CN105603084B - 检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法 - Google Patents
检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药突变位点的引物、探针及方法，其用于检测结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点。其中异烟肼耐药突变位点位于katG基因和inhA基因，利福平耐药突变位点位于rpoB基因,福诺喹酮类药物的耐药突变位点位于gyrA基因。本发明根据基因库中4种耐药相关基因的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计引物和探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中是否含有耐药突变位点。本发明提供的耐药基因突变位点的检测，对于临床采取正确的治疗方案来治疗结核分支杆菌的感染至关重要。本发明具有检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，利于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药相关基因突变位点的检测，尤其是一种借助液相芯片对结核分枝杆菌针对3种药物耐药相关的基因突变位点的检测，属于医学监测技术领域。
背景技术
结核(Tuberculosis，TB)是威胁人类健康的最主要的传染病之一，而结核耐药性的出现是目前结核病治疗过程中面临的最大难题。全球约20亿结核分支杆菌感染者，每年多达130万人死于结核病。近10年来，由于抗生素的广泛使用和不合理使用，导致了多重耐药结核菌株(MDR-TB)以及广泛耐药结核菌株(XDR-TB)的出现，为结核病的防治带来严峻的挑战。耐药结核较敏感结核具有更高的发病率、病死率和传染能力。目前尚未开发出有效治疗耐药结核的新型药物。我国近年来一直是全世界结核病负担第二高的国家，而耐药结核的病例数居世界首位。
结核耐药性的检测对结核的临床治疗和防治耐药结核的传播至关重要，也是临床治疗过程中面临的难题。现有基于培养法的药敏试验，一般需要3-4周的时间，而近年发展起来的结核杆菌快速培养和药敏测定也需要1-2周的时间。分子生物学的应用大大提高了结核耐药菌株的检测速度，但是结核杆菌的耐药是由多个基因上多个位点的突变引起的，导致基于PCR的检测方法存在操作繁琐、工作量过大的缺点而难以在临床上推广使用。
MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过Luminex检测仪时，该检测仪上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病病原体的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用液相芯片检测结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药相关的基因突变位点检测的引物和探针，还提供一种利用上述引物和探针检测结核分枝杆菌针对上述3种药物耐药的基因突变位点检测的方法。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的是一种基于MASA液相芯片对结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点检测的引物。这3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药位点分别位于4个基因上，其中异烟肼耐药基因位点位于katG基因和inhA基因，利福平耐药基因位点位于rpoB基因,福诺喹酮类药物的耐药基因位点位于gyrA基因。主要根据基因库中能够检索到的4种耐药相关基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：
(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：
katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTA
katG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC
(2)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：
inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGT
inhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC
(3)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：
rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGA
rpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC
(4)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物F、引物R的DNA序列：
gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCG AGGAGATGCAGCGCAGCTACA
gyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC CATTGCCTGGCGAGCCGAAGT
本发明提供的用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针有24种，它们分别与上述的4种引物对应设计制成，所述探针为特异性检测探针，其DNA序列为：
(1)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC
(2)用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC
(3)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG
(4)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的突变型探针inhA--15T的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG
(5)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的DNA序列：
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC
(6)用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的探针突变型inhA--8A的DNA序列：
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC
(7)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针
rpoB-516GAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG
(8)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针
rpoB-516GTC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG
(9)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GGC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG
(10)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG
(11)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526TAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG
(12)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526GAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG
(13)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCGACAGTCGGCGC
(14)用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGC
(15)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACGCGTCGCCGTGC
(16)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACACGTCGCCGTGC
(17)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGACGCGTCGCCGT
(18)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-91CCG的DNA序列：
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGGCGCGTCGCCGT
(19)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-94GAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTCGTAGATCGACG
(20)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94AAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTTGTAGATCGACG
(21)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94TAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTAGTAGATCGACG
(22)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94CAC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTGGTAGATCGACG
(23)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GGC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGCCGTAGATCGACG
(24)用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GCC的DNA序列：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGGCGTAGATCGACG。
本发明提供的用液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的方法，是采用上述的引物和探针，通过两轮PCR反应，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
所述方法可以按下列步骤顺序进行：
a.提取样本中总DNA；
b.第一轮PCR反应：
先以步骤a中提取的样本总DNA为模版，用katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行第一轮PCR。在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F各0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R各0.25uL、TaqDNA聚合酶0.5uL、DNA模板1uL和超纯水19.5uL，
将PCR管放入PCR仪进行第一轮PCR反应，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
c.第二轮PCR反应：
以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、TaqDNA聚合酶1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
然后将PCR管放入PCR仪中进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液；
d.杂交：
分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性检测探针为权力要求2所述探针。
然后将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；
e.检测：
用Luminex200仪器分别读取经步骤d杂交后的24种微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；然后根据荧光检测值判定样品中结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的存在。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第一轮PCR反应时，其反应条件建议为：b1.94℃，5分钟；b2.94℃，30秒；b3.57℃，30秒；b4.72℃，30秒；b5.重复29次步骤b2～b4；b6.72℃，10分钟；b7.降温至4℃。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第二轮PCR反应时，其反应条件建议为：c1.94℃，5分钟；c2.94℃，30秒；c3.60℃，30秒；c4.72℃，30秒；c5.重复29次步骤c2～c4；c6.72℃，10分钟；c7.降温至4℃；
第二轮PCR反应使用的通用引物(生物素修饰的通用引物)的序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R：biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。
本发明可以采用以下方法进行杂交：杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL；96℃变性5min后，55℃杂交15min；加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min。
所述方法包括PCR产物的获得及与探针的杂交，检测结果的判定步骤。其中：
所述PCR产物的获得及与探针的杂交：用于液相芯片检测的PCR产物通过两轮PCR反应获得。第一轮反应以katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行第一轮PCR扩增目标基因片段，第一轮扩增以样本总DNA为模版进行PCR。第二轮反应利用生物素标记的通用引物以第一轮反应产物为模板进行PCR，使所获得PCR产物带有生物素标记，同时第二轮PCR反应具有将第一轮PCR信号放大的作用，增加检测的灵敏度。获得的PCR产物与偶联在不同微球上的特异性探针杂交。
所述检测结果的判定：杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，使之带有荧光。通过Luminex200检测仪读取微球上的荧光数值对检测结果进行判定。
本发明采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含探针对应的病毒种类：当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞100，且大于同一基因同一氨基酸检测位点其他探针荧光检测值两倍，则样品中相应基因的相应氨基酸位点为该探针欧联DNA所对应的氨基酸种类。如果该探针为野生型探针，则该样品中不含有该探针检测的耐药基因突变，如果该探针为突变型探针，则该样品中含有该探针检测的耐药基因突变。
本发明与其他技术相比具有以下的主要的优点：
本发明设计了结核分枝杆菌针对3种治疗药物耐药的基因突变位点的特异性检测引物和探针，使用24种荧光编码微球，利用液相芯片技术对标本进行检测分析。发现基于液相芯片技术研制的针对结核分枝杆菌3种治疗药物耐药的基因突变位点的特异性检测引物和探针具有特异性高、灵敏度高的特点，对所有耐药基因突变位点都可进行明确的区分。
本发明提供的用液相芯片检测结核分枝杆菌针对3种治疗药物耐药的基因突变位点的方法，不仅检测速度快，完成一次检测仅需3.5小时，一次检测可以进行最多达96个样本的同时检测，且操作简单，检测费用低，适合大范围推广应用。在临床结核分枝杆菌治疗过程中耐药产生的检测方面具有重要的应用价值。
总之，本发明具有速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点的检测，因而能对结核临床治疗方案的优化和防治耐药结核的传播作出重要贡献。
具体实施方式
本发明基于MASA液相芯片技术对结核分枝杆菌针对异烟肼、利福平和福诺喹酮类药物这3种药物耐药的基因突变位点进行检测。主要根据基因库中能够检索到的耐药相关基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计简并引物和特异性探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中是否含有耐药相关基因突变位点。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
已知样品1中含有异烟肼和福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤如下：
a.提取样本中总DNA；
b.以步骤a中提取的样本总DNA为模版，用katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行第一轮PCR。各引物序列如下：
katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTA
katG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC
inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGT
inhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC
rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGA
rpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC
gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACA
gyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT
c.在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F各0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R各0.25uL、Taq DNA聚合酶0.5uL、DNA模板1uL和超纯水19.5uL。
使用Biometra T personal PCR仪，PCR过程条件为：c1.94℃，5分钟；c2.94℃，30秒；c3.57℃，30秒；c4.72℃，30秒；c5.重复29次步骤c2～c4；c6.72℃，10分钟；c7.降温至4℃。
所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
d.以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、Taq DNA聚合酶1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
e.将PCR管放入PCR仪，PCR反应过程条件为：e1.94℃，5分钟；e2.94℃，30秒；e3.60℃，30秒；e4.72℃，30秒；e5.重复29次步骤e2～e4；e6.72℃，10分钟；e7.降温至4℃；
得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。
f.分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液(1.5×TMAC，氯化四甲铵)稀释，使得每微升含有100个微球,各探针序列如下：
katG-315AGC:NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC
katG-315ACC:NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC
inhA--15C:NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG
inhA--15T:NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG
inhA--8T:NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC
inhA--8A:NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC
rpoB-516GAC:NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG
rpoB-516GTC:NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG
rpoB-516GGC:NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG
rpoB-526CAC:NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG
rpoB-526TAC:NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG
rpoB-526GAC:NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG
rpoB-531TCG:NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCGACAGTCGGCGC
rpoB-531TTG:NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGC
gyrA-90GCG:NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACGCGTCGCCGTGC
gyrA-90GTG:NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACACGTCGCCGTGC
gyrA-91TCG:NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGACGCGTCGCCGT
gyrA-91CCG:NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGGCGCGTCGCCGT
gyrA-94GAC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTCGTAGATCGACG
gyrA-94AAC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTTGTAGATCGACG
gyrA-94TAC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTAGTAGATCGACG
gyrA-94CAC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTGGTAGATCGACG
gyrA-94GGC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGCCGTAGATCGACG
gyrA-94GCC:NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGGCGTAGATCGACG
g.将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL。96℃变性5min后，55℃杂交15min,加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
h.用Luminex200仪器分别读取经步骤g杂交后的24种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值。
结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC的荧光值为1555，大于100，且为野生型探针katG-315AGC荧光值的两倍，所以该样本含有katG基因315位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的荧光值为1238，大于100，且为突变型探针inhA--15T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--15位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的荧光值为1365.5，大于100，且为突变型探针inhA--8T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--8位氨基酸相关的耐药突变。综合上述结果，该样本含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为1912，大于100，且为突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-516位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为382.5，大于100，且为突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-526位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG的荧光值为269.5，大于100，且为突变型探针rpoB-531TTG荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-531位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本不含有利福平耐药的结核分枝杆菌。
该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG的荧光值为1032，大于100，且为野生型探针gyrA-90GCG荧光值的两倍,所以该样本含有gyrA基因90位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为393.5，大于100，且为突变型探针gyrA-91CCG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因91位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-94GAC的荧光值为477，大于100，且为突变型探针gyrA-94AAC、gyrA-94TAC、gyrA-94CAC、gyrA-94GGC和突变型探针gyrA-94GCC荧光值的两倍，所以该样本不含有gyrA-94位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌。
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实施例2：
已知已知样品2中含有利福平和福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为1646，大于100，且为突变型探针katG-315ACC荧光值的两倍，所以该样本不含有katG基因315位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的荧光值为395.5，大于100，且为突变型探针inhA--15T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--15位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的荧光值为290，大于100，且为突变型探针inhA--8T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--8位氨基酸相关的耐药突变。综合上述结果，该样本不含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为1773，大于100，且为突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-516位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为935，大于100，且为突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-526位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG荧光值为1180，大于100，且为野生型探针rpoB-531TCG荧光值的两倍，所以该样本含有rpoB-531位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有利福平耐药的结核分枝杆菌。
该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG的荧光值为1362，大于100，且为野生型探针gyrA-90GCG荧光值的两倍,所以该样本含有gyrA基因90位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为598，大于100，且为突变型探针gyrA-91CCG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因91位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探gyrA-94GAC的荧光值为592，大于100，且为突变型探针gyrA-94AAC、gyrA-94TAC、gyrA-94CAC、gyrA-94GGC和突变型探针gyrA-94GCC荧光值的两倍，所以该样本不含有gyrA-94位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌。
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实施例3：
已知已知样品3中含有利福平和福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为2043.5，大于100，且为突变型探针katG-315ACC荧光值的两倍，所以该样本不含有katG基因315位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的荧光值为380.5，大于100，且为突变型探针inhA--15T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--15位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的荧光值为387，大于100，且为突变型探针inhA--8T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--8位氨基酸相关的耐药突变。综合上述结果，该样本不含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为1707.5，大于100，且为突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-516位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变型探针rpoB-526TAC的荧光值为310.5，大于100，且为野生型探针rpoB-526CAC和突变型探针rpoB-526GAC荧光值的两倍，所以该样本含有rpoB-526位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG荧光值为1081，大于100，且为野生型探针rpoB-531TCG荧光值的两倍，所以该样本含有rpoB-531位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有利福平耐药的结核分枝杆菌。
该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的荧光值为375，大于100，且为突变型探针gyrA-90GTG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因90位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-91CCG的荧光值为1445，大于100，且为野生型探针gyrA-91TCG荧光值的两倍,所以该样本含有gyrA基因91位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94CAC的荧光值为813，大于100，且为野生型探gyrA-94GAC和突变型探针gyrA-94AAC、gyrA-94TAC、gyrA-94GGC和突变型探针gyrA-94GCC荧光值的两倍，所以该样本含有gyrA-94位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌。
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实施例4：
已知已知样品4中含有异烟肼和利福平耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC的荧光值为1721，大于100，且为野生型探针katG-315AGC荧光值的两倍，所以该样本含有katG基因315位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--15C的荧光值为1083，大于100，且为突变型探针inhA--15T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--15位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的荧光值为1105，大于100，且为突变型探针inhA--8T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--8位氨基酸相关的耐药突变。综合上述结果，该样本含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为1781.5，大于100，且为突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-516位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变型探针rpoB-526TAC的荧光值为424，大于100，且为野生型探针rpoB-526CAC和突变型探针rpoB-526GAC荧光值的两倍，所以该样本含有rpoB-526位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG荧光值为1221，大于100，且为野生型探针rpoB-531TCG荧光值的两倍，所以该样本含有rpoB-531位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有利福平耐药的结核分枝杆菌。
该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的荧光值为986，大于100，且为突变型探针gyrA-90GTG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因90位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为809，大于100，且为突变型探针gyrA-91CCG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因91位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探gyrA-94GAC的荧光值为909，大于100，且为且为突变型探针gyrA-94AAC、gyrA-94TAC、gyrA-94CAC、gyrA-94GGC和突变型探针gyrA-94GCC荧光值的两倍，所以该样本不含有gyrA-94位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本不含有福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌。
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实施例5：
已知已知样品5中含有异烟肼和福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如表1所示，该样本异烟肼耐药相关katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC的荧光值为1591.5，大于100，且为突变型探针katG-315ACC荧光值的两倍，所以该样本不含有katG基因315位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的突变型探针inhA--15T的荧光值为1363，大于100，且为野生型探针inhA--15C荧光值的两倍，所以该样本含有inhA--15位氨基酸相关的耐药突变。该样本异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA--8T的荧光值为651，大于100，且为突变型探针inhA--8T荧光值的两倍，所以该样本不含有inhA--8位氨基酸相关的耐药突变。综合上述结果，该样本含有异烟肼耐药的结核分枝杆菌。
该样本利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC的荧光值为2004，大于100，且为突变型探针rpoB-516GTC和突变型探针rpoB-516GGC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-516位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸野生型探针rpoB-526CAC的荧光值为879，大于100，且为突变型探针rpoB-526TAC和突变型探针rpoB-526GAC荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-526位氨基酸的耐药突变。该样本利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG荧光值为981.5，大于100，且为突变型探针rpoB-531TTG荧光值的两倍，所以该样本不含有rpoB-531位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本不含有利福平耐药的结核分枝杆菌。
该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG的荧光值为953，大于100，且为突变型探针gyrA-90GTG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因90位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG的荧光值为884，大于100，且为突变型探针gyrA-91CCG荧光值的两倍,所以该样本不含有gyrA基因91位氨基酸相关的耐药突变。该样本福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GGC的荧光值为926，大于100，且为且为野生型探gyrA-94GAC和突变型探针gyrA-94AAC、gyrA-94TAC、gyrA-94CAC和突变型探针gyrA-94GCC荧光值的两倍，所以该样本含有gyrA-94位氨基酸的耐药突变。综合上述结果，该样本含有福诺喹酮类药物耐药的结核分枝杆菌。
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
表1
| 探针 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 |
| katG-315AGC | 549 | 1646 | 2043.5 | 585 | 1591.5 |
| katG-315ACC | 1555 | 489 | 548.5 | 1721 | 474 |
| inhA--15C | 1328 | 395.5 | 380.5 | 1083 | 546.5 |
| inhA--15T | 266 | 15 | 14.5 | 196 | 1363 |
| inhA--8T | 1365.5 | 290 | 387 | 1105 | 651 |
| inhA--8A | 561 | 42.5 | 39.5 | 377 | 25 |
| rpoB-516GAC | 1912 | 1773 | 1707.5 | 1781.5 | 2004 |
| rpoB-516GTC | 732 | 368 | 454 | 291 | 660 |
| rpoB-516GTC | 473.5 | 192 | 484 | 541 | 453 |
| rpoB-526CAC | 382.5 | 935 | 40 | 43 | 879 |
| rpoB-526TAC | 35 | 111.5 | 310.5 | 424 | 101 |
| rpoB-526GAC | 35 | 112 | 94 | 98 | 96 |
| rpoB-531TCG | 269.5 | 85 | 94 | 88 | 981.5 |
| rpoB-531TTG | 92 | 1108 | 1081 | 1221 | 10.5 |
| gyrA-90GCG | 91 | 164 | 375 | 986 | 953 |
| gyrA-90GTG | 1032 | 1362 | 30.5 | 113 | 154 |
| gyrA-91TCG | 393.5 | 598 | 252 | 809 | 884 |
| gyrA-91CCG | 54 | 54 | 1445 | 107 | 64.5 |
| gyrA-94GAC | 477 | 592 | 93 | 909 | 113 |
| gyrA-94GGC | 19.5 | 30 | 19 | 86 | 926 |
| gyrA-94GCC | 80 | 134 | 102 | 35 | 235 |
| gyrA-94CAC | 12 | 26.5 | 813 | 17 | 13.5 |
| gyrA-94TAC | 20.5 | 34 | 21 | 22 | 24 |
| gyrA-94AAC | 22.5 | 38.5 | 20 | 19.5 | 16 |
<110> 海南医学院，港大科桥有限公司（Versitech Limited）
<120> 检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法
<140>
<141>
<160> 1
<170>
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 1
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTA
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因突变位点的引物R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 2
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 3
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGT
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因突变位点的引物R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 4
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 5
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGA
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因突变位点的引物R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 6
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 7
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACA
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因突变位点的引物R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 8
TACAGTCGGTCGCGTGCCTC CATTGCCTGGCGAGCCGAAGT
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 9
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 10
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的野生型探针inhA- -15C
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 11
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位氨基酸突变位点的突变型探针inhA- -15T
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 12
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的野生型探针inhA- -8T
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 13
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位氨基酸突变位点的探针突变型inhA- -8A
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 14
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 15
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GTC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 16
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516 GGC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 17
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 18
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526TAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 19
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526GAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 20
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 21
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCGACAGTCGGCGC
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 22
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGC
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 23
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACGCGTCGCCGTGC
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 24
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACACGTCGCCGTGC
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 25
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGACGCGTCGCCGT
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-91CCG
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 26
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGGCGCGTCGCCGT
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-94GAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 27
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTCGTAGATCGACG
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94AAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 28
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTTGTAGATCGACG
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94TAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 29
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTAGTAGATCGACG
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94CAC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 30
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTGGTAGATCGACG
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GGC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 31
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGCCGTAGATCGACG
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GCC
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 32
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGGCGTAGATCGACG
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 第二轮PCR反应使用的通用引物Universal-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 33
TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 第二轮PCR反应使用的通用引物Universal-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400> 34
biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG
Claims (8)
1.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物组，其特征是一种用MASA液相芯片对临床常见的3种结核分枝杆菌治疗药物的耐药相关基因突变位点进行检测的引物组，该引物组引物是根据基因库中能够检索到的目标基因所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计的，具体是：
（1）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因耐药突变位点的引物F、引物R：
其DNA序列是：
katG-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCGGCGGTCACACTTTCGGTA
katG-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACGGGTCCGGGATGGTGCC；
（2）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因耐药突变位点的引物F、引物R：
其DNA序列是：
inhA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGT
inhA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTTGGACACCAGCACCTCGAC；
（3）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因耐药突变位点的引物F、引物R：
其DNA序列是：
rpoB-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCGAGCTGATCCAAAACCAGA
rpoB-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGACAGCGAGCCGATCAGAC；
（4）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因耐药突变位点的引物F、引物R：
其DNA序列是：
gyrA-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGAGATGCAGCGCAGCTACA
gyrA-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCATTGCCTGGCGAGCCGAAGT 。
2.一种检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的探针，其特征是一种用MASA液相芯片检测结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的探针，有24种探针，它们分别与权利要求1所述的4种引物对应设计，具体是：
（1）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的野生型探针katG-315AGC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGCTGGTGATCGC；
（2）用于检测异烟肼耐药相关基因katG基因315位氨基酸突变位点的突变型探针katG-315ACC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CTCGATGCCGGTGGTGATCGC；
（3）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的野生型探针inhA- -15C：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCGTCTCGCCGCGG ；
（4）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-15位突变位点的突变型探针inhA- -15T：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GACAACCTATCATCTCGCCGCGG ；
（5）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的野生型探针inhA- -8T：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACAACCTATCGTCTC；
（6）用于检测异烟肼耐药相关基因inhA基因-8位突变位点的突变型探针inhA- -8A：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-TCACCCCGACATCCTATCGTCTC；
（7）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-516GAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGTCCATGAATTGG；
（8）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516GTC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGACCATGAATTGG；
（9）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因516位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-516 GGC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GGTTGTTCTGGCCCATGAATTGG；
（10）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-526CAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTGGGTCAACCCCG ；
（11）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526TAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTAGGTCAACCCCG ；
（12）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因526位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-526GAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-TCGGCGCTTGTCGGTCAACCCCG ；
（13）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的野生型探针rpoB-531TCG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCGACAGTCGGCGC ；
（14）用于检测利福平耐药相关基因rpoB基因531位氨基酸突变位点的突变型探针rpoB-531TTG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GCCCCAGCGCCAACAGTCGGCGC ；
（15）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-90GCG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACGCGTCGCCGTGC ；
（16）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因90位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-90GTG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CGTAGATCGACACGTCGCCGTGC ；
（17）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-91TCG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGACGCGTCGCCGT ；
（18）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因91位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-91CCG：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-GTCGTAGATCGGCGCGTCGCCGT ；
（19）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的野生型探针gyrA-94GAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGTCGTAGATCGACG ；
（20）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94AAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTTGTAGATCGACG ；
（21）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94TAC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTAGTAGATCGACG ；
（22）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94CAC：
其DNA序列：
NH2-(CH2)12- CACCAGGGTGTGGTAGATCGACG ；
（23）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GGC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGCCGTAGATCGACG ；
（24）用于检测福诺喹酮类药物耐药相关基因gyrA基因94位氨基酸突变位点的突变型探针gyrA-94GCC：
其DNA序列是：
NH2-(CH2)12-CACCAGGGTGGCGTAGATCGACG 。
3.权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针在制备检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的试剂的用途，其特征是该试剂是通过两轮PCR反应，分子杂交，再用Luminex200系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类的。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于该用途按下述步骤进行：
a.提取样本中总DNA；
b.第一轮PCR反应：
先以步骤a中提取的样本总DNA为模版，用katG基因的引物katG-F和katG-R、inhA基因的引物inhA-F和inhA-R、rpoB基因的引物rpoB-F和rpoB-R、gyrA基因的引物gyrA-F和gyrA-R进行第一轮PCR反应，
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液2.5uL、四种脱氧核糖核苷酸0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F各0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R各0.25uL、Taq DNA聚合酶0.5uL、DNA模板 1uL和超纯水19.5uL，
将PCR管放入PCR仪进行第一轮PCR反应，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段；
c. 第二轮PCR反应：
以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液 5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、TaqDNA聚合酶 1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL，
然后将PCR管放入PCR仪中进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液；
d. 杂交：
分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵，所述特异性检测探针为权利要求2所述探针，
然后将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物；
e. 检测：
用Luminex200仪器分别读取经步骤d杂交后的24种微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值，
然后根据荧光检测值判定样品中结核分枝杆菌耐药相关基因突变位点的存在。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于第一轮PCR反应条件为：b1.94℃，5分钟；b2.94℃，30秒；b3.57℃，30秒；b4.72℃，30秒；b5.重复29次步骤b2～b4；b6.72℃，10分钟；b7.降温至4℃。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于第二轮PCR反应的条件为：c1.94℃，5分钟；c2. 94℃，30秒；c3. 60℃，30秒；c4. 72℃，30秒；c5.重复29次步骤 c2～c4 ；c6. 72℃，10分钟；c7.降温至4℃；
该PCR反应使用的通用引物序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R：biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG 。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于采用以下方法进行杂交：
杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL；96℃变性5min后，55℃杂交15min；加入亲和素-藻红蛋白 55℃杂交5min。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于采用以下方法根据荧光检测值判断样本中是否含耐药相关基因突变位点：
当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞100，且大于同一基因同一氨基酸检测位点其他探针荧光检测值两倍，则样品中相应基因的相应位点为该探针欧联DNA所对应的氨基酸种类；如果该探针为野生型探针，则该样品中不含有该探针检测的耐药基因突变，如果该探针为突变型探针，则该样品中含有该探针检测的耐药基因突变。
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