CN111549118A

CN111549118A - 一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法

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Publication number: CN111549118A
Application number: CN202010474809.3A
Authority: CN
Inventors: 戴丽丽; 林文静; 李军; 翁水锦; 温千钧
Original assignee: Aginbury Xiamen Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Aginbury Xiamen Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明公开了一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法。所述引物组和探针的序列如SEQ ID NO:1‑32所示，其中SEQ ID NO:1‑2；5‑6,9‑10；13‑14；17‑18；21‑22；25‑26；29‑30为引物，SEQ ID NO:3‑4,7‑8,11‑12；15‑16；19‑20；23‑24；27‑28；31‑32为探针，探针的5'、3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团。采用本发明的引物和探针，可以免提取直接扩增检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类用药基因多态性，同时还可以知道用药情况。

Description

一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及基因多态性领域，尤其涉及一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法。

背景技术

近年来，荧光PCR技术得到了越来越广泛的应用。常规通过荧光PCR检测核酸的方法一般需要两个独立的过程：一是核酸模板制备，二是将核酸模板加入反应体系中进行PCR扩增检测。

人基因组DNA提取方法非常的多，DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂等。

以上这些提取方法均需要借助专业的提取设备和耗材、提取试剂，操作人员需要熟练掌握提取操作技能。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了检测成本并且提取过程耗时长，还有增加后续荧光PCR扩增失败的可能。因此，样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为样本荧光PCR扩增亟待解决的难题。

发明内容

本发明目的是提供一种免提取直接扩增检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类用药基因多态性检测的试剂盒以及方法。旨在解决现有技术对样本进行PCR扩增时，需要预先对样本进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且有毒试剂使用的问题，缩短PCR检测时间和简化操作步骤。

本发明目的是提供高效快速检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类药物用药涉及的高血脂用药中他汀类相关的rs4149056、rs429358、rs7412；高血压用药中：叶酸相关的rs1801133、氨氯地平相关的rs776746、氢氯噻嗪相关的rs4961；高血糖用药中：磺脲类相关的rs5219、双胍类相关的rs11212617共8个位点的基因多态性；给予正确的基因多态性位点分型。

为实现上述目的，本发明提供一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针，其特征在于，所述引物组和探针的序列如SEQ ID NO:1-32所示，其中SEQ IDNO:1-2；5-6,9-10；13-14；17-18；21-22；25-26；29-30为引物，SEQ ID NO:3-4,7-8,11-12；15-16；19-20；23-24；27-28；31-32为探针，探针的5'、3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团。

本发明还提供一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物组和探针。

进一步，还含有阳性质粒对照品，10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺和Taq DNA聚合酶，阳性质粒对照品的序列如SEQ ID NO:33-38所示。

本发明还提供一种免提取并同时富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段的方法，其特征在于，使用了所述的引物组和探针中的引物组，或所述的试剂盒。

进一步，所述方法采用了PCR扩增，PCR扩增的预扩反应体系为，

25μl的反应体系：3μl检测样本，10×PCR反应液，Taq DNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg²⁺，终浓度为5umol/L的Oligo Mix，余量为无菌水；所述Oligo Mix含有等量的SEQ ID NO:1,2,5,6,9，10，13，14,17,18,21,22,25,26,29,30；

PCR扩增的预扩反应程序为：

第一步骤：95℃5min；循环1次；

第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次；

第三步骤：72℃10min；循环1次。

进一步，所述检测样本为全血、血清、血浆、分离或浓缩的红细胞成分、血纱、血片、指尖血、口腔拭子或唾液等；

优选的，如果检测样本是液体状则无需处理直接作为检测样本；如果样本是固状样本(如口腔拭子、血纱或血片等)时，将新鲜采集的固状样本放置于无菌水中使其混悬，得到的混悬液作为检测样本。

本发明还提供一种免提取直接扩增并检测人三高类用药基因多态性的方法，其特征在于，使用了所述的引物组和探针，或所述的试剂盒。

进一步，包括如下步骤，采用权利要求1的引物组和探针，或权利要求2的试剂盒，对权利要求4得到的富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段进行检测与分型。

进一步，所述检测与分型步骤中使用了荧光PCR，荧光PCR的反应体系为，

25μL的PCR反应体系：2μL的权利要求4所得的稀释液，10×PCR反应液，0.5U TaqDNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg²⁺，Oligo Mix X，OligoMix X包括终浓度为0.4mmol/L的上游引物,终浓度为0.4mmol/L的下游引物,终浓度分别为0.1mmol/L的两个探针；所述Oligo Mix X为Oligo Mix A或B或C或D或E或F或G或H；OligoMix A包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ ID NO:1和2,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:3和4；Oligo Mix B包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ IDNO:5和6,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:7和8；……，Oligo Mix H包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ ID NO:29和30,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:31和32；

荧光PCR扩增的反应程序为：

第一步骤：95℃，5min，循环1次；

第二步骤：95℃，10s；65℃，30s；循环6次，0.5°touchdown不收集荧光；

第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光；

根据荧光PCR的CT值区分分型的判断标准如下：

第一：FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,TT1-TT3均为GG型.XY1-XY3均为GG，XT1为GG型，XT2为CC型；

第二：FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3，TT1-TT3均为AG型，XY1-XY2均为AG型，XY3为GT型，XT1为AG型，XT2为AC型；

第三：FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通道有S型扩增曲线且CT值<34,为TT1-TT3均为AA型，XY1-XY2均为AA型，XY3为TT型，XT1-XT2均为AA型。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供两步法对待检样本进行精准的检测：第一步对待测靶标基因DNA片段进行预扩增，目的是为了富集待测靶标基因DNA片段；第二步则是根据富集的待测靶标基因DNA片段进行荧光PCR检测，该步骤能准确的得出待测靶标基因的多态性位点分型。

本发明首先提供一种预扩增的方法同时对高血脂rs4149056、rs429358、rs7412三个位点；高血压rs1801133、rs776746、rs4961三个位点；高血糖rs5219、rs11212617两个位点的特异性DNA片段进行富集。

1)根据三个待测靶标基因位点进行设计的预扩增PCR反应体系为：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix、Taq DNA聚合酶。

所述Oligo Mix分别含有：

rs4149056的正向引物即TT1-F：TACTATGGGAGTCTCCCCTATT；SEQ ID NO:1；

rs4149056的反向引物即TT1-R：TTGTTTAAAGGAATCTGGGTCAT；SEQ ID NO:2；

rs429358的正向引物即TT2-F：ATGGCCTGCACCTCGCCG；SEQ ID NO:5；

rs429358的反向引物即TT2-R：ACGGCTGTCCAAGGAGCT；SEQ ID NO:6；

rs7412的正向引物即TT3-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ ID NO:9；

rs7412的反向引物即TT3-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA。SEQ ID NO:10；

rs1801133的正向引物即XY1-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ ID NO:13；

rs1801133的反向引物即XY1-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ ID NO:14；

rs776746的正向引物即XY2-F：GTACCACCCAGCTTAACGAATGCT；SEQ ID NO:117；

rs776746的反向引物即XY2-R：CCTTAGGTTCTAGTTCATTAGGGT；SEQ ID NO:18；

rs4961的正向引物即XY3-F：AGCAGTTGGTAATACAGCTTGGCA；SEQ ID NO:21；

rs4961的反向引物即XY3-R：GGGGCGACGAAGCTTCCGA；SEQ ID NO:22；

rs5219的正向引物即XT1-F：GCCACGTTGCAGTTGCCTTT；SEQ ID NO:25；

rs5219的反向引物即XT1-R：CGAGGAATACGTGCTGACAC；SEQ ID NO:26；

rs11212617的正向引物即XT2-F：TGGGTTGCTTGTGGATAACATATA；SEQ ID NO:29；

rs11212617的反向引物即XT2-R：AATGATCTACATATACCAATTACAAAGGG；SEQ ID NO:30。

2)采用本发明的试剂盒和检测样本，通过在普通PCR仪上运行PCR扩增程序，本发明将检测样本直接作为模板，无需处理直接加入PCR反应体系中进行检测。普通PCR仪器操作简单且高效，对待测靶标基因退火温度的扩增。该普通PCR仪器可以采用XP基因扩增仪系列(杭州博日科技有限公司，中国)等。

3)所述的检测样本，包括但不限于全血、血清、血浆、血纱、血片、指尖血、口腔拭子、唾液等。

4)如果所述的检测样本是液体状则无需处理；如果检测样本是口腔拭子、血片、血纱等固状样本时，可进行简单处理，例如，将新鲜采集的植绒拭子放置于200μl纯净水剧烈旋涡混悬至少15s以上，作为检测样本。

所述扩增程序如下：

第一步骤：95℃5min；循环一次；

第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次；

第三步骤：72℃10min；循环一次。

所述富集到的PCR产物进行开盖稀释：选择一个密闭的、安全的、不易造成实验室污染的空间做PCR产物稀释：用稀释40倍后的PCR产物作为模板进入下一步荧光定量PCR检测反应。

本发明提供一种免提取直接扩增检测人三高(高血压、高血脂、高血糖)类用药基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)根据八个基因位点进行设计的三个反应体系分别包含：

反应体系TT1：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix A、Taq DNA聚合酶；

反应体系TT2：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix B、Taq DNA聚合酶、DMSO；

反应体系TT3：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix C、Taq DNA聚合酶、DMSO。

反应体系XY1：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix D、Taq DNA聚合酶；

反应体系XY2：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix E、Taq DNA聚合酶；

反应体系XY3：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix F、Taq DNA聚合酶。

反应体系XT1：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix G、Taq DNA聚合酶、DMSO；

反应体系XT2：10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺、Oligo Mix H、Taq DNA聚合酶。

每个反应体系中均可以添加DMSO，以提高体系检测灵敏度。如果体系中的引物和探针序列为高GC含量，就要加DMSO降低退火温度。

阳性质粒对照品TT-G和TT-A：阳性质粒为rs4149056、rs429358、rs7412三个待测靶标基因位点共用，质粒序列包含了三个基因位点的多态性，即三个体系的阳性对照均是加入同样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。

阳性质粒对照品XY-G和XY-AT：阳性质粒为rs1801133、rs776746、rs4961三个待测靶标基因位点共用，质粒序列包含了三个基因位点的多态性，即三个体系的阳性对照均是加入同样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。

阳性质粒对照品XT-GC和XT-A：阳性质粒为rs5219、rs11212617两个个待测靶标基因位点共用，质粒序列包含了两个基因位点的多态性，即两个体系的阳性对照均是加入同样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。

阴性对照品。

所述Oligo Mix A分别含有：

rs4149056的正向引物即TT1-F：TACTATGGGAGTCTCCCCTATT；SEQ ID NO:1；

rs4149056的反向引物即TT1-R：TTGTTTAAAGGAATCTGGGTCAT；SEQ ID NO:2；

rs4149056的探针1即TT1-P1：FAM-ACCCATGAACGCATATATCCACA-BHQ；SEQ ID NO:3；

rs4149056的探针2即TT1-P2：HEX-ACCCATGAACACATATATCCACATGT-BHQ；SEQ IDNO:4。

所述Oligo Mix B分别含有：

rs429358的正向引物即TT3-F：ATGGCCTGCACCTCGCCG；SEQ ID NO:5；

rs429358的反向引物即TT3-R：ACGGCTGTCCAAGGAGCT；SEQ ID NO:6；

rs429358的探针1即TT3-P1：FAM-CCGCGCACGTCCTCCAT-BHQ；SEQ ID NO:7；

rs429358的探针2即TT3-P2：HEX-CCGCACACGTCCTCCATGT-BHQ；SEQ ID NO:8。

所述Oligo Mix C分别含有：

rs7412的正向引物即TT3-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ ID NO:9；

rs7412的反向引物即TT3-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ ID NO:10；

rs7412的探针1即TT3-P1：FAM-TACACTGCCAGGCGCTTCT-BHQ；SEQ ID NO:11；

rs7412的探针2即TT3-P2：HEX-CACTGCCAGGCACTTCTGC-BHQ；SEQ ID NO:12。

所述Oligo Mix D分别含有：

rs1801133的正向引物即XY1-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ ID NO:13；

rs1801133的反向引物即XY1-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ ID NO:14；

rs1801133的探针1即XY1-P1：FAM-TGATGATGAAATCGGCTCCCG-BHQ；SEQ ID NO:15；

rs1801133的探针2即XY1-P2：HEX-TGATGAAATCGACTCCCGCA-BHQ；SEQ ID NO:16。

所述Oligo Mix E分别含有：

rs776746的正向引物即XY2-F：GTACCACCCAGCTTAACGAATGCT；SEQ ID NO:17；

rs776746的反向引物即XY2-R：CCTTAGGTTCTAGTTCATTAGGGT；SEQ ID NO:18；

rs776746的探针1即XY2-P1：FAM-TTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-BHQ；SEQ ID NO:19；

rs776746的探针2即XY2-P2：HEX-TTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTG-BHQ；SEQ ID NO:20。

所述Oligo Mix F分别含有：

rs4961的正向引物即XY3-F：AGCAGTTGGTAATACAGCTTGGCA；SEQ ID NO:21；

rs4961的反向引物即XY3-R：GGGGCGACGAAGCTTCCGA；SEQ ID NO:22；

rs4961的探针1即XY3-P1：FAM-TCCGAGGAAGGGCAGAATG-BHQ；SEQ ID NO:23；

rs4961的探针2即XY3-P2：HEX-CTTCCGAGGAATGGCAGAATG-BHQ；SEQ ID NO:24。

所述Oligo Mix G分别含有：

rs5219的正向引物即XT1-F：GCCACGTTGCAGTTGCCTTT；SEQ ID NO:25；

rs5219的反向引物即XT1-R：CGAGGAATACGTGCTGACAC；SEQ ID NO:26；

rs5219的探针1即XT1-P1：FAM-CCTGCCGAGCCCAGGT-BHQ；SEQ ID NO:27；

rs5219的探针2即XT1-P2：HEX-CCCTGCCAAGCCCAGGT-BHQ；SEQ ID NO:28。

所述Oligo Mix H分别含有：

rs11212617的正向引物即XT2-F：TGGGTTGCTTGTGGATAACATATA；SEQ ID NO:29；

rs11212617的反向引物即XT2-R：AATGATCTACATATACCAATTACAAAGGG；SEQ ID NO:30；

rs11212617的探针1即XT2-P1：FAM-CGCTCTGACAGTCTCTGATC-BHQ；SEQ ID NO:31；

rs11212617的探针2即XT2-P2：FAM-CGCTCTGACATTCTCTGATCT-BHQ；SEQ ID NO:32。

所述的5'、3'末端标记的荧光基团包括但不限于ALEXA350、FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5、TAMRA等。所述的淬灭基团包括Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2。5'及3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团在折叠状态时能发生荧光共振能量转移(FRET)，使荧光基团的荧光被淬灭。

所述阳性质粒对照品包含：

TT-G:AAATCATCAATGTAAGAAAGCCCCAATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCACGAAGCATATTACCCATGAACGCATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCATTTTAAACATTACAGGGGCCCCAGGCGCTCGCGGATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGGCGCCCTCGCGGGCCCCGGCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAGCCGCTTACGCAGCTTGCGCAGGTGGGAGGCGAGGCGCACCCGCAGCTCCTCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCTCGCCGCGGTACTGCACCAGGCGGCCGCGCACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCGTGCCCGCGTCTCCTCCGCCA。

SEQ ID NO:33。

TT-A:AAATCATCAATGTAAGAAAGCCCCAATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCACGAAGCATATTACCCATGAACACATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCATTTTAAACATTACAGGGGCCCCAGGCGCTCGCGGATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGGCGCCCTCGCGGGCCCCGGCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAGCCGCTTACGCAGCTTGCGCAGGTGGGAGGCGAGGCGCACCCGCAGCTCCTCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCTCGCCGCGGTACTGCACCAGGCGGCCGCACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCGTGCCCGCGTCTCCTCCGCCA。

SEQ ID NO:34。

XY-G:GCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGTACCACCCAGCTTAACGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCTCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCCTGTTTGGACCACATTACCCTTCATCATATGAAGCCTTGGGTGGCTCCTGTGTGAGACTCTTGCTACAGTTTTCAGAAGCAGCAGCGGGAGAAGACAAGATGGCTGAACTCTGGCCGGGGCGACGAAGCTTCCGAGGAAGGGCAGAATGGAAGCAGTCCCAAGTCGAAGACTAAGGTGTGGACGAACATTACACACGATCACGTGAAACCCTTGC。

SEQ ID NO:35。

XY-AT:GCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGTACCACCCAGCTTAACGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCTCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTGGACCACATTACCCTTCATCATATGAAGCCTTGGGTGGCTCCTGTGTGAGACTCTTGCTACAGTTTTCAGAAGCAGCAGCGGGAGAAGACAAGATGGCTGAACTCTGGCCGGGGCGACGAAGCTTCCGAGGAATGGCAGAATGGAAGCAGTCCCAAGTCGAAGACTAAGGTGTGGACGAACATTACACACGATCACGTGAAACCCTTGC。

SEQ ID NO:36。

XT-GC:CACCGGAGCCATGCTGTCCCGCAAGGGCATCATCCCCGAGGAATACGTGCTGACACGCCTGGCAGAGGACCCTGCCGAGCCCAGGTACCGTGCCCGCCAGCGGAGGGCCCGCTTTGTGTCCAAGAAAGGCAACTGCAACGTGGCCCACAATGTGTCTTTATATTTAAAGTGGGTTGCTTGTGGATAACATATAGTTGGGTCTTGATTTTTTATCCGCTCTGACAGTCTCTGATCTGCCCTTTGTAATTGGTATATGTAGATCATTGACATTTAAAGTTATTGATATAGTTCAATCGATAT。

SEQ ID NO:37。

XT-A:CACCGGAGCCATGCTGTCCCGCAAGGGCATCATCCCCGAGGAATACGTGCTGACACGCCTGGCAGAGGACCCTGCCAAGCCCAGGTACCGTGCCCGCCAGCGGAGGGCCCGCTTTGTGTCCAAGAAAGGCAACTGCAACGTGGCCCACAATGTGTCTTTATATTTAAAGTGGGTTGCTTGTGGATAACATATAGTTGGGTCTTGATTTTTTATCCGCTCTGACATTCTCTGATCTGCCCTTTGTAATTGGTATATGTAGATCATTGACATTTAAAGTTATTGATATAGTTCAATCGATAT。

SEQ ID NO:38。

2)本发明将上一步稀释的PCR产物直接作为模板，无需处理直接加入优化的PCR反应体系中进行检测，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。

3)采用本发明的试剂盒和检测样本，通过在荧光定量PCR仪上运行PCR扩增程序，分析检测结果，根据CT值区分出三个基因多态性。该荧光定量PCR仪器可以采用ABI7500系列(赛默飞世尔科技公司，麻省，美国)，LighterCycler 480(罗氏，巴塞尔，瑞士)，CFX96(美国伯乐，加州，美国)，MX3005P(安捷伦科技公司，加州，美国)，Rotor-Gene Q(QIAGEN,凯杰,德国)等。

所述扩增程序如下：

第一步骤：95℃，5min，循环1次；

第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光。

所述根据CT值区分分型的判断标准如下：

第一：FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,TT1-TT3为GG型.XY1-XY3为GG型，XT1为GG型，XT2为CC型。

第二：FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3，TT1-TT3为AG型，XY1-XY2为AG型，XY3为GT型，XT1为AG型，XT2为AC型。

第三：FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通道有S型扩增曲线且CT值<34,为TT1-TT3为AA型，XY1-XY2为AA型，XY3为TT型，XT1-XT2为AA型。

附图说明

图1为实施例1的梯度稀释扩增曲线结果图。

图2为实施例1的梯度稀释扩增曲线的Ct值与DNA起始拷贝数的对数关系曲线图。

图3为检测样本TT1反应体系的分型GG型图。

图4为检测样本TT2反应体系的分型AG型图。

图5为检测样本TT3反应体系的分型AG型图。

图6为检测样本XY1反应体系的分型GG型图。

图7为检测样本XY2反应体系的分型AA型图。

图8为检测样本XY3反应体系的分型TT型图。

图9为检测样本XT1反应体系的分型AG型图。

图10为检测样本XT2反应体系的分型CC型图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1免提取直接扩增检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类用药基因多态性检测实验样本

待测样本选用厦门第一医院提供的口腔拭子2222，将口腔拭子折断放入EP管中，加入200μl无菌水进行震荡几秒钟即为样本混悬液，即可进入检测阶段。

第一步预扩增PCR反应体系内含3μl样本混悬液，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg²⁺，5umol/L Oligo Mix(等量的SEQ ID NO:1-2,5-6,9-10，13-14,17-18,21-22,25-26,29-30),余量为无菌水。

扩增程序为：

第一步骤：95℃5min；循环1次。

第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次。

第三步骤：72℃10min；循环1次。

经过普通PCR仪器进行扩增之后，得到PCR扩增产物，选择一个密闭的、安全的、不易造成实验室污染的空间做PCR产物稀释：用稀释40倍后的PCR产物作为模板进入下一步荧光定量PCR检测反应。

第二步配置TT1、TT2、TT3、XY1、XY2、XY3、XT1、XT2反应体系，分别如下：

25μL的TT1反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix A(0.4mmol/L TT1-F,0.4mmol/L TT1-R,0.1mmol/L TT1-P1,0.1mmol/L TT1-P2)，无菌水。

25μL的TT2反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix B(0.4mmol/L TT2-F,0.4mmol/L TT2-R,0.1mmol/L TT2-P1,0.1mmol/L TT2-P2)，4mmol/LDMSO，无菌水。

25μL的TT3反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix C(0.4mmol/L TT3-F,0.4mmol/L TT3-R,0.1mmol/L TT3-P1,0.1mmol/L TT3-P2)，4mmol/LDMSO，无菌水。

25μL的XY1反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix D(0.4mmol/L XY1-F,0.4mmol/L XY1-R,0.1mmol/L XY1-P1,0.1mmol/L XY1-P2)，无菌水。

25μL的XY2反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix E(0.4mmol/L XY2-F,0.4mmol/L XY2-R,0.1mmol/L XY2-P1,0.1mmol/L XY2-P2)，无菌水。

25μL的XY3反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix F(0.4mmol/L XY3-F,0.4mmol/L XY3-R,0.1mmol/L XY3-P1,0.1mmol/L XY3-P2)，无菌水。

25μL的XT1反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix G(0.4mmol/L TXT1-F,0.4mmol/L XT1-R,0.1mmol/L XT1-P1,0.1mmol/L XT1-P2)，4mmol/LDMSO，无菌水。

25μL的XT2反应体系内含有2μL上一步预扩的PCR稀释产物，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，2.5mmol/L dNTP，3.5mmol/L Mg²⁺，Oligo Mix F(0.4mmol/L XT2-F,0.4mmol/L XT2-R,0.1mmol/L XT2-P1,0.1mmol/L XT2-P2)，无菌水。

PCR扩增反应的程序为：

第一步骤：95℃，5min，循环1次；

第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光。

八个反应体系以不经过处理的免提取直接进行扩增反应，根据CT值区分分型的判断标准可以完全准确分型。

CT值区分分型的判断标准如下：

第一：FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,TT1-TT3为GG型.XY1-XY3为GG，XT1为GG型，XT2为CC型。

本实施例采用TT1反应体系，FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>34,且|CTFAM-CTHEX|>3,依据以上判断原则，为GG型。

本实施例采用TT2反应体系，FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3,依据以上判断原则，为AG型。

本实施例采用TT3反应体系，FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3,依据以上判断原则，为AG型。

本实施例采用XY1反应体系，FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>34,且|CTFAM-CTHEX|>3,依据以上判断原则，为GG型。

本实施例采用XY2反应体系，FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>34，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通道有S型扩增曲线且CT值<34,依据以上判断原则，为AA型。

本实施例采用XY3反应体系，FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>34，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通道有S型扩增曲线且CT值<34,依据以上判断原则，为TT型。

本实施例采用XT1反应体系，FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3,依据以上判断原则，为AG型。

本实施例采用XT2反应体系，FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,依据以上判断原则，为CC型。

结果见图3-5，图3为检测样本TT1反应体系的分型GG型，图4为检测样本TT2反应体系的分型为AG，图5为检测样本TT3反应体系的分型为AG。图6为检测样本XY1反应体系的分型GG型图。图7为检测样本XY2反应体系的分型AA型图。图8为检测样本XY3反应体系的分型TT型图。图9为检测样本XT1反应体系的分型AG型图。图10为检测样本XT2反应体系的分型CC型图。因而，以上结果表明了将免提取的检测样本直接作为模板直接扩增可行，能高效检测，节省时间。

实施例2灵敏度试验

本实施例选择rs4149056质粒GG型为待测靶标位点，根据本发明之相应精神，进行配置TT1反应体系。

选择用量为1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL(即为10倍梯度稀释)的rs4149056质粒GG型标准品(即SEQID NO:13)作为反应模板。

25μL的PCR反应体系内含有2μL的rs4149056质粒GG型标准品，10×PCR反应液(10mmol/L Tris-HCl，其pH＝8.3，50mmol/L KCl)，0.5U Taq DNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg²⁺，Oligo Mix A(终浓度为0.4mmol/L的TT1-F,0.4mmol/L的TT1-R,0.1mmol/L的TT1-P1,0.1mmol/L的TT1-P2)，余量用无菌水。

PCR扩增反应的程序为：第一步骤：95℃，5min，循环1次；第二步骤：95℃，10s；65℃，30s；循环6次，0.5°touchdown不收集荧光；第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环40次，收集荧光。

其中：

所述Oligo Mix A分别含有：

rs4149056的正向引物即TT1-F：TACTATGGGAGTCTCCCCTATT；SEQ ID NO:1；

rs4149056的反向引物即TT1-R：TTGTTTAAAGGAATCTGGGTCAT；SEQ ID NO:2；

rs4149056的探针1即TT1-P1：FAM-ACCCATGAACGCATATATCCACA-BHQ；SEQ ID NO:3；

rs4149056的探针2即TT1-P2：HEX-ACCCATGAACACATATATCCACATGT-BHQ。SEQ IDNO:4。

本实施例的梯度稀释扩增曲线见图1。如图1所示，10倍梯度稀释样本的扩增曲线2a体现较好的梯度，而1a(阴性对照ddH₂O，即为没有模板的存在)无特异性产物的扩增，故检测不到特异信号。参照图2，其示出了待测样本的梯度稀释扩增曲线的Ct值与DNA起始拷贝数的对数关系曲线，可以看出1×10⁶copies模板用量的反应管的Ct值为13.56(Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)、1×10⁵copies模板用量的反应管的Ct值为16.86、1×10⁴copies模板用量的反应管的Ct值为20.16、1×10³copies模板用量的反应管的Ct值为23.46、1×10²copies模板用量的反应管的Ct值为26.76，可见，相邻梯度模板用量的Ct值差约为3.3(理论上，扩增效率为100％时，模板用量差异10倍时Ct值差为3.3)，因而，以上结果表明了该PCR反应体系具有较高的反应效率，梯度样本扩增曲线的Ct值与其DNA起始拷贝数的对数有很好的线性关系(R²＝1)，体现了该技术较强的定量检测能力。

实施例3准确性试验

本实施例随机选取8个由厦门市第一医院提供的外周血样本，利用上述的TT1、TT2、TT3、XY1、XY2、XY3、XT1、XT2八种反应体系分别对以上8个样本进行基因分型检测并统计各自的检测结果，将其组合以得到待测样本的SNP位点的基因型结果。

在8个待测样本中，八种反应体系检测的SNP位点检测结果具体如下表1-3所示。

表1高血脂三种反应体系检测的SNP位点检测结果表

表2高血压三种反应体系检测的SNP位点检测结果表

样本

XY1血样

XY1测序

XY2血样

XY2测序

XY3血样

XY3测序

ZB19005396

GG

GT

ZB19005397

GG

AG

GT

ZB19005398

AA

AG

GT

ZB19005399

AA

GG

TT

ZB19005400

AG

TT

ZB19005401

GG

GT

ZB19005403

GG

AA

GG

ZB19005404

GG

AA

GG

表3高血糖两种反应体系检测的SNP位点检测结果表

样本	XT1血样	XT1测序	XT2血样	XT2测序
					ZB19005396	AG	AG	CC	CC
ZB19005397	AG	AG	CC	CC
					ZB19005398	GG	GG	CC	CC
ZB19005399	AA	AA	CC	CC
					ZB19005400	AG	AG	CC	CC
ZB19005401	GG	GG	CC	CC
					ZB19005403	GG	GG	CC	CC
ZB19005404	AG	AG	AC	AC

发明人还对8个样本的第二次PCR扩增产物分别送到上海生物生工有限公司进行了Sanger测序，结果见表1-3。从表1-3可以看出，所得结果与免提取直接扩增检测完全一致。

因而，在本实施例中，本发明提供的免提取直接扩增三高(高血压、高血脂、高血糖)类药物SNP位点检测方法可以高效地对多个样品的SNP位点进行检测，并得到准确可信的结果。而与Sanger测序法相比，本实施例大大提高了测序的通量，能够同时对多个样品的SNP位点进行有效的检测，并减少中间样品处理的步骤，提高实验效率，检测成本更低。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 爱基因博瑞（厦门）医学检验实验室有限公司

<120> 一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及

其方法

<130> AJYB-20001-CNI

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tactatggga gtctccccta tt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgtttaaag gaatctgggt cat 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccatgaac gcatatatcc aca 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acccatgaac acatatatcc acatgt 26

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcctgca cctcgccg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acggctgtcc aaggagct 18

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgcgcacgt cctccat 17

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcacacgt cctccatgt 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggcgctga ggccgcgct 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgcctccca cctgcgca 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tacactgcca ggcgcttct 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cactgccagg cacttctgc 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggcgctga ggccgcgct 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgcctccca cctgcgca 18

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgatgatgaa atcggctccc g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgatgaaatc gactcccgca 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtaccaccca gcttaacgaa tgct 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccttaggttc tagttcatta gggt 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttttgtcttt cagtatctct tccc 24

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttgtctttc aatatctctt ccctg 25

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agcagttggt aatacagctt ggca 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggggcgacga agcttccga 19

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tccgaggaag ggcagaatg 19

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cttccgagga atggcagaat g 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gccacgttgc agttgccttt 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgaggaatac gtgctgacac 20

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cctgccgagc ccaggt 16

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccctgccaag cccaggt 17

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgggttgctt gtggataaca tata 24

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aatgatctac atataccaat tacaaaggg 29

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgctctgaca gtctctgatc 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgctctgaca ttctctgatc t 21

<210> 33

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aaatcatcaa tgtaagaaag ccccaatggt actatgggag tctcccctat tccacgaagc 60

atattaccca tgaacgcata tatccacatg tatgacccag attcctttaa acaacctatg 120

tagataagag agtgtttcat tttaaacatt acaggggccc caggcgctcg cggatggcgc 180

tgaggccgcg ctcggcgccc tcgcgggccc cggcctggta cactgccagg cgcttctgca 240

ggtcatcggc atcgcggagg agccgcttac gcagcttgcg caggtgggag gcgaggcgca 300

cccgcagctc ctcggtgctc tggccgagca tggcctgcac ctcgccgcgg tactgcacca 360

ggcggccgcg cacgtcctcc atgtccgcgc ccagccgggc ctgcgccgcc tgcagctcct 420

tggacagccg tgcccgcgtc tcctccgcca 450

<210> 34

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaatcatcaa tgtaagaaag ccccaatggt actatgggag tctcccctat tccacgaagc 60

atattaccca tgaacacata tatccacatg tatgacccag attcctttaa acaacctatg 120

tagataagag agtgtttcat tttaaacatt acaggggccc caggcgctcg cggatggcgc 180

tgaggccgcg ctcggcgccc tcgcgggccc cggcctggta cactgccagg cacttctgca 240

ggtcatcggc atcgcggagg agccgcttac gcagcttgcg caggtgggag gcgaggcgca 300

cccgcagctc ctcggtgctc tggccgagca tggcctgcac ctcgccgcgg tactgcacca 360

ggcggccgca cacgtcctcc atgtccgcgc ccagccgggc ctgcgccgcc tgcagctcct 420

tggacagccg tgcccgcgtc tcctccgcca 450

<210> 35

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gccttcacaa agcggaagaa tgtgtcagcc tcaaagaaaa gctgcgtgat gatgaaatcg 60

gctcccgcag acaccttctc cttcaagtgc ttcaggtcag cctcaaagct ccctgcttcg 120

gggtggcctt tggggtaacc tgccaatagg gtaccaccca gcttaacgaa tgctctactg 180

tcatttctaa ccataatctc tttaaagagc tcttttgtct ttcagtatct cttccctgtt 240

tggaccacat tacccttcat catatgaagc cttgggtggc tcctgtgtga gactcttgct 300

acagttttca gaagcagcag cgggagaaga caagatggct gaactctggc cggggcgacg 360

aagcttccga ggaagggcag aatggaagca gtcccaagtc gaagactaag gtgtggacga 420

acattacaca cgatcacgtg aaacccttgc 450

<210> 36

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gccttcacaa agcggaagaa tgtgtcagcc tcaaagaaaa gctgcgtgat gatgaaatcg 60

actcccgcag acaccttctc cttcaagtgc ttcaggtcag cctcaaagct ccctgcttcg 120

gggtggcctt tggggtaacc tgccaatagg gtaccaccca gcttaacgaa tgctctactg 180

tcatttctaa ccataatctc tttaaagagc tcttttgtct ttcaatatct cttccctgtt 240

tggaccacat tacccttcat catatgaagc cttgggtggc tcctgtgtga gactcttgct 300

acagttttca gaagcagcag cgggagaaga caagatggct gaactctggc cggggcgacg 360

aagcttccga ggaatggcag aatggaagca gtcccaagtc gaagactaag gtgtggacga 420

acattacaca cgatcacgtg aaacccttgc 450

<210> 37

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

caccggagcc atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct 60

ggcagaggac cctgccgagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc 120

caagaaaggc aactgcaacg tggcccacaa tgtgtcttta tatttaaagt gggttgcttg 180

tggataacat atagttgggt cttgattttt tatccgctct gacagtctct gatctgccct 240

ttgtaattgg tatatgtaga tcattgacat ttaaagttat tgatatagtt caatcgatat 300

<210> 38

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

caccggagcc atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct 60

ggcagaggac cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc 120

caagaaaggc aactgcaacg tggcccacaa tgtgtcttta tatttaaagt gggttgcttg 180

tggataacat atagttgggt cttgattttt tatccgctct gacattctct gatctgccct 240

ttgtaattgg tatatgtaga tcattgacat ttaaagttat tgatatagtt caatcgatat 300

Claims

1.一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针，其特征在于，所述引物组和探针的序列如SEQ ID NO:1-32所示，其中SEQ ID NO:1-2；5-6,9-10；13-14；17-18；21-22；25-26；29-30为引物，SEQ ID NO:3-4,7-8,11-12；15-16；19-20；23-24；27-28；31-32为探针，探针的5'、3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团。

2.一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组和探针。

3.如权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还含有阳性质粒对照品，10×PCR反应液、dNTP、Mg²⁺和Taq DNA聚合酶，阳性质粒对照品的序列如SEQ ID NO:33-38所示。

4.一种免提取并同时富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段的方法，其特征在于，使用了权利要求1所述的引物组和探针中的引物组，或权利要求2所述的试剂盒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法采用了PCR扩增，PCR扩增的预扩反应体系为，

PCR扩增的预扩反应程序为：

第一步骤：95℃5min；循环1次；

第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次；

第三步骤：72℃10min；循环1次。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测样本为全血、血清、血浆、分离或浓缩的红细胞成分、血纱、血片、指尖血、口腔拭子或唾液等；

优选的，如果检测样本是液体状则无需处理直接作为检测样本；如果样本是固状样本时，将新鲜采集的固状样本放置于无菌水中使其混悬，得到的混悬液作为检测样本。

7.一种免提取直接扩增并检测人三高类用药基因多态性的方法，其特征在于，使用了权利要求1所述的引物组和探针，或权利要求2所述的试剂盒。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，包括如下步骤，采用权利要求1的引物组和探针，或权利要求2的试剂盒，对权利要求4得到的富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段进行检测与分型。

9.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测与分型步骤中使用了荧光PCR，荧光PCR的反应体系为，

25μL的PCR反应体系：2μL的权利要求4所得的稀释液，10×PCR反应液，0.5U Taq DNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg²⁺，Oligo Mix X，Oligo Mix X包括终浓度为0.4mmol/L的上游引物,终浓度为0.4mmol/L的下游引物,终浓度分别为0.1mmol/L的两个探针；所述Oligo Mix X为Oligo Mix A或B或C或D或E或F或G或H；OligoMix A包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ ID NO:1和2,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:3和4；Oligo Mix B包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ IDNO:5和6,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:7和8；……，Oligo Mix H包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ ID NO:29和30,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ ID NO:31和32；

荧光PCR扩增的反应程序为：

第一步骤：95℃，5min，循环1次；

第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光；

根据荧光PCR的CT值区分分型的判断标准如下：