CN104232757A

CN104232757A - 检测cyp2c19*2突变位点的方法和寡核苷酸

Info

Publication number: CN104232757A
Application number: CN201410366181.XA
Authority: CN
Inventors: 陈奕磊; 周晓犊
Original assignee: HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN104232757B

Abstract

本发明提供利用荧光实时PCR技术高灵敏度检测CYP2C19*2突变位点的方法和寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一对扩增引物SEQNO1和SEQNO2，以及检测探针SEQNO3和SEQNO4，且将MGB基团修饰于两条探针的3端，以增加特异性。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。

Description

检测CYP2C19*2突变位点的方法和寡核苷酸

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及利用荧光实时PCR技术高灵敏度检测CYP2C19*2突变位点的方法和寡核苷酸。

背景技术

氯吡格雷(clopidogrel)是心血管疾病中广泛用于抗血小板的药物。血小板激活和聚集是急性冠状动脉综合征和冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention,PCI)术后引发动脉血栓形成的关键因素。将两种药物氯吡格雷和阿司匹林联用的抗血小板疗法对于急性冠状动脉综合征和PCI术后患者至关重要，可以有效预防缺血事件的发生。然而，接受这种抗血小板疗法的治疗后，仍有约10％的患者发生支架内血栓、死亡、卒中等心血管事件，主要由于不同患者个体对于氯吡格雷的反应存在差异，其影响因素是多方面的，其中基因多态性起着决定性作用。

研究发现氯吡格雷在体内通过氧化、水解两步连锁反应后形成一种硫醇衍生物，此衍生物与位于血小板上的二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y12不可逆结合，从而阻止ADP对腺苷酸环化酶的抑制作用，促进血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化，从而起到抑制血小板聚集的作用。这一过程受细胞色素P450同工酶系统的调控，包括同工酶CYP1A2、CYP3A 4、CYP2C19等，而CYP2C19在这一过程中起主要作用。同时目前的研究也证实了CYP2C19存在基因多态性，并直接影响该酶的活性，因此CYP2C19的基因多态性被认为是氯吡格雷反应个体差异性的重要决定因素，也是氯吡格雷耐药性产生的可能机制之一。

CYP2C19基因位于人类10号染色体上(10q24.1～10q24.3)，编码含450个氨基酸残基的CYP2C19同工酶。现已发现CYP2C19至少含有25个等位基因，其中CYP2C19*1为编码正常活性酶的基因，编码的酶缺失活性的等位基因被称为失功能(loss-of-function)等位基因。作为最为常见的失功能等位基因，CYP2C19*2是由于CYP2C19基因的5号外显子第681位点上的碱基G突变为A而产生的，这一突变导致所编码酶发生剪接缺陷，丧失活性。CYP2C19*2在白种人群的基因频率约为0.13，非洲人群0.18，亚洲人群0.30。

目前，按氯吡格雷的药效差异可将患者分为超速代谢(UM)型、广泛代谢(EM)型、中间代谢(IM)型以及低代谢(PM)型4种。IM及PM类型的患者接受氯吡格雷治疗后获得的疗效最差，因而一般而言，这两类类患者均应该接其它药物替代的治疗方案，例如普拉格雷，替卡格雷等，而产生这种现象的主要原因就是由于这些患者自身携带了CYP2C19*2突变基因，从而导致CYP2C19酶活性丧失，影响药效。

因此，了解患者的CYP2C19*2突变位点情况，将有助于临床医生判断是否使用氯吡格雷进行相关后续治疗。

目前，临床对于检测CYP2C19*2突变位点的方法一般为传统的DNA测序、荧光实时PCR和等位基因特异性扩增(ARMS-PCR)。但是传统的DNA测序方法如Sanger测序和焦磷酸测序，检测周期较长，通常需要1～2天，操作复杂，容易污染，而且测序设备昂贵，一般实验室难以配置。ARMS-PCR虽然提高了检测特异性，但是检测条件要求严格，在实际操作中，容易容易出现引物错配而产生假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

进一步地，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为2:2:1:1。

进一步地，所述一对扩增引物的扩增条件为：95℃5min预变性；95℃15s，62℃30s，40个循环。

本发明的目的还在于提供一种检测CYP2C19*2突变位点的方法，包括：

(1)提取样本中的DNA；

(2)荧光实时PCR扩增反应：在同一个反应管中加入(1)中提取的样本DNA、一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，进行扩增；

(3)结果分析：根据扩增反应结果，判断样本是否存在CYP2C19*2突变位点，其中，

SEQ NO 1：5’-GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

进一步地，步骤(2)中的扩增反应条件为：95℃5min预变性；95℃15s，62℃30s， 40个循环。

进一步地，在步骤(3)结果分析中，若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其基因型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。

本发明的目的还在于提供一种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，其中，

SEQ NO 1：5’-GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

本发明的有益效果：本发明通过设计一对特异性扩增引物及两条MGB探针，利用荧光实时PCR(Real-time PCR)技术进行CYP2C19*2突变类型的检测，并直接根据Real-time PCR结果图谱分析该位点基因型，可在同一PCR反应管中检测纯合突变型，杂合型，野生型，避免了临床漏检，同时将本发明检测结果与DNA测序结果对比，发现两者结果一致，说明本发明具有较高的准确性。

此外，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，这使得本底信号产生的荧光干扰大大降低，同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，所以在Tm值相同的条件下，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针特异性及与模板的结合成功率大为提高。同时依据3’端末位碱基必须与其模板DNA互补时才能有效扩增的原理，将MGB探针的3’端设计在CYP2C19*2突变位点上，进一步增强了探针的特异性和准确性。

因此，本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高，条件依赖少，污染风险低等优点。检测结果将有助于临床医生更好地根据个体差异判断是否使用氯吡格雷进行相关后续治疗。

附图说明

图1是样本A的Real-time PCR检测结果。

图2是样本B的Real-time PCR检测结果。

图3是样本C的Real-time PCR检测结果。

图4是样本A的Sanger测序图谱。

图5是样本B的Sanger测序图谱。

图6是样本C的Sanger测序图谱。

图7是MGB探针和常规探针(TAMARA探针)的检测对比结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1：检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸和试剂盒

检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

其中SEQ NO 3只能结合野生型CYP2C19*2样本的DNA模板，SEQ NO 4只能结合突变型CYP2C19*2样本的DNA模板。

一种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，包括样本DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

样本DNA抽提试剂：可以选择业内技术人员熟知的提取试剂进行DNA抽提，也可使用生物技术公司开发的试剂盒(如天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒)来进行DNA抽提。

检测体系PCR反应液包括2*qPCR MIX(购自TOYOBO生物科技有限公司)、50*ROX(购自TOYOBO生物科技有限公司)、ddH₂O、一对扩增引物SEQ NO 1(10mM)和SEQ NO2(10mM)以及两条检测探针SEQ NO 3(10mM)和SEQ NO 4(10mM)。

阳性对照品：含有CYP2C19*2突变位点的DNA序列溶液。

阴性对照品：不含有CYP2C19*2突变位点的DNA序列溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

检测体系PCR反应液试剂配制如下：

其中，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3和SEQ NO 4的碱基序列为：

引物名称	碱基序列
		SEQ NO 1	5’-GTATAATCAGAGAATTACTACACATG-3’
SEQ NO 2	5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’
		SEQ NO 3	FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB
SEQ NO 4	HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB

实施例2：CYP2C19*2突变位点检测流程

(1)利用血液DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取血液样本中的基因组DNA:

1)抽取500μl血液加入1000μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000 rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12,000 rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份23μl分装：

X＝23μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测样本数。

(3)加样：对血样样本检测而言，将2μl步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2μl阴性对照品；对空白对照实验而言，加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)荧光实时PCR扩增

扩增反应程序：95℃5min预变性；95℃15s，62℃30s，40个循环后，反应结束后，获取扩增曲线。

(5)结果分析

根据(4)中所获得的扩增曲线确定样本是否存在CYP2C19*2突变：若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其基因型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。

实施例3：临床样本检测

选择21例临床待检血液样本，利用本发明的试剂盒进行检测。按照实施例2中的方法进行样本DNA提取、荧光实时PCR扩增和结果分析，同时利用Sanger测序法对相同的待检样本进行测序，结果如表3所示：

表3 CYP2C19*2突变位点检测结果

由表3可知，利用本发明提供的检测方法所获得的检测结果与利用Sanger测序法所获得的检测结果完全一致，这就说明本方法具有极高的检测准确性，其中表3中的字母Y表示存在CYP2C19*2突变位点，即CYP2C19基因的5号外显子第681位点上的碱基G突变为A；字母N表示不存在CYP2C19*2突变位点，即CYP2C19基因的5号外显子第681位点上的碱基仍然为G。同时，本发明提供的检测方法的检测周期只需半天就可获得检测结果，且全程为闭管检测，因此具有较短的检测周期和理想的污染控制。而传统的DNA测序方法如Sanger测序和焦磷酸测序，检测周期较长，通常需要1～2天，操作复杂，容易污染，而且测序设备昂贵，一般实验室难以配置。

实施例4：临床样本检测

取待检的临床血液样本A、B、C，按照实施例2中的方法进行样本DNA提取、荧光实时PCR扩增和结果分析。

样本A的Real-time PCR检测结果如图1所示，由于样本A产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO 3，因此A样本为野生型，即GG型。

样本B的Real-time PCR检测结果如图2所示，由于只产生一条扩增曲线，且对应探针SEQ NO 4，因此B样本为纯合突变型，即AA型。

样本C的Real-time PCR检测结果如图3所示，由于样本C产生两条扩增曲线，因此样本C为杂合突变型，即GA型。

图4～6分别是样本A、B、C的Sanger测序图谱，目的是为了验证图1～3的本发明的检测结果，最终发现Sanger测序结果与本发明的检测结果相一致。在获得Sanger测序结果之后，要将Sanger测序所获得的测序结果与CYP2C19的部分标准序列CYP2C19-partial-ref进行比较，用来确认是否存在CYP2C19*2突变位点，其中CYP2C19-partial-ref的序列如下所示：

TATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCTAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAG。在此序列中，CYP2C19*2突变位点为用方框框住的碱基A。

图7是本发明的MGB探针和常规探针(TAMARA探针)的检测对比结果，其中这两类探针的碱基序列和荧光报告基团相同，而且检测对象均为同一样本C，唯独不同的地方在于MGB探针的淬灭基团为MGB，而TAMARA探针的淬灭基团为TAMARA。结果发现本发明的MGB探针产生的扩增曲线Ct值及荧光增量(Delta Rn)均要优于TAMARA探针，因此本发明的MGB探针具有较好的检测灵敏度。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 检测CYP2C19*2突变位点的方法和寡核苷酸

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtataatcag agaattacta cacatg 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgatgtcc atcgattctt ggtg 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccactatcat tgattatttc ccg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccactatcat tgattatttc cca 23

<210> 5

<211> 173

<212> DNA

<213> CYP2C19-partial-ref

<400> 5

tatgcaataa ttttcccact atcattgatt atttcccggg aacccataac aaattactta 60

aaaaccttgc ttttatggaa agtgatattt tggagaaagt aaaagaacac caagaatcga 120

tggacatcaa caaccctcgg gactttattg attgcttcct gatcaaaatg gag 173

Claims

1.检测CYP2C19*2突变位点的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3 和SEQ NO 4，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’- GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为2:2:1:1。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述一对扩增引物的扩增条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，62℃ 30s，40个循环。

4.一种检测CYP2C19*2突变位点的方法，包括：

（1）提取样本中的DNA；

（2）荧光实时PCR扩增反应：在同一个反应管中加入（1）中提取的样本DNA、一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和 SEQ NO 4，进行扩增；

（3）结果分析：根据扩增反应结果，判断样本是否存在CYP2C19*2突变位点，其特征在于：

SEQ NO 1：5’- GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的扩增反应条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，62℃ 30s，40个循环。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，SEQ NO 1、SEQ NO 2、SEQ NO 3以及SEQ NO 4的使用浓度之比为2:2:1:1。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（3）结果分析中，若样本只产生一条扩增曲线，则根据相对应的探针判断其基因型；若样本产生两条扩增曲线，则判定样本为杂合突变型。

8.一种检测CYP2C19*2突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括一对扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，以及检测探针SEQ NO 3和SEQ NO 4，其特征在于，

SEQ NO 1：5’- GTATAATCAGAGAATTACTACACATG -3’；

SEQ NO 2：5’-GTTGATGTCCATCGATTCTTGGTG-3’；

SEQ NO 3：FAM-CCACTATCATTGATTATTTCCCG-MGB；

SEQ NO 4：HEX-CCACTATCATTGATTATTTCCCA-MGB。