CN101445831A - Fshr基因突变检测液相芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种FSHR基因突变检测液相芯片及其检测方法，该液相芯片包括有：分别包被有特异的anti－tag标签序列的微球；针对每种点突变分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物；扩增出具有FSHR基因外显子10上的突变位点的目标序列的引物。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％，所制备的FSHR基因突变检测液相芯片具有非常好的信号－噪声比，并且所设计的探针以及anti－tag序列之间基本上不存在交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及一种用于FSHR基因突变液相芯片及其检测方法。
背景技术
卵泡刺激素受体(Follicular stimulating hormone receptor，FSHR)属于G蛋白耦联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员，由胞外区、胞内区及跨膜区3部分构成。卵巢颗粒细胞膜表面的特异性FSHR与卵泡刺激素(Follicular stimulating hormone，FSH)结合，在女性促进卵巢内的卵泡发育中发挥重要的作用。FSH与FSHR结合后，通过激活FSHR启动子，活化RNA聚合酶使之与模板DNA准确地结合并启动基因转录，引起FSHR基因转录后水平的变化，从而介导促性腺激素的反应信号，导致第二信使产生以及激发后续的细胞内反应，参与卵泡和生殖细胞的发育和成熟，从而影响女性卵巢的生殖和内分泌功能。研究表明FSHR基因突变是卵巢过度刺激综合征(Ovarian hyper stimulation syndrome，OHSS)发病的主要原因，在辅助生育技术中，为了正确评估患者情况，最大程度避免OHSS的发生，在人工妊娠及促卵泡治疗之前进行FSHR突变检测变得尤为重要。
OHSS是人工妊娠及促卵泡治疗所引起的医源性并发症，常见于试管婴儿治疗周期或排卵障碍妇女的诱导排卵治疗后。OHSS的临床表现为体重、腹围迅速增加、恶心、呕吐、腹泻、血液浓缩、白细胞增加、血氧不足、少尿或无尿、电解质紊乱、腹水、胸水、心包积液、消化道出血、血栓形成、呼吸窘迫综合征、多器官损害和功能衰竭，甚至引起死亡。随着对诱导排卵药品的改善，严格控制指征，排卵监测水平的提高，OHSS的发生率有所下降，但由于不能预测病人对诱导排卵敏感性，OHSS的发生还不能完全避免，并且OHSS是诱发超排卵过程中较常见的医源性并发症，要完全避免其发生是很难实现的。据世界卫生组织在25个国家的33个中心组织了一次采用标准化诊断的不孕症夫妇调查表明，发达国家约有5％-8％的夫妇受到不孕症的影响，发展中国家一些地区不孕症的患病率可高达30％。全世界的不孕患者人数约为8000万～1.1亿。有关医疗机构分析不孕患者的病因，其中内分泌原因占大约38.3％。引起不孕的内分泌原因主要为不排卵。排卵障碍大约占不育的1/3，是引起不孕的主要原因之一。在排卵障碍治疗中轻度OHSS发生率为2.8％～23％，中度为2.9％～16.3％，重度为0.08％～7.1％。由此可见，OHSS在不孕治疗中严重威胁着女性的身体健康，由于OHSS的发病机理仍未阐明，因此对本病的治疗仍缺乏明确有针对性的有效方法，但按个体化原则选择促排卵方案，正确地掌握其适应征，严密观察，预测其发生，采取适当的预防措施，减少严重病例的出现，及时采取相应的治疗，可大大降低严重并发症的发生率。
据相关文献报道，目前已发现FSHR基因共14处突变，分为功能失活的突变和功能活化的突变两大类。与OHSS相关的突变属于功能活化突变，主要包括以下5种：T449I，T449A，I545T，D567N，D567G。
目前已建立了若干以PCR为基础的检测FSHR SNPs的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR—单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应—限制性片段长度多态(PCR—RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多种突变，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供FSHR基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测FSHR基因外显子10上的点突变，分别是codon449、codon545、codon567三个密码子的突变，从而可用于排卵障碍治疗中选择有效的促排卵方案。
一种FSHR基因突变检测液相芯片，包括有：
(A).分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7—10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.21中的序列；
(B).针对每种点突变分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的特异性引物序列和5’端的tag标签序列组成，所述tag标签序列能相应地与(A)中所选的微球上anti-tag标签序列互补配对，所述野生型和突变型特异性引物序列分别选自：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；和/或SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；和/或SEQ ID NO.5及SEQID NO.6；和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；和/或SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；
(C).用于扩增出需要检测的、具有FSHR基因外显子10上的突变位点的目标序列的引物。优选地，扩增出具有FSHR基因外显子10上突变位点的目标序列的引物为：
5’-AGTCCCCAGGTTCCTTATGTG-3’；和
5’-GGAGTTGATGGGGTGAAACAG-3’。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对FSHR基因突变检测的方法。
一种使用上述液相芯片对FSHR基因突变检测的方法，主要包括以下步骤：
(一)提取样本中的DNA；
(二)PCR扩增待测样品，得到需要检测的、具有FSHR基因外显子10上的突变位点的目标PCR反应产物；
(三)用虾碱性磷酸酶及内切酶I对步骤(二)得到的PCR反应产物进行酶切处理；
(四)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(五)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(六)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(七)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的FSHR基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。
3.本发明的检测方法步骤简单，5种突变检测集中于外显子10上，一步PCR即可完成，避免了多重PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1
FSHR基因突变检测液相芯片试剂盒，主要包括有：
一、ASPE引物
针对FSHR外显子10上5种类型突变分别设计野生型和突变型的特异性引物序列。ASPE引物由Tag+特异性引物序列组成，特异性引物设计的原则是：特异性引物的3’末端为突变位点；用于检测一个基因突变位点野生型与突变型的特异性引物应当来自DNA的同一条链；特异性引物的退火温度应当在51℃-56℃之间；引物长度一般在18-22bp之间。ASPE序列如下表所示：
表1 ASPE引物序列
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，特异性tag序列与对应的anti-tag序列碱基互补配对，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用ddH2O配制成100pmol/mL的贮存液。
表2 ASPE引物的tag序列
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag标签序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的10种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表3所示：
表3 ASPE特异性引物右端的Tag序列及微球上对应的anti-tag序列
| 类型 | 微球编号 | SEQ NO. | 微球上对应的anti-tag序列 |
| Thr449Ile-w | LUA8 | 12 | GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT |
| Thr449Ile-m | LUA7 | 13 | ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG |
| Thr449Ala-w | LUA96 | 14 | GTTTAAAGTTAGTTGAGTTAGTAT |
| Thr449Ala-m | LUA51 | 15 | ATTGTTGATGATTGATTGAAATGA |
| Ile545Thr-w | LUA58 | 16 | GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG |
| Ile545Thr-m | LUA59 | 17 | AAAGTGAAAAAGATTGATTGATGA |
| Asp567Asn-w | LUA57 | 18 | GTAATGATAAAGATGATGATATTG |
| Asp567Asn-m | LUA63 | 19 | TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG |
| Asp567Gl y-w | LUA85 | 20 | TGATGTTTGATTATGATGTAGTAT |
| Asp567Gly-m | LUA65 | 21 | AAAGGTAAGATTATTGATGAAAAG |
选择的10种微球(FlexMAP微球)购自美国Luminex公司，也可自己合成tag序列，购买Lumincx公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下：
根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列，每个anti-tag序列前加上一段10个T的“TTTTTTTTTT”的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物(SEQ NO.22—23)：
5’-AGTCCCCAGGTTCCTTATGTG-3’
5’-GGAGTTGATGGGGTGAAACAG-3’
5种FSHR基因点突变集中在外显子10上，分别是codon449、codon545、codon567三个密码子的突变。三个密码子位于大约600bp区间的片段上，利用Primer5.0并参考文献设计一对引物，扩增出包含三个密码子的整段目标序列。
实施例2运用实施例1中的FSHR基因突变检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5M NaOH | Fi sher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTri s-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取患者抗凝静脉血或胸腔积液约2.5ml，3000rpm离心15分钟，取300μl上清加到一个1.5ml干净无菌的离心管中；
2.向离心管中加入500μl AP1缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
3.加入100μl AP2缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
4.室温下12,000rpm离心10分钟；
5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，盖上盖子，以6,000rpm离心1分钟；
6.倒掉废液收集管中的废液，用800μl缓冲液W1洗涤1次，以6,000rpm离心1分钟；
7.倒掉废液收集管中的废液，加入800μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟；倒掉废液收集管中的废液，加入500μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟，弃掉废液；
8.将吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm离心1分钟；
9.将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中，加入40μlTE缓冲液，室温下放置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，电泳检测，-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计一对引物，扩增出包含三个密码子的整段序列，产物大小为673bp。
引物序列(SEQ NO.22-23)如下：
5’-AGTCCCCAGGTTCCTTATGTG-3’
5’-GGAGTTGATGGGGTGAAACAG-3’
反应体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2 3ul
dNTP 1.5ul
Taq酶 0.5ul
引物SEQ NO.22 0.5ul
引物SEQ NO.23 0.5ul
模板DNA 5ul
ddH2O 12ul
共 25ul
PCR扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 5min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取25ul PCR反应后的产物，加入2ul虾碱性磷酸酶(2U)和5ul的内切酶I(5U)2. 37℃孵育30min。99℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取野生型1、Thr449Ile、野生型2、Thr449Ala、野生型3、Ile545Thr、野生型4、Asp567Asn、野生型5、Asp567Gly相应的ASPE引物贮存液2ul于1.5ml微量离心管中，加入ddH2O补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
六、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的10种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物3’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检测中都分别选择LUA18，LUA19，LUA28，LUA48，LUA98，LUA97，LUAO5，LUA10，LUA63，LUA64共10种微球，参见实施例1；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥8000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡漩震荡约20s，超声处理约20s；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，96℃ 90s，37℃ 30min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥2250g离心3min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥2250g离心3min；
11.重复步骤9-10一次；
12.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
13. 37℃孵育15min；
七、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。
实验结果表明，阴性对照荧光值(MFI)都在15以下，检出基因突变的样本对应的突变型MFI比阴性对照MFI高出400倍以上。以阴性对照的MFI为标准，各种突变类型的MFI除以阴性对照MFI，得出一个比值即R＝M/N作为阳性判定值(cut-off值)。高于cut-off值就视为该基因型的突变。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率(除去一个混合感染的样本，即样本号7，因为测序法分型技术本身存在缺陷，对于杂合子突变，在测序过程中将遇到杂峰图形，因此无法准确地进行基因杂合突变的判断)。以R≥400作为cut-off值，本方法检测10份样本的FSHR基因突变型检测结果与测序结果吻合率达到100％；以R≥200作为cut-off值，本方法检测10份样本的FSHR基因突变检测结果与测序结果的吻合率仍为100％，以R≥50作为cut-off值，检测结果的吻合率还是100％，可见本发明所提供的FSHR基因突变检测液相芯片能够准确地检测出FSHR基因突变类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
| 序号NO. | 阴性对照 | T449I-w | T449I-m | T449A-w | T449A-m | I545T-w | I545T-m | D567N-w | D567N-m | D567G-w | D567G-m |
| 1 | 7 | 5665 | 18 | 5624 | 17 | 5512 | 125 | 6385 | 17 | 6246 | 23 |
| 2 | 12 | 6032 | 19 | 5862.5 | 15 | 7699 | 11 | 6279.5 | 8 | 6389 | 10 |
| 3 | 12 | 6168 | 25 | 5994 | 117 | 5716 | 24 | 5614 | 5937 | 6572 | 13 |
| 4 | 10 | 5937 | 9 | 5826 | 14 | 6533 | 15 | 5483 | 15 | 5643 | 11 |
| 5 | 4 | 5534.5 | 5869 | 5714 | 22 | 5328 | 30 | 7358 | 89 | 7352 | 15 |
| 6 | 9 | 5722 | 24 | 5791.5 | 16 | 5462 | 17 | 5617 | 16 | 6482.5 | 21 |
| 7 | 11 | 6007 | 105 | 6021 | 17 | 5804.5 | 12 | 6658 | 34 | 6336.5 | 6119.5 |
| 8 | 13 | 6485 | 13 | 6135.5 | 23 | 6297 | 45 | 6475 | 17 | 6143 | 96 |
| 9 | 9 | 5996 | 29 | 6186 | 21 | 6953.5 | 11 | 6826 | 25 | 5597 | 26 |
| 10 | 8 | 5851.5 | 33 | 5796 | 9 | 5846 | 8 | 6752 | 14 | 5679 | 8 |
| 11 | 15 | 6143 | 16 | 5892 | 29 | 6922 | 19 | 5992 | 38 | 6874 | 24 |
| 12 | 17 | 5934 | 17 | 6438 | 35 | 5973 | 13 | 6878 | 27 | 6255 | 18 |
| 13 | 11 | 7167 | 10 | 5167 | 16 | 6845 | 18 | 6231 | 24 | 6438 | 28 |
| 14 | 16 | 6892 | 19 | 5992 | 6845 | 6967 | 20 | 5493 | 37 | 5346 | 40 |
| 15 | 8 | 6584 | 8 | 7015 | 18 | 5741 | 15 | 6751 | 24 | 6947 | 20 |
| 16 | 6 | 5341.5 | 23 | 6713 | 8 | 7006 | 7 | 5859 | 10 | 6538 | 9 |
| 17 | 18 | 6017 | 24 | 5951 | 18 | 6839 | 14 | 6781 | 13 | 5933 | 35 |
| 18 | 9 | 5945 | 20 | 6349 | 11 | 6542 | 18 | 6346 | 15 | 7116 | 43 |
| 19 | 16 | 6663 | 18 | 6852 | 54 | 5763 | 7154 | 5978.5 | 27 | 6945 | 19 |
| 20 | 10 | 5138 | 19 | 5547.5 | 27 | 5491 | 10 | 6432 | 33 | 6742 | 20 |
表5 样本FSHR突变类型分析结果
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>FSHR基因突变检测液相芯片及其检测方法
<160>23
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
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Claims (5)
1.一种FSHR基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(A).分别包被有特异的anti-tag标签序列的微球，anti-tag标签序列与微球连接中间还设有7—10个T的间隔臂序列；所述anti-tag标签序列选自SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.21中的序列；
(B).针对每种点突变分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的特异性引物序列和5’端的tag标签序列组成，所述tag标签序列能相应地与(A)中所选的微球上anti-tag标签序列互补配对；所述野生型及突变型特异性引物序列分别选自：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、和/或SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；
(C).用于扩增出需要检测的、具有FSHR基因外显子10上的突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的FSHR基因突变检测液相芯片，其特征是，扩增出需要检测的、具有FSHR基因外显子10上突变位点的目标序列的引物序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23。
3.一种FSHR基因突变检测的方法，其特征是，使用权利要求1所述的FSHR基因突变检测液相芯片，主要包括以下步骤：
(一)提取样本中的DNA；
(二)PCR扩增待测样品，得到需要检测的、具有FSHR基因外显子10上突变位点的目标PCR反应产物；
(三)用虾碱性磷酸酶及内切酶I对步骤(二)得到的PCR反应产物进行酶切处理；
(四)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(五)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag标签序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(六)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(七)通过荧光检测仪检测。
4.根据权利要求3所述的FSHR基因突变液相芯片及其检测方法，其特征是：步骤(二)中PCR扩增用的引物序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23。
5.根据权利要求3所述的FSHR基因突变液相芯片及其检测方法，其特征是：步骤(五)中杂交的混度为35—38℃。
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