CN105002275A - 人类mthfr和mtrr基因多态性检测引物和试剂盒 - Google Patents

人类mthfr和mtrr基因多态性检测引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术以及医学领域，提供了用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列和试剂盒，其中所述试剂盒含有特异性引物，特异性探针，内标系统，Taq酶，UNG酶。本发明所提供的引物和试剂盒用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Description

人类MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及人类MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针和试剂盒。
背景技术
叶酸(Folic Acid)是指具有相关生物活性的一类同效水溶性B族维生素，其在机体内的活性形式为5-甲基四氢叶酸，为细胞生长和繁殖的必须物质，参与体内很多重要的代谢反应。作为体内一碳单位的传递体，叶酸参与嘌呤、胸腺嘧啶、核苷酸等多种物质的合成和转化，同时影响磷脂、肌酸、神经介质的生成，促进神经细胞与脑细胞发育。叶酸缺乏会导致高同型半胱氨酸血症，引起机体出现多系统损伤，是新生儿神经管缺陷，癌症、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、肝细胞受损、血栓闭塞性心脏病、巨幼红细胞性贫血和白细胞减少症、抑郁症、动脉粥样硬化及其他心血管疾病的重要危险因素之一。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。其基因位点突变对酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸和甲硫氨酸代谢。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性下降，杂合MTHFR 677CT酶活性下降30％，纯合677TT酶活性下降65％以上，在低叶酸的环境下，纯合677TT可显著升高血浆同型氨酸浓度，从而引起静脉栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病，携带MTHFR 677TT基因型的母亲在低叶酸环境情况下生育神经管缺陷的病儿的风险也大大增加。MTHFR A1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFR C677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接关系，但与MTHFR C677T突变有协同效应。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸保持在无毒水平。其报道最多的单核苷酸多态性是66A>G，中国人群发生率为25.7％，突变导致其酶活与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。MTHFR和MTRR基因多态性如表1所示。
表1：MTHFR和MTRR基因多态性
目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的MTHFR和MTRR基因多态性的方法。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中的不足，提供同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。
本发明提供了同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列，所述特异性引物序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1-9所示。
本发明还提供了一种用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，其中，所述试剂盒中含有本发明所述的特异性引物序列。
所述检测试剂盒中还含有3组特异性探针，所述3组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:12与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15，且所述特异性探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。
本发明的人类MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，另外本发明MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测目的模板方法，对特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测1ng基因组DNA的基因型；3.针对MTHFR和MTRR的基因型设计ARMS引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测，结果判读方法简单客观，便于分析。
本试剂盒对人类MTHFR基因677C>T和1298A>C位点和MTRR基因66A>G位点的多态性进行定性检测，可辅助医生对孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，指导叶酸的个体化服用，但不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断唯一依据。本方法的优点在于检测过程全封闭、检测时间短。
附图说明
图1为MTHFR 677C/C纯合野生样本6例检测结果；
图2为MTHFR 677T/T纯合突变样本3例检测结果；
图3为MTHFR 677C/T杂合突变样本7例检测结果；
图4为MTHFR 1298A/A纯合野生样本10例检测结果；
图5为MTHFR 1298A/C杂合突变样本6例检测结果；
图6为MTRR 66A/A纯合野生样本8例检测结果；
图7为MTRR 66A/G杂合突变样本8例检测结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释本发明，并不限定本发明。
本发明的一个方面提供了同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列，其中，所述特异性引物序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1-9所示。
其中，SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4与SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8为普通PCR引物，分别扩增包含MTHFR 677、MTHFR 1298、MTRR 66基因多态性的DNA片段；其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有MTHFR 677、MTHFR 1298、MTRR 66三个位点特异性DNA片段。3条ARMS引物分别在3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强扩增时的特异性。
各引物序列列举如下：
MTHFR 677上游引物5’-ATTGGCAGGTTACCCCAAAG-3’
MTHFR 677下游引物5’-ATGCCTTCACAAAGCGGAAG-3’
MTHFR 677ARMS引物5’-AAAGCTGCGTGATGATGAAATGAG-3’
MTHFR 1298上游引物5’-CTGAAGAGCAAGTCCCCCAAG-3’
MTHFR 1298下游引物5’-CACTCCAGCATCACTCACTTT-3’
MTHFR 1298ARMS引物5’-GGAGGAGCTGACCAGTGAACA-3’
MTRR 66上游引物5’-CCCATTTTTCAGTTTCACTGTTA-3’
MTRR 66下游引物5’-TCAAAGCACAAAACGGTAAAATCCACT-3’
MTRR 66ARMS引物5’-AGGCCATCGCAGAAGAAACA-3’
本发明还提供了一种用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的特异性引物序列。所述检测试剂盒中还含有3组特异性探针，所述3组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，SEQID NO:12与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15，且所述特异性探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
其中SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11探针分别特异性检测MTHFR 677C、MTHFR 677T模板DNA，SEQ ID NO:12与SEQ IDNO:13探针分别特异性检测MTHFR 1298A、MTHFR 1298C模板DNA，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15探针分别特异性检测MTRR66A、MTRR 66G模板DNA。
优选地，所述3组特异性探针序列分别为SEQ ID NO:10与SEQID NO:11，SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14与SEQID NO:15，
各探针序列列举如下：
MTHFR 677C检测探针5’-FAM-GTGTCTGCGGGAGCCG-NFQ-MGB-3’
MTHFR 677T检测探针5’-VIC-GTGTCTGCGGGAGTCG-NFQ-MGB-3’
MTHFR 1298A检测探针5’-FAM-AGCTGACCAGTGAAGAA-NFQ-MGB-3’
MTHFR 1298C检测探针5’-VIC-AGCTGACCAGTGAAGCA-NFQ-MGB-3’
MTRR 66A检测探针5’-FAM-TCGCAGAAGAAATATG-NFQ-MGB-3’
MTRR 66G检测探针5’-VIC-TCGCAGAAGAAATGTG-NFQ-MGB-3’
在本发明的一种实施方式中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针，本发明实施例中个可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。
优选地，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述内标探针序列为SEQID NO:18；所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。
优选地，本发明实施例中的内标系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度的灵敏性和扩增特异性，其中包含的内标引物序列如下所示：
内标正向引物F:5’-CGCGAACTCACCCGT-3’SEQ IDNO:16
内标反向引物R:5’-CACTAGGCGCTCACTGT-3’SEQ IDNO:17
本发明实施例中的内标探针5′端标记有报告基团，如ROX，3′端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。
优选地，所述内标探针为：
ROX-5’-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3’-BHQ2SEQ IDNO:18
优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。
优选地，本发明实施例中的检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发明中涉及的MTHFR基因两种多态性MTHFR 677、MTHFR 1298，MTRR基因一种多态性MTRR66的6种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这6种质粒浓度相同，均为2500copies/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。
本发明实施例的另一目的在于提供一种同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的方法，该法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)利用所述特异性引物对、荧光定量PCR探针、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统、进行荧光定量PCR反应，其中，每个样品的MTHFR基因多态性和MTRR基因多态性检测分3管进行PCR反应。
优选地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：
上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。
具体地，在上述25μl反应体系中，所述各条引物包括所述特异性引物对和内标引物对，所述各条探针包括所述特异性探针和内标探针，所述样品为基因组DNA。
具体地，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。
在上述PCR反应后，所得结果按表2进行结果判定：
表2.结果判定
本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。
实施例1
制备本发明的MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：
1.引物及探针合成：
设计并合成3组特异性引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9；3组特异性探针SEQ ID NO:10、SEQID NO:11；SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15，并在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。
2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物，该引物对序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO:18。将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存。
3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl2，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×103U/ml，UNG酶0.1×103U/ml。
4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有6种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的MTHFR677C、MTHFR 677T、MTHFR 1298A、MTHFR 1298C、MTHFR 66A、MTHFR 66G基因6种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500copies/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。
5.PCR反应液配制：按照下表3-5进行不同体系PCR反应液配制
表3
表4
表5
6.组装试剂盒：试剂盒中包含3管分别检测MTHFR和MTRR基因多态性检测PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。
实施例2
用实施例1制备的人类MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒对待侧样品进行检测。
本实施例中收集16例叶酸代谢障碍的抗凝全血样样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的人类MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒检测待检样品的MTHFR和MTRR的基因多态性情况。
1.血液样品基因组DNA提取
取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μl Proteinase K溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7。12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取2μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的MTHFR 677、MTHFR1298和MTRR 66检测反应体系中，使三种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
37℃ 10min；
95℃ 5min；
95℃ 15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。
3.样本的检测结果分析:16例样品的检测结果如下：
MTHFR 677C/C纯合野生样本6例，其中一个检测结果如图1所示；
MTHFR 677T/T纯合突变样本3例，其中一个检测结果如图2所示；
MTHFR 677C/T杂合突变样本7例，其中一个检测结果如图3所示；
MTHFR 1298A/A纯合野生样本10例，其中一个检测结果如图4所示；MTHFR 1298A/C杂合突变样本6例，其中一个检测结果如图5所示；
MTRR 66A/A纯合野生样本8例，其中一个检测结果如图6所示；
MTRR 66A/G杂合突变样本8例，其中一个检测结果如图7所示。
上述16例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类MTHFR和MTRR基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列，其特征在于，所述特异性引物序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.1-9所示。
2.一种用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的特异性引物序列。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有3组特异性探针，所述3组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12与SEQ IDNO:13，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15，且所述特异性探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括内标系统，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液中含有6种质粒DNA，所述6种质粒DNA中分别含有4种不同的MTHFR等位基因和2种不同的MTRR等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HotStart Taq酶和UNG酶。
8.利用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2-7中任意一项所述的试剂盒同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)利用所述特异性引物对、荧光定量PCR探针、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统、进行荧光定量PCR反应，其中，每个样品的MTHFR基因多态性和MTRR基因多态性检测分3管进行PCR反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的体系为：
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃ 15秒，60℃ 1分钟。
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