CN106399561A - Cyp2c19基因多态性检测引物、探针及试剂盒 - Google Patents
Cyp2c19基因多态性检测引物、探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒,用于检测CYP2C19基因CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C‑806T)多态性位点。本发明的引物和探针灵敏度高、特异性强,可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长,提取浓度很低的样本能准确检出,对于高至200ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。由其制备的试剂盒成本低,操作简单,检测速度快,整个检测过程只需要120分钟,适用于临床多种样本类型选择。
Description
技术领域
本发明涉及基因多态性检测技术领域,具体涉及CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒。
背景技术
氯吡格雷英文名称Clopidogrel,药品名称波立维,化学式为C16H16ClNO2S。该药品为口服抗血小板药物,可用于防治心肌梗死、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎、动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。罹患中风、心肌梗死或确诊为外周动脉疾病的患者,用药后可减少动脉粥样硬化的发生;经皮冠状动脉介入治疗后的病人,应用氯吡格雷可以降低血栓形成的风险。该药品经体内P450酶生物转化后可与血小板表面ADP受体P2Y12发生不可逆的结合,从而抑制ADP诱导的血小板的聚集,达到抗凝血的功效。
在临床工作中发现,并非所有患者都能在应用氯吡咯雷中获得预期效果,表现为心血管不良事件的发生,这个现象称为“氯吡咯雷抵抗”。另外,服用氯吡咯雷也存在出血的风险,严重出血事件的发生率为1.4%。氯吡格雷抵抗主要原因是CYP2C19基因突变致使氯吡格雷的活性代谢产物减少。2009年1月,哈佛大学JessicaL.M.等在《新英格兰医学杂志》上发表了最新临床研究结果,证实CYP2C19基因突变所导致的弱代谢个体,其栓塞重新形成的风险增加,心脑血管事件的发生风险增加,病死率升高。目前,公认的与氯吡咯雷代谢减弱相关的CYP2C19基因多态性主要包括CYP2C19*2和CYP2C19*3,与氯吡咯雷代谢增强相关的CYP2C19基因多态性则为CYP2C19*17。基于以上原因,氯吡格雷遭遇了美国食品药品监督管理局(FDA)的黑框警告,警告内容为“建议服用氯吡格雷的患者做CYP2C19基因检测”。
目前,针对CYP2C19基因多态性检测的方法有多种,主要包括DNA测序法、高分辨率溶解曲线法和液相芯片法。DNA测序法虽然是金标准,但步骤繁琐,耗时长。高分辨率溶解曲线法,快速,简便,经济实用,但对仪器的需求较高,绝大部分的实时荧光定量PCR仪无法适用。液相芯片法操作过程复杂,且容易污染,假阳性率高。因此需要建立一种快速操作方便,快速,特异性好、灵敏的基因检测方法。
发明内容
为了克服现有检测技术的上述不足,本发明在Taqman探针法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的CYP2C19基因CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)多态性位点的引物和探针,本发明的另一目的是提供包括检测以上多态性位点的试剂盒,以及检测方法。
本发明提供的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,用于检测第681位点、第836位点以及第806位点基因多态性,其具体核苷酸序列如下:
(1)检测CYP2C19*2(G681A)基因多态性的引物和探针:
G681A位点突变型ARMS上游引物:
5’-CCCACTATCATTGATTATTTCACA-3’(SEQ ID NO.1),
G681A位点野生型ARMS上游引物:
5’-TTCCCACTATCATTGATTATTGCCGG-3’(SEQ ID NO.2),
G681A位点公用的下游引物:5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAATC-3’(SEQ ID NO.3),
G681A位点公用的探针:5’-CCTTGCTTTTATGG-3’(SEQ ID NO.4);
(2)检测CYP2C19*3(G836A)基因多态性的引物和探针:
G836A位点突变型ARMS上游引物:
5’-GATTGTAAGCACCACCTGA-3’(SEQ ID NO.5),
G836A位点野生型ARMS上游引物:
5’-GATTGTAAGCACCCACTGG-3’(SEQ ID NO.6),
G836A位点公用的下游引物:5’-CTAGGCAAGACTGTAGTATTC-3’(SEQ ID NO.7),
G836A位点公用的探针:5’-CCAGGTAAGGCCAAGT-3’(SEQ ID NO.8);
(3)检测CYP2C19*17(C-806T)基因多态性的引物和探针:
C-806T位点突变型ARMS上游引物:
5’-GTGTCTTCTGTTCTCAACGT-3’(SEQ ID NO.9),
C-806T位点野生型ARMS上游引物:
5’-GTGTCTTCTGTTCTCAAGGC-3’(SEQ ID NO.10),
C-806T位点公用的下游引物:5’-CTCATAGCTGGCAGAACTGG-3’(SEQ ID NO.11),
C-806T位点公用的探针:5’-CGCCACGATGGGCATC-3’(SEQ ID NO.12);
所述探针均为MGB探针,探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团。
优选地,上述检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,所述荧光你报告基团为FAM。
本发明还提供了一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒,包括以上任一所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针。
该试剂盒针对不同基因位点,分别采用上述设计的野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针,结合荧光定量PCR反应,对从人外周血中提取的基因组DNA进行检测,一次性在一条6联PCR反应条上实现对CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)基因多态性进行检测,通过实时荧光PCR仪上收集信号,计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型,准确度好,操作简单方便。
优选地,所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒,还包括一组内控基因的检测引物和探针,具体核苷酸序列如下:
上游引物:5’-GGAAAGTGATATTTTGGAGAA-3’(SEQ ID NO.13),
下游引物:5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.14),
内控探针:5’-CACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGAC-3’(SEQ ID NO.15);
所述内控探针为Taqman探针,探针核苷酸序列的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,且荧光报告基团不同于权利要求1所述的MGB探针。
优选地,上述CYP2C19基因多态性检测试剂盒,内控探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE,3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地,所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒,还包括PCR反应液,所述PCR反应液包括dNTPs、PCR缓冲液、Fast Advanced Master Mix、矿物油和超纯水。
优选地,所述CYP2C19基因多态性检测试剂盒,还包括非模板对照和阳性对照。
本发明还提供了上述CYP2C19基因多态性检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
(1)提取待检测样品中的DNA;
(2)用权利要求1所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,每个基因型的检测引物和探针对应一个反应体系,每个反应体系里均含有内控引物和探针,每个反应体系均使用提取的DNA作为模板,进行荧光定量PCR;同时设置非模板对照和阳性对照;
(3)检测结果分析:
在非模板对照FAM及JOE信号不起线,或Ct>28;阳性对照FAM及JOE信号Ct值≤25;待检测样本产生的JOE信号Ct值≤25的情况下,代表扩增正常,按照以下标准判断基因型:
其中,Ct1为CYP2C19*2G基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct2为CYP2C19*2A基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct3为CYP2C19*3G基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct4为CYP2C19*3A基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct5为CYP2C19*17C基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct6为CYP2C19*17T基因型反应体系的FAM信号Ct值。
本发明具有以下有益效果:
本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测CYP2C19基因多态性检测引物、探针和试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出CYP2C19*2(G681A)、CYP2C19*3(G836A)和CYP2C19*17(C-806T)三个位点的基因多态性情况。
与现有技术相比,本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因,有如下有益效果和显著进步:
(1)灵敏度高,可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长,提取浓度很低的样本能准确检出。
(2)特异性强,对于高至200ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。
(3)成本低,ARMS分型法相对于Taqman探针分型法,不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性,而且还能节约成本。
(4)操作简单,检测速度快,整个检测过程只需要120分钟。
(5)应用Fast Advanced Master Mix预混在反应体系中,减少了酶与样本混合的步骤,减少了样本的污染,避免了气溶胶污染引起的假阳性。
总之,本发明涉及的CYP2C19基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择,具有特异性强,灵敏度高,实验周期短,操作简单,成本低等显著优点。
附图说明
图1是实施例3中样本1第1、2孔扩增曲线(CYP2C19*2 G/A);
图2是实施例3中样本1第3、4孔扩增曲线(CYP2C19*3 G/G);
图3是实施例3中样本1第5、6孔扩增曲线(CYP2C19*17 C/C);
图4是实施例3中样本2第1、2孔扩增曲线(CYP2C19*2 G/A);
图5是实施例3中样本2第3、4孔扩增曲线(CYP2C19*3 G/A);
图6是实施例3中样本2第5、6孔扩增曲线(CYP2C19*17 C/C)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1:试剂盒组成
本发明所述的检测试剂盒组成如下表。
注:Fast Advanced Master Mix(简称AB premix),购自美国应用生物系统公司;10×buffer(PCR缓冲液,含Mg2+等)购自宝生物工程(大连)有限公司。试剂盒中,内控探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE,3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。检测探针均为MGB探针,探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团FAM,3’端标记荧光淬灭基团。
实施例2:样本基因组DNA的提取
本实施例中收集人体全血样本,从中提取基因组DNA。
从EDTA抗凝血中提取基因组DNA,并对其进行定量,作为PCR检测的模板。采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒,按照说明进行,具体详述如下:
1、处理血液材料:
(1)当血液样品体积小于200μL时,可加缓冲液GS补足体积至200μL,再进行下一步实验(如血液样品体积为200μL,可直接进行下一步实验,不需加入GS)。
(2)当血液样品体积超过200μL时,需用细胞裂解液CL处理,具体步骤如下:在样品中加入1~2.5倍体积的细胞裂解液CL,颠倒混匀,10,000rpm(~11,500×g)离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底,可重复以上步骤一次),向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS,振荡至彻底混匀。
2、加入20μL roteinase K溶液,混匀。
3、加200μL缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10min,其间颠倒混匀数次,溶液应变清亮。
4、加200μL无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
6、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7、向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8、重复操作步骤7。
9、12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10、将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。
11、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量,稀释DNA浓度到1ng/μL。
实施例3:样本基因组DNA的检测
本实施例采用实施例1中所列举的引物、探针组合来扩增实施例2所提取的基因组DNA样品。
检测CYP2C19基因多态性的反应体系组成:
10×buffer(Mg2+Plus):4~8μL,
dNTPs:50~250μM(each),
各条引物:150~300nM,
各条探针:50~200nM,
FastAdvanced Master Mix:6~12μL,
模板:10μL,
总体积:40μL。
PCR反应条件设置:
检测方法如下:
1、每次PCR反应中,同时进行非模板对照(No Template Control;NTC)、阳性对照和待测样本的检测。
2、将阳性对照取出解冻后震荡混匀,并离心30sec。
3、将6联PCR反应条取出解冻后离心30sec,防止反应液在开盖时溅出。
4、将ddH2O(NTC)、实施例1中提取的DNA样本、阳性对照分别加入6联PCR反应条,每孔10μL。
5、将以上6联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30sec,确保管壁上不沾有液滴。
6、将6联PCR反应条放于实时PCR仪器中,用预设的反应程序进行PCR扩增。
检测结果分析:
根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果:以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD)FAM及JOE信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM及JOE信号不起线,或Ct>28;阳性对照FAM及JOE信号Ct值≤25,体系性能良好,结果有效);以待测样本JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准(JOE信号Ct值≤25,扩增正常),以待测样本每组SNP位点检测孔FAM信号Ct值的差值作为判断标准。
注:Ct1~Ct6分别表示第1到第6孔的FAM信号Ct值。其中第1、2孔为一组,3、4孔为一组,5、6孔为一组;分别计算三组Ct值的差值。当ct值为Undetermined(无扩增曲线)时,该孔的Ct值记为∞。
附图1~3中,Ct2-Ct1=-0.39,Ct4-Ct3=∞,Ct6-Ct5=∞。结果显示样本1为CYP2C19*2杂合型(G/A),CYP2C19*3纯野生型(G/G),CYP2C19*17纯野生型(C/C)。
附图4~6中,Ct2-Ct1=-0.44,Ct4-Ct3=0.2,Ct6-Ct5=17.81。结果显示样本2为CYP2C19*2杂合型(G/A),CYP2C19*3杂合型(G/A),CYP2C19*17纯野生型(C/C)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海吉力生物科技有限公司
<120> CYP2C19基因多态性检测引物、探针及试剂盒
<130> WH1610026-1
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccactatca ttgattattt caca 24
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcccactat cattgattat tgccgg 26
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ccattttgat caggaagcaa tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttgctttt atgg 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gattgtaagc accacctga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gattgtaagc acccactgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctaggcaaga ctgtagtatt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccaggtaagg ccaagt 16
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gtgtcttctg ttctcaacgt 20
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cgccacgatg ggcatc 16
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<213> 人工序列
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caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggac 36
Claims (8)
1.检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,用于检测第681位点、第836位点以及第806位点基因多态性,其特征在于,具体核苷酸序列如下:
(1)检测CYP2C19*2(G681A)基因多态性的引物和探针:
G681A位点突变型ARMS上游引物:
5’-CCCACTATCATTGATTATTTCACA-3’,
G681A位点野生型ARMS上游引物:
5’-TTCCCACTATCATTGATTATTGCCGG-3’,
G681A位点公用的下游引物:5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAATC-3’,
G681A位点公用的探针:5’-CCTTGCTTTTATGG-3’;
(2)检测CYP2C19*3(G836A)基因多态性的引物和探针:
G836A位点突变型ARMS上游引物:
5’-GATTGTAAGCACCACCTGA-3’,
G836A位点野生型ARMS上游引物:
5’-GATTGTAAGCACCCACTGG-3’,
G836A位点公用的下游引物:5’-CTAGGCAAGACTGTAGTATTC-3’,
G836A位点公用的探针:5’-CCAGGTAAGGCCAAGT-3’;
(3)检测CYP2C19*17(C-806T)基因多态性的引物和探针:
C-806T位点突变型ARMS上游引物:
5’-GTGTCTTCTGTTCTCAACGT-3’,
C-806T位点野生型ARMS上游引物:
5’-GTGTCTTCTGTTCTCAAGGC-3’,
C-806T位点公用的下游引物:5’-CTCATAGCTGGCAGAACTGG-3’,
C-806T位点公用的探针:5’-CGCCACGATGGGCATC-3’;
所述探针均为MGB探针,探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,其特征在于,所述荧光你报告基团为FAM。
3.一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒,其特征在于,还包括一组内控基因的检测引物和探针,具体核苷酸序列如下:
上游引物:5’-GGAAAGTGATATTTTGGAGAA-3’,
下游引物:5’-CCATTTTGATCAGGAAGCAA-3’,
内控探针:5’-CACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGAC-3’;
所述内控探针为Taqman探针,探针核苷酸序列的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,且荧光报告基团不同于权利要求1所述的MGB探针。
5.根据权利要求4所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒,其特征在于,内控探针的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为JOE,3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
6.根据权利要求4所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒,其特征在于,还包括PCR反应液,所述PCR反应液包括dNTPs、PCR缓冲液、Fast Advanced Master Mix、矿物油和超纯水。
7.根据权利要求6所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒,其特征在于,还包括非模板对照和阳性对照。
8.权利要求7所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取待检测样品中的DNA;
(2)用权利要求1所述的检测CYP2C19基因多态性的引物和探针,每个基因型的检测引物和探针对应一个反应体系,每个反应体系里均含有内控引物和探针,每个反应体系均使用提取的DNA作为模板,进行荧光定量PCR;同时设置非模板对照和阳性对照;
(3)检测结果分析:
在非模板对照FAM及JOE信号不起线,或Ct>28;阳性对照FAM及JOE信号Ct值≤25;待检测样本产生的JOE信号Ct值≤25的情况下,代表扩增正常,按照以下标准判断基因型:
其中,Ct1为CYP2C19*2G基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct2为CYP2C19*2A基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct3为CYP2C19*3G基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct4为CYP2C19*3A基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct5为CYP2C19*17C基因型反应体系的FAM信号Ct值,Ct6为CYP2C19*17T基因型反应体系的FAM信号Ct值。
Priority Applications (1)
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