CN101781684B - Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 - Google Patents
Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101781684B CN101781684B CN 201010105567 CN201010105567A CN101781684B CN 101781684 B CN101781684 B CN 101781684B CN 201010105567 CN201010105567 CN 201010105567 CN 201010105567 A CN201010105567 A CN 201010105567A CN 101781684 B CN101781684 B CN 101781684B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- comprised
- reaches
- tag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 101150056519 CYP19A1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title abstract 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title abstract 3
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 claims abstract description 41
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 19
- 102220181527 rs4646 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102220182714 rs10046 Human genes 0.000 claims description 13
- 102200026601 rs700519 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 75
- 230000008859 change Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 102100029361 Aromatase Human genes 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000919395 Homo sapiens Aromatase Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003881 letrozole Drugs 0.000 description 2
- HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N letrozole Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C(N1N=CN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种CYP19A1基因SNP检测液相芯片，包括有：针对CYP19A1基因rs4646、rs10046C＞T、rs700519C＞T、rs1870050C＞A、hCV1664178A＞C、rs12900137G＞C、rs730154G＞A、rs936306T＞C、rs1902586A＞G SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自SEQ ID NO.19～SEQID NO.36；所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQID NO.18中的序列；分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与所选tag序列互补配对；用于扩增具有CYP19A1基因待检测的目标序列SNP位点的引物。本发明还公开了CYP19A1基因SNP检测方法。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的CYP19A1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP19A1基因SNP检测液相芯片及检测方法。
背景技术
近年来，芳香化酶抑制剂类药物(Aromatase inhibitors，AIs)由于其特异性强、疗效高、副作用小等特点，在乳腺癌和卵巢癌的治疗中得到了越来越多的重视和应用。芳香化酶属于细胞色素P450家族，能催化雄激素转化为雌激素，是雌激素合成中的限速酶，广泛存在于卵巢、胎盘、睾丸、脑、脂肪、骨等正常组织器官中，与乳腺癌的发生密切相关。因而AIs通过抑制芳香化酶，可使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。体内外研究均显示，第三代AIs药物，如来曲唑、阿那曲唑等，能有效抑制雄激素向雌激素转化。另外，由于绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化，故该类药物特别适用于绝经后的乳腺癌患者。研究还显示，绝经后妇女早期乳腺癌的治疗中，来曲唑的疗效和耐药性明显优于他莫昔芬，显著降低了疾病的复发率。因此，越来越多的医生使用AIs来减少绝经后早期乳腺癌患者的术后肿瘤复发，避免他莫昔芬给患者带来的不可预测且可能是相当严重的副作用。
AIs药物的使用需具备两个条件：绝经后妇女和雌激素受体阳性。即便如此，接受AIs治疗后，仍只有约30％的患者能达到理想的治疗效果。进一步研究发现，AIs的药效与CYP19的基因多态性有关。
CYP19是芳香化酶的编码基因。临床研究已证实，接受芳香化酶抑制剂治疗的乳腺癌患者中，携带CYP19A1基因rs4646(G＞T)突变患者的治疗效果较无此突变的患者非常显著。CYP19A1基因rs4646(G/T)位点GG、GT、TT基因型的频率在欧洲人群中分别为54％、39％、7％，而在我国人群中分别为47.6％、41.6％、10.7％，分布情形大致相似，突变型所占比例较高，因此，CYP19A1rs4646(G＞T)SNP突变是乳腺癌和卵巢癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标，
研究表明，在接受芳香化酶抑制剂治疗的过程中，rs10046位点的突变与患者的5年生存率有重要相关。rs700519突变与绝经后妇女患子宫内膜癌的风险呈强烈正相关。rs1870050突变与绝经后妇女患子宫内膜癌的风险呈负相关。hCV1664178、rs12900137、rs730154、rs936306、rs1902586等位点突变与乳腺癌患者的无疾病生存期的缩短相关。
目前已有检测CYP19A1基因多态性的产品上市，如Applied Biosystems公司的
SNPGenotyping Assays系列产品，它是基于TaqMan技术的等位基因差异分析法，但其一次只能进行一种突变的检测，耗时费力；传统固相芯片法，价格昂贵，敏感性不高，检测结果的重复性较差。而其它以PCR为基础的检测SNPs的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性均不能满足检测推广的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP19A1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP19A1基因的rs4646(G＞T)、rs10046(C＞T)、rs700519(C＞T)、rs1870050(C＞A)、hCV1664178(A＞C)、rs12900137(G＞C)、rs730154(G＞A)、rs936306(T＞C)、rs1902586(A＞G)突变中的一种或多种。
实现上述目的的技术方案如下：
一种CYP19A1基因SNP检测液相芯片，包括有：
A.针对CYP19A1基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：针对rs4646G＞T的SEQ ID NO.19和SEQID NO.20、针对rs10046C＞T的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、针对rs700519C＞T的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对rs1870050C＞A的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、针对hCV1664178A＞C SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、针对rs12900137G＞C的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、针对rs730154G＞A的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、针对rs936306T＞C的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、针对rs1902586A＞G的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36中的一对或一对以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18中的序列；
B.分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与A中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
C.用于扩增具有rs4646G＞T、rs10046C＞T、rs700519C＞T、rs1870050C＞A、hCV1664178A＞C、rs12900137G＞C、rs730154G＞A、rs936306T＞C、rs1902586A＞G的中的一个或一个以上SNP位点的CYP19A1基因目标序列的引物。
优选地，扩增出具有SNP位点的目标序列的引物选自：针对rs4646G＞T的SEQ IDNO.55和SEQ ID NO.56、针对rs10046C＞T的SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、针对rs700519C＞T的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、针对rs1870050C＞A的SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、针对hCV1664178A＞C SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、针对rs12900137G＞C的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、针对rs730154G＞A的SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、针对rs936306T＞C的SEQ ID NO.69和SEQ ID NO70、针对rs1902586A＞G的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中的一对或一对以上；所述间隔臂序列为5-10个T。
优选地，所述特异性ASPE引物分别选自：针对rs4646G＞T的由SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.19组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列、针对rs10046C＞T的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列、针对rs700519C＞T的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.24组成的序列、针对rs1870050C＞A的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.26组成的序列、针对hCV1664178A＞C的由SEQ ID NO.9和SEQID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、针对rs12900137G＞C的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、针对rs730154G＞A的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32组成的序列、针对rs936306T＞C的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.34组成的序列、针对rs1902586A＞G的由SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36组成的序列、。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP19A1基因SNP进行检测的方法。
具体技术方案如下：
一种使用上述液相芯片对CYP19A1基因SNP检测方法，主要包括以下步骤：
(1)PCR扩增待测DNA样品；
(2)PCR扩增产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；
(3)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(4)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(6)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的CYP19A1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。尤其是，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，提高检测的特异性，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE特异性引物序列具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。本发明所设计的各种特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。
3.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷。本发明还可进一步同步对CYP19A1基因的rs4646(G＞T)、rs10046(C＞T)、rs700519(C＞T)、rs1870050(C＞A)、hCV1664178(A＞C)、rs12900137(G＞C)、rs730154(G＞A)、rs936306(T＞C)、rs1902586(A＞G)的SNP位点进行检测，提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征，从而使检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。同时，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
具体实施方式
实施例1CYP19A1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CYP19A1的9种常见SNP位点：rs4646(G＞T)、rs10046(C＞T)、rs700519(C＞T)、rs1870050(C＞A)、hCV1664178(A＞C)、rs12900137(G＞C)、rs730154(G＞A)、rs936306(T＞C)、rs1902586(A＞G)，设计特异性的引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的十八种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示。
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的18种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。
微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物：
目标检测CYP19A1基因9种常见SNP位点：rs4646(G＞T)、rs10046(C＞T)、rs700519(C＞T)、rs1870050(C＞A)、hCV1664178(A＞C)、rs12900137(G＞C)、rs730154(G＞A)、rs936306(T＞C)、rs1902586(A＞G)。利用Primer5.0设计引物(见表3)。
表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述CYP19A1基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5M NaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计九对引物，多重PCR一步扩增出9种具有SNP位点的目标序列。引物序列(SEQ NO.55-72)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.55-72的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 33.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：取相应的ASPE引物贮存液各10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10.ul
共 20ul
PCR程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的18种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测大量样本的CYP19A1基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP19A1基因(9个SNP位点同时检测)检测结果与测序结果吻合率达到100％，且具有非常好的信号-噪声比。可见本发明所提供的CYP19A1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP19A1基因的SNP类型，且结果稳定可靠，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
表4样本检测结果(MFI)
表5样本CYP19A1基因多态性分析结果
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CYP19A1基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP19A1基因rs4646(G＞T)位点突变的检测液相芯片为例，针对rs4646(G＞T)的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.18中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.54。具体设计如下表(表6)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表6液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表7样本检测结果(MFI)与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4不同间隔臂液相芯片对CYP19A1基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以CYP19A1基因rs10046(C＞T)位点突变的检测液相芯片为例，探明不同的间隔臂液相芯片对CYP19A1基因SNP检测的影响，针对rs10046(C＞T)的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18中的4条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的ant i-tag序列选择SEQ ID NO.37-SEQ IDNO.54。本实施例的间隔臂为(CH2)12，具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表9样本检测结果(MFI)与基因多态性分析
实施例4的间隔臂为(CH2)12，由检测结果依然稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此，具体数据省略)，而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片，本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>CYP19A1基因SNP检测液相芯片及检测方法
<160>72
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ctttaatcct ttatcacttt atca 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cttttacaat acttcaatac aatc 24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aatcctttct ttaatctcaa atca 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttcaatcatt caaatctcaa cttt 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tcaattacct tttcaataca atac 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cttttcaatt acttcaaatc ttca 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ttactcaaaa tctacacttt ttca 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cttttcaaat caatactcaa cttt 24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
aatcttacta caaatccttt cttt 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ttcacttttc aatcaacttt aatc 24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
attattcact tcaaactaat ctac 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tcaattactt cactttaatc cttt 24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tcattcatat acataccaat tcat 24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
caatttcatc attcattcat ttca 24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcaatcatta cacttttcaa caat 24
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
accaagctag gtgctattg 19
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
caccaagcta ggtgctattt 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
gagaaggctg gtcagtaccc 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
gagaaggctg gtcagtacct 20
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
cagactcgag tttttcccc 19
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cagactcgag tttttccct 19
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
tcaaggcctt tgcttcaggc 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
tcaaggcctt tgcttcagga 20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
cctgattctt ccctcccaca 20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
cctgattctt ccctcccacc 20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
aaagcaaacg tgccatgaag 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
aaagcaaacg tgccatgaac 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
cagcaaaact tcatggagcg 20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
cagcaaaact tcatggagca 20
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
gcatatcagg caggtctgt 19
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
gcatatcagg caggtctgc 19
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
agatgtttta tgtgtgaaca 20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
agatgtttta tgtgtgaacg 20
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
gtatttgagt aagtaattga ttga 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gattgtattg aagtattgta aaag 24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
tgatttgaga ttaaagaaag gatt 24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tgaagatttg aagtaattga aaag 24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tgaaaaagtg tagattttga gtaa 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
gtagattagt ttgaagtgaa taat 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
aaaggattaa agtgaagtaa ttga 24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
atgaattggt atgtatatga atga 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
tgaaatgaat gaatgatgaa attg 24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
attgttgaaa agtgtaatga ttga 24
<210>55
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
ctggagcatt tctcatcagt agt 23
<210>56
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
tatccttctc aaagcacatt tgg 23
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
atattctggc taactgtctg atc 23
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
cattttgtta atgaaggcct atc 23
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
atggaaacta acattacctt ct 22
<210>60
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
agctggagac ccaacatcct tg 22
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
gacctataga atcctctcca ga 22
<210>62
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
cgatatatac tagatcattc tc 22
<210>63
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
gtacatattc agaccccaaa gt 22
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
gtattctcac atagcagaaa ga 22
<210>65
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
tcttggaagg aaggatgact gt 22
<210>66
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
cactaaaatt atattcttct gc 22
<210>67
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
ctgagcagca gctcctgtga at 22
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
cagactagat ggtttttaag aa 22
<210>69
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
ctcccacagg cattactaac gc 22
<210>70
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
aattggctgg caacctggga ct 22
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
gtgaacagag agtaatatca tg 22
<210>72
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
aaggaacttg agtctttcat tt 22
Claims (5)
1.一种CYP19A1基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
A.针对CYP19A1基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：针对rs4646 G＞T的SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、针对rs10046 C＞T的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、针对rs700519 C＞T的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对rs1870050 C＞A的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、针对hCV1664178 A＞C的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、针对rs12900137 G＞C的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、针对rs730154G＞A的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、针对rs936306 T＞C的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、针对rs1902586 A＞G的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36中的一对或一对以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18中的序列；
B.分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与A中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.54中的序列，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；
C.用于扩增具有rs4646 G＞T、rs10046 C＞T、rs700519 C＞T、rs1870050 C＞A、hCV1664178、rs12900137 G＞C、rs730154 G＞A、rs936306 T＞C、rs1902586 A＞G中的一个或一个以上SNP位点CYP19A1基因目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的CYP19A1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物选自：针对rs4646 G＞T的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、针对rs10046 C＞T的SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、针对rs700519 C＞T的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、针对rs1870050 C＞A的SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、针对hCV1664178 A＞C SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、针对rs12900137 G＞C的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、针对rs730154 G＞A的SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、针对rs936306 T＞C的SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70、针对rs1902586 A＞G的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中的一对或一对以上。
3.根据权利要求1或2所述的CYP19A1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述特异性ASPE引物分别选自：针对rs4646 G＞T的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.20组成的序列、针对rs10046 C＞T的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列、针对rs700519 C＞T的由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列、针对rs1870050 C＞A的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.26组成的序列、针对hCV1664178 A＞C的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、针对rs12900137 G＞C的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、针对rs730154G＞A的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32组成的序列、针对rs936306 T＞C的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.34组成的序列、针对rs1902586 A＞G的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36组成的序列中的一组或一组以上。
4.根据权利要求1或2所述的CYP19A1基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.根据权利要求1所述的CYP19A1基因SNP检测液相芯片，其特征是，
所述特异性ASPE引物为：针对rs4646 G＞T的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列、针对rs10046 C＞T的由SEQ ID NO.3和SEQID NO.21组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22组成的序列、针对rs700519 C＞T的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列、针对rs1870050 C＞A的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQID NO.26组成的序列、针对hCV1664178 A＞C的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、针对rs12900137 G＞C的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、针对rs730154G＞A的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32组成的序列、针对rs936306 T＞C的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.34组成的序列、和针对rs1902586 A＞G的由SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.35组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36组成的序列；
分别包被有特异的anti-tag序列的18种微球，所述anti-tag序列能相应地与所述特异性ASPE引物中的tag序列互补配对，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有5-10个T的间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；
扩增引物为：针对rs4646 G＞T的SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、针对rs10046 C＞T的SEQID NO.57和SEQ ID NO.58、针对rs700519 C＞T的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、针对rs1870050 C＞A的SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、针对hCV1664178 A＞C SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、针对rs12900137 G＞C的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、针对rs730154G＞A的SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、针对rs936306 T＞C的SEQ ID NO.69和SEQ ID NO70、和针对rs1902586 A＞G的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010105567 CN101781684B (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010105567 CN101781684B (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101781684A CN101781684A (zh) | 2010-07-21 |
| CN101781684B true CN101781684B (zh) | 2013-04-24 |
Family
ID=42521837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010105567 Expired - Fee Related CN101781684B (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101781684B (zh) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102312009B (zh) * | 2009-06-09 | 2013-04-24 | 广州益善生物技术有限公司 | 铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列和液相芯片 |
| CN101984072B (zh) * | 2010-09-21 | 2013-04-24 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种pdgfra基因突变检测液相芯片 |
| CN102010907B (zh) * | 2010-11-09 | 2013-03-20 | 广州益善生物技术有限公司 | katG、inhA和ndh基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102304568B (zh) * | 2011-04-29 | 2013-05-08 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种fgfr2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102952871B (zh) * | 2011-08-29 | 2014-04-16 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种sult1a1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102952868B (zh) * | 2011-08-29 | 2014-04-16 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种slc15a2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102952872B (zh) * | 2011-08-29 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种slco1b3基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994616B (zh) * | 2011-09-13 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种mek1基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994625B (zh) * | 2011-09-13 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种pik3r1基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994618B (zh) * | 2011-09-13 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种akt3基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994617B (zh) * | 2011-09-13 | 2015-02-04 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种hras基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994622B (zh) * | 2011-09-13 | 2014-09-24 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种met基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102994624B (zh) * | 2011-09-13 | 2014-12-10 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种pik3r5基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN103031366B (zh) * | 2011-09-30 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种fgfr2基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN103031370B (zh) * | 2011-09-30 | 2014-06-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种rb1基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102643904B (zh) * | 2012-04-01 | 2014-08-20 | 周宏灏 | 焦磷酸测序法检测cyp19a1基因多态性的试剂盒及方法 |
| CN103374600B (zh) * | 2012-04-11 | 2014-11-26 | 益善生物技术股份有限公司 | 染色体13q22区段SNP检测特异性引物和液相芯片 |
| CN103451273B (zh) * | 2012-05-31 | 2015-03-04 | 益善生物技术股份有限公司 | Tgm5基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN103451270B (zh) * | 2012-05-31 | 2015-08-19 | 益善生物技术股份有限公司 | Itga6基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN113549681A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-10-26 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种他莫昔芬代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7485711B2 (en) * | 2005-08-12 | 2009-02-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | CYP19A1 polymorphisms |
| WO2008154352A3 (en) * | 2007-06-11 | 2009-02-26 | Juneau Biosciences Llc | Genetic markers associated with endometriosis and use thereof |
-
2010
- 2010-01-29 CN CN 201010105567 patent/CN101781684B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7485711B2 (en) * | 2005-08-12 | 2009-02-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | CYP19A1 polymorphisms |
| WO2008154352A3 (en) * | 2007-06-11 | 2009-02-26 | Juneau Biosciences Llc | Genetic markers associated with endometriosis and use thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Peter Andreas Fasching,et al..Single nucleotide polymorphisms of the aromatase gene (CYP19A1), HER2/neu status, and prognosis in breast cancer patients.《Breast Cancer Res Treat》.2007,第112卷89-98. * |
| PeterAndreasFasching et al..Single nucleotide polymorphisms of the aromatase gene (CYP19A1) |
| 宋传贵等.CYP19A1 基因R264C 在中国上海BRCA1/ 2 基因突变阴性的遗传倾向乳腺癌中的作用.《中华医学遗传学杂志》.2006,第23卷(第2期),181-183. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101781684A (zh) | 2010-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101781684B (zh) | Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 | |
| CN101812511B (zh) | 一种cyp3a4基因snp检测特异性引物、液相芯片及方法 | |
| CN101824467B (zh) | Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法 | |
| CN101824466B (zh) | 一种cyp2c9和vkorc1基因snp检测特异性引物、液相芯片及方法 | |
| CN101565749B (zh) | Cyp2c19、abcb1基因snp检测液相芯片及其检测方法 | |
| CN101671739B (zh) | Tpmt基因snp检测的特异性序列、液相芯片及方法 | |
| CN101487052B (zh) | Cyp2c9、cyp2c19基因突变检测液相芯片及其检测方法 | |
| CN101445831B (zh) | Fshr基因突变检测液相芯片及其检测方法 | |
| CN101805798A (zh) | Cyp2e1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法 | |
| CN101812523B (zh) | Ryr1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法 | |
| CN101624626B (zh) | 氟尿嘧啶类药物疗效相关基因突变检测特异性引物、液相芯片及方法 | |
| CN103805688A (zh) | Ret融合基因检测的pcr引物、试剂盒和液相芯片 | |
| CN101671740B (zh) | Ugt1a1基因多态性检测的方法及液相芯片 | |
| CN101580875B (zh) | 铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列、液相芯片及检测方法 | |
| CN102234686B (zh) | 一种kras基因突变检测液相芯片 | |
| CN102021238B (zh) | Adrb1基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102994617A (zh) | 一种hras基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021240B (zh) | 一种gstm1、gstt1和gstp1基因突变检测液相芯片 | |
| CN102277413B (zh) | Cox-1基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021236B (zh) | Agt1r基因snp检测液相芯片和特异性引物 | |
| CN101824476B (zh) | Oprm1基因snp检测特异性引物、液相芯片和检测方法 | |
| CN102533951A (zh) | 一种brap与psma6基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103031367A (zh) | 一种vhl基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102010898B (zh) | Ephx1基因检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021239B (zh) | Slco1b1基因snp检测特异性引物和液相芯片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SUREXAM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: GUANGZHOU YISHAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee after: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. Address before: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee before: GUANGZHOU SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130424 |