CN1341752A - 检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的dna芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片。在玻片等材料表面固定检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的特异DNA探针。所说的基因是引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域;引起利福平抗药性的rpoB基因;引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因;引起乙胺丁醇抗药性的embB基因;引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因。结核杆菌抗药性检测可缩短至1天内完成,并可同时检测116种常见抗药性突变位点。
Description
本发明涉及一种检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片。
结核杆菌引起的结核病是以呼吸道传播为主的慢性传染病，曾是危及人类生命的“第一杀手”。1882年科赫(德国)发现了致病的病源菌----结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，结核菌属于分枝杆菌属，分为人型、牛型、鸟型、鼠型等，对人类有致病能力的有人型和牛型，其中人型结核菌为人类结核病的主要病原菌(占95％以上)，牛型结核菌次之，其它类型结核菌人类罕被感染。
结核菌为长约1～4μm、宽约0.3～0.6μm、稍弯曲的细长杆菌，两端钝圆。抗酸染色呈红色，最适生长温度为37℃，在氧气丰富的环境生长良好。结核菌对外环境的抵抗力较强，100℃15分钟或直接阳光下2～3小时才能将其杀死。
110多年来，随着社会的文明进步，抗结核病药物的开发、预防疫苗的研制和应用，在全世界范围内结核病的发病率和死亡率均有明显下降。
但进入80年代中期，一度被人们已控制流行的结核病，近十年来发病率呈大幅上升的趋势。在全球范围内，结核病又呈肆虐人类之势，其中受害最重的仍为经济滞后的发展中国家。世界卫生组织宣布：全球已处于结核病紧急状态！结核病卷土重来，势头凶猛。每年死于结核病的人数已达到人类没发现链霉素等化学治疗药物前的水平。
据估计全球已有17亿人感染结核杆菌，约有2000万结核患者，每年新增病例800万，死亡达300万，为传染病死亡人数第一位。结核病又将可能成为“十痨九死”或“不治之症”。由于吸烟低龄化及女性化、环境污染加剧，免疫力下降，使年轻女性及老年结核患者死亡率上升。
结核病死灰复燃，全球呈大回升流行之势，究其原因有：一是结核杆菌的耐药性。由于链霉素、异烟肼、乙胺丁醇、利福平等12种国际通用抗结核药物长期使用，结核病疗程长的因素，自然界和患者体内已产生了对化学药物具抗性的结核菌株，特别是多重耐药结核病流行，增大了治疗难度。二是结核病和艾滋病的双重感染。在全球范围内，结核病是目前HTV患者的头号杀手。几乎三分之一的HTV患者的死亡是由结核病造成的。三是由于结核杆菌传染途径和传染力极强，整个世界范围内的人口流动，使结核传染源得到传播。另外，早期发现感染致病有一定的难度，致使漏诊、误诊等。
许多研究资料证明，现今使用的卡介苗既不能预防原发性结核杆菌的感染，又不能预防大量传染性的肺结核发病，故不能明显地降低社区中的结核病传播。因此，不能寄希望于现行使用的卡介苗作控制结核病的主导措施，而只能作为一种辅助手段。国际经验表明，预防控制结核病，最有效的办法是对那些作为主要传染源的向外界排菌的肺结核病人实施有监督的化学治疗。
预防结核病的根本措施在于早期发现和早期治疗，这样既可以迅速消灭结核病的传染源，也有利于切断传染途径，没有治疗过的结核病人是最危险的传染原，而结核病患者一经接受药物治疗，其传染性可迅速降低。就目前的化学疗法水平来说，即便是大量排菌的初发结核病患者，经过合理化疗三个月内可以使大约50％的病人痰菌阴转，经过六个月的治疗，痰菌阴转率可达90％以上，这就使结核病的传染危险大为降低。因此，搜寻、发现和及时治疗新发生的结核病人，是预防结核病的头等重要的工作。
实践证明，结核杆菌的抗药性分型的所需时间非常长，因为结核杆菌生长非常缓慢，检测及抗药性分析一般需6～8周。本发明所说的抗药性分型是指引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域；引起利福平抗药性的rpoB基因；引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗药性的embB基因；引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因分型。结核杆菌的相关抗药性作用机制如下表：
注：katG：catalase-peroxidase；inhA：enoyl-acyl carrier protein reductase；ahp C：alkylhydroperoxide reductase；rpoB：subunit B of RNA polymerase；rpsL：ribosomalprotein S12；rrs：16S rRNA；embB：arabinosyl transferase；pncA：pyrazinamidasenicotinamidase；gyrA：DNA gyrase subunit A。
| 药物 | 作用机制 | 基因 | 抗药性关联突变频率 |
| 异烟肼 | 抑制mycolic acid的生物合成 | katG | 42～58％ |
| inhA基因 | 21～34％ | ||
| ahp C基因 | 10～15％ |
| 利福平 | 抑制转录 | rpoB基因 | 96～98％ |
| 链霉素 | 抑制蛋白质合成 | rpsL基因 | 52～59％ |
| rrs基因 | 8～21％ | ||
| 乙胺丁醇 | 抑制arabinogalactan和lipoarabinomannan的生物合成 | embB基因 | 47～65％ |
| Fluoroquinolone | 抑制DNA gyrase | gyrA基因 | 75～94％ |
| 吡嗪酰胺 | pncA基因 | 72～97％ |
在现有技术中，结核杆菌的抗药性检测主要是检测分离培养的结核杆菌在不同浓度的不同抗菌药物的特定生长条件下的生长速度。经常使用的方法有平板扩散(disk diffusion)、培养液稀释(broth dilution)、琼脂稀释(agar dilution)和递度扩散(gradient diffusion)等。因为结核杆菌生长非常缓慢，检测及抗药性分析一般需6～8周。由于抗药性的遗传机制的有关研究的大量报道，抗药性的基因检测正在成为临床实验室的一种方法(Franklin R Cockerill III，GantimicrobialAgents and Chemotherapy，43(2)，199-212，1999)。现在结核杆菌抗药性相关基因突变检测方法主要有：(1)PCR-SSCP(single-stranded conformation polymorphism)，SSCP是指单链DNA分子在中性PAGE中电泳迁移率随其构象改变的性质。因此可作为基因变异的检测方法，最早由Orita用于癌基因点突变和人基因组多态性研究(Orita，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766，1989)，此法仅能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。以下文献报道了目前广泛应用于结核杆菌抗药性基因检测的方法：(Heym B et al.，Mol.Microbiol.15，235-245，1995；Rouse D.A.et al.，Antimicrob.Agents Chemother.39，2472-2477，1995；Selvakumar N，et al.，Curr.Sci.73，774-777，1997；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，1677-1681，1997；Telenti A，et al.，J Clin Microbiol.，35，719-723，1997；Temesgen Z，et al.，Mol Cell.Probes，11，59-63，1997；Whelen A.C，et al.，J Clin Microbiol.，33，556-561，1995；Victor T. C，et al.，Antimicrob.AgentsChemother，40，1572，1996)；(2)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱(Nachamkin I，et al.，Clin Infect Dis.，24，894-900，1997；Cockerill F.R，et al.，J Infect Dis.，171，240-245，1995；Haas W.H，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，1601-1603，1997)。该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时；(3)PCR-LiPA(line probe assay)(Rossau R，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，2093-2098，1997)，该方法需进行同位素标记或地高辛，生物素，过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析；(4)DNA测序法Musser J.M，et al.，J Infect Dis.，173，196-202，1996；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，600-606，1997；William D.L，et al，Clin InfectDis.，26，446-450，1998；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，40，1024-1026，1996；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，636-640，1997；Takiff H.E，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，38，773-780，1994)，这是最直观，最准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。
Affymetrix公司研究开发了结核杆菌利福平抗药性基因芯片(A.Troesch et al.，J of Clinical Microbiology，37(1)，49-55，1999；T.R.Gingeras et al.，Genome Research，8,435-448,1998)，该公司是利用光导DNA原位合成方法在硅片上合成特定的DNA探针的方法制作这种芯片。该芯片制作方法复杂，设备要求高，芯片杂交信号处理困难，并且只能检测一种药物的抗药性。Orchid Biocomputer公司开发了引物延伸序列扫描方法(S.R.Head et al.，Molecular and Cellular Probes，13，81-87，1999)检测结核杆菌利福平抗药性，由于固相表面引物延伸仍然存在许多技术问题，灵敏度及分辨率都较低，难以大规模使用。
综上所述，在结核杆菌抗药性相关基因突变诊断的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种可同时检测结核杆菌所有抗药性相关基因突变的检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片。
本发明还涉及一种待检测样品的靶的基因或突变区域的PCR扩增引物。
实现本发明目的的技术方案如下所述：
所说的检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片，是一种在表面固定了检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的特异DNA探针的玻片、硅片、膜、高分子材料。
所说的探针为：
引起利福平抗药性的rpoB基因突变探针：W1 gga gtt ctt cgg cacW2 cag cca gct gag ccaW3 agc tga gcc aat tcaW4 att cat gga cca gaaW5 tgg acc aga aca accW6 caa ccc gct gtc gggW7 ccg ctg tcg ggg ttW8 ggt tga ccc aca agcW9 ttg acc cac aag cgcW10 aag cgc cga ctg tcgW11 cga ctg tcg gcg ctgW12 tcg gcg ctg ggg cccM1 gga gtt gtt cgg cacM2 cca gcc atc tga gccM3 agc cag cng agc caa n---c，gM4 cca gct ggg cca attM5 cag ctg acc caa ttcM6 gct gag cna att cat n---a，gM7 ctg agc cna ttc atg n---t，cM8 agc caa ttc ttc atgM9 gcc aat tca tgt tcaM10 cat gga caa ccc gctM11 gga cca gaa ccc gctM12 att cat gaa caa cccM13 tgg acc acc cgc tgtM14 gct gag cat gga ccaM15 ctg agc cac cag aacM16 aat tca tag acc agaM17 att cat gta cca gaaM18 ttc atg gtc cag aac n---t，gM19 tca tgg agc aga acaM20 caa ccc gat gtc gggM21 ccc gct gcc ggg gttM22 ccg ctg tng ggg ttg n---t，aM23 ggg ttg aac cac aagM24 gtt gac can caa gcg n---t，g，aM25 ttg acc cnc aag cgc n---g，t，cM26 tga ccc ana agc gcc n---a，gM27 aag cgc caa ctg tcgM28 ccg act gcc ggc gctM29 cga ctg tng gcg ctg n---a，t，gM30 gac tgt ctg cgc tggM31 tcg gcg ccg ggg ccc
引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因突变探针：
引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因突变探针：
引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、ahpC基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域突变探针：
引起乙胺丁醇抗药性的embB基因突变探针：
引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因突变探针：
这些设计的探针的长度可以有一定的增加或减少，一般在10～25个碱基范围。
本发明与现有技术相比，在一显微镜载玻片表面，固定160×2DNA探针，因此一次可同时检测引起结核杆菌抗药性相关基因----引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域；引起利福平抗药性的rpoB基因；引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗药性的embB基因；引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因的常见基因突变。同时具有平行分析和多重分析的特定。结核杆菌抗药性相关基因突变的检测可缩短至1天内完成。开发的检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片可检测116种常见抗药性突变位点，包括katG基因的10种突变位点(SEQ ID 7)；inhA基因的4种突变位点(SEQ ID 6)；oxyR基因和ahp C基因的中间区域的13种突变位点(SEQ ID 5)；rpoB基因的43种突变位点(SEQ ID 1)；rpsL基因的5种突变位点(SEQ ID 2)；rrs基因的10种突变位点(SEQ ID 3)；embB基因的6种突变位点(SEQ ID 8)；pncA基因的17种突变位点(SEQ ID 9)和gyrA基因的8种突变位点(SEQ ID 4)。所需时间为一天。生产成本少于30元。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片模式图。
图2是一种利福平抗药性结核杆菌的杂交结果图。
图3是一种异烟肼抗药性结核杆菌的杂交结果图。
图4是一种链霉素抗药性结核杆菌的杂交结果图。
图1中：
黑色点阵为野生型探针；白色点阵为突变型探针。由图1可见，该基因芯片包括：
①利福平抗药性分型区域阵列1，野生型探针从左到右分别是W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、W10、W11和W12；突变型探针从左到右，从上到下分别是W1、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、W1、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、W1、M23、M24、M25、M26、M27、M28、M29、M30和M31；
②异烟肼抗药性分型区域阵列2，上排野生型探针从左到右分别OA4(1)、OA-4(1)、OA-6(1)、OA-9(1)、OA-9(1)、OA-12(1)、OA-32(1)、OA-34(1)、OA-39(1)、OA-44(1)、OA-45(1)、OA-45(1)；上排突变型探针从左到右分别是OA4(2)、OA-4(2)、OA-6(2)、OA-9(2)、OA-10(2)、OA-12(2)、0A-32(2)、OA-34(2)、OA-39(2)、OA-44(2)、OA-45(2)、OA-46(2)；下排野生型探针从左到右分别KatG275(1)、KatG833(1)、KatG848(1)、KatG315(1)、KatG328(1)、KatG463(1)、KatG488(1)、KatG500(1)、RBS-A(1)、RBS-T(1)、KatG315(3)、KatG328(3)；下排突变型探针从左到右分别是KatG275(2)、KatG833(2)、KatG848(2)、KatG315(2)、KatG328(2)、KatG463(2)、KatG488(2)、KatG500(2)、RBS-A(2)、RBS-T(2)、RBS-C(2)、RBS-T(3)；
③链霉素和Fluoroquinolones抗药性分型区域阵列，上排野生型探针从左到右分别是16S-491(1)、16S-512(1)、16S-512(1)、16S-516(1)、16S-798(1)、16S-877(1)、16S-904(1)、16S-905(1)、16S-905(1)、S12-9(1)；上排突变型探针从左到右分别是16S-491(2)、16S-512(2)、16S-513(2)、16S-516(2)、16S-798(2)、16S-877(2)、16S-904(2)、16S-905(2)、16S-906(2)、S12-9(2)；下排野生型探针从左到右分别是S12-43(1)、S12-88(1)、S12-88(1)、S12-93(1)、GyrA88(1)、GyrA90(1)、GyrA91(1)、GyrA94(1)、GyrA94(1)；下排突变型探针从左到右分别是S12-43(2)、S12-88(2)、S12-88(3)、S12-93(2)、GyrA88(2)、GyrA90(2)、GyrA91(2)、GyrA94(2)、GyrA94(3)；
④吡嗪酰胺和乙胺丁醇抗药性分型区域阵列，上排野生型探针从左到右分别PncA55(1)、PncA55(1)、PncA57(1)、PncA63(1)、PncA68(1)、PncA69(1)、PncA72(1)、PncA76(1)、PncA85(1)、PncA96(1)；上排突变型探针从左到右分别是PncA55(2)、PncA55(3)、PncA57(2)、PncA63(2)、PncA68(2)、PncA69(2)、PncA72(2)、PncA76(2)、PncA85(2)、PncA96(2)；下排野生型探针从左到右分别PncA132(1)、PncA137(1)、PncA138(1)、PncA139(1)、PncA141(1)、PncA142(1)、EmbB306(1)、EmbB306(1)、EmbB306(1)、EmbB330(1)；下排突变型探针从左到右分别是PncA132(2)、PncA137(2)、PncA138(2)、PncA139(2)、PncA141(2)、PncA142(2)、EmbB306(2)、EmbB306(3)、EmbB306(4)、EmbB330(2)；
本发明的目的是这样实现的：将涉及的特异性探针固定于一种载体如载玻片、硅片、膜和高分子材料表面。用表面阵列的特异性DNA探针杂交方法来检测引起结核杆菌抗药性的所有相关基因突变。
探针设计：选取结核杆菌抗药性katG基因的10种突变位点、inhA基因的4种突变位点、oxyR基因和ahp C基因的中间区域的13种突变位点、rpoB基因的43种突变位点、rpsL基因的5种突变位点、rrs基因的10种突变位点、embB基因的6种突变位点、pncA基因的17种突变位点和gyrA基因的8种突变位点，合成相对应的野生型和突变型DNA探针，固定于载体表面。
检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片的构建：合成以上160种DNA探针，5’末端用氨基或其它活性基团修饰。每种探针重复3次固定于载体的活性表面，构建检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片。
样品处理：用设计的PCR引物扩增待检测样品的靶的基因或突变区域，荧光标记可以用PCR引物末端标记或PCR扩增时加入荧光标记的dNTP。设计的PCR引物是：RpoB1： tcacaccgcagacgttgatRpoB2： cacgctcacgtgacagaccRps1： ggtagatgccaaccatccagRps2： tcttgacaccctgcgtatcc16S1： gggttctctcggattgacg16S2： cgagctctttacgcccagta16S3： gcagtaactgacgctgagga16S4： cgttgcatcgaattaatccacGyrA1： ggtgctctatgcaatgttcgGyrA2： gcttcggtgtacctcatcgOA1： attgatcgccaatggttagcOA2： ccggctagcacctcttggInhA1： gtaaccccagtgcgaaagttInhA2： actgaacgggatacgaatggKatG1： catgaacgacgtcgaaacagKatG2： ccgtacaggatctcgaggaaKatG3： ccgagattgccagccttaKatG4： agggtgcgaatgaccttgembB1： tgatattcggcttcctgctcembB2： gctgacatgggtcatcagcPncA1： ggcggactaccatcacgtcPncA2： ccgttctcgtcgactccttPncA3： tcgaaggagtcgacgagaacPncA4： acacacccgctgtcaggt
芯片表面杂交：荧光标记的PCR扩增产物在一定的条件下与检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片表面的DNA探针杂交，用特定的洗脱条件可以区分全配杂交和单碱基失配杂交。
杂交信号检测：杂交洗脱后用共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号；从而可以检测结核杆菌抗药性katG基因的10种突变位点、inhA基因的4种突变位点、oxyR基因和ahpC基因的中间区域的13种突变位点、rpoB基因的43种突变位点、rpsL基因的5种突变位点、rrs基因的10种突变位点、embB基因的6种突变位点、pncA基因的17种突变位点和gyrA基因的8种突变位点。
实施例1
现结合附图1和图2介绍本发明的实施例1。利用本发明的芯片检测利福平抗药性结核杆菌。取分离培养的结核杆菌溶液1毫升，利用商业化的DNA抽提试剂盒或标准的苯酚抽提/乙醇沉淀方法提取待测结核杆菌基因组DNA，用设计的PCR(聚合酶链式反应)引物RpoB1：tcacaccgcagacgttgat和RpoB2：Cy5-cacgctcacgtgacagacc对rpoB基因片段进行扩增。扩增的体积为100μl，PCR产物中，加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。
DNA芯片表面杂交过程：
5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA芯片表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。杂交信号检测：
用荧光扫描仪GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000检测DNA芯片杂交信号。结果如图2。结果显示，待测结核杆菌是一种带有rpoB基因Ser531Leu突变的利福平抗药性结核杆菌。
实施例2
现结合附图1和图3介绍本发明的实施例2。利用本发明的芯片检测异烟肼抗药性结核杆菌。取分离培养的结核杆菌溶液1毫升，利用商业化的DNA抽提试剂盒或标准的苯酚抽提/乙醇沉淀方法提取待测结核杆菌基因组DNA，用设计的PCR(聚合酶链式反应)引物KatG1：catgaacgacgtcgaaacag；KatG2：Cy5-ccgtacaggatctcgaggaa和KatG3：ccgagattgccagcctta；KatG4：Cy5-agggtgcgaatgaccttg对katG基因、InhA1：gtaaccccagtgcgaaagtt和InhA2：Cy5-actgaacgggatacgaatgg对inhA基因、OA1：attgatcgccaatggttagc和OA2：Cy5-ccggctagcacctcttgg对oxyR基因和ahp C基因的中间区域片段进行扩增。扩增的体积分别为50μl，混合PCR产物，加入1/10体积的3M pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。
DNA芯片表面杂交过程：
5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，冷却至室温，滴加于DNA芯片表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。杂交信号检测：
用荧光扫描仪GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000检测DNA芯片杂交信号。结果如图3。结果显示，待测结核杆菌是一种带有oxyR基因和ahpC基因的中间区域G-12A突变的异烟肼抗药性结核杆菌。
实施例3
现结合附图l和图4介绍本发明的实施例3。利用本发明的芯片检测一种结核杆菌。取分离培养的结核杆菌溶液1毫升，利用商业化的DNA抽提试剂
盒或标准的苯酚抽提/乙醇沉淀方法提取待测结核杆菌基因组DNA，用设计的12
组PCR(聚合酶链式反应)引物对katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C
基因的中间区域、rpoB基因、rpsL基因、rrs基因、embB基因、pncA基因和gyrA
基因进行扩增。扩增的体积分别为50μl，混合PCR产物，加入1/10体积的3M
pH5.2醋酸缓冲液，加入2.5倍体积的-20℃冷藏的100％乙醇，混匀后，-20℃
放置30分钟。13000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥。
DNA芯片表面杂交过程：
5μl杂交缓冲液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃变性5分钟，
冷却至室温，滴加于DNA芯片表面，再盖上载玻片，42℃杂交4～8小时。
杂交信号检测：
用荧光扫描仪GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000检测DNA
芯片杂交信号。结果如图4。从芯片杂交结果图4可以知道待测结核杆菌是rpsL
的K88Q突变，具有链霉素抗药性。
基因序列表：
(1)SEQ ID 1：rpoB(βsubunit of RNA polymerase)基因片段(GenBank L27989)及突变位点(阴影位点)：
(2)SEQ ID 2：rpsL(核糖体蛋白S12)基因片段(GenBank L08011)及突变位点(阴影位点)：
(3)SEQ ID 3：rrs(16s rRNA)基因片段(GenBank X52917)及突变位点(阴影位点)：
(4)SEQ ID 4：gyrA(A subunit of DNA gryase)基因片段(GenBank L27512)及突变位点(阴影位点)：
(5)SEQ ID 5：oxyR基因和ahp C基因的中间区域片段(GenBank U16243)及突变位点(阴影位点)：(6)SEQ ID 6：inhA基因调控区域片段(GenBank U41388)及突变位点(阴影位点)：
(7)SEQ ID 7：KatG(catalase-peroxidase)基因片段(GenBank X68081)及突变位点(阴影位点)：
(8)SEQ ID 8：embB基因片段(GenBank U68480)及突变位点(阴影位点)：(9)SEQ ID 9：pncA(pyranzinamidase)基因片段(GenBank U59967)及突变位点(阴影位点)：
Claims (4)
1.一种检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的DNA芯片，由玻片、硅片、膜或高分子材料和固定在其表面的DNA探针所构成，其特征在于：所说的DNA探针为检测引起结核杆菌抗药性的相关基因突变的特异DNA探针。
2.如权利要求1所说的基因芯片，其特征在于，所说的引起结核杆菌抗药性相关基因突变的特异DNA探针为引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域；引起利福平抗药性的rpoB基因；引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗药性的embB基因；引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因，所说的引起利福平抗药性的rpoB基因突变探针为：W1 gga gtt ctt cgg cacW2 cag cca gct gag ccaW3 agc tga gcc aat tcaW4 att cat gga cca gaaW5 tgg acc aga aca accW6 caa ccc gct gtc gggW7 ccg ctg tcg ggg ttW8 ggt tga ccc aca agcW9 ttg acc cac aag cgcW10 aag cgc cga ctg tcgW11 cga ctg tcg gcg ctgW12 tcg gcg ctg ggg cccM1 gga gtt gtt cgg cacM2 cca gcc atc tga gccM3 agc cag cng agc caa n---c，gM4 cca gct ggg cca attM5 cag ctg acc caa ttcM6 gct gag cna att cat n---a，gM7 ctg agc cna ttc atg n---t，cM8 agc caa ttc ttc atgM9 gcc aat tca tgt tcaM10 cat gga caa ccc gctM11 gga cca gaa ccc gctM12 att cat gaa caa cccM13 tgg acc acc cgc tgtM14 gct gag cat gga ccaM15 ctg agc cac cag aacM16 aat tca tag acc agaM17 att cat gta cca gaaM18 ttc atg gtc cag aac n---t，gM19 tca tgg agc aga acaM20 caa ccc gat gtc gggM21 ccc gct gcc ggg gttM22 ccg ctg tng ggg ttg n---t，aM23 ggg ttg aac cac aagM24 gtt gac can caa gcg n---t，g，aM25 ttg acc cnc aag cgc n---g，t，cM26 tga ccc ana agc gcc n---a，gM27 aag cgc caa ctg tcgM28 ccg act gcc ggc gctM29 cga ctg tng gcg ctg n---a，t，gM30 gac tgt ctg cgc tggM31 tcg gcg ccg ggg ccc所说的引起链霉素抗药性的rpsL基因和rrs基因突变探针为： 
引起Fluoroquinolones抗药性的gyrA基因突变探针：
所说的引起异烟肼抗药性的katG基因、inhA基因、ahpc基因、oxyR基因和ahp C基因的中间区域突变探针为：
所说的引起乙胺丁醇抗药性的embB基因突变探针为
所说的引起吡嗪酰胺抗药性的pncA基因突变探针为： 
3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于探针的长度为10～25个碱基范围。
4.如权利要求1～4所述的任一芯片，其特征在于，设计荧光标记PCR引物扩增相关基因片段，所说的PCR引物为：RpoB1： tcacaccgcagacgttgatRpoB2： cacgctcacgtgacagaccRps1： ggtagatgccaaccatccagRps2： tcttgacaccctgcgtatcc16S1： gggttctctcggattgacg16S2： cgagctctttacgcccagta16S3： gcagtaactgacgctgagga16S4： cgttgcatcgaattaatccacGyrA1： ggtgctctatgcaatgttcgGyrA2： gcttcggtgtacctcatcgOA1： attgatcgccaatggttagcOA2： ccggctagcacctcttggInhA1： gtaaccccagtgcgaaagttInhA2： actgaacgggatacgaatggKatG1： catgaacgacgtcgaaacagKatG2： ccgtacaggatctcgaggaaKatG3： ccgagattgccagccttaKatG4： agggtgcgaatgaccttgembB1： tgatattcggcttcctgctcembB2： gctgacatgggtcatcagcPncA1： ggcggactaccatcacgtcPncA2： ccgttctcgtcgactccttPncA3： tcgaaggagtcgacgagaacPncA4： acacacccgctgtcaggt
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|---|---|---|---|---|
| CN102010906A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-04-13 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种emb B基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102084006A (zh) * | 2008-07-02 | 2011-06-01 | 尼普洛株式会社 | 用于检测结核杆菌中的异烟肼敏感性的方法和试验片 |
| CN101580879B (zh) * | 2009-04-30 | 2012-04-11 | 广西医科大学 | 检测结核杆菌耐药基因膜芯片 |
| CN105603084A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-05-25 | 海南医学院 | 检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法 |
-
2000
- 2000-09-05 CN CN 00119877 patent/CN1341752A/zh active Pending
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