1μl |
(2)纯化后的产物用Qubit进行定量,具体包括如下步骤:
步骤1,仪器使用前,先将附带的电源线的一端插入Qubit 2.0荧光计,然后将电源线插入电源插座。插上后,仪器自动接通电源;
步骤2,平衡试剂到室温,预制工作液。浓缩的分析试剂:稀释缓冲液=1: 200;
步骤3,标准品溶液的配制:1)取适用于Qubit 2.0荧光计的薄壁、透明的0.5mLPCR管。可接受的分析管包括Qubit分析管(货号Q32856,500支管) 或Axygen PCR-05-C管(VWR,货号10011-830);2)取2支新的0.5mL PCR 管,编号:标1,标2;3)吸取190μL预制工作液到已编号的标1,标2 PCR 管中;4)吸取10μL标准品1到已编号的标1PCR管中,涡旋混匀2-3秒;5) 吸取10μL标准品2到已编号的标2PCR管中,涡旋混匀2-3秒;
步骤4,样品溶液的配制:1)取与待测样品数一致的新的0.5mL PCR管,并编号;2)吸取199μL预制工作液到已编号PCR管中;3)吸取1μL样品到对饮编号的PCR管中,涡旋混匀2-3秒;4)标准品和样品与工作液混合之后,所有的DNA分析管室温孵育2分钟;
步骤5,运行新标准品进行校准:1)在Qubit 2.0荧光计仪器主界面上,选择想要运行的分析类型。标准品界面自动显示;2)对于选定的分析,如果已开展过校准,Qubit 2.0荧光计会提示选择读取新的标准品或使用上一次校准;3) 按下Yes(是),读取新的标准品。插入Standerd#1的提示出现在界面上;4) 在样品槽中插入Standerd#1,并按下Read(读取)。确保使用了适合分析的 Standerd#1。读取过程大约需要3秒钟;5)插入Standerd#2,并按下Read(读取)。确保使用了适合分析的Standerd#2。在读取Standerd#2之后,校准完成。新的标准品曲线及直线连接的标准品的数据点出现在屏幕上;
步骤6,读取样品:1)选择Sample(样品),进入样品界面;2)在样品槽中插入样品,并按下Read(读取)。读取过程大约需要3秒钟。测定完成,结果会显示在界面上。显示的数字即为分析管中样品的浓度;3)如果要读取下一个样品,从样品槽中取出样品,插入下一个样品,并按下Read Next Sample (读取下一个样品);4)重复样品读取,直至所有样品读完;
步骤7,关机:将仪器电源线从电源插座上拔下。
步骤三包括:
(1)纯化后的PCR产物稀释至50ng/μl;
(2)DNA末端修复反应,具体包括如下步骤:
步骤1,向200μL PCR管中加入以下试剂:
成分 | 加入量 |
10×End Repair Reaction Buffer | 6.5μl |
End prep Enzyme Mix | 2μl |
纯化并稀释好的PCR产物 | 1μl |
RNase-free Water | 55.5μl |
总体积 | 65μl |
步骤2,用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀,短暂离心,使所有组分收集到管底;
步骤3,将上述PCR管置于PCR仪中,热盖打开,运行如下程序:12℃ 15分钟→37℃15分钟→72℃20分钟→4℃保温。
(3)接头连接,具体包括如下步骤:
步骤1,将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM;
步骤2,将表中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用;
步骤3,于DNA末端修复反应后的PCR管中配制下面表中所示反应体系:
成分 | 加入量 |
T4 DNA ligase buffer for illumina | 14μl |
T4 DNA ligase | 2μl |
Adaptor | 2.5μl |
步骤4,使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底;
步骤5,将PCR管置于PCR仪中,关闭热盖,进行接头连接反应,程序为:20℃,20分钟→4℃保温。
(4)连接产物磁珠纯化,具体包括如下步骤:
步骤1,涡旋振荡CMPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液;
步骤2,将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中;
步骤3,加入1倍样本体积(83.5μl)的CMPure,涡旋振荡5秒钟吸打混匀后,室温静置5分钟;
步骤4,短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA 的磁珠(注意:不要弃除磁珠);
步骤5,继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清;
步骤6,重复步骤5,总计漂洗两次;
步骤7,保持离心管固定于磁力架上,室温静置10分钟,使磁珠在空气中干燥;
步骤8,将离心管从磁力架上取下,加入26-28μL EB(自备)或去离子水,涡旋振荡吸打混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟;
步骤9,短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。
(5)文库扩增,具体包括如下步骤:
步骤1,将下表中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用;
步骤2,于无菌PCR管中配制下表所示反应体系:
步骤3,使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底;
步骤4,将PCR管置于PCR仪中,进行PCR扩增程序为:98℃1分钟→ (98℃10秒→60℃30秒→72℃30秒)×9循环→72℃5分钟→4℃保温。
(6)扩增产物磁珠纯化,具体包括如下步骤:
步骤1,涡旋振荡CMPure 20秒,使其彻底混匀为均一溶液;
步骤2,将PCR反应液转移至一新的1.5mL离心管中;
步骤3,加入1倍样本体积(50μL)的CMPure,涡旋振荡5秒钟吸打混匀后,室温静置5分钟;
步骤4,短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA 的磁珠(注意:不要弃除磁珠);
步骤5,继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μL新鲜配制的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清;
步骤6,重复步骤5,总计漂洗两次;
步骤7,保持离心管固定于磁力架上,室温静置10分钟,使磁珠在空气中干燥;
步骤8,将离心管从磁力架上取下,加入30μL EB(自备)或去离子水,涡旋振荡吸打混匀使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟;
步骤9,短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μL,DNA文库在-20℃保存。
(7)使用Qubit定量,具体包括如下步骤:
步骤1,仪器使用前,先将附带的电源线的一端插入Qubit 2.0荧光计,然后将电源线插入电源插座。插上后,仪器自动接通电源;
步骤2,平衡试剂到室温,预制工作液。浓缩的分析试剂:稀释缓冲液=1: 200;
步骤3,标准品溶液的配制:1)取适用于Qubit 2.0荧光计的薄壁、透明的0.5mLPCR管。可接受的分析管包括Qubit分析管(货号Q32856,500支管) 或Axygen PCR-05-C管(VWR,货号10011-830);2)取2支新的0.5Ml PCR 管,编号:标1,标2;3)吸取190μL预制工作液到已编号的标1,标2PCR 管中;4)吸取10μL标准品1到已编号的标1PCR管中,涡旋混匀2-3秒;5) 吸取10μL标准品2到已编号的标2PCR管中,涡旋混匀2-3秒;
步骤4,样品溶液的配制:1)取与待测样品数一致的新的0.5mL PCR管,并编号;2)吸取199μL预制工作液到已编号PCR管中;3)吸取1μL样品到对饮编号的PCR管中,涡旋混匀2-3秒;4)标准品和样品与工作液混合之后,所有的DNA分析管室温孵育2分钟;
步骤5,运行新标准品进行校准:1)在Qubit 2.0荧光计仪器主界面上,选择想要运行的分析类型。标准品界面自动显示;2)对于选定的分析,如果已开展过校准,Qubit 2.0荧光计会提示选择读取新的标准品或使用上一次校准;3) 按下Yes(是),读取新的标准品。插入Standerd#1的提示出现在界面上;4) 在样品槽中插入Standerd#1,并按下Read(读取)。确保使用了适合分析的 Standerd#1。读取过程大约需要3秒钟;5)插入Standerd#2,并按下Read(读取)。确保使用了适合分析的Standerd#2。在读取Standerd#2之后,校准完成。新的标准品曲线及直线连接的标准品的数据点出现在屏幕上;
步骤6,读取样品:1)选择Sample(样品),进入样品界面;2)在样品槽中插入样品,并按下Read(读取)。读取过程大约需要3秒钟。测定完成,结果会显示在界面上。显示的数字即为分析管中样品的浓度;3)如果要读取下一个样品,从样品槽中取出样品,插入下一个样品,并按下Read Next Sample (读取下一个样品);4)重复样品读取,直至所有样品读完;
步骤7,关机:将仪器电源线从电源插座上拔下。
步骤四包括:
(1)机器准备,具体包括如下步骤:
步骤1,点击开始界面的Manage Instrument键进入重启界面,再点击 Reboot键。机器便会在实现关闭MiSeq Control SoftWare软件、重启电脑、重启MiSeq ControlSoftWare软件;
步骤2,点Sequence键,机器会要求先洗机器,往换洗机器的瓶子里加满水,点Next,清洗机器。这个步骤机器要求清洗三次,每清洗完一个步骤,机器会出现一个暂停界面,提示往清洗机器的瓶子里加水,此时要加水后再按 Next,直至界面显示Done,表示清洗完成,等待上机。
(2)试剂准备,具体包括如下步骤:
步骤1,从-20℃冰箱中拿出MiSeq TM Reagent Kit 300 cycle PE-Box 1 of 2,将里面的2种试剂MiSeq reagent cartridge和HT1(Hybridization buffer)拿出,并记录相应信息(主要登记的信息包括Lot number、RGT号);
步骤2,将MiSeq reagent cartridge和HT1放在水中融化半小时,注意 MiSeqreagent cartridge水位不能超过最高水线;
步骤3,确保MiSeq reagent cartridge每个贮液管里的试剂都已经融化,上下颠倒MiSeq reagent cartridge十次,并确保贮液管底部没有气泡;
步骤4,将融化好的MiSeq reagent cartridge避光保存在4℃冰箱,HT1 放置在冰上,准备样品变性稀释;
步骤5,从4℃冰箱中取出MiSeq TM Reagent Kit Box 2 of 2,将盒子中的试剂PR2和Flow Cell。登记相应信息,并在包装上做好标记,放入4℃冰箱以待下一步操作。
(3)样品变性稀释,准备4个1.5mL离心管。第一个离心管为稀释管1,第二个离心管为0.1N NaOH,第三个离心管为变性管,第四个离心管为稀释管 2。
(4)变性文库稀释,具体包括如下步骤:
步骤1,在稀释管1中加入相应体积HT1;
步骤2,从文库原管中取相应的样品DNA量到对应的已加好HT1的稀释管1中,并反复吹打多次,使其混匀,文库稀释至2nM;
步骤3,稀释操作完成后,将稀释管1弹匀离心,放在冰上,等待变性;
步骤4,将文库原管用封口膜密封,置于冻存盒,放入-20℃冰箱,待实验完成后摆放入相应的样品盒中;
步骤5,在离心管0.1N NaOH.中加入95μL纯净水,再加入5μL已事先配好的2NNaOH,放在离心管架上待变性时用;
步骤6,在变性管中加入10μL的稀释管1样品和10μL的0.1N NaOH,并同时按下定时器开始计时(定时器事先调整为5分钟倒计时);
步骤7,待定时器发出响声表示5分钟变性时间已到时,在变性管中加入 980μL体积的HT1,并振荡混匀离心,变性文库稀释至20pM;
步骤8,在稀释管2中加入相应体积的HT1和变性管中的样品,稀释至预期上机浓度。并振荡混匀离心,放置在冰上。
(5)文库上机,具体包括如下步骤:
步骤1,从4℃冰箱中取出已融化好的MiSeq reagent cartridge,用吸头将17#(sample)贮液管的封膜戳破;
步骤2,在17#贮液管中加入600μL稀释管2中样品,并用封口膜将17#管封好,放置4℃冰箱;
步骤3,按Done键进行下一步操作,机器会提示更换FC(flowcell);
步骤4,从4℃试剂盒中拿出FC,先用水冲洗,再用纸擦,直至FC表面无水痕,无油迹、无杂质颗粒。特别注意小心操作,轻拿轻放,以免力度过大压碎FC。
步骤5,拆下MiSeq机器上的旧FC,并擦拭FC平台,再将擦干净的FC 放入机器,放入新FC的时候,注意FC位置卡好。并关门。待机器识别成功后进行下一步操作;
步骤6,前面操作成功后,机器会提示上机信息,进行第二次确认,确认无误按Next键;
步骤7,机器会做一个快检,等所有项都成功了之后点start键开始实验;
(6)下机,具体包括如下步骤:
步骤1,检查数据保证全部cycles已经测序完成,避免软件自动关闭原因或其它原因而误以为已经下机;
步骤2,一个Run成功完成之后,用PW1清洗机器,按照机器的提示,把所有的试剂换下,再换上水,清洗机器。
步骤五包括:
(1)参数设定,数据拆分主要用CASAVA1.8.2中的configureBclToFastq.pl 程序,主要参数说明见下表:
(2)运行数据拆分,具体包括如下步骤:
步骤1,拆分配置,按照软件要求输入各参数:
示例:/path/to/bin/configureBclToFastq.pl\
--input-dir/path/to/raw_data/xxx/Data/Intensities/BaseCalls/\
--sample-sheet/path/to/SampleSheet/xxx_SampleSheet.csv\
--fastq-cluster-count 0\
--output-dir/path/to/xxx/Unaligned
终端显示配置信息:
…………
INFO:Running self tests on/path/to/xxx/Unaligned completed with noproblems
最后一行显示“completed with no problems”证明配置成功;
注意:输出目录需指定,但不需新建
步骤2,进入拆分目录:cd/path/to/xxx/Unaligned;
步骤3,数据拆分:后台运行编译,数据拆分:nohup make-j 8&;
步骤4,异常排查:可根据线程数监测运行情况,出现异常,及时报告管理员;后台运行过程中的log文件在nohup.out,注意保存,若拆分出现问题,可查看log文件查找原因。
(3)拆分结果检查,下载拆分统计目录/DemμLtiplex_Stats.htm:统计文件;拆分统计目录/css:统计文件框架。
(4)拆分结果质控,检查每条lane的拆分比例(%ofraw clusters per lane 列),未拆分的数据(Undetermined行)应少于10%;检查大于Q30比例(% of>=Q30 Bases(PF)一列),应大于80%;检查平均Q值Mean Quality一列,应大于30。
表1:促排卵药物敏感性和副作用相关基因和位点
虽然本发明已经参考特定的说明性实施例进行了描述,但是不会受到这些实施例的限定而仅仅受到附加权利要求的限定。本领域技术人员应当理解可以在不偏离本发明的保护范围和精神的情况下对本发明的实施例能够进行改动和修改。
Claims (10)
1.一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)提取样本基因组DNA,定量和质检;
(2)质检合格后进行多重目的基因变异位点的扩增或采用特异性核酸探针对目的基因进行富集,根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行一代测序,采用一代测序对特定位点进行扩增和检测;
(3)根据检测目的基因和位点的数量,取适量质检合格的扩增产物,进行二代测序或基因芯片分析,对多重PCR产物进行测序,下机数据拆分后进行生物信息学分析输出特定基因的SNP;
(4)通过药物基因组数据库进行分析和解读,输出个性化的精准促排卵用药建议和方案。
2.根据权利要求1所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤(1)包括:采用吸附柱或磁珠法针对唾液、外周血、口腔黏膜细胞、血卡多种样本类型进行DNA提取、纯化和定量,使用Nanodrop分光光度计进行定量,吸光度OD260/OD280在1.6-2.2之间,OD260/OD230在1.5-3.0之间即为合格,取适量DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测,以出现单一条带且位于目标DNA长度范围内为合格;通过多重PCR扩增配合sanger测序、基因芯片检测、qPCR和质谱检测技术进行检测,所述sanger测序包括:在所述电泳检测合格后进行测序,按照样品接收单填写的样本类型、样本名称、片段长度、引物名称及备注切胶纯化进行sanger测序;针对待检测基因和位点序列,设计正向引物和反向引物;对设计好的引物进行合成和质检。
3.根据权利要求1所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤(2)包括:取适量的DNA模板,建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增,多重PCR实验完成后,取1微升扩增产物DNA进行凝胶电泳质检。
4.根据权利要求3所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:建立多重PCR反应体系,对特定基因位点进行扩增包括:将如下组分加到0.2mLPCR管或八联排管中,所述组分包括10.0μL含染料的2xGoldStar Best MasterMix,1μL COS-1或COS-2Prime,每个反应0.4pM引物,30ng DNA模板以及上限为20μL ddH2O,其中PCR反应程序包括:
步骤1,95℃下进行预变性5~15分钟循环1次;
步骤2,首先在95℃下进行变性20~40秒,然后58℃下进行退火20~40秒,最后72℃下进行延伸40~100秒;该步骤2循环35次进行;
步骤3,72℃下进行延伸5~10分钟,循环1次;
步骤4,4℃下进行保存。
5.根据权利要求3所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述凝胶电泳质检的条件为电压95V,具体包括如下步骤:
步骤1,琼脂糖凝胶的制备:称取1.5g琼脂糖,加入到100mL1×TAE中,置于微波炉中加热至完全溶解,取出摇匀,灯光下观察无白色细小晶体颗粒,冷却至60℃左右即可,其中所述琼脂糖凝胶浓度为1-1.5%,所述琼脂糖凝胶浓度的改变方法为:配制n%的琼脂糖凝胶,即向100mL 1×TAE中加入n g琼脂糖,置于微波炉中加热溶解即可;
步骤2,灌胶:向冷却到60℃左右的琼脂糖溶液中加入8mLGoldview,摇匀,轻轻倒入安装好凝胶托盘的制胶器中,然后立即在特定位置插入25齿的梳子,所述灌胶过程迅速,以防琼脂糖凝胶凝固造成灌胶失败,当灌胶过程中产生气泡,则小心震动制胶器或用移液器吸头将气泡戳破,以保证所制得的琼脂糖凝胶不能有气泡,待琼脂糖凝胶凝固后,拔出所述梳子,将琼脂糖凝胶置于电泳槽中,所述电泳槽内放置1×TAE缓冲液,缓冲液要没过胶面,点样孔充满液体,然后进行步骤3的操作;
步骤3,加样:用微量移液器将扩增产物加到点样孔中,每槽加5μL,记录样品的点样次序;
步骤4,电泳:盖上电泳槽上盖,安装好电极导线,点样孔一端接负极,另一端接正极,打开电源,调电压至95V,电泳30-40min,当条带移到距凝胶前沿2-3cm时,停止电泳;
步骤5,观察:取出凝胶,在凝胶成像系统下观察,并保存和记录电泳图谱。
6.根据权利要求1所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤(2)和所述步骤(3)中的所述一代测序,或二代测序,或基因芯片分析包括:
步骤一,测序PCR模板的制备;
步骤二,将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化;
步骤三,纯化后的PCR产物的测序反应;
步骤四,测序反应产物纯化。
7.根据权利要求6所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤一包括:
(1)预先制备适量冰;
(2)在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix;
(3)按照一定的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上;
(4)将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序:
95℃5min→(95℃30秒,67℃30秒-0.5℃/循环,72℃1分钟)×14循环→(95℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟)×30循环→72℃7分钟→保持4℃
(5)琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TAE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1-1.5%的琼脂糖凝胶,在微波炉上加热溶化,待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料,温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却,待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中,取少量PCR产物上样电泳,将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
8.根据权利要求6所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤二包括:根据核酸外切酶I,碱性磷酸酶的作用浓度,加入到PCR反应产物中,37℃消化15分钟,85℃使酶失活15分钟。
9.根据权利要求6所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤三包括:
(1)纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释,若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮,可以适当增大稀释倍数;
(2)测序反应用引物稀释到1μM。
10.根据权利要求6所述的一种促排卵药物个体敏感性和副反应的基因检测方法,其特征在于:所述步骤四测序反应产物纯化采用96孔板纯化方法,所述96孔板纯化方法包括步骤:
(1)每管加入2.5μL 125mM EDTA,pH=8,加到管底;
(2)加入30μL100%酒精,封严,震荡4次,室温放置15分钟;20℃最大转速离心45分钟,马上倒置96孔板,倒置最小转速离心10秒;
(3)加入60μL70%酒精,最大转速4℃离心15分钟,马上倒置96孔板,最小转速离心1分钟;
(4)70%酒精重复洗涤1次或2次;
(5)让残余的酒精在室温挥发干,加入10μL Hi-Di甲酰胺,95℃变性4分钟,迅速置冰上4分钟,上样电泳;
所述步骤四测序反应产物纯化采用单个0.2mL离心管离心方法,包括步骤:
(1)每孔加入2.5μL 125mM EDTA到溶液中,再加入30μL 100%酒精,盖好,震荡4次,室温15分钟;
(2)台式离心机12000×g离心30分钟,马上用枪吸尽上清液;
(3)每孔加入60μL 70%酒精,12000×g 4℃离心15分钟,马上用枪吸尽上清液,将此步骤再重复1次;
(4)让酒精在室温挥发干净,加入10μL Hi-DiFormamide溶解DNA;
(5)在PCR仪上变性:95℃4分钟,4℃4分钟,上机电泳。
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