CN112210591A - 一种检测人mthfr基因c677t位点多态性的方法 - Google Patents

一种检测人mthfr基因c677t位点多态性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及MTHFR基因C677T位点(rs1801133)突变的检测方法，本发明针对这个位点分别设计了野生型和突变型的引物和探针，使用qPCR技术扩增这个位点的野生型目的片段和突变型目的片段。与其他方法相比，本发明具有检测周期短、特异性高、准确度高、通量高、成本低、判读结果直观便捷、可推广性强等优点。

Description

一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法
技术领域
本发明属于基因多态性检测技术领域，具体是指一种检测人MTHFR基因C677T位点(rs1801133)多态性的方法。
背景技术
叶酸，又称维生素B9。叶酸在DNA合成、DNA甲基化等方面发挥重要的作用，与胚胎正常发育、健康维持以及多种疾病的风险有关，是细胞增殖、组织生长与机体发育不可缺少的营养素。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因)缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下(叶酸代谢通路障碍)。一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或间接地导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心血管疾病的发生。
目前，经验证MTHFR(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，亚甲基四氢叶酸还原酶)是与叶酸代谢密切相关的基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，甲基化后的叶酸具有生物活性，可以被人体使用。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。因此，MTHFR基因一旦发生缺陷，将导致机体多个基础生化过程(包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等)的紊乱，进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病、自发性流产。
MTHFR基因常见的突变有两种：NCBI单核苷酸多态性数据库(db SNP)中的c.677位点C/T多态性(SNP ID：rs1801133)与c.1298位点A/C多态性(SNP ID:rs1801131)。其中，c.677位点C/T多态性是由Frosst等于1995年首次发现的，也是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点。研究表明，c.677位点C变为T后，引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸(Val)，导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低。在世界人群中的该多态的频率分布为A占78％，T占22％。中国人群中的分布A占67％，C为33％。携带677CC基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型为TT型的只有34％。
本发明通过对叶酸代谢相关的MTHFR基因C677T位点进行检测，从而评估个体对叶酸的利用能力，为受检者提供个体化的合理叶酸补充指导。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用Taqman-MGB探针原理检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，具有高灵敏度、高特异性、操作方法简单、周期短等优点。
本发明公开了一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其具体技术方案如下：
(1)针对C677T位点设计特异性扩增引物和探针，包括针对野生型和突变型，分别设计带有不同荧光标记的探针；
(2)利用所述特异性扩增引物和探针使用qPCR技术分别扩增该位点的野生型目的片段和突变型目的片段；
(3)在检测过程中质控，每次检测均加入各分型阳性对照，以及以水作为阴性对照NTC；
(4)根据qPCR分析软件快速判别基因分型结果；
步骤(1)所述引物和探针的序列如下：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：5’-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGT-3’；
MTHFR基因C677T反向扩增引物：5’-TCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’；
MTHFR基因677C探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCC-淬灭基团；
MTHFR基因677T探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCC-淬灭基团。
优选地，所述MTHFR基因677C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB-NFQ。
优选地，所述MTHFR基因677T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为MGB-NFQ。
优选地，MTHFR基因C677T引物探针混合液比例为：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：MTHFR基因C677T反向扩增引物＝1:1，
MTHFR基因677C探针：MTHFR基因677T探针＝1:1，
引物：探针＝(9～15):5。
优选地，步骤(2)所述的PCR反应体系最终为10μL，反应体系组分如下：
Figure BDA0002780093920000031
进一步地，步骤(2)所述的PCR反应程序为：60℃1min*，95℃5min，95℃10s和62℃30s*合并循环40次，60℃1min*；其中*为采集荧光信号阶段。
优选地，步骤(3)所述的阳性对照是含有MTHFR基因C677T位点野生型CC、突变杂合型CT、突变纯化型TT三种已验证分型的样本。
本发明的具体原理是：针对MTHFR基因C677T位点设计一对PCR扩增引物以及针对野生型和突变型两种基因型分别设计两条特异性结合的探针，把从人外周血细胞或口腔拭子中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光PCR反应。在PCR过程中，当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光，设备不能检测到荧光信号，当TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模板的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性会切割探针5'端的荧光基团产生游离的荧光基团并远离淬灭基团，因此打破荧光共振能量的传递，被激发的荧光基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到，从而检测出目的基因的具体基因型。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明中的Taqman-MGB探针具有3’端淬灭基团不发光，极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，对单个碱基突变检测更敏感，提高检测灵敏性。
(2)本发明中的检测成本较低，操作简单。且本发明方法不需要进行PCR产物的后续分析，不需PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，无需荧光PCR扩增曲线CT值计算与判定，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。
(3)本发明采用实时荧光PCR技术平台，相对测序法、PCR-RFLP、芯片法更容易实现高通量检测。
(4)本发明检测结果直观，可快速从扩增曲线或SNP分型象限图中判断出样本的基因型。
附图说明
图1是13例样本的MTHFR基因C677T位点(rs1801133)分型结果示意图；
图2是阴性对照样品的MTHFR基因C677T位点扩增曲线图；
图3是野生型样品MTHFR基因C677T位点分型为CC扩增曲线图；
图4是杂合突变样品MTHFR基因C677T位点分型为CT扩增曲线图；
图5是纯合突变样品MTHFR基因C677T位点分型为TT扩增曲线图；
图6是一代测序验证MTHFR基因C677位点分型为CC的样本峰图；
图7是一代测序验证MTHFR基因C677T位点分型为CT的样本峰图；
图8是一代测序验证MTHFR基因C677T位点分型为TT的样本峰图；
图9是5例样本的MTHFR基因C677T位点(rs1801133)分型结果示意图；
图10是7例样本的MTHFR基因C677T位点(rs1801133)分型结果示意图。
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例一：
从人口腔拭子样本中提取DNA，检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据NCBI数据库中MTHFR基因C677T位点(rs1801133)在基因组上的位置，设计相应引物和探针，具体序列如下：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：5’-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGT-3’；
MTHFR基因C677T反向扩增引物：5’-TCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’；
MTHFR基因677C探针：5’-FAM-ATGAAATCGGCTCCC-MGB-NFQ-3’；
MTHFR基因677T探针：5’-VIC-ATGAAATCGACTCCC-MGB-NFQ-3’。
步骤二：试剂准备
(1)自行设计的引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成，
(2)磁珠法唾液&拭子基因组DNA提取试剂盒(购自英芮诚)，
(3)KAPA PROBE FAST Universal qPCR Kit(购自KAPA)。
步骤三：口腔拭子样本DNA提取
从口腔拭子中提取基因组DNA，采用超微量紫外分光光度计Nanphotometer N50对DNA浓度和纯度进行检测，提取合格的DNA作为PCR检测的模板。实例中采用英芮诚的磁珠法唾液&拭子基因组DNA提取试剂盒，提取步骤参考试剂盒说明书。
步骤四：PCR扩增体系的配制
(1)每次检测均需加入四种对照组以进行质量控制：阳性对照是含有MTHFR基因C677T位点野生型CC、突变杂合型CT、突变纯化型TT三种已验证分型的样本，阴性对照NTC以水为样本。
(2)按照MTHFR基因C677T正向扩增引物：MTHFR基因C677T反向扩增引物：MTHFR基因677C探针：MTHFR基因677T探针＝9:9:5:5比例配置引物探针混合液，每个反应体系中加入2μL引物探针混合物。
(3)PCR反应体系最终为10μL，反应体系组分如下：
Figure BDA0002780093920000051
步骤五：PCR反应程序的设置
Figure BDA0002780093920000061
步骤六：结果分析
通过7500分析软件对分型结果进行判读，首先本次实验中：(1)阴性对照应无典型S型扩增，点状图中分离明显(如图2)；(2)阳性对照：每次检测均加入三种已验证分型的样本作为各分型阳性对照，结果应有典型S型扩增(如图3-5)，且基因分型符合已验证分型结果；(3)所有检测样本具有典型S型扩增，点状图中分离明显，若检测样本没有扩增出来，则此样本此次检测无效。以上要求需在同一实验中同时满足，则表明本次实验结果在控，否则本次实验无效。具体结果判读见图1：图1平面图中已根据分型探针的荧光对X轴和Y轴进行定义，该判读方法只需根据检测样本在平面图中的位置来进行基因分型，并可以导出excel表格。如在样本检测结果定位在C坐标轴附近，则基因型判读为CC；样本检测结果在T坐标轴附近，则基因型判读为TT；如样本检测结果定位在平面图对角线上，则基因型判读为CT。
众所周知，基因分型检测金标准为一代测序(Sanger测序)，一代测序通过对该位点的峰型进行判读：图6中第111位碱基为C单峰型，图6对应样本该位点基因分型为CC；图7中第111位碱基为CT双峰型，图7对应样本的该位点分型为CT；图8中第111位碱基为T单峰型，图8对应样本的该位点分型为TT。但一代测序存在检测时间长、检测通量低(每次检测仅可判读一个样本)的缺点。
本方案共验证涵盖MTHFR基因C677T位点三种分型结果CC、CT、TT在内的34个样本，同时使用一代测序与本方案描述的方法检测，两种方法检测一致率为100％(准确性100％)，CC分型检测特异性100％，CT分型特异性100％，TT分型特异性100％。本方案中几十个样本的检测可以在同一个结果图(类似于图1)中判读。
Figure BDA0002780093920000071
Figure BDA0002780093920000081
与一代测序相比，本发明使用QPCR方法，具有高特异性、高灵敏度、高通量的特点，且方便快捷，成本较低，结果直观，可快速判读。
实施例二：
从人外周血细胞样本中提取DNA，检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据NCBI数据库中MTHFR基因C677T位点(rs1801133)在基因组上的位置，设计相应引物和探针，具体序列如下：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：5’-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGT-3’；
MTHFR基因C677T反向扩增引物：5’-TCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’；
MTHFR基因677C探针：5’-Cy5-ATGAAATCGGCTCCC-MGB-NFQ-3’；
MTHFR基因677T探针：5’-ROX-ATGAAATCGACTCCC-MGB-NFQ-3’。
步骤二：试剂准备
(1)自行设计的引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成，
(2)外周血基因组DNA提取试剂盒(购自天根)，
(3)基因分型PCR试剂(探针法)(购自天根)。
步骤三：外周血细胞样本DNA提取
从外周血细胞中提取基因组DNA，采用超微量紫外分光光度计Nanphotometer N50对DNA浓度和纯度进行检测，提取合格的DNA作为PCR检测的模板。提取步骤参考试剂盒说明书。
步骤四：PCR扩增体系的配制
(1)每次检测均需加入四种对照组以进行质量控制：阳性对照是含有MTHFR基因C677T位点野生型CC、突变杂合型CT、突变纯化型TT三种已验证分型的样本，阴性对照NTC以水为样本。
(2)按照MTHFR基因C677T正向扩增引物：MTHFR基因C677T反向扩增引物：MTHFR基因677C探针：MTHFR基因677T探针＝2:2:1:1，按比例配置引物探针混合液，每个反应体系中加入2μL引物探针混合物。
(3)PCR反应体系最终为10μL，反应体系组分如下：
Figure BDA0002780093920000091
步骤五：PCR反应程序的设置
Figure BDA0002780093920000092
步骤六：结果分析
通过7500分析软件对分型结果进行判读，首先本次实验中：(1)阴性对照应无典型S型扩增，点状图中分离明显；(2)阳性对照：每次检测均加入三种已验证分型的样本作为各分型阳性对照，结果应有典型S型扩增，且基因分型符合已验证分型结果；(3)所有检测样本具有典型S型扩增，点状图中分离明显，若检测样本没有扩增出来，则此样本此次检测无效。以上要求需在同一实验中同时满足，则表明本次实验结果在控，否则本次实验无效。5例样本的分型结果见图9。
实施例三：
从已经做过一代测序的结果中查找并随机获得四个一代测序结果分析为基因型TT的DNA样本，检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以下步骤：
步骤一：根据NCBI数据库中MTHFR基因C677T位点(rs1801133)在基因组上的位置，设计相应引物和探针，具体序列如下：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：5’-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGT-3’；
MTHFR基因C677T反向扩增引物：5’-TCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’；
MTHFR基因677C探针：5’-FAM-ATGAAATCGGCTCCC-MGB-NFQ-3’；
MTHFR基因677T探针：5’-HEX-ATGAAATCGACTCCC-MGB-NFQ-3’。
步骤二：试剂准备
(1)自行设计的引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成，
(2)基因分型PCR试剂(探针法)(购自KAPA)。
步骤三：PCR扩增体系的配制
(1)每次检测均需加入四种对照组以进行质量控制：阳性对照是含有MTHFR基因C677T位点野生型CC、突变杂合型CT、突变纯化型TT三种已验证分型的样本，阴性对照NTC以水为样本。
(2)按照MTHFR基因C677T正向扩增引物：MTHFR基因C677T反向扩增引物：MTHFR基因677C探针：MTHFR基因677T探针＝3:3:1:1，按比例配置引物探针混合液，每个反应体系中加入2μL引物探针混合物。
(3)PCR反应体系最终为10μL，反应体系组分如下：
Figure BDA0002780093920000111
步骤四：PCR反应程序的设置
Figure BDA0002780093920000112
步骤五：结果分析
通过7500分析软件对分型结果进行判读，首先本次实验中：(1)阴性对照应无典型S型扩增，点状图中分离明显；(2)阳性对照：每次检测均加入三种已验证分型的样本作为各分型阳性对照，结果应有典型S型扩增，且基因分型符合已验证分型结果；(3)所有检测样本具有典型S型扩增，点状图中分离明显，若检测样本没有扩增出来，则此样本此次检测无效。以上要求需在同一实验中同时满足，则表明本次实验结果在控，否则本次实验无效。分型结果见图10。除三个各分型的对照样本外，4个样本分型结果均是TT，同一代测序结果一致。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对C677T位点设计特异性扩增引物和探针，包括针对野生型和突变型，分别设计带有不同荧光标记的探针；
(2)利用所述特异性扩增引物和探针使用qPCR技术分别扩增该位点的野生型目的片段和突变型目的片段；
(3)在检测过程中质控，每次检测均加入各分型阳性对照，以及以水作为阴性对照NTC；
(4)根据qPCR分析软件快速判别基因分型结果；
步骤(1)所述引物和探针的序列如下：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：5’-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGT-3’；
MTHFR基因C677T反向扩增引物：5’-TCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT-3’；
MTHFR基因677C探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCC-淬灭基团；
MTHFR基因677T探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCC-淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，所述MTHFR基因677C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB-NFQ。
3.根据权利要求1所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，所述MTHFR基因677T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为MGB-NFQ。
4.根据权利要求1所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，MTHFR基因C677T引物探针混合液比例为：
MTHFR基因C677T正向扩增引物：MTHFR基因C677T反向扩增引物＝1:1，
MTHFR基因677C探针：MTHFR基因677T探针＝1:1，
引物：探针＝(9～15):5。
5.根据权利要求1所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR反应体系最终为10μL，反应体系组分如下：
Figure FDA0002780093910000021
6.根据权利要求1或5所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR反应程序为：60℃1min*，95℃5min，95℃10s和62℃30s*合并循环40次，60℃1min*；其中*为采集荧光信号阶段。
7.根据权利要求1所述的一种检测人MTHFR基因C677T位点多态性的方法，其特征在于：步骤(3)所述的阳性对照是含有MTHFR基因C677T位点野生型CC、突变杂合型CT、突变纯化型TT三种已验证分型的样本。
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