CN102134605B - 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102134605B CN102134605B CN 201010617260 CN201010617260A CN102134605B CN 102134605 B CN102134605 B CN 102134605B CN 201010617260 CN201010617260 CN 201010617260 CN 201010617260 A CN201010617260 A CN 201010617260A CN 102134605 B CN102134605 B CN 102134605B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- snp site
- comprised
- snp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种CYP2C19基因SNP检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有：由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物分别为：SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C194T SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、和/或SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的CYP2C 19基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2C19基因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)又称S-美芬妥英羟化酶，是一种重要的肝微粒体酶。CYP2C19存在于肝微粒体中，许多内源性底物、环境污染物以及临床上大约2％的药物都由其催化代谢。研究发现，CYP2C19基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢，如omeprazole、diazepam、imipramine、propranolol等，是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。
CYP2C19位于染色体10q24，由490个氨基酸组成，分子质量为55933kb，其中全部顺序包括9个外显子和5个内含子，序列已清楚，其遗传为常染色体隐性遗传。
本发明目标检测的CYP2C19基因突变位点，如表所示：
| 序号 | CYP2C19位点突变的内容 | 简写 |
| 1 | SEQ ID NO.91的第96位核甘酸，发生A→G突变 | A96G |
| 2 | SEQ ID NO.91的第194位核甘酸，发生C→T突变 | C194T |
| 3 | SEQ ID NO.92的第77位核甘酸，发生A→G突变 | A77G |
| 4 | SEQ ID NO.93的第147位核甘酸，发生G→A突变 | G147A |
| 5 | SEQ ID NO.94的第78位核甘酸，发生A→G突变 | A78G |
| 6 | SEQ ID NO.94的第196位核甘酸，发生C→T突变 | C196T |
| 7 | SEQ ID NO.95的第117位核甘酸，发生C→T突变 | C117T |
| 8 | SEQ ID NO.95的第258位核甘酸，发生T→A突变 | T258A |
| 9 | SEQ ID NO.96的第95位核甘酸，发生A→C突变 | A95C |
| 10 | SEQ ID NO.97的第126位核甘酸，发生C→T突变 | C126T |
| 11 | SEQ ID NO.98的第72位核甘酸，发生C→T突变 | C72T |
| 12 | SEQ ID NO.99的第107位核甘酸，发生G→A突变 | G107A |
目前，对CYP2C 19基因多态性进行检测、分析的方法很多，如：直接测序法、荧光定量PCR、固相芯片法、PCR-RFLP分析法等等，其中最常用的方法有荧光定量PCR和PCR-RFLP分析法。荧光定量PCR具有操作简便、结果快捷、量化等优点，但是，该技术存在样品易污染，易发生交叉反应，假阳性率高的缺点；而PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP2C19基因SNP检测液相芯片，该液相芯片可用于检测CYP2C19基因十二种常见基因型A96G、C194T、A77G、G147A、A78G、C196T、C117T、T258A、A95C、C126T、C72T和G107A的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下。
一种CYP2C19基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A).针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为：针对A96G SNP位点的SEQ ID NO.25及SEQ IDNO.26、针对C194T SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对A77G SNP位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对G147A SNP位点的SEQ ID NO.31及SEQID NO.32、针对A78G SNP位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对C196T SNP位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对C117T SNP位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对T258A SNP位点的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40、针对A95CSNP位点的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对C126T SNP位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对C72T SNP位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、和/或针对G107A SNP位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48；所述tag序列选自SEQ IDNO.1-24；
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.49～SEQ IDNO.72中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为：针对A96G和C194T SNP位点的SEQ ID NO.73及SEQID NO.74、针对A77G SNP位点的SEQ ID NO.75及SEQ ID NO.76、针对G147A SNP位点的SEQ ID NO.77及SEQ ID NO.78、针对A78G和C196T SNP位点的SEQ IDNO.79及SEQ ID NO.80、针对C117T和T258A SNP位点的SEQ ID NO.81及SEQ IDNO.82、针对A95C SNP位点的SEQ ID NO.83及SEQ ID NO.84、针对C126T SNP位点的SEQ ID NO.85及SEQ ID NO.86、针对C72T SNP位点的SEQ ID NO.87及SEQ IDNO.88、和/或针对G107A SNP位点的SEQ ID NO.89及SEQ ID NO.90。
优选地，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.26组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.29组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.32组成的序列、由SEQID NO.9和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.34组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.36组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.37组成的序列及由SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.40组成的序列、由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.41组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.42组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.43组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.44组成的序列、由SEQID NO.21和SEQ ID NO.45组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.46组成的序列、和/或由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.47组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ IDNO.48组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种用于CYP2C 19基因SNP检测的特异性引物。
具体实施方案如下：
一种用于CYP2C19基因SNP检测的特异性引物，包括有：针对A96G SNP位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C194T SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ IDNO.28、针对A77G SNP位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对G147A SNP位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对A78G SNP位点的SEQ ID NO.33及SEQ IDNO.34、针对C 196T SNP位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对C117T SNP位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对T258A SNP位点的SEQ ID NO.39及SEQID NO.40、针对A95C SNP位点的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对C126T SNP位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对C72T SNP位点的SEQ ID NO.45及SEQID NO.46、和/或针对G107A SNP位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的CYP2C 19基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中，经过大量试验，反应验证，得到最优组合的液相芯片系统，所制备的CYP2C 19基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.通过本发明的发明人的长期积累的设计经验和大量实验的操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致(参见实施例4)。
3.本发明的检测方法步骤简单，十二种多态性位点检测可通过一步多重PCR即可完成九条含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1CYP2C19基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CYP2C19基因十二种常见基因型A96G、C194T、A77G、G147A、A78G、C196T、C117T、T258A、A95C、C126T、C72T和G107A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1CYP2C19基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的24种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的24种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对CYP2C19基因十二种常见基因型A96G、C194T、A77G、G147A、A78G、C196T、C117T、T258A、A95C、C 126T、C72T和G107A的野生型和突变型，设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出九条含有多态性位点的目标序列。
表3扩增出具有多态性位点的目标序列的引物
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计六对引物，多重PCR一步扩增出分别含有CYP2C19基因十二种常见基因型A96G和C194T、A77G、G147A、A78G和C196T、C117T和T258A、A95C、C126T、C72T和G107A共九条的目标序列，产物大小分别为357bp、341bp、302bp、357bp、527bp、217bp、421b、290bp和254bp，引物序列(SEQ ID NO.73-90)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.73-90的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测CYP2C19基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的24种微球(每种微球浓度均为2.5×105个/ml)；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP2C19基因多态性位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2C19基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CYP2C19基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2C19基因多态性位点类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果之一(MFI)
表5样本检测结果之二(MFI)
表6样本检测结果之三(MFI)
表7样本CYP2C19基因突变比值之一(％)
表8样本CYP2C19基因突变比值之二(％)
| 样品号 | C117T | T258A | A95C | C126T | C72T | G107A |
| 1 | 1％ | 2％ | 1％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| 2 | 1％ | 1％ | 2％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 3 | 2％ | 2％ | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ |
| 4 | 2％ | 1％ | 2％ | 1％ | 2％ | 52％ |
| 5 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 6 | 1％ | 2％ | 50％ | 2％ | 2％ | 1％ |
| 7 | 1％ | 2％ | 2％ | 1％ | 1％ | 1％ |
| 8 | 1％ | 2％ | 1％ | 1％ | 49％ | 2％ |
| 9 | 1％ | 2％ | 1％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 10 | 2％ | 98％ | 1％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 11 | 1％ | 2％ | 1％ | 1％ | 2％ | 2％ |
| 12 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 2％ |
| 13 | 1％ | 1％ | 1％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| 14 | 1％ | 2％ | 2％ | 1％ | 1％ | 2％ |
| 15 | 99％ | 1％ | 2％ | 2％ | 1％ | 2％ |
| 16 | 2％ | 1％ | 1％ | 99％ | 1％ | 1％ |
| 17 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 54％ | 1％ |
| 18 | 2％ | 2％ | 2％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 19 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 2％ | 1％ |
| 20 | 1％ | 2％ | 1％ | 2％ | 2％ | 1％ |
表9样本CYP2C19基因突变类型分析结果
| 样本号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | 78GG | 78GG |
| 3 | 96GG | 96GG |
| 4 | 107GA | 107GA |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | 194CT、95AC | 194CT、95AC |
| 7 | 野生型 | 野生型 |
| 8 | 72CT | 72CT |
| 9 | 77GG | 77GG |
| 10 | 258AA | 258AA |
| 11 | 96AG | 96AG |
| 12 | 196TT | 196TT |
| 13 | 194CT、147GA | 194CT、147GA |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | 117TT | 117TT |
| 16 | 96AG、126TT | 96AG、126TT |
| 17 | 野生型 | 野生型 |
| 18 | 196CT | 196CT |
| 19 | 147AA | 147AA |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CYP2C19基因多态性位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP2C19基因A77G和T258A位点突变检测液相芯片为例，分别针对A77G和T258A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.72。具体设计如下表(表10)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表10液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表11样本A77G检测结果与基因多态性分析
表12样本T258A检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组2和试验组5。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
实施例4CYP2C19突变基因检测野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计
本发明在大量实验的基础上，对每个SNP位点选择了最适合的针对野生型和突变型的特异性引物序列。本实施例CYP2C19基因C196T、A95C和G107A位点突变检测液相芯片为例，分别针对C196T、A95C和G107A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，其中，该三个位点针对野生型和突变型的ASPE引物的不同特异性引物序列(仅例举与实施例1中所述的特异性引物相近似的)，如表13所示。
针对同一位点不同基因型的特异性引物序列，使用固定的tag和anti-tag序列，以比较同一位点不同基因型特异性引物序列的检测效果，具体见表14所示。
针对多个位点多种基因型的特异性引物序列并行检测系统，分别制备不同的液相芯片，以选择能够达到最佳效果的并行检测反应体系，具体见表15所示。
ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表13CYP2C19基因突变检测特异性引物
表14CYP2C19基因突变检测液相芯片制备的设计(单个位点不同特异性引物检测效果比较)
表15CYP2C19基因突变检测液相芯片制备的设计(多个位点并行检测)
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
其中，表16～表18为表14中制备的液相芯片检测结果，即单位点不同特异性引物序列效果比较。表19～表21为表15中制备的液相芯片检测结果，即多位点并行检测体系的检测效果比较。
表16C196T位点不同特异性引物效果比较
表17A95C位点不同特异性引物效果比较
表18G107A位点不同特异性引物效果比较
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的特异性引物序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例2中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组7、试验组10和试验组13。其它不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
表19多位点并行检测特异性引物效果比较(Group16)
表20多位点并行检测特异性引物效果比较(Group17)
表21多位点并行检测特异性引物效果比较(Group18)
通过表19到表21的检测结果可见，针对多个位点多种基因型的并行检测，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列，检测效果最佳(信噪比最好，参见本实施例试验组16)，与表16～表18中的实验组7、实验组10和实验组13的单一位点ASPE引物选用最佳的特异性引物序列的检测效果(信噪比和灵敏度等)相近。其它多个位点的不同特异性引物序列的选用，当为实施例2中的组合时，检测效果最佳，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (1)
1.一种CYP2C19基因SNP检测液相芯片，其特征在于，主要包括有：
（A）. 针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为：针对A96G SNP 位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C194T SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对A77G SNP位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对G147A SNP位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对A78G SNP位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对C196T SNP位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对C117T SNP位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对T258A SNP位点的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40、针对A95C SNP位点的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对C126T SNP位点的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44、针对C72T SNP位点的SEQ ID NO.45及SEQ ID NO.46、和/或针对G107A SNP位点的SEQ ID NO.47及SEQ ID NO.48；所述tag序列选自SEQ ID NO.1－24；
（B）. 有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.72中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）. 用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物，
所述扩增引物为：针对A96G和C194T SNP 位点的SEQ ID NO.73及SEQ ID NO.74、针对A77G SNP位点的SEQ ID NO.75及SEQ ID NO.76、针对G147A SNP位点的SEQ ID NO.77及SEQ ID NO.78、针对A78G和C196T SNP位点的SEQ ID NO.79及SEQ ID NO.80、针对C117T和T258A SNP位点的SEQ ID NO.81及SEQ ID NO.82、针对A95C SNP位点的SEQ ID NO.83及SEQ ID NO.84、针对C126T SNP位点的SEQ ID NO.85及SEQ ID NO.86、针对C72T SNP位点的SEQ ID NO.87及SEQ ID NO.88、和/或针对G107A SNP位点的SEQ ID NO.89及SEQ ID NO.90；
所述A96G SNP 位点为SEQ ID NO.91的第96位核苷酸发生A→G突变，
所述C194T SNP 位点为SEQ ID NO.91的第194位核苷酸发生C→T突变，
所述A77G SNP 位点为SEQ ID NO.92的第77位核苷酸发生A→G突变，
所述G147A SNP 位点为SEQ ID NO.93的第147位核苷酸发生G→A突变，
所述A78G SNP 位点为SEQ ID NO.94的第78位核苷酸发生A→G突变，
所述C196T SNP 位点为SEQ ID NO.94的第196位核苷酸发生C→T突变，
所述C117T SNP 位点为SEQ ID NO.95的第117位核苷酸发生C→T突变，
所述T258A SNP 位点为SEQ ID NO.95的第258位核苷酸发生T→A突变，
所述A95C SNP 位点为SEQ ID NO.96的第95位核苷酸发生A→C突变，
所述C126T SNP 位点为SEQ ID NO.97的第126位核苷酸发生C→T突变，
所述C72T SNP 位点为SEQ ID NO.98的第72位核苷酸发生C→T突变，
所述G107A SNP 位点为SEQ ID NO.99的第107位核苷酸发生G→A突变。
2. 根据权利要求1所述的CYP2C19基因SNP检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.26组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.28组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.30组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.32组成的序列、由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.34组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.36组成的序列、由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.37组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.40组成的序列、由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.41组成的序列及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.42组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.43组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.44组成的序列、由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.45组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.46组成的序列、和/或由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.47组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.48组成的序列。
3、根据权利要求1－2任一项所述的CYP2C19基因SNP检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5－10个T。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010617260 CN102134605B (zh) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010617260 CN102134605B (zh) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102134605A CN102134605A (zh) | 2011-07-27 |
| CN102134605B true CN102134605B (zh) | 2013-01-02 |
Family
ID=44294532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010617260 Active CN102134605B (zh) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102134605B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103923988A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-07-16 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102912003A (zh) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种abcb1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN102534005A (zh) * | 2012-01-14 | 2012-07-04 | 长沙三济生物科技有限公司 | 一种检测cyp2c19基因分型的荧光pcr试剂盒 |
| CN106119381A (zh) * | 2016-07-15 | 2016-11-16 | 大连医科大学附属第医院 | 一种cyp2c19基因多态性检测试剂盒及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200754B1 (en) * | 1998-03-19 | 2001-03-13 | Variagenics, Inc. | Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes |
| CN101487052A (zh) * | 2009-02-24 | 2009-07-22 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2c9、cyp2c19基因突变检测液相芯片及其检测方法 |
-
2010
- 2010-12-30 CN CN 201010617260 patent/CN102134605B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200754B1 (en) * | 1998-03-19 | 2001-03-13 | Variagenics, Inc. | Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes |
| CN101487052A (zh) * | 2009-02-24 | 2009-07-22 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2c9、cyp2c19基因突变检测液相芯片及其检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kaori Nakamoto，et al..Genotyping and haplotyping of CYP2C19 functional alleles.《Pharmacogenetics and Genomics》.2007,第17卷103-114. * |
| P . FONTANA,et al..Influence of CYP2C19 and CYP3A4 gene polymorphisms on clopidogrel responsiveness in healthy subjects.《J Thromb Haemost》.2007,第5卷2153-2155. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103923988A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-07-16 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
| CN103923988B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-08-24 | 宋竞岩 | 用于检测等位基因cyp2c19*2的引物组合及检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102134605A (zh) | 2011-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102134605B (zh) | 一种cyp2c19基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102154455B (zh) | 一种cyp2c9基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102533948B (zh) | 一种apoB基因SNP检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103374609B (zh) | Abo基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102994621B (zh) | 一种ptpn11基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102191337B (zh) | 一种cdkal1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102912002B (zh) | 一种abcc2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102533951B (zh) | 一种brap与psma6基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102010898B (zh) | Ephx1基因检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102181573B (zh) | 一种kitlg基因检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102559850B (zh) | 一种apoA5基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN101962686B (zh) | 一种rpoB基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102952866B (zh) | 一种dpyd基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103031367A (zh) | 一种vhl基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102533954B (zh) | 一种cyp17a1基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102912006B (zh) | 一种cyp2a6基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102304567B (zh) | 一种染色体8q24区段多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102888444B (zh) | 一种Factor II和Factor V基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102304564B (zh) | 一种染色体15q25区段SNP检测的特异性引物和液相芯片 | |
| CN102912005A (zh) | 一种cyp2c8基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102533949B (zh) | 一种染色体4q25区段SNP检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102952872B (zh) | 一种slco1b3基因多态性检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN103374608B (zh) | Mtrr基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102191335B (zh) | 一种pigu基因snp检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102952870B (zh) | 一种slc22a2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SUREXAM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: GUANGZHOU YISHAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee after: Surexam Biological Technology Co., Ltd. Address before: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Patentee before: Guangzhou Yishan Biotechnology Co., Ltd. |