CN106119381A - 一种cyp2c19基因多态性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种cyp2c19基因多态性检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术及医学领域，特别是涉及一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR缓冲液、特异性突变检测引物、质控引物和特异性Taqman探针。本发明还提供了一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，该方法适用于手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋的病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液等样品的测定，本发明方法可以快速准确地检测CYP2C19基因多态性，具有灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确、便于推广等特点。

Description

一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，特别是涉及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测试剂盒及检测方法。
背景技术
细胞色素P450酶系(CYP或P450)是肝脏中主要的代谢酶系之一。CYP2C19是P450酶系第二家族中的重要成员，参与了P450酶系负责代谢药物的约12％，是人体重要的药物代谢酶。目前CYP2C19已发现很多单核苷酸多态性，引起了CYP2C19等位基因的发生，亚洲人中最常见的2种基因多态性分别为CYP2C19*2(G681A，rs4244285)和CYP2C19*3(G636A，rs4986893)。CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性与代谢药物的疗效密切相关，从药物代谢方面可分为3类表型：快代谢型(野生纯合子，CYP2C19*1/*1)，中间代谢型(杂合子，CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3)，慢代谢型(突变纯合子，CYP2C19*2/*2或CYP2C19*2/*3或CYP2C19*3/*3)。
氯吡格雷是一种血小板受体抑制剂类药物，在急性冠状动脉综合症(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的血小板治疗中被广泛应用。CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性会使得CYP2C19酶代谢活性显著降低，从而对氯吡格雷代谢转化产生重要影响，造成血小板表面受体异常，导致不良心血管事件的风险增加。2010年，美国食品药品监督管理局(FDA)强调指出氯吡格雷代谢不良的患者药物疗效显著降低，建议医生应该在用药之前对患者的CYP2C19基因型进行检测，从而合理调整用药剂量并确定具体个性化用药方案。
关于基因突变检测方法有很多种，各国学者对此都进行了大量研究。已经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system，扩增阻滞突变系统)法。
直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，耗时费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。
ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒生产厂家包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，但价格昂贵。
因此，本发明釆用ARMS技术与Taqman探针相结合的方法，研发出一种全新的并且能够快速、敏感而且简便的检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。通过自己研发设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为Taqman探针以使检测成本大大降低，这样更适合中国患者CYP2C19基因多态性的检测。综上所述，本发明试剂盒及检测方法提供了一种灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确的CYP2C19基因多态性检测手段。
发明内容
解决的技术问题
本发明需要解决的问题是：本发明的目的是克服现有的基因多态性检测方法所存在的不足，如直接测序法检测能力低、检测灵敏度低、步骤复杂、耗时费力；ARMS方法检测成本高，所用试剂盒价格昂贵等问题。
技术方案
本发明旨在提供一种灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确的CYP2C19基因多态性检测试剂盒及检测方法。
首先，本发明提供了一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、特异性突变检测引物、质控引物和特异性探针，所述引物和探针包括下列3组引物和探针中的至少一组或多组：
(1)
(2)
(3)
进一步地，该基因多态性检测试剂盒中的PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶、1.0-5.0mM的MgCl2、1.0-5.0mM的dNTPs，其中所述dNTPs为dATP、dUTP、dGTP、dCTP的等摩尔混合物。
另一方面，本发明还提供了一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，包括以下步骤：(1)提供如上所述的3组引物和探针中的至少一组；(2)待测样品的处理和模板的提取；(3)配制荧光定量PCR反应体系；(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过特异性探针和扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度来判定检测结果；其中HEX为内控信号，以HEX信号达到设定阈值，即Ct>18时表明上样的DNA量在允许范围内，检测结果可信；FAM为检测信号，以FAM信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
进一步地，上述CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其中的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋的病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
进一步地，上述CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其中的PCR反应体系中各组分终浓度或含量分别为：PCR缓冲液8-10μl、各对引物0.2-1μM、各条探针0.1-0.5μM、待测样品DNA 1μl、加水至25μl。
进一步地，上述CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其中的PCR反应条件为：95℃10分钟；然后将95℃10秒、60℃15秒、72℃30秒循环40次。
综上，本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒采用TaqMan探针法，建立了针对人类CYP2C19基因多态性(如表1所示)的多重实时PCR检测方法；本发明经过大量试验、研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效的检测CYP2C19基因多态性的引物组合与探针组合，并利用这些引物和探针开发出用于检测CYP2C19基因多态性的方法和试剂盒。
表1 CYP2C19基因多态性形式
检测结果 碱基突变形式 基因ID
CYP2C19*2 G681A rs4244285
CYP2C19*3 G636A rs4986893
所述的特异性引物和探针见下表2：
表2 CYP2C19基因多态性的检测引物和探针
引物名称 碱基序列(5′→3′方向) 序列号
P2FW 5′-CCACTATCATTGATTATTTCCTG-3′ SEQ ID NO:1
P2FS 5′-CCACTATCATTGATTATTTCCGA-3′ SEQ ID NO:2
P2R 5′-CCCGAGGGTTGTTGATGTC-3′ SEQ ID NO:3
P2P 5′-FAM/CCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCT/BHQ1-3′ SEQ ID NO:4
P3FW 5′-GGATTGTAAGCACCCCCTCG-3′ SEQ ID NO:5
P3FS 5′-GGATTGTAAGCACCCCCTCA-3′ SEQ ID NO:6
P3R 5′-TGTACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′ SEQ ID NO:7
P3P 5′-FAM/TTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTAC/BHQ1-3′ SEQ ID NO:8
CF 5′-CTTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG-3′ SEQ ID NO:9
CR 5′-CCTCTGCACATAGGTAATTTCCAAATTCC-3′ SEQ ID NO:10
OCP 5′-FAM/CACCTCACAGTTATTGAACATCCTCTGGAG/BHQ1-3′ SEQ ID NO:11
ICP 5′-HEX/CACCTCACAGTTATTGAACATCCTCTGGAG/BHQ1-3′ SEQ ID NO:12
本发明涉及的检测人类CYP2C19基因多态性的荧光定量PCR方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的片段DNA依然具有与新鲜组织样本DNA相同的扩增和检测能力。
本发明的检测试剂盒可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA，且针对性设计不同突变位点的特异性引物，使用荧光定量PCR进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染。
有益效果
本发明的检测试剂盒及检测方法克服了现有基因多态性检测技术中所存在的检测能力低、灵敏度低、步骤复杂、耗时费力、检测成本高等缺陷，由于本发明试剂盒及检测方法具有灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确、便与推广等特点，预期将会具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒检测CYP2C19*2样品的扩增曲线图。
图2为本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒检测CYP2C19*3样品的扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
1.样本处理和核酸提取
利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，具体操作参见试剂盒说明书，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8-2.0，浓度应在5-50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新取切片进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。
2.试剂配置
2.1配置说明：检测反应设置阴性质控品和阳性质控品。
2.2配置过程
提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算方法如下表3：
表3 PCR反应体系配置表
试剂 PCR反应液P 引物探针混合液 纯化水
反应液A(μL) 12.5*N 6.5*N 4.0*N
外控反应液B(μL) 12.5*N 6.5*N 4.0*N
取2个灭菌离心管配置上述2个反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合液23μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。
3.加样
表4样品及质控品上样表
注：STD代表阳性质控品；NTC代表阴性质控品。
根据表4提示的上样比例，将已处理样本、阳性质控品P1和阴性质控品P2加入反应管中，盖紧管盖(避免气泡产生)，2000rpm离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增程序设置
表5 PCR反应程序的设定
5.检验结果的解读
利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过特异性探针和扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度来判定检测结果。HEX为内控信号，以HEX信号达到设定阈值(Ct>18)时表明上样的DNA量在允许范围内，检测结果可信。FAM为检测信号，以FAM信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。

Claims (6)

1.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR缓冲液、特异性突变检测引物、质控引物和特异性探针，所述引物和探针包括下列3组引物和探针中的至少一组或多组：
2.如权利要求1所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶、1.0-5.0mM的MgCl2、1.0-5.0mM的dNTPs，其中所述dNTPs为dATP、dUTP、dGTP、dCTP的等摩尔混合物。
3.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，包括以下步骤：
(1)提供如权利要求1中所述的3组引物和探针中的至少一组；
(2)待测样品的处理和模板的提取；
(3)配制荧光定量PCR反应体系；
(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过特异性探针和扩增产物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度来判定检测结果；其中HEX为内控信号，以HEX信号达到设定阈值，即Ct>18时表明上样的DNA量在允许范围内，检测结果可信；FAM为检测信号，以FAM信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
4.如权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其特征在于：所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋的病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
5.如权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其特征在于：所述的PCR反应体系中各组分终浓度或含量分别为：PCR缓冲液8-10μl、各对引物0.2-1μM、各条探针0.1-0.5μM、待测样品DNA 1μl、加水至25μl。
6.如权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性检测方法，其特征在于：所述的PCR反应条件为：95℃10分钟；然后将95℃10秒、60℃15秒、72℃30秒循环40次。
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