CN110423801A - Mthfr和mtrr基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用 - Google Patents

Mthfr和mtrr基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合。本发明还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：核酸释放剂，2×PCR反应混合液(包含热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)，3组特异性引物，3组特异性探针和内标系统。本试剂盒仅需在常温下对2μl血液样本进行短暂处理便可得到用于多次检测的高质量DNA；检测特异性好，与金标准测序法符合率为100％；灵敏度高，可对0.2ng基因组DNA准确分型；检测流程耗时短，从样本处理到检测结果可在1小时内完成。

Description

MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种MTHFR和MTRR基因多态性快速检测引物、探针、试剂盒及其应用。
背景技术
叶酸是一种水溶性B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸代谢通路中的关键酶活性降低会导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，是新生儿出生缺陷、孕妇妊娠高血压、自发性流产、男性精子质量下降、H型高血压、动脉粥样硬化和冠心病的重要危险因素之一。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是影响叶酸代谢的关键酶，其基因的多态性造成个体间叶酸利用能力差异，包括MTHFR基因的C677T、A1298C和MTRR基因的A66G多态性。MTHFR基因C677T位点的CC、CT、TT基因型在中国人群中的所占的比例分别为22％、50％、28％；A1298C位点的AA、AC、CC基因型在中国人群中所占的比例分别为66％、31％、4％；MTRR基因A66G位点的AA、AG、GG基因型在中国人群中所占的比例分比为58％、36％、6％。通过检测MTHFR基因和MTRR基因多态性，指导个体根据自身基因型合理准确地制定叶酸增补计划，预防因叶酸缺乏导致的相关疾病的发生。
目前用于MTHFR和MTRR基因多态性检测的方法主要有DNA测序法、基因芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法。其中，DNA测序法是突变检测金标准，但此方法存在操作复杂、检测周期长、容易污染、成本高等缺点；基因芯片法芯片制备难度高、操作繁琐、检测成本昂贵；HRM法对设备要求高，需配置专门分析软件，限制了该方法的普及；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法一般采用Genotyping方法进行基因分型，对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确分型。此外，以上检测方法使用的模板DNA均需要经过繁琐的提取和纯化步骤，不仅操作耗时、成本高，而且容易导致核酸损失并造成样本间交叉污染。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本MTHFR和MTRR基因多态性的方法。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“MTHFR”是指：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶。
术语“MTRR”是指：甲硫氨酸合成酶还原酶。
术语“PCR”是指：聚合酶链式反应。
术语“FAM”是指：6-羧基荧光素。
术语“HEX”是指：六氯-6-甲基荧光素。
术语“ROX”是指：羧基-X-罗丹明。
术语“NFQ”是指：非荧光淬灭基团。
术语“MGB”是指：小沟结合物。
术语“BHQ2”是指：荧光淬灭基团。
术语“NP40”是指：乙基苯基聚乙二醇。
术语“EDTA”是指：乙二胺四乙酸。
术语“BSA”是指：牛血清白蛋白。
术语“DMSO”是指：二甲基亚砜。
术语“UDG酶”是指：尿嘧啶-DNA糖基化酶。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，所述组合包括：
(1)MTHFR C677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的MTHFR C677T上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的MTHFR C677T下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的MTHFR C677T 677C检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的MTHFR C677T 677T检测探针；
(2)MTHFR A1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ IDNO:3所示的MTHFR A1298C上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的MTHFR A1298C下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的MTHFR A1298C 1298A检测探针、核苷酸序列为SEQID NO:10所示的MTHFR A1298C 1298C检测探针；和
(3)MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的MTRR A66G上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的MTRR A66G下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示的MTRR A66G 66A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的MTRR A66G 66G检测探针；
其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB。
本发明的第二方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括：
如第一方面所述的基因多态性检测引物和探针组合；
内标系统；
核酸释放剂；和
2×PCR反应混合液。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述内标系统包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示的GAPDH上游引物和SEQ ID NO:14所示的GAPDH下游引物，所述内标探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示的检测探针，其中，所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述核酸释放剂包括：终浓度为0.1～5％体积分数NP40、100～200mmol/L KCl、5～20mmol/L EDTA、10～20％体积分数BSA、10～30％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为7.0～8.5；
优选地，所述核酸释放剂包括：终浓度为1％体积分数NP40、150mmol/L KCl、10mmol/L EDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为8.2。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述试剂盒中包括三个PCR反应管，其中，每个PCR体系中含有2×PCR反应混合液、如第一方面所述的引物与探针组合和内标系统。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中，所述每个PCR体系中PCR反应混合液的体积为10μl，所述各引物的体积为0.1μM～1μM，所述各探针的终浓度为50nM～250nM；
优选地，各引物的终浓度为0.1μM，所述各探针的终浓度为100nM。
本发明的第三方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测方法，使用第二方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测样本加入到所述核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置1～30优选为5分钟，瞬时离心备用；
(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测；
(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测。
根据本发明第三方面的方法，其中，所述步骤(3)中，所述荧光定量检测，反应条件为：
95℃预变性30秒；
95℃10秒，62℃30秒，40个循环,并在62℃时收集FAM、HEX和ROX信号。
根据本发明第三方面的方法，其中，所述PCR反应体系中，所述样本的加入量为4μl。
本发明的第四方面提供了第一方面所述的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合或第二方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗叶酸缺乏导致的相关疾病的药物中的应用。
本发明的目的之一在于提供一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，克服现有技术中的不足，旨在解决现有荧光定量PCR技术，样本量少时基因多态性检测效果不理想，且需要预先对血液进行繁琐的核酸提取纯化步骤，造成核酸损失、增加交叉污染风险的问题。本试剂盒适用于微量的指尖血或EDTA抗凝全血高通量、低成本快速检测MTHFR和MTRR基因多态性，还具有灵敏度高，特异性强的优点。
本发明提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：核酸释放剂，2×PCR反应混合液(包含热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)，3组特异性引物，3组特异性探针和内标系统。
所述3组特异性引物序列分别为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3与SEQID NO:4，SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6。
所述3组特异性探针序列分别为SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9与SEQID NO:10，SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12，且所述特异性探针5′端修饰有FAM或HEX荧光基团，3′端修饰有NFQ-MGB。
所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物序列为SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14，所述内标探针序列为SEQ ID NO:15，且所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。
所述核酸释放剂含有以下组分：0.5％～1.5％体积分数NP40、50～300mmol/LKCl、5～20mmol/L EDTA、5％～25％体积分数BSA、15％～30％体积分数DMSO，pH值为7.0～8.5。
在其中一个实施例中，所述核酸释放剂包含有1％体积分数NP40、150mmol/L KCl、10mmol/L EDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，pH8.2。
本发明的另一目的还在于提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)待测的人血液样本加入到40μl核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置5分钟，瞬时离心备用；
(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测，每个PCR体系含有以下组分：2×PCR反应混合液、特异性引物、特异性探针、内标系统、上述释放DNA模板；
(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测，反应条件为：
95℃预变性30秒；
95℃10秒，62℃30秒，40个循环,并在62℃时收集FAM、HEX和ROX信号。
本发明的MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒采用核酸快速释放和Taqman-MGB探针法，建立了在同一反应管检测同一位点两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法。本发明所述检测试剂盒和检测方法具有以下优点：
本发明的试剂盒可以具有但不限于以下有益效果：
1、简单、高效、稳定：所用的核酸释放剂，能使血液中抑制PCR反应的物质变性，并抑制核酸酶活性，仅需2μl血液样本一步加样即可获得可进行多次检测的高质量的模板DNA，核酸释放过程在常温进行，避免产生气溶胶造成的模板交叉污染风险；
2、特异性强：针对MTHFR和MTRR的基因型设计的特异性引物和分型探针，可特异性扩增识别对应的多态性，分型结果与金标准测序法完全一致；
3、灵敏度高：可以准确检测0.2ng基因组DNA的基因型；
4、检测速度快：选用的UDG酶常温即可发挥作用，无需增加特定的反应程序，1个小时即可完成核酸释放及结果检测，结果判读方法简单客观，便于分析；
5、污染小：检测过程均为闭管反应，且引入了dUTP/UDG酶防污染系统，确保结果真实可信。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1中MTHFR C677T位点纯合野生(C/C)样本的扩增曲线图。
图2示出了实施例1中MTHFR C677T位点杂合突变(C/T)样本的扩增曲线图。
图3示出了实施例1中MTHFR C677T位点纯合突变(T/T)样本的扩增曲线图。
图4示出了实施例1中MTHFR A1298C位点纯合野生(A/A)样本的扩增曲线图。
图5示出了实施例1中MTHFR A1298C位点杂合野生(A/C)样本的扩增曲线图。
图6示出了实施例1中MTRR A66G位点纯合野生(A/A)样本的扩增曲线图。
图7示出了实施例1中MTRR A66G位点杂合突变(A/G)样本的扩增曲线图。
图8示出了实施例1中MTRR A66G位点纯合突变(G/G)样本的扩增曲线图。
图9示出了实施例2中不同样本类型MTHFR C677T位点纯合野生(C/C)的扩增曲线图。
图10示出了实施例3中不同样本加入量的扩增曲线图。
图11示出了实施例4中不同模板加入量的扩增曲线图。
图12示出了实施例5中灵敏度的扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
SEQ ID NO：1-15，购自苏州泓迅生物科技股份有限公司；
2×ChamQ Geno-SNP Probe Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；NP40、KCl、EDTA、BSA、DMSO，购自北京索莱宝科技有限公司；
仪器：
荧光定量PCR仪，购自杭州博日科技有限公司、型号FQD-96A。
实施例1
本发明提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：核酸释放剂，2×PCR反应混合液(包含热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)，3组特异性引物，3组特异性探针和内标系统。
所述3组特异性引物为MTHFR C677T引物、MTHFR A1298C引物和MTRR A66G引物，所述特异性引物序列列举如下：
MTHFR C677T上游引物5′-CTTCACAAAGCGGAAGAATGTG-3′SEQ ID NO:1
MTHFR C677T下游引物5′-CCTGAAGCACTTGAAGGAGAA-3′SEQ ID NO:2
MTHFR A1298C上游引物5′-TGGTTCTCCCGAGAGGTAAA-3′SEQ ID NO:3
MTHFR A1298C下游引物5′-GGACTACTACCTCTTCTACCTGAA-3′SEQ ID NO:4
MTRR A66G上游引物5′-GTGATGAGGAGGTTTCTGTTACT-3′SEQ ID NO:5
MTRR A66G下游引物5′-CGGCTCTAACCTTATCGGATTC-3′SEQ ID NO:6
所述3组特异性探针为MTHFR C677T探针、MTHFR A1298C探针和MTRR A66G探针，探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB，所述特异性探针序列如下：
MTHFR C677T 677C检测探针5′-HEX-ATGAAATCGGCTCCCG-MGB-3′SEQ ID NO:7
MTHFR C677T 677T检测探针5′-FAM-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3′SEQ ID NO:8
MTHFR A1298C 1298A检测探针5′-HEX-AAAGACACTTTCTTCACTGG-MGB-3′SEQ IDNO:9
MTHFR A1298C 1298C检测探针5′-FAM-AAAGACACTTGCTTCACTG-MGB-3′SEQ ID NO:10
MTRR A66G 66A检测探针5′-HEX-CAGAAGAAATATGTGAGCA-MGB-3′SEQ ID NO:11
MTRR A66G 66G检测探针5′-FAM-CAGAAGAAATGTGTGAGC-MGB-3′SEQ ID NO:12
使用内标系统消除因存在PCR抑制物或人为加样错误导致的假阴性结果，保证检测结果的准确性。该内标系统针对人类基因组内参基因的保守区域设计，具有较高的特异性和灵敏度，所述内标系统包括内标引物和内标探针，内标引物序列如下所示：
GAPDH上游引物5′-CCCTTCATACCCTCACGTATTC-3′SEQ ID NO:13
GAPDH下游引物5′-TCCATTGATGACAAGCTTCC-3′SEQ ID NO:14
所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2，序列信息如下：
5′-ROX-CAAATTCCATGGCACCGTCAAGGC-BHQ2-3′SEQ ID NO:15
所述核酸释放剂的组分为：1％体积分数NP40、150mmol/L KCl、10mmol/L EDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，pH8.2。
所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)待测2μl的人血液样本加入到40μl核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置5分钟，瞬时离心，得到快速释放DNA备用；
(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测，每个PCR体系含有以下组分：2×PCR反应混合液、特异性引物、特异性探针、内标系统、上述释放DNA模板；每个PCR体系的总体积为20μl，体系中各组分的终浓度及含量如下：
(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测，反应条件为：
95℃预变性30秒；
95℃10秒，62℃30秒，40个循环,并在62℃时收集FAM、HEX和ROX信号。在上述PCR反应后，所得结果按表1进行结果判定：
表1结果判定
按照上述检测方法，对收集的34例指尖血进行MTHFR和MTRR的基因多态性检测，34例样本的检测结果如下：
MTHFR C677T位点纯合野生(C/C)样本5例，其中一个检测结果如图1所示；
MTHFR C677T位点杂合突变(C/T)样本20例，其中一个检测结果如图2所示；
MTHFR C677T位点纯合突变(T/T)样本9例，其中一个检测结果如图3所示；
MTHFR A1298C位点纯合野生(A/A)样本28例，其中一个检测结果如图4所示；
MTHFR A1298C位点杂合突变(A/C)样本6例，其中一个检测结果如图5所示；
MTRR A66G位点纯合野生(A/A)样本20例，其中一个检测结果如图6所示；
MTRR A66G位点杂合突变(A/G)样本11例，其中一个检测结果如图7所示；
MTRR A66G位点纯合突变(G/G)样本3例，其中一个检测结果如图8所示。
上述34例样本荧光定量PCR检测结果与金标准测序结果一致，表明本发明提供的检测试剂盒用于MTHFR和MTRR基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于临床大规模推广。
实施例2
本实施例用于说明本发明所述的试剂盒对于样本类型的兼容性。
本实施例以MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)为例，分别收集同一人的指尖血、EDTA抗凝新鲜全血和EDTA抗凝冻存全血样本进行荧光定量PCR实验。
本实施例采用的试剂盒与实施例1中的检测MTHFR基因C677T位点的引物和探针相同，其他组分也相同，采用的检测方法也与实施例1相同。
结果如图9所示，从MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)扩增曲线中可以看出同一人不同样本类型的扩增结果基本重合，无明显差异。
实施例3
本实施例用于说明本发明所述试剂盒样本加入量的选择。
本实施例以MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)为例，分别取2μl、5μl和10μl的指尖血进行荧光定量PCR实验。
本实施例采用的试剂盒与实施例1中的检测MTHFR基因C677T位点的引物和探针相同，其他组分也相同，采用的检测方法也与实施例1相同，其区别仅在于样本加入量。
不同加入量样本的MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)扩增曲线见图10，结果表明随着样本加入量的增加扩增曲线逐渐降低，当样本加入量为10μl时，扩增曲线下降尤为明显。
实施例4
本实施例用于说明本发明所述试剂盒核酸释放模板加入量的选择。
本实施例以MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)为例，2μl指尖血进行核酸快速释放处理，分别取1μl、2μl和4μl的释放模板进行荧光定量PCR检测。
本实施例所用的引物和探针与实施例1相同，其他组分也相同，采用的检测方法也与实施例1相同，其区别仅在于核酸释放模板加入量。
不同核酸释放模板量的MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)扩增曲线结果如图11所示，从扩增曲线中可以看出随着模板量的增加扩增曲线也相应提升，4μl核酸释放模板量的扩增曲线最高。
实施例5
本实施例用于说明本发明所述试剂盒的灵敏度。
本实施例以MTHFR基因C677T位点纯合野生型(C/C)为例，采用不同浓度的经核酸提取纯化的基因组DNA，模板加入量分别为60ng、30ng、10ng、1ng、0.2ng、0.1ng进行荧光定量PCR检测。本实施例所用的引物和探针与实施例1相同，其他组分也相同，采用的检测方法也与实施例1相同，提取的基因组DNA模板的加入体积为4μl。结果如图12所示，结果显示模板加入量为0.2ng时有明显扩增曲线且分型准确，但加入量为0.1ng时无曲线升起，说明本发明试剂盒的灵敏度为0.2ng基因组DNA。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 北京协和洛克生物技术有限责任公司
<120> MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用
<130> YZDI-190070
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttcacaaag cggaagaatg tg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctgaagcac ttgaaggaga a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggttctccc gagaggtaaa 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggactactac ctcttctacc tgaa 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgatgagga ggtttctgtt act 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggctctaac cttatcggat tc 22
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaaatcgg ctcccg 16
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaaatcga ctcccgc 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaagacactt tcttcactgg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaagacactt gcttcactg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagaagaaat atgtgagca 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagaagaaat gtgtgagc 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccttcatac cctcacgtat tc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccattgatg acaagcttcc 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaattccat ggcaccgtca aggc 24

Claims (10)

1.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，其特征在于，所述组合包括：
(1)MTHFR C677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的MTHFR C677T上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的MTHFR C677T下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的MTHFR C677T 677C检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的MTHFR C677T 677T检测探针；
(2)MTHFR A1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的MTHFR A1298C上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的MTHFR A1298C下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的MTHFR A1298C 1298A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的MTHFR A1298C 1298C检测探针；和
(3)MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的MTRR A66G上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的MTRR A66G下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示的MTRR A66G 66A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的MTRRA66G 66G检测探针；
其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB。
2.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
如权利要求1所述的基因多态性检测引物和探针组合；
内标系统；
核酸释放剂；和
2×PCR反应混合液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内标系统包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示的GAPDH上游引物和SEQ ID NO:14所示的GAPDH下游引物，所述内标探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示的检测探针，其中，所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括：终浓度为0.1～5％体积分数NP40、100～200mmol/L KCl、5～20mmol/L EDTA、10～20％体积分数BSA、10～30％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为7.0～8.5；
优选地，所述核酸释放剂包括：终浓度为1％体积分数NP40、150mmol/L KCl、10mmol/LEDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为8.2。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括三个PCR反应管，其中，每个PCR体系中含有2×PCR反应混合液、如权利要求1所述的引物与探针组合和内标系统。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述每个PCR体系中PCR反应混合液的体积为10μl，所述各引物的体积为0.1μM～1μM，所述各探针的终浓度为50nM～250nM；
优选地，各引物的终浓度为0.1μM，所述各探针的终浓度为100nM。
7.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测方法，其特征在于，使用权利要求2至6中任一项所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测样本加入到所述核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置1～30分钟优选为5分钟，瞬时离心备用；
(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测；
(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述荧光定量检测，反应条件为：
95℃预变性30秒；
95℃10秒，62℃30秒，40个循环,并在62℃时收集FAM、HEX和ROX信号。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，所述样本的加入量为4μl。
10.权利要求1所述的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合或权利要求2至6中任一项所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗叶酸缺乏导致的相关疾病的药物中的应用。
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