CN102010906B - 一种embB基因突变检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种emb B基因突变检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有ASPE引物，ASPE引物的特异性引物选自：针对codon 285位点的SEQ ID NO.18及SEQ IDNO.19、针对codon 306位点的SEQ ID NO.20及SEQ ID NO.21～25中的一种以上、针对codon330位点的SEQ ID NO.26及SEQ ID NO.27、针对codon 406的SEQ ID NO.28及SEQ IDNO.29～32中的一种以上、和/或针对codon 497位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；微球；扩增引物。本发明所提供的emb B基因突变检测液相芯片具的检测结果与测序法的吻合率高达100％，并具有很好的信号-噪声比。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种emb B基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
乙胺丁醇(EMB)是1961年发现的一种具有抗分枝杆菌活性的合成药物，是第一线抗结核药物。EMB是一种阿拉伯糖类似物，作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，从而影响细胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物的形成，导致菌细胞的死亡，同时它也使靶分子在细胞内的药物(如利福平)更容易进入细胞内，而与利福平联合应用时具有协同抗结核作用。最近的研究表明结核菌耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达有关，该操纵子由emb A、emb B和emb C等3个基因组成，其中emb B基因(尤其是306位密码子)突变是耐乙胺丁醇产生的主要原因。
结核分枝杆菌emb B基因约3246bp，编码一个糖基转移酶emb B，基因突变使糖基转移酶结构改变，影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的相互作用，从而导致耐乙胺丁醇的产生。emb B基因突变主要发生在codon 306，其为codon 306的Met(ATG)→Ile(ATC/ATA/ATT)或Leu(CTG)或Val(GTG)，codon 285的Phe(TTC)→Leu(TTA)、codon 330Phe(TTC)→Val(GTC)、codon406的Gly(GGC)→Ala(GCC)或Asp(GAC)或Cys(TGC)或Ser(TCC)、codon 497的Gln(CAG)→Arg(CGG)。
目前，对emb B基因突变的检测方法主要有过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR直接测序法等，存在灵敏度低、假阳性率高、稳定性和可重复性差、价格昂贵等缺点，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种emb B基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测emb B基因常见突变位点：codon 306的Met(ATG)→Ile(ATC/ATA/ATT)或Leu(CTG)或Val(GTG)，codon285的Phe(TTC)→Leu(TTA)、codon 330的Phe(TTC)→Val(GTC)、codon 406的Gly(GGC)→Ala(GCC)或Asp(GAC)或Cys(TGC)或Ser(TCC)、codon 497的Gln(CAG)→Arg(CGG)。
实现上述目的的技术方案如下：
一种emb B基因突变检测液相芯片，包括有
(A)针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.17；所述野生型和突变型的特异性引物选自：针对codon 285位点的SEQ ID NO.18及SEQ ID NO.19、针对codon 306位点的SEQ ID NO.20及SEQID NO.21～25中的一种以上、针对codon 330位点的SEQ ID NO.26及SEQ IDNO.27、针对codon 406的SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29～32中的一种以上、和/或针对codon 497位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；
(B)anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDNO.35～SEQ ID NO.51，并能相应地与(A)中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C)用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为：针对codon 285、codon306和/或codon 330突变位点的SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53，针对codon 406的SEQ ID NO.54及SEQ ID NO.55，和/或针对codon 497位点的SEQID NO.56及SEQ ID NO.57。
优选地，所述ASPE引物为，由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.18组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.19组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.20组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.21组成的序列，由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.22组成的序列，由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.23组成的序列，由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.24组成的序列，由SEQID NO.8和SEQ ID NO.25组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.26组成的序列及由SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.27组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.28组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.29组成的序列，由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.30组成的序列，由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.31组成的序列，由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.32组成的序列、和/或由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.34组成的序列。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所提供的emb B基因突变检测液相芯片具的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的emb B基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点并行检测。
(2)本发明所提供的ASPE引物特异性引物，能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点。在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，除了能够单独检测codon 306、codon 330、codon 406或codon 497突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的SNP情况，检测效果一致。
(3)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型。
(4)本发明的检测方法步骤简单，5种基因突变检测可通过一步PCR即可完成含有目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征。
(5)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1emb B基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对emb B基因的突变位点：codon 285的Phe(TTC)→Leu(TTA)，codon 306的Met(ATG)→Ile(ATC/ATA/ATT)或Leu(CTG)或Val(GTG)，codon 330的Phe(TTC)→Val(GTC)、codon406的Gly(GGC)→Ala(GCC)或Asp(GAC)或Cys(TGC)或Ser(TCC)，codon 497的Gln(CAG)→Arg(CGG)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的17种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的17种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50μL 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10μL合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配制10ng/mL的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5μL的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5μL的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100μL的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对emb B基因的突变位点：codon 285的Phe(TTC)→Leu(TTA)，codon 306的Met(ATG)→Ile(ATC/ATA/ATT)或Leu(CTG)或Val(GTG)，codon 330Phe(TTC)→Val(GTC)、codon406的Gly(GGC)→Ala(GCC)或Asp(GAC)或Cys(TGC)或Ser(TCC)，codon 497的Gln(CAG)→Arg(CGG)，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出3条含有突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2emb B基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250mL)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250mL的用量 |
| MES(2[N-Morpholino] | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| ethanesulfonic acid) | |||
| 5MNaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250mL的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50mL |
| 5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20mL |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4mL |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计三对引物，多重PCR一步扩增出分别含有emb B基因目标检测的codon285/306/330、codon 406和codon 497共3条目标序列，产物大小分别为293bp、188bp、194bp，引物序列(SEQ ID NO.52-57)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.40-45的引物贮存液100μL于1.5mL微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25μL
dNTP(各2.5mmol/L) 4μL
Taq酶(5U/μL) 0.2μL
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6μL
模板DNA(10ng/μL) 2μL
ddH2O 12.8μL
共 50μL
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5μLPCR反应后的产物，加入1μL 10×SAP缓冲液、1μL SAP酶和0.5μLExo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测emb B基因的突变位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10μL于1.5mL微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200μL，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。
ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2μL
MgCl2(50mmol/L) 0.5μL
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25μL
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1μL
Tsp酶(5U/μL) 0.25μL
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1μL
酶切处理的PCR扩增产物 5μL
ddH2O 10μL
共 20μL
反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应17种的微球(微球浓度均为2.5×105个/mL)；
2.分别取1μL每种编号的微球于1.5mL的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100μL的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25μL上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25μL的ddH2O；
6.取5-25μL的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50μL；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75μL的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75μL的1×Tm杂交缓冲液中，加入15μL浓度为10ug/mL的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的emb B基因突变位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的emb B基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的emb B基因突变检测液相芯片能够准确地检测出emb B基因的突变类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)之一
表5样本检测结果(MFI)之二
表6样本emb B基因突变比值(％)
表7样本emb B基因突变类型分析结果
| 样本号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | codon 330TG | codon 330TG |
| 3 | codon 497GG | codon 497GG |
| 4 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | codon 306ATG→ATT纯合子 | codon 306ATG→ATT纯合子 |
| 6 | codon 406GGC→GAC纯合子 | codon 406GGC→GAC纯合子 |
| 7 | 野生型 | 野生型 |
| 8 | 野生型 | 野生型 |
| 9 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | 野生型 | 野生型 |
| 11 | codon 285AA | codon 285AA |
| 12 | 野生型 | 野生型 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 野生型 | 野生型 |
| 16 | codon 306ATG→ATC杂合子 | codon 306ATG→ATC杂合子 |
| 17 | 野生型 | 野生型 |
| 18 | 野生型 | 野生型 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对emb B基因突变位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以emb B基因codon 285的Phe(TTC)→Leu(TTA)和codon 330的Phe(TTC)→Val(GTC)突变检测液相芯片为例，分别针对密码子285和330位的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ NO.1-SEQ NO.17，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ NO.35-SEQ NO.51。具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表9codon 285样本检测结果与基因多态性分析
表10codon330样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1和实验组5。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (6)
1.一种emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有
（A）针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.17，且所选的tag序列互不相同；所述野生型和突变型的特异性引物选自：针对codon285位点的SEQ ID NO.18及SEQ ID NO.19、针对codon306位点的SEQ ID NO.20及选自SEQ ID NO.21～25中的一种以上、针对codon330位点的SEQ ID NO.26及SEQ ID NO.27、针对codon406的SEQ ID NO.28及选自SEQ ID NO.29～32中的一种以上、和/或针对codon497位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；
（B）anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDNO.35～SEQ ID NO.51，并能相应地与（A）中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
（C）用于扩增出需要检测的、具有突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为：针对codon285、codon306和codon330突变位点的SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53，针对codon406的SEQ IDNO.54及SEQ ID NO.55，和/或针对codon497位点的SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57。
3.根据权利要求1所述的emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为，针对codon285的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.18组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.19组成的序列；针对codon306的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.20组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.21组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.22组成的序列、由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.23组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.24组成的序列和由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.25组成的序列；针对codon330的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.26组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.27组成的序列；针对codon406的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.28组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.29组成的序列、由SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.31组成的序列和由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.32组成的序列；和/或针对codon497的由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.34组成的序列。
4.根据权利要求1－3任一项所述的emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括：
（A）ASPE引物：针对codon285的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.18组成的序列及由SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.19组成的序列；针对codon306的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.20组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.21组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.22组成的序列、由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.23组成的序列和由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.24组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.25组成的序列；针对codon330的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.26组成的序列及由SEQID NO.10和SEQ ID NO.27组成的序列；针对codon406的由SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.28组成的序列及选自如下至少一种序列：由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.29组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.31组成的序列、和由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.32组成的序列；和针对codon497的由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.34组成的序列；
（B）有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ IDNO.35～SEQ ID NO.51，并能相应地与（A）中所选的微球上tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
（C）扩增引物：针对codon285、codon306和/或codon330突变位点的SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53，针对codon406的SEQ ID NO.54及SEQ ID NO.55，和针对codon497位点的SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57。
5.根据权利要求1所述的emb B基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5－10个T。
6.一种emb B基因突变检测特异性引物，其特征是，包括有：针对codon285位点的SEQ IDNO.18及SEQ ID NO.19，以及针对codon306位点的SEQ ID NO.20及选自SEQ ID NO.21～25中的一种以上、针对codon330位点的SEQ ID NO.26及SEQ ID NO.27、针对codon406的SEQ ID NO.28及选自SEQ ID NO.29～32中的一种以上、和/或针对codon497位点的SEQ IDNO.33及SEQ ID NO.34。
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