CN101984070A

CN101984070A - 一种c-KIT基因突变检测液相芯片

Info

Publication number: CN101984070A
Application number: CN2010102926162A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 余刚
Original assignee: Guangzhou Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: CN101984070B

Abstract

本发明公开了一种c-KIT基因突变检测液相芯片，主要包括有：5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物是：针对AY502-503dup突变位点的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、针对V560G突变位点的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的c-KIT基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并可实现多个突变位点的并行检测。

Description

一种c-KIT基因突变检测液相芯片

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种c-KIT基因突变检测液相芯片。

背景技术

胃肠间质瘤(gastrointestinal stroml tumor，GIST)是来源于胃肠道的一种特殊肿瘤。近年来随着对GIST分子病理的深人研究和靶向药物的应用，GIST越发引起人们的关注。手术切除至今仍是GIST惟一根治性治疗手段，但复发率极高。分子靶向药物甲磺酸伊马替尼(格列卫)在GIST的治疗中取得了非常好的疗效，是当今GIST患者的首选药物。

伊马替尼的作用机制是抑制血小板衍化生长因子(PDGFR)受体和c-KIT受体的酪氨酸激酶，从而抑制由PDGFR和c-KIT介导的细胞行为，继而抑制GIST细胞的增殖并诱导其凋亡。其中c-KIT基因是HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于人染色体4q12-13。c-KIT是白色斑点显性基因的等位基因，属于原癌基因，其产物是III型酪氨酸激酶，编码145kD的跨膜糖蛋白-酪氨酸激酶受体。

研究表明，GIST的c-KIT基因突变率＞85％，突变主要见于恶性GIST。c-KIT突变有多种形式，常见的有3-21碱基对丢失、点突变，偶见插入性突变。突变可以发生在胞外区(外显子9突变约5％-10％)、激酶区(外显子13突变约5％；外显子17突变占5％)，胞膜区的外显子11大约57％-71％突变。其中发生在外显子17上的突变D816H/V对伊马替尼耐药，而发生在外显子9上的AY502-503重复、外显子11上的突变V560G以及外显子14上的T670I突变对伊马替尼部分耐药。因此，检测GIST患者c-KIT基因突变情况可用于判断格列卫治疗能否有效，对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。

目前对c-KIT基因突变的检测产品主要有定量PCR、直接测序法、Pyrosequencing焦磷酸测序技术、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、价格昂贵等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供c-KIT基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测c-KIT基因四种常见基因型AY502-503dup、V560G、T670I、和/或D816H/V的野生型和突变型。

一种c-KIT基因突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对c-KIT基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对AY502-503dup突变位点的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、针对V560G突变位点的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.27中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增出具有AY502-503dup、V560G、T670I、和/或D816H/V的突变位点的c-KIT基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为：针对AY502-503dup和V560G突变位点的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的c-KIT基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

(2)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型。

(3)本发明的所述液相芯片的检测方法步骤简单，4种突变位点检测可通过一步多重PCR即可完成含有4个突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。

(4)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述c-KIT基因突变检测液相芯片，主要包括有：

一、ASPE引物

针对c-KIT基因的4种常见突变位点AY502-503dup、V560G、T670I、D816H/V，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的9种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的9种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH₂)_n间隔臂(n≥3)，如(CH₂)₁₂、(CH₂)₁₈等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50μl 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10μl合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配制10ng/mL的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5μl的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5μl的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100μl的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物

针对4种c-KIT基因常见突变位点D816H/V、AY502-503dup、V560G、T670I，分别利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出3条含有突变位点的目标序列。

表3扩增出具有目标位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2 c-KIT基因突变检测液相芯片对样本的检测

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250mL)：

2×Tm杂交缓冲液：

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

二、待测样品的PCR扩增

利用Primer5.0设计3对引物，多重PCR一步扩增出c-KIT基因AY502-503dup、V560G、T670I、D816H/V，产物大小分别为350bp、309bp、301bp，引物序列(SEQ ID NO.28-33)见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.28-33的引物贮存液100μl于1.5mL微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

2×缓冲液(含Mg²⁺) 25μl

dNTP(各2.5mmol/L) 4μl

Taq酶(5U/μl) 0.2μl

多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6μl

模板DNA(10ng/μl) 2μl

ddH₂O 12.8μl

共 50μl

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

三、PCR产物的酶切处理

1.取7.5μl PCR反应后的产物，加入1μl 10×SAP缓冲液、1μl SAP酶和0.5μl Exo-I酶；

2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测c-KIT基因的突变位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10μl于1.5mL微量离心管中，加入10mmol/LTris Buffer补至200μl，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。

ASPE反应的体系如下：

10×缓冲液 2μl

MgCl₂(50mmol/L) 0.5μl

Biotin-dCTP(400μmol/L) 0.25μl

dATP、dGTP、dTTP混合液(各100μmol/L) 1μl

Tsp酶(5U/μl) 0.25μl

混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1μl

酶切处理的PCR扩增产物 5μl

ddH₂O 10μl

共 20μl

反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/mL)；

2.分别取1μl每种编号的微球于1.5mL的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100μl的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25μl上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25μl的ddH₂O；

6.取5-25μl的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50μl；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75μl的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥3000g离心2-5min；

11.将微球重悬于75μl的1×Tm杂交缓冲液中，加入15μl浓度为10μg/mL的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。c-KIT各突变型检测荧光值(MFI)的cut-off值如表4所示，当检测的MFI值大于cut-off值时，判定该样本为存在相应的突变，否则判定该样本为野生型，检测结果如表5和表6所示。

使用本方法检测大量样本的c-KIT基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的c-KIT基因突变检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的c-KIT基因突变检测液相芯片能够准确地检测出c-KIT基因的突变类型，且结果稳定可靠。

表4样本cut-of准

突变位点	AY502-503dup	V560G	T670I	D816H	D816V
						cut-off值	76	105	80	103	78

表5样本检测结果(MFI)

表6样本c-KIT基因突变类型分析结果

样本序号	液相芯片检测结果	测序结果
			1	野生型	野生型
2	野生型	野生型
			3	D816V突变型	D816V突变型
4	野生型	野生型
			5	野生型	野生型
6	野生型	野生型
			7	V560G突变型	V560G突变型
8	野生型	野生型
			9	野生型	野生型
10	野生型	野生型
			11	T670I、D816V突变型	T670I、D816V突变型
12	野生型	野生型
			13	D816V突变型	D816V突变型
14	野生型	野生型
			15	D816H突变型	D816H突变型
16	野生型	野生型
			17	AY502-503dup突变型	AY502-503dup突变型
18	AY502-503dup突变型	AY502-503dup突变型
			19	野生型	野生型

20

野生型

实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对c-KIT基因突变位点的检测

一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

以c-KIT基因AY502-503dup位点突变检测液相芯片为例，分别针对AY502-503dup的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.27。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表7液相芯片制备的设计

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：

表8样本检测结果与基因突变分析

其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳，参见本实施例试验组1。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims

1.一种c-KIT基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(C)用于扩增具有AY502-503dup、V560G、T670I、和/或D816H/V的突变位点的c-KIT基因目标序列的扩增引物。

2.根据权利要求1所述的c-KIT基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为：针对AY502-503dup和V560G突变位点的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31、和/或针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。

3.根据权利要求1或2所述的c-KIT基因突变检测液相芯片，其特征是，

(A)ASPE引物对为：针对AY502-503dup突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11组成的序列、针对V560G突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.13组成的序列、针对T670I突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.15组成的序列、和/或针对D816H/V突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.16组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.18组成的序列。

4.根据权利要求3所述的c-KIT基因突变检测液相芯片，其特征是，

(A)ASPE引物对为：针对AY502-503dup突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11组成的序列、针对V560G突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.13组成的序列、针对T670I突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.15组成的序列、和针对D816H/V突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.16组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.18组成的序列；

(C)所述扩增引物为：针对AY502-503dup和V560G突变位点的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29、针对T670I突变位点的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31、和针对D816H/V突变位点的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33。

5.根据权利要求1所述的c-KIT基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。