CN108998512A - 免提取的用于cyp2c19基因多态性检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents

免提取的用于cyp2c19基因多态性检测的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒所述试剂盒包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品。本发明还公开一种免提取的检测CYP2C19基因多态性的检测方法。所述DNA聚合酶是本身或者经过基因工程改造后具有很强的抗PCR抑制剂的一种或几种DNA聚合酶。本发明的试剂盒及检测方法真正实现微量样本直接检测，免除外周血、拭子类样本的DNA提取环节。本发明中将微量的血液类样本、口腔拭子样本直接加入到PCR反应液中，运行PCR扩增程序即可完成CYP2C19基因多态性检测。整个检测过程不涉及有毒试剂，安全便捷，操作简易，整个检测耗时短，灵敏度高、特异性强、可以应用于高通量检测。

Description

免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测人基因组中是否存在CYP2C19基因多态性的免提取的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
人CYP2C19基因位于10号染色体上，长约90.21kb，含9个外显子和8个内含子。
研究发现，CYP2C19基因多态性可影响到许多重要临床应用药物的代谢，如奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑，泮托拉唑(质子泵抑制剂)；氯吡格雷(血小板聚集抑制剂)；安定，氯巴占，苯妥英钠，苯巴比妥等(抗癫痫药)；氟西汀，西酞普兰，艾司西酞普兰，阿米替林，氯米帕明，丙咪嗪等(抗抑郁药)；地西泮、唑吡旦(镇静、安眠药)；环磷酰胺(抗肿瘤药)；氯胍(抗疟疾药)；伏立康唑(抗真菌药)；孕黄体酮等(激素)；普萘洛尔(心率不齐心绞痛药物)等。CYP2C19基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。CYP2C19酶活性存在多态性，因此不同的个体对药物代谢能力不同，产生的药物毒副作用及治疗效果不同。
CYP2C19除了野生型等位基因CYP2C19*1外，存在CYP2C19*2～CYP2C19*21等多种突变等位基因，其中CYP2C19*2(外显子5的681位单个碱基突变G→A)和CYP2C19*3(外显子4的636位单个碱基突变G→A)为CYP2C19基因在亚洲人群中的主要突变类型，突变后造成相关药物代谢缓慢，CYP2C19*17为功能获得性等位基因，酶活性增强，代谢加快，在白种人以及美国黑人中的突变比例较高。CYP2C19*17有5′侧翼区-806C→T和-3402C→T 2个突变位点，其中-806C→T起效应作用，因为含-806C→T的调控元件可结合肝核蛋白，可加快CYP2C19的转录速率，从而提高CYP2C19对奥美拉唑等药物的代谢效率。CYP2C19*17纯合子个体对奥美拉唑代谢快，且CYP2C19*17和CYP2C19*1纯合子个体之间对奥美拉唑的药物代谢动力学差异极显著，使得CYP2C19*17成为个性化用药的靶点。
CYP2C19基因多态性的检测方法，主要是将待测样本经过核酸提取后再经PCR-RLFP法、直接测序法、固相/液相芯片法或ARMS-qPCR法进行检测。人基因组DNA提取方法，按照核酸释放原理可分为煮沸法、盐析法、碘化钾法、胍盐法等，按照核酸分离方式可以分为离心法、吸附法，按介质分有柱法和磁珠法。
以上这些提取方法均需要借助专业的提取设备和耗材、提取试剂，操作人员需要熟练掌握提取操作技能。单个样本提取需要耗时0.5-1小时，加上核酸检测环节，从样本入检到得到检测结果通常需要耗时2-3小时，具体检测时长受制于样本量和提取的自动化程度。整个提取过程步骤较多，操作繁琐，一旦提取出现误操作，会导致整个实验的失败，在提取过程中也容易造成样本之间交叉污染，以及提取设备的污染。而且提取后需要进行专门的消毒清洁工作。另外，提取过程中操作人员需要接触有毒或者有腐蚀性的化学试剂，提取中会产生大量的废液，对人体以及环境都不够友好。市面上也有一些免提取的试剂，但仍需要样本的前处理步骤，需要借助核酸释放剂处理10-30分钟，再经离心才能用于下一步检测，并未实现真正的样本直接检测。以上这些方法都有着通量的限制，不能满足实际应用的需求。目前尚没有不用提取核酸就可以直接以荧光定量PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，该试剂盒能够对未经DNA提取的全血样本或口腔棉拭子样本直接进行检测，无需对样本进行DNA提取、借助核酸释放剂处理等操作。
为解决上述技术问题，本发明提供一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性(PC)对照品和阴性(NC)对照品；其中，
所述Oligo Mix A含有：
rs4244285G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.1所示；rs4244285G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；
rs4986893G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.5所示；rs4986893G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；
rs12248560C型基因正向引物，序列如SEQ ID No.9所示；rs12248560C型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；
Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；
PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ IDNo.14所示；
所述Oligo Mix B含有：
rs4244285A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.2所示；rs4244285A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；
rs4986893A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.6所示；rs4986893A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；
rs12248560T型基因正向引物，序列如SEQ ID No.10所示；rs12248560T型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；
Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；
PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ IDNo.14所示；
所述DNA聚合酶可以是一类经基因工程改造后具有很强抗PCR抑制剂的Taq DNA聚合酶突变体，或者是具有强PCR抑制剂耐受性的其他DNA聚合酶。所述DNA聚合酶包括Taq聚合酶、Phusion聚合酶、Phire聚合酶、Tth聚合酶，以及它们的突变体，也可以是几种酶的混合。优选为Taq聚合酶及其突变体。
上述的探针及引物的具体序列如表1所示。
表1CYP2C19基因突变检测试剂盒所含引物探针序列
序列类型 基因 标记 SEQ ID NO. 引物序列
正向引物 2*A 1 TCCCACTATCATTGATTATTTCCCA
正向引物 2*G 2 CCCACTATCATTGATTATTTCGCG
反向引物 2 3 TACGCAAGCAGTCACATAACT
探针 2 FAM,BHQ1 4 AGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAAC
正向引物 3*A 5 GATTGTAAGCACCCCCcGA
正向引物 3*G 6 GATTGTAAGCACCCCCAGG
反向引物 3 7 AGAACTTTGCCATCTTTTCCAG
探针 3 JOE,BHQ1 8 CCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCT
正向引物 17*T 9 TTTGTGTCTTCTGTTCTCAATGT
正向引物 17*C 10 TTGTGTCTTCTGTTCTCAATGC
反向引物 17 11 ACACGTGAAGGCAGGAATTG
探针 17 CY5,BHQ2 12 TGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGC
正向引物 β-globin 13 ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT
反向引物 β-globin 14 AGGCACCGAGCACTTTCTTG
探针 β-globin ROX,BHQ2 15 TCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAAC
上述的试剂盒中，如SEQ ID No.4所示的Taqman探针是FAM通道通用Taqman探针，具有FAM，BHQ1标记；如SEQ ID No.8所示的Taqman探针是JOE通道通用Taqman探针，具有JOE，BHQ1标记；如SEQ ID No.12所示的Taqman探针是CY5通道通用Taqman探针，具有CY5，BHQ2标记；如SEQ ID No.15所示的Taqman探针是内参ROX通道通用Taqman探针，具有ROX，BHQ2标记。
上述的试剂盒用于检测时，在FAM通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQID No.4所示Taqman探针、如SEQ ID No.3所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQ IDNo.1(使用Oligo Mix A时)或SEQ ID No.2(使用Oligo Mix B时)所示的正向引物；
在JOE通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.8所示Taqman探针、如SEQ ID No.7所示的反向引物和rs4986893Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4986893Arms引物为如SEQ ID No.5(使用Oligo Mix A时)或SEQ ID No.6(使用Oligo Mix B时)所示的正向引物；
在CY5通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.12所示Taqman探针、如SEQ ID No.11所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQ ID No.9(使用Oligo Mix A时)或SEQ ID No.10(使用Oligo Mix B时)所示的正向引物；
在ROX通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.15所示Taqman探针、如SEQ ID No.14所示的PCR下游通用引物和如SEQ ID No.13所示PCR上游通用引物，三者的浓度分别为0.05～0.1μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM。
上述的试剂盒中，所述阳性(PC)对照品优选为分别包含6个SNP位点和1个内参片段的7个pUC57质粒的混合物。所述6个SNP位点分别为如SEQ ID No.16所示的SNP位点上rs4244285的G型、如SEQ ID No.17所示的SNP位点上rs4244285的A型、如SEQ ID No.18所示的SNP位点上rs4986893的G型、如SEQ ID No.19所示的SNP位点上rs4986893的A型、如SEQID No.20所示的SNP位点上rs12248560的C型、如SEQ ID No.21所示的SNP位点上rs12248560的T型，所述1个内参片段为如SEQ ID No.22所示的β-globin内参片段；阴性(NC)对照品优选为含如SEQ ID No.22所示的β-globin内参片段的pUC57质粒。
具体的，所述的检测样本，可以为未发生溶血的抗凝全血；抗凝剂可以为肝素、枸橼酸钠、EDTA-K2、EDTA-Na2。
具体的，所述的检测样本也可以为口腔拭子或其浸出液。所述口腔拭子包括棉拭子或植绒拭子。浸出液是指将口腔拭子放置于生理盐水或者PBS缓冲液中的浸出液。例如，将新鲜采集的植绒拭子放置于20～50uL生理盐水或者PBS缓冲液中，以浸出液为检测样本进行检测。
采用本发明的试剂盒和检测样本，通过在荧光定量PCR仪上运行PCR扩增程序，分析检测结果，根据CT值区分出CYP2C19基因多态性。该荧光定量PCR仪器可以采用ABI7500系列(赛默飞世尔科技公司，麻省，美国)，LighterCycler 480(罗氏，巴塞尔，瑞士)，CFX96(美国伯乐，加州，美国)，MX3005P(安捷伦科技公司，加州，美国)。
本发明提供的试剂盒，可以检测出CYP2C19*2(681位单碱基突变G→A)和CYP2C19*3(636位单碱基突变G→A)以及CYP2C19*17(5′侧翼区806C→T)的多态性。
本发明利用具有很强抗PCR抑制剂的Taq DNA聚合酶突变体，或者是具有强PCR抑制剂耐受性的其他DNA聚合酶及突变体，提供了用微量全血或者口腔拭子样本检测CYP2C19基因多态性的方法，可以用指尖血或者口腔拭子进行检测，大大降低了对取样和样本保存的要求。
本发明中的检测试剂盒可以实现以全血或者口腔拭子样本直接用于ARMS-荧光定量PCR检测，免除了核酸提取的环节，操作简单、降低了核酸污染的可能，使整个检测的时间明显缩短。
本发明的另一方面还提供一种免提取的检测CYP2C19基因多态性的检测方法，具体步骤如下：
1)配制PCR反应试剂：从试剂盒中取出2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性(PC)对照品和阴性(NC)对照品，待平衡至室温后混匀离心，然后配制PCR反应试剂A和B。其中，PCR反应试剂A是由2×PCR反应液25μL，Oligo Mix B 1μL，DNA聚合酶1μL配置得到，然后加入样本或阳性对照品或阴性对照品，并用超纯水补至50μL后用于检测；PCR反应试剂B是由2×PCR反应液25μL，Oligo Mix B 1μL，DNA聚合酶1μL配置得到，然后加入样本或阳性对照品或阴性对照品，并用超纯水补至50μL后用于检测。
表2每人份PCR反应试剂组分表
PCR反应试剂A PCR反应试剂B
2×PCR反应液 25μL 25μL
Oligo MixA 1μL 0
Oligo MixB 0 1μL
DNA聚合酶 1μL 1μL
样本或阳性对照品或阴性对照品 1份 1份
超纯水 补至50μL 补至50μL
注：1份全血样本为1μL、1份口腔拭子浸出液为2～5μL，1份阳性对照品或阴性对照品为1μL，分别加入到A，B两管中。
2)设置荧光定量PCR的条件，运行PCR程序，步骤为：步骤1、UNG酶反应，50℃，2分钟，循环1次；步骤2、预变性，95℃，10分钟，循环1次；步骤3、扩增及检测，先95℃，10秒，然后60℃，40秒，循环40次；所述步骤3中，于60℃时收集荧光信号。
3)质量控制：
阴性对照：两个孔位的FAM、JOE、CY5通道均为阴性(CT＝40或无数值)，ROX通道均为阳性且CT值≤35。
阳性对照：两个孔位的FAM、JOE、CY5通道均为阳性，且有明显的S型扩增曲线。
4)结果解读
根据A、B两管的扩增曲线的CT值差|CTB-CTA|对CYP2C19基因多态性进判断，判断方法如下：
a)A管FAM通道有S型扩增曲线且CT≤32，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT＞32，且|CTB-CTA|＞2，则待测样本中无CYP2C19*2位点突变，为纯合野生型；
b)A、B两管FAM通道均有S型扩增曲线且CT≤32,|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*2位点突变，为杂合突变，
c)A管FAM通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，B管有S型扩增曲线且CT≤32,且|CTB-CTA|>2，则待测样本中只含CYP2C19*2位点突变，为纯合突变；
d)A管JOE通道有S型扩增曲线且CT≤32，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，且|CTB-CTA|＞2，则待测样本中无CYP2C19*3位点突变，为纯合野生；
e)A、B两管中JOE通道均有S型扩增曲线且CT≤32，且|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*3位点突变，为杂合突变；
f)A管JOE通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，B管有S型扩增曲线且≤32且|CTB-CTA|>2，则待测样本中含CYP2C19*3位点突变，为纯合突变；
g)A管CY5通道有S型扩增曲线且CT≤30，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTB-CTA|>2则待测样本中无CYP2C19*17位点突变，为纯合野生；
h)A、B两管中CY5通道均有S型扩增曲线且CT≤30，且|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*17位点突变，为杂合突变；
i)A管CY5通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，B管有S型扩增曲线且≤30，且|CTB-CTA|>2，则待测样本中含CYP2C19*17位点突变，为纯合突变。
本发明的检测方法具有检测时间短、易于进行全自动化检测，特异性强、敏感度高的特点，适合开展高通量检测。
本发明通过免提取的Taq DNA聚合酶与ARMS-荧光定量PCR技术相结合，提供一种用于检测CYP2C19基因多态性的ARMS-荧光定量PCR检测试剂盒，可以定性检测血液类样本、口腔拭子样本中人CYP2C19基因2、3、17位点的点突变。整个检测过程不涉及有毒试剂，安全便捷，操作简易，整个检测耗时短，灵敏度高、特异性强、可以应用于高通量检测。
本发明的试剂盒及检测方法真正实现微量样本直接检测，免除外周血、拭子类样本的提取环节。本发明中将微量的血液类样本、口腔拭子样本直接加入到PCR反应液中，运行PCR扩增程序即可完成CYP2C19基因多态性检测。目前市面上也有一些免提取的试剂，但需要样本的前处理步骤，需要借助核酸释放剂处理10-30分钟，再经静置或者离心才能用于下一步检测，并未实现真正的样本直接检测。
本发明的试剂盒及检测方法对检测设备及人员要求较低，安全、环保。整个检测环节不需要核酸提取设备，借助DNA聚合酶的抗抑制性能，在实时荧光PCR仪上完成样本的直接检测，整个过程中不使用有毒有害提取试剂，整个过程均闭管完成，避免核酸释放造成的污染，不外排废液。无需提取设备、耗材及提取试剂，操作人员也不需要掌握提取技能，大大降低使用者的硬件和人员能力方面的要求，适用人群更广。
本发明的试剂盒及检测方法操作简便快速，大大简化检测流程，在1.5小时内即可完成1～96个样本的PCR检测，随着样本数量增加，检测时长不会有明显延长，使检测机构的样本检测通量大幅提高。
本发明的试剂盒及检测方法特异性强，灵敏度高，低成本可以广泛应用。本发明通过免提取与ARMS-qPCR相结合，对于已知基因均可以进行检测，相比PCR-RLFP法适用范围明显扩大；检测成本明显低于固/液相芯片法，在特异性方面和一代测序有良好的一致性，灵敏度方面明显优于一代测序。
附图说明
图1为用试剂盒检测CYP2C19*2野生型样本的扩增曲线图。
图2为用试剂盒检测CYP2C19*2杂合型样本的扩增曲线图。
图3为用试剂盒检测CYP2C19*2突变型样本的扩增曲线图。
图4为用试剂盒检测CYP2C19*3野生型样本的扩增曲线图。
图5为用试剂盒检测CYP2C19*3杂合型样本的扩增曲线图。
图6为用试剂盒检测CYP2C19*3突变型样本的扩增曲线图。
图7为用试剂盒检测CYP2C19*17野生型样本的扩增曲线图。
图8为用试剂盒检测CYP2C19*17杂合型样本的扩增曲线图。
图9为用试剂盒检测CYP2C19*17突变型样本的扩增曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：8例已测序全血样本检测
1)采用本发明的试剂盒，配制11人份CYP2C19基因多态性检测试剂。
2)将8例未发生溶血的全血样本及阴、阳性对照各吸1uL分别加到A、B两孔，运行荧光定量PCR的扩增程序。
3)结果分析：如表4～表6所示
表4全血样本检测结果(CYP2C19*2位点)
表5全血样本检测结果(CYP2C19*3位点)
通道 样本名称 CT 样本名称 CT |CTB-CTA| 基因型判断
JOE A-WFL 27.31 B-WFL 26.53 0.77 杂合
JOE A-LQC 26.33 B-LQC 40.00 13.67 野生
JOE A-LL 27.36 B-LL 37.64 10.28 野生
JOE A-GCX 28.97 B-GCX 27.64 1.32 杂合
JOE A-GLJ 27.48 B-GLJ 40.00 12.52 野生
JOE A-WGZ 25.88 B-WGZ 37.95 12.07 野生
JOE A-WHM 27.36 B-WHM 35.74 8.38 野生
JOE A-LJH 26.39 B-LJH 32.75 6.36 野生
JOE A-PC 30.65 B-PC 30.89 0.24 杂合
JOE A-NC 40.00 B-NC 40.00 0.00 /
表6全血样本检测结果(CYP2C19*17位点)
通道 样本名称 CT 样本名称 CT |CTB-CTA| 基因型判断
CY5 A-WFL 27.30 B-WFL 31.02 3.72 野生
CY5 A-LQC 27.11 B-LQC 32.25 5.14 野生
CY5 A-LL 27.76 B-LL 32.73 4.97 野生
CY5 A-GCX 29.14 B-GCX 32.86 3.71 野生
CY5 A-GLJ 27.61 B-GLJ 33.71 6.09 野生
CY5 A-WGZ 26.51 B-WGZ 30.87 4.36 野生
CY5 A-WHM 27.81 B-WHM 33.46 5.65 野生
CY5 A-LJH 27.21 B-LJH 32.87 5.66 野生
CY5 A-PC 29.11 B-PC 28.81 0.30 杂合
CY5 A-NC 40.00 B-NC 40.00 0.00 /
实施例2：9例人口腔拭子样本检测
1)配制CYP2C19基因多态性检测试剂。
2)将9例口腔拭子分别浸在50uL生理盐水中，室温静置10min后用移液器吸头分别吸取浸出液2uL，阴性、阳性对照各1uL分别加到A、B两孔，运行荧光定量PCR的扩增程序。
3)结果分析：如表7～表9所示
表7口腔拭子样本检测结果(CYP2C19*2位点)
表8口腔拭子样本检测结果(CYP2C19*3位点)
通道 样本名称 CT 样本名称 CT |CTB-CTA| 基因型判断
JOE A-1 25.82 B-1 40.00 14.18 野生
JOE A-2 25.74 B-2 34.69 8.95 野生
JOE A-3 25.07 B-3 35.07 10.01 野生
JOE A-4 27.48 B-4 34.73 7.25 野生
JOE A-5 22.91 B-5 31.90 8.99 野生
JOE A-6 24.77 B-6 33.61 8.84 野生
JOE A-7 25.78 B-7 26.24 0.46 杂合
JOE A-8 24.07 B-8 33.16 9.09 野生
JOE A-9 26.77 B-9 40.00 13.23 野生
JOE A-PC 30.96 B-PC 31.14 0.18 杂合
JOE A-NC 40.00 B-NC 40.00 0.00 /
表9口腔拭子样本检测结果(CYP2C19*17位点)
通道 样本名称 CT 样本名称 CT |CTB-CTA| 基因型判断
CY5 A-1 26.13 B-1 32.60 6.48 野生
CY5 A-2 26.39 B-2 32.04 5.65 野生
CY5 A-3 25.55 B-3 31.08 5.53 野生
CY5 A-4 27.89 B-4 33.75 5.86 野生
CY5 A-5 23.29 B-5 29.39 6.10 野生
CY5 A-6 25.13 B-6 31.29 6.16 野生
CY5 A-7 25.18 B-7 31.36 6.17 野生
CY5 A-8 24.47 B-8 30.48 6.01 野生
CY5 A-9 27.03 B-9 31.99 4.96 野生
CY5 A-PC 29.45 B-PC 29.44 0.01 杂合
CY5 A-NC 40.00 B-NC 40.00 0.00 /
实施例3：特异性和灵敏度分析
特异性分析：将实施例1和2中获得的检测结果与一代测序结果进行对比分析，二者检测结果一致性达到100％，特异性达100％。
表10全血及口腔拭子样本荧光定量PCR与测序结果对比
注:W表示野生型,H表示杂合型,M表示突变型
灵敏度分析：将含有1％突变型的质粒与野生型质粒按照拷贝数进行倍比稀释后，经qPCR检测直至检测不到信号，该试剂盒能够稳定检测出5.0E+06copies/mL野生型质粒中1％的突变型质粒。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海芯超生物科技有限公司
<120> 免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒及检测方法
<130> CPC-NP-18-101077
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 1
tcccactatc attgattatt tccca 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 2
cccactatca ttgattattt cgcg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 3
tacgcaagca gtcacataac t 21
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 探针
<400> 4
agaacaccaa gaatcgatgg acatcaacaa c 31
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 5
gattgtaagc accccccga 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 6
gattgtaagc acccccagg 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 7
agaactttgc catcttttcc ag 22
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 探针
<400> 8
ccaggtaagg ccaagttttt tgcttcct 28
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 9
tttgtgtctt ctgttctcaa tgt 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 10
ttgtgtcttc tgttctcaat gc 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 11
acacgtgaag gcaggaattg 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 探针
<400> 12
tgtaagagat aatgcgccac gatgggc 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 13
acccagaggt tctttgagtc ctt 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 14
aggcaccgag cactttcttg 20
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 探针
<400> 15
tccactcctg atgctgttat gggcaac 27
<210> 16
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatttcccca tcaagatata caatatattt tatttatatt tatagtttta aattacaacc 60
agagcttggc atattgtatc tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat aaattattgt 120
tttctcttag atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccgg gaacccataa 180
caaattactt aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag taaaagaaca 240
ccaagaatcg atggacatca acaaccctcg ggactttatt gattgcttcc tgatcaaaat 300
ggagaaggta aaatgttaac aaaagcttag ttatgtgact gcttgcgtat ttgtgattca 360
ttgactagtt ttgtgtttac tacggatgtt taacaggtca aggagtaatg cttgagaagc 420
atatttaagt ttttattgta tgcatgaata tccagtaagc atcatagaaa atgtaaaatt 480
aaattgttaa ataattagaa 500
<210> 17
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aatttcccca tcaagatata caatatattt tatttatatt tatagtttta aattacaacc 60
agagcttggc atattgtatc tataccttta ttaaatgctt ttaatttaat aaattattgt 120
tttctcttag atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccag gaacccataa 180
caaattactt aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag taaaagaaca 240
ccaagaatcg atggacatca acaaccctcg ggactttatt gattgcttcc tgatcaaaat 300
ggagaaggta aaatgttaac aaaagcttag ttatgtgact gcttgcgtat ttgtgattca 360
ttgactagtt ttgtgtttac tacggatgtt taacaggtca aggagtaatg cttgagaagc 420
atatttaagt ttttattgta tgcatgaata tccagtaagc atcatagaaa atgtaaaatt 480
aaattgttaa ataattagaa 500
<210> 18
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aatttctaaa ctattattat ctgttaacaa atatgaagtg ttttatatct aatgtttact 60
catattttaa aattgtttcc aatcatttag cttcaccctg tgatcccact ttcatcctgg 120
gctgtgctcc ctgcaatgtg atctgctcca ttattttcca gaaacgtttc gattataaag 180
atcagcaatt tcttaacttg atggaaaaat tgaatgaaaa catcaggatt gtaagcaccc 240
cctggatcca ggtaaggcca agttttttgc ttcctgagaa accacttaca gtcttttttt 300
ctgggaaatc caaaattcta tattgaccaa gccctgaagt acatttttga atactacagt 360
cttgcctaga cagccatggg gtgaatatct ggaaaagatg gcaaagttct ttattttatg 420
cacaggaaat gaatatccca atatagatca ggcttctaag cccattagct ccctgatcag 480
tgttttttcc actaaactcc 500
<210> 19
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aatttctaaa ctattattat ctgttaacaa atatgaagtg ttttatatct aatgtttact 60
catattttaa aattgtttcc aatcatttag cttcaccctg tgatcccact ttcatcctgg 120
gctgtgctcc ctgcaatgtg atctgctcca ttattttcca gaaacgtttc gattataaag 180
atcagcaatt tcttaacttg atggaaaaat tgaatgaaaa catcaggatt gtaagcaccc 240
cctgaatcca ggtaaggcca agttttttgc ttcctgagaa accacttaca gtcttttttt 300
ctgggaaatc caaaattcta tattgaccaa gccctgaagt acatttttga atactacagt 360
cttgcctaga cagccatggg gtgaatatct ggaaaagatg gcaaagttct ttattttatg 420
cacaggaaat gaatatccca atatagatca ggcttctaag cccattagct ccctgatcag 480
tgttttttcc actaaactcc 500
<210> 20
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tctatttaat gtgaagcctg ttttatgaac aggatgaatg tggtatatat tcagaataac 60
taatgtttgg aagttgtttt gttttgctaa aacaaagttt tagcaaacga tttttttttt 120
caaatttgtg tcttctgttc tcaaagcatc tctgatgtaa gagataatgc gccacgatgg 180
gcatcagaag acctcagctc aaatcccagt tctgccagct atgagctgtg tggcaccaac 240
aggtgtcctg ttctcccagg gtctcccttt tcccatttga aatataaaaa ataacaattc 300
ctgccttcac gtgttttttt agggggttaa atggtaaagg tgtttatatc tgctaaggta 360
atttacttga tatatgtttg gttattgaag atatatgagt tatgttagct atttcatgtt 420
taggctgctg tatttttagt aggctatatt aaatagagga tttcattata aaggacaaag 480
tctcctaatc ttcgatatag 500
<210> 21
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tctatttaat gtgaagcctg ttttatgaac aggatgaatg tggtatatat tcagaataac 60
taatgtttgg aagttgtttt gttttgctaa aacaaagttt tagcaaacga tttttttttt 120
caaatttgtg tcttctgttc tcaaagtatc tctgatgtaa gagataatgc gccacgatgg 180
gcatcagaag acctcagctc aaatcccagt tctgccagct atgagctgtg tggcaccaac 240
aggtgtcctg ttctcccagg gtctcccttt tcccatttga aatataaaaa ataacaattc 300
ctgccttcac gtgttttttt agggggttaa atggtaaagg tgtttatatc tgctaaggta 360
atttacttga tatatgtttg gttattgaag atatatgagt tatgttagct atttcatgtt 420
taggctgctg tatttttagt aggctatatt aaatagagga tttcattata aaggacaaag 480
tctcctaatc ttcgatatag 500
<210> 22
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cctattggtc tattttccca cccttaggct gctggtggtc tacccttgga cccagaggtt 60
ctttgagtcc tttggggatc tgtccactcc tgatgctgtt atgggcaacc ctaaggtgaa 120
ggctcatggc aagaaagtgc tcggtgcctt tagtgatggc ctggctcacc tggacaacct 180
caagggcacc tttgccacac 200

Claims (8)

1.一种免提取的用于CYP2C19基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；其中，
所述Oligo Mix A含有：
rs4244285G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.1所示；rs4244285G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；
rs4986893G型基因正向引物，序列如SEQ ID No.5所示；rs4986893G型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；
rs12248560C型基因正向引物，序列如SEQ ID No.9所示；rs12248560C型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；
Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；
PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ ID No.14所示；
所述Oligo Mix B含有：
rs4244285A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.2所示；rs4244285A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.3所示；
rs4986893A型基因正向引物，序列如SEQ ID No.6所示；rs4986893A型基因反向引物，序列如SEQ ID No.7所示；
rs12248560T型基因正向引物，序列如SEQ ID No.10所示；rs12248560T型基因反向引物，序列如SEQ ID No.11所示；
Taqman探针，序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15所示；
PCR上游通用引物，序列如SEQ ID No.13所示；PCR下游通用引物，序列如SEQ ID No.14所示；
所述DNA聚合酶选自Taq酶、Phusion聚合酶、Phire聚合酶、Tth聚合酶及其它们的突变体中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，如SEQ ID No.4所示的Taqman探针是FAM通道通用Taqman探针，如SEQ ID No.8所示的Taqman探针是JOE通道通用Taqman探针，如SEQID No.12所示的Taqman探针是CY5通道通用Taqman探针，如SEQ ID No.15所示的Taqman探针是内参ROX通道通用Taqman探针。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在FAM通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.4所示Taqman探针、如SEQ ID No.3所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的正向引物；
在JOE通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.8所示Taqman探针、如SEQID No.7所示的反向引物和rs4986893Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4986893Arms引物为如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的正向引物；
在CY5通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.12所示Taqman探针、如SEQID No.11所示的反向引物和rs4244285Arms引物，三者的终浓度分别为0.05～0.2μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM；所述rs4244285Arms引物为如SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的正向引物；
在ROX通道中参与检测反应的引物探针组合为如SEQ ID No.15所示Taqman探针、如SEQID No.14所示的PCR下游通用引物和如SEQ ID No.13所示PCR上游通用引物，三者的浓度分别为0.05～0.1μM、0.1～0.5μM和0.1～0.5μM。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为分别包含6个SNP位点和1个内参片段的7个pUC57质粒的混合物；其中，所述6个SNP位点分别为如SEQ ID No.16所示的SNP位点上rs4244285的G型、如SEQ ID No.17所示的SNP位点上rs4244285的A型、如SEQID No.18所示的SNP位点上rs4986893的G型、如SEQ ID No.19所示的SNP位点上rs4986893的A型、如SEQ ID No.20所示的SNP位点上rs12248560的C型、如SEQ ID No.21所示的SNP位点上rs12248560的T型，所述1个内参片段为如SEQ ID No.22所示的β-globin内参片段。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为含如SEQ ID No.22所示的β-globin内参片段的pUC57质粒。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒直接检测的样本为未发生溶血的抗凝全血。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒直接检测的样本为口腔拭子或其浸出液。
8.一种免提取的检测CYP2C19基因多态性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制PCR反应试剂：从权利要求1所述的试剂盒中取出2×PCR反应液、Oligo Mix A、Oligo Mix B、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品，待平衡至室温后混匀离心，然后配制PCR反应试剂A和B；其中，PCR反应试剂A是由2×PCR反应液25μL，Oligo Mix B 1μL，DNA聚合酶1μL配置得到，然后加入样本或阳性对照品或阴性对照品，并用超纯水补至50μL；PCR反应试剂B是由2×PCR反应液25μL，Oligo Mix B 1μL，DNA聚合酶1μL配置得到，然后加入样本或阳性对照品或阴性对照品，并用超纯水补至50μL；
2)设置荧光定量PCR的条件，运行PCR程序，步骤为：
步骤1、UNG酶反应，50℃，2分钟，循环1次；
步骤2、预变性，95℃，10分钟，循环1次；
步骤3、扩增及检测，先95℃，10秒，然后60℃，40秒，循环40次；
所述步骤3中，于60℃时收集荧光信号；
3)质量控制：
阴性对照：两个孔位的FAM、JOE、CY5通道均为阴性(CT＝40或无数值)，ROX通道均为阳性且CT值≤35；
阳性对照：两个孔位的FAM、JOE、CY5通道均为阳性，且有明显的S型扩增曲线；
4)结果解读：
根据A、B两管的扩增曲线的CT值差|CTB-CTA|对CYP2C19基因多态性进判断，判断方法如下：
a)A管FAM通道有S型扩增曲线且CT≤32，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT＞32，且|CTB-CTA|＞2，则待测样本中无CYP2C19*2位点突变，为纯合野生型；
b)A、B两管FAM通道均有S型扩增曲线且CT≤32,|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*2位点突变，为杂合突变；
c)A管FAM通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，B管有S型扩增曲线且CT≤32,且|CTB-CTA|>2，则待测样本中只含CYP2C19*2位点突变，为纯合突变；
d)A管JOE通道有S型扩增曲线且CT≤32，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，且|CTB-CTA|＞2，则待测样本中无CYP2C19*3位点突变，为纯合野生；
e)A、B两管中JOE通道均有S型扩增曲线且CT≤32，且|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*3位点突变，为杂合突变；
f)A管JOE通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>32，B管有S型扩增曲线且≤32且|CTB-CTA|>2，则待测样本中含CYP2C19*3位点突变，为纯合突变；
g)A管CY5通道有S型扩增曲线且CT≤30，B管无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTB-CTA|>2则待测样本中无CYP2C19*17位点突变，为纯合野生；
h)A、B两管中CY5通道均有S型扩增曲线且CT≤30，且|CTB-CTA|≤2，则待测样本中含CYP2C19*17位点突变，为杂合突变；
i)A管CY5通道无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，B管有S型扩增曲线且≤30，且|CTB-CTA|>2，则待测样本中含CYP2C19*17位点突变，为纯合突变。
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