CN109913540A - 一种检测cyp3a多态性位点的试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测CYP3A多态性位点的试剂盒及其用途。具体地，本发明提供了一种检测CYP3A4和CYP3A5基因多态性位点的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.:9‑10所示的引物对和SEQ ID NO.:21‑22所示的探针；和/或SEQ ID NO.:11‑12所示的引物对和SEQ ID NO.:23‑24所示的探针。本发明能高特异性、高灵敏度、非常快速地检测CYP3A多态性位点，可有效地指导芬太尼类等药物的用药。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地涉及一种检测CYP3A多态性的试剂盒及其用途。
背景技术
芬太尼类药物为人工合成的强效麻醉性镇痛药，为临床主要的麻醉用药，但药物剂量一旦过量，会导致呼吸抑制甚至死亡的危险。通过检测芬太尼类药物的主要代谢基因CYP3A4/CYP3A5的基因多态性位点，来判断患者对芬太尼类药物的代谢能力，从而指导药物的使用剂量。
CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员，占P450酶系总量的30％～40％，主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢，可代谢约50％的临床常用药物。研究表明，人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异，并且这种差异90％与遗传多态性有关。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性(SNP)，其等位基因频率在亚洲和南非人群中超过20％。研究表明CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。
CYP3A5是CYP3A亚家族中主要的肝外表达形式，在肺、肾、乳腺、前列腺以及多形核白细胞中显现出比CYP3A4基因更高的表达水平，却与CYP3A4基因拥有相似的编码氨基酸序列、相似的作用底物及相同的调控途径。
目前很多药物通过P450家族的酶代谢，测定P450基因型，确定酶活很关键。但是CYP3A4、CYP3A5基因的几个关键位点，由于序列结构特殊，设计荧光探针难度大，且设计出来的探针对于基因型的分辨率不好，与之匹配的PCR引物要求高，引物本身或者上下游引物之间存在二级结构，或者引物和DNA模板的结合效率低，上下游引物之间的DNA模板序列存在高GC等特殊结构，导致PCR效率低下。市场上销售的分型产品，只有全球最大的生物公司Life Technology(Thermal Fisher子公司)提供，其序列与配方全部保密。目前现有的检测方法及产品效果均不佳。
综上所述，本领域迫切需要开发操作简便、准确率高、高效地检测CYP3A多态性位点的试剂盒和方法，以弥补国内CYP3A基因检测方面的不足。
发明内容
本发明的目的就是提供一种操作简便、准确率高、高效地检测CYP3A多态性位点的试剂盒和方法。
在本发明的第一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有第一试剂和/或第二试剂，其中，
(1)所述第一试剂包括：
针对CYP3A4基因的第一引物对、第一探针和第二探针；
其中，所述第一引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:9所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:10所示，
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.:21所示，和
所述第二探针的序列如SEQ ID NO.:22所示；
(2)所述第二试剂包括：
针对CYP3A5基因的第二引物对、第三探针和第四探针；
其中，所述第二引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:11所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:12所示，
所述第三探针的序列如SEQ ID NO.:23所示，和
所述第四探针的序列如SEQ ID NO.:24所示。
在另一优选例中，所述的CYP3A4和/或CYP3A5基因来源于哺乳动物，较佳地，来源于小鼠、大鼠、或人。
在另一优选例中，所述各探针独立地为经过或未经过化学基团修饰的。
在另一优选例中，所述各探针的双末端独立地修饰有化学基团，其中一端修饰有荧光基团，另一端修饰有淬灭基团。
在另一优选例中，所述各探针的5’端独立地修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
在另一优选例中，所述各探针独立地修饰有选自下组的荧光基团：FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX、TAMRA、或NED，较佳地为FAM或VIC。
在另一优选例中，所述各探针独立地修饰有选自下组的淬灭基团：MGB、TAMRA、Eclipse、BHO1、BHO2、或Dabcy1，较佳地为MGB。
在另一优选例中，所述各探针的5’端独立地修饰有荧光基团FAM或VIC，3’端独立地修饰有淬灭基团MGB。
在另一优选例中，所述各探针独立地可以和CYP3A4和/或CYP3A5基因的核酸序列特异性结合。
在另一优选例中，所述第一引物对的浓度为50-900nM，优选为50-300nM。
在另一优选例中，所述第一和第二探针的浓度各自独立地为50-500nM，优选为50-250nM。
在另一优选例中，所述第二引物对的浓度为50-900nM，优选为50-300nM。
在另一优选例中，所述第三和第四探针的浓度各自独立地为50-500nM，优选为50-250nM。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括容器，所述各引物对及各探针位于所述容器中。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
第一容器，以及位于所述第一容器中的第一引物对、第一探针和第二探针；
第二容器，以及位于所述第二容器中的第二引物对、第三探针和第四探针。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器为同一容器；并且所述的第一、二引物对和第一、第二、第三、第四探针被混合在一起。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括(a)用于扩增的试剂，包括mastermix、水等；和(b)用于检测的试剂，如荧光染料。
在另一优选例中，所述试剂盒用于检测CYP3A多态性位点。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中记载了利用本发明第一方面所述的第一试剂和/或第二试剂对CYP3A多态性位点的检测方法。
在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒的用途，所述试剂盒用于
(a)检测CYP3A多态性位点；和/或
(b)检测待测对象对选自下组的药物的代谢能力：阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼类、或其组合。
在另一优选例中，所述芬太尼类药物选自下组：芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼、或阿芬太尼。
在另一优选例中，所述CYP3A多态性位点为CYP3A4基因和/或CYP3A5基因的多态性位点。
在另一优选例中，所述CYP3A4基因的多态性位点为CYP3A4*1G：rs2242480基因位点。
在另一优选例中，所述CYP3A5基因的多态性位点为CYP3A5*3：rs776746基因位点。
在另一优选例中，所述待测对象为哺乳动物。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。
在另一优选例中，所述检测是非诊断性、非治疗性的。
在本发明的第三方面，提供了一种核酸扩增体系，所述体系包括：(a)用于扩增的缓冲体系以及(b)位于所述体系中的第一试剂和/或第二试剂，其中所述第一试剂、第二试剂如本发明第一方面中定义的。
在本发明的第四方面，提供了一种实时荧光PCR方法，所述方法包括步骤：
(a)利用本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第三方面所述的扩增体系，对待测样本进行实时荧光PCR。
在另一优选例中，所述实时荧光定量PCR中，退火温度为58-62℃。
在另一优选例中，所述实时荧光定量PCR的扩增产物长度为150-300bp。
在另一优选例中，所述的待测样本选自下组：血液样本、唾液样本、口腔拭子、或其组合。
在另一优选例中，所述的待测样本来源于：人和非人哺乳动物，较佳地啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。
在本发明的第五方面，提供了一种检测CYP3A多态性位点的方法，所述方法包括步骤：
(a)利用本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第三方面所述的扩增体系，扩增待测样本的多核苷酸，得到扩增产物；和
(b)检测所述扩增产物的荧光，从而获得定量或定性的检测结果。
在另一优选例中，所述CYP3A多态性位点为CYP3A4*1G：rs2242480基因位点和/或CYP3A5*3：rs776746基因位点。
在另一优选例中，所述的待测样本选自下组：血液样本、唾液样本、口腔拭子、或其组合。
在另一优选例中，所述的待测样本来源于：人和非人哺乳动物，较佳地啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性、非治疗性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在本发明的第六方面，提供了一种检测对芬太尼类药物的代谢能力的方法，所述方法包括步骤：
a)提供一来自待测对象的待测样本，所述的待测样本选自下组：血液样本、唾液样本、口腔拭子、或其组合；
(b)利用本发明第一方面所述的试剂盒或本发明第三方面所述的扩增体系，检测所述待测样本的选自下组的基因位点，并与对应的正常基因位点相比较：
CYP3A4*1G：rs2242480；和/或CYP3A5*3：rs776746；
存在差异就表明该待测对象对芬太尼类药物的代谢能力低于正常人群。
在另一优选例中，所述的待测对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，如果所述待测对象的CYP3A4：rs2242480基因位点由G突变为A，则说明该对象对所述芬太尼类药物的代谢能力减弱。
在另一优选例中，如果所述待测对象的CYP3A5：rs776746基因位点由A突变为G，则说明该对象对所述芬太尼类药物的代谢能力减弱。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在本发明的第七方面，提供了一种检测试剂，所述检测试剂含有第一试剂和/或第二试剂，其中，
(1)所述第一试剂包括：
针对CYP3A4基因的第一引物对、第一探针和第二探针；
其中，所述第一引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:9所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:10所示，
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.:21所示，和
所述第二探针的序列如SEQ ID NO.:22所示；
(2)所述第二试剂包括：
针对CYP3A5基因的第二引物对、第三探针和第四探针；
其中，所述第二引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:11所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:12所示，
所述第三探针的序列如SEQ ID NO.:23所示，和
所述第四探针的序列如SEQ ID NO.:24所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明试剂盒检测样品的CYP3A4基因PCR扩增曲线。其中图1A为野生纯合型CYP3A4*1/*1时的荧光扩增曲线，图1B为突变纯合型CYP3A4*1G/*1G时的荧光扩增曲线，图1C为杂合型CYP3A4*1/*1G时的荧光扩增曲线。
图2显示了对照例1的引物和探针检测样品的CYP3A4基因PCR扩增曲线。其中图2A为野生纯合型CYP3A4*1/*1时的荧光扩增曲线，图2B为突变纯合型CYP3A4*1G/*1G时的荧光扩增曲线。
图3显示了对照例2的引物和探针检测样品的CYP3A4基因PCR扩增曲线。其中图3A为野生纯合型CYP3A4*1/*1时的荧光扩增曲线，图3B为突变纯合型CYP3A4*1G/*1G时的荧光扩增曲线，图3C为杂合型CYP3A4*1/*1G时的荧光扩增曲线。
图4显示了本发明试剂盒检测样品的CYP3A5基因PCR扩增曲线。其中图4A为野生纯合型CYP3A5*1/*1时的荧光扩增曲线，图4B为突变纯合型CYP3A5*3/*3时的荧光扩增曲线，图4C为杂合型CYP3A5*1/*3时的荧光扩增曲线。
图5显示了对照例1的引物和探针检测样品的CYP3A5基因PCR扩增曲线。其中图5A为野生纯合型CYP3A5*1/*1时的荧光扩增曲线，图5B为突变纯合型CYP3A5*3/*3时的荧光扩增曲线。
图6显示了对照例2的引物和探针检测样品的CYP3A5基因PCR扩增曲线。其中图6A为野生纯合型CYP3A5*1/*1时的荧光扩增曲线，图6B为突变纯合型CYP3A5*3/*3时的荧光扩增曲线，图6C为杂合型CYP3A5*1/*3时的荧光扩增曲线。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，筛选了大量CYP3A基因的引物和探针，首次意外地发现一种用于检测CYP3A基因多态性位点的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途。具体地，本发明提供了针对CYP3A4基因和CYP3A5基因的上、下游引物和特异性荧光探针。本发明的试剂盒可以快速简便地检测CYP3A基因多态性位点，特异性非常强、灵敏度很高、扩增效率非常高、稳定性好，具有非常好的重现性。本发明的试剂盒可以通过检测CYP3A基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。
细胞色素P450
细胞色素P450(cytochromeP450，CYP)，为超家族氧化酶酶，广泛分布于各种生命形式，从低等细菌到高等动植物，是多功能氧化酶的重要组成成分，存在于多组织细胞的微粒体中，在人体内该酶主要存在于肝脏组织内。P450活性决定药物的代谢速率及体内清除，因而又称为药物代谢酶。P450家族参与代谢的药物占市场上销售药物的80％以上，一旦该酶的功能发生改变，会影响药物的代谢和疗效。在药物的不良反应研究中，大约48％与P450酶基因的多态性密切相关。P450遗传多态性是引起P450酶缺失，表达量下降或增高，底物特异性改变的主要原因，最终引起药物代谢动力学改变，导致不同个体对同一药物产生不同药物应答。
P450酶系的基因主要有CYP1、CYP2和CYP3三个家族，其中CYP3A亚家族成员最丰富，也是最重要的药物代谢酶。其中CYP3A4、CYP3A5参与了约50％常用药物在人体内的代谢。
CYP3A4
CYP3A4基因位于人类第7号染色体，全长约27kb，有13个外显子。CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员，占P450酶系总量的30％-40％，主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢，可代谢约50％的临床常用药物。研究表明，人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异，并且这种差异90％与遗传多态性有关。
CYP3A4野生型定义为CYP3A4*1，目前已发现的SNP位点有40个，其中CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性(SNP)，其等位基因频率在亚洲和南非人群中超过20％。研究表明CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。本发明试剂盒用于检测CYP3A4*1G的多态性。CYP3A4*1G(20230G＞A)的SNP ID为rs2242480，即基于SEQ ID NO.:25所示的核苷酸序列第501位C→T(反向序列)。
AGGCTATGACCACTAGCATCAAATAACATATGAGAAAGTGATTGTTACCTTTCAAAAAAAAAAGTCACATGTCTGTAACCAAGAAAATAAAAAGAGATAAAAAGAGCAAATTCCTGTGTCCATATGTGGATACAGCTAAGGGGACATCACACACCACTATGGTGCCTGCTGCAAACATGTAATTCACAACCAAAACCAATGTGAAATGAGTGTGAGCAACAAATGCTTATTGTTAGATGCCACTGAGGTTTTTGGAGGTTTTTTACTTAGCATTATTGTAGTAATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCCAGCACGTTTTACAAAGATCTTACGCTTCTGCCAGTAGCAACCATTTGCTATGTTTCTTTCTTTTTCTTTTCAGAGCCTTCCTACATAGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGATTATGCTTTTTATAAAAATTCTCCTGGGAAGTGGTGAGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTCACCTCCTCCCTCCTTCTCCATGTA
Y
CATCCACTCACCTTATTGGGTAAAACTGCATCAATTTCCTCCTGCAGTTTCTGCTGGACATCAGGGTGAGTGGCCAGTTCATACATAATGAAGGAGAGAACACTGCTCGTGGTTTCATAGCCAGCAAAAATAAAGATAATTGATTGGGCCACGAGCTCCAGATCGGACAGAGCTGAAAGGAGAGGAAAGACATTTTAGGTAAATCAGATCAATGTAGGGCATCACAGTTTAGATGAAGAGAAATCTAAGTGAAGCCCTCAAATCCCTAAGGGAAAAGAATAGAAAAGCAATTCAGAGGTACACTGGGGGTGGTTTCATTCTGATGTGTATCTTACAGAACCAGAATAAGGCAAATCATTTTAATCCAGTTTTCCCCAAGGTCTTCGAGAATGTGGGCCATCCACTCCTCCTCATGCCACCCCCGCCACCTGCACAGCTGTGTAATTTCCAGAGAGAGCATTTCCGCATAACATACTCAGTGTTATGGGTGTGTTCCTTGA(SEQIDNO.:25)
CYP3A5
CYP3A5基因位于人类第7号染色体，全长31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸。它是CYP3A亚家族中主要的肝外表达形式，在肺、肾、乳腺、前列腺以及多形核白细胞中显现出比CYP3A4基因更高的表达水平，却与CYP3A4基因拥有相似的编码氨基酸序列、相似的作用底物及相同的调控途径。CYP3A5的表达呈高度多态性，不同种族人群中CYP3A5酶活性可相差10-40倍。
CYP3A5野生型定义为CYP3A5*1，其SNP位点包括位于编码区的位点CYP3A5*2、*4、*6、*7、*8、*9和*10；位于非编码区的位点CYP3A5*3和*5。其中CYP3A5*3是导致个体间CYP3A5蛋白差异表达的主要原因。本发明试剂盒用于检测CYP3A5*3多态性。CYP3A5*3(6986A/G)的SNP ID为rs776746，即基于SEQ IDNO.:26所示的核苷酸序列第390位A→G。
GAAGCAAGTGGGAGAAAGCTTTGCCTCTTTGTACTTCTTCATCTTCTCCCCTCAAGTCCTCAGAATCCACAGCGCTGACTGTGGAGTGCTGTGGAGCTGGCATGGCCCATACAGGCAACATGACTTAGTAGACAGATGACACAGCTCTAGATGTCCATGGGCCCCACACCAACTGCCCTTGCAGCATTTAGTCCTTGTGAGCACTTGATGATTTACCTGCCTTCAATTTTTCACTGACCTAATATTCTTTTTGATAATGAAGTATTTTAAACATATAAAACATTATGGAGAGTGGCATAGGAGATACCCACGTATGTACCACCCAGCTTAACGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCTCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTGGACCACATTACCCTTCATCATATGAAGCCTTGGGTGGCTCCTGTGTGAGACTCTTGCTGTGTGTCACACCCTAATGAACTAGAACCTAAGGTTGCTGTGTGTCGTACAACTAGGGGTATGGATTACATAACATAATGATCAAAGTCTGGCTTCCTGGGTGTGGCTC(SEQ ID NO.:26)
引物
如本文所用，术语“引物”、“特异性引物”、“本发明引物对”是指这样的引物(对)，其扩增出的扩增产物具有CYP3A4和/或CYP3A5基因的互补链序列。
本文涉及的引物序列见下表1，其中本发明所述的引物对序列如SEQ ID NO.:9-12所示。其中，SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物对能够高效地检测CYP3A4的多态性位点，SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示的引物对能够高效地检测CYP3A5的多态性位点。
表1引物序列表
| 引物名 | 引物序列 | SEQ ID NO.: |
| CYP3A4-1F | 5’-AGCCTTCCTACATAGAGTCA-3’ | 1 |
| CYP3A4-1R | 5’-AACTGCAGGAGGAAATTG-3’ | 2 |
| CYP3A5-1F | 5’-CAGCTTAACGAATGCTCTAC-3’ | 3 |
| CYP3A5-1R | 5’-CACAGCAACCTTAGGTTCT-3’ | 4 |
| CYP3A4-2F | 5’-CAGAGCCTTCCTACATAGAG-3’ | 5 |
| CYP3A4-2R | 5’-GGCCCAATCAATTATCTTTA-3’ | 6 |
| CYP3A5-2F | 5’-AGAGTGGCATAGGAGATACC-3’ | 7 |
| CYP3A5-2R | 5’-GTGTGACACACAGCAAGAGT-3’ | 8 |
| CYP3A4-3F | 5’-CTTACGCTTCTGCCAGTAG-3’ | 9 |
| CYP3A4-3R | 5’-TATGTATGAACTGGCCACTC-3’ | 10 |
| CYP3A5-3F | 5’-GAGAGTGGCATAGGAGATAC-3’ | 11 |
| CYP3A5-3R | 5’-AAGCCAGACTTTGATCATTA-3’ | 12 |
探针
如本文所用，“探针”和“特异性探针”可互换使用，是一种寡核苷酸序列，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，但不结合于其他无关的扩增产物的探针。本发明的特异性探针带有可检测标记。所述的可检测标记的例子包括(但并不限于)：荧光基团、淬灭基团。探针5’端一般连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，呈现一种S型曲线。
在另一优选例中，本发明探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
在另一优选例中，本发明探针具有选自下组的荧光基团：FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX、TAMRA、或NED。
在另一优选例中，本发明探针具有选自下组的淬灭基团：MGB、TAMRA、或Eclipse、BHO1、BHO2、或Dabcy1。
在另一优选例中，本发明探针的5’端标记有荧光基团FAM或VIC，3’端标记有淬灭基团MGB。
本文涉及的探针序列见下表2，其中本发明所述的特异性探针序列如SEQ ID NO.:21-24所示。
表2探针序列表
试剂盒
本发明提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒，可用于检测CYP3A基因多态性位点。本发明的试剂盒包括：容器以及位于所述容器内的本发明上述的引物对及探针。此外，本发明的试剂盒还可含有以下任选组分：PCR扩增试剂、核酸探针微球集、PCR检测试剂等。本发明的试剂盒可高效、灵敏、准确地检测CYP3A基因多态性位点。
本发明试剂盒中探针和引物的浓度没有特别限制，可以由本领域技术人员根据所需的扩增效率进行决定。优选地，本发明CYP3A4基因特异性引物的浓度为50-900nM，优选为50-300nM；本发明CYP3A4基因特异性探针的浓度为50-500nM，优选为50-250nM。优选地，本发明CYP3A5基因特异性引物的浓度为50-900nM，优选为50-300nM；本发明CYP3A5基因特异性探针的浓度为50-500nM，优选为50-250nM。
本发明的应用
本发明提供的试剂盒和检测方法可用于检测CYP3A基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药。通过检测CYP3A4和CYP3A5基因多态性位点，提供CYP3A4和CYP3A5基因组合用药剂量梯度分级(表3)，剂量由少到多分级为I-IV级(即I级用量最少，IV级用量最多)，实际用药量以实际临床为准。例如，达到相同镇痛效果时，*1G/*1G组患者消耗的PCIA舒芬太尼量为(49.8±10.2)μg，与*1/*1组(64.6±10.9)μg和*1/*1G组(62.5±12.7)μg相比均减少(P＜0.01)。
表3CYP3A4和CYP3A5基因与芬太尼的用药剂量
本发明的主要优点
本发明的试剂盒可以快速简便地检测CYP3A基因多态性位点，特异性非常强、灵敏度很高、扩增效率非常高、稳定性好，具有非常好的重现性。
本发明设计并筛选了大量引物和探针的组合后发现，当采用本发明引物和探针能够高效、高特异性、非常迅速地检测CYP3A基因多态性位点，灵敏度高，且其检测获得的荧光信号准确无干扰。将其应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高，更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1样本的收集
样本收集前30分钟，病人使用清水漱口，30分钟内不应进食，饮水。
1.打开口腔拭子包装，小心取出拭子，拭子头部在口腔内壁来回摩擦20-30次。
2.打开唾液保存管将拭子头部在保存管中折断，盖上保存管盖，完成样本收集。
实施例2DNA抽提
DNA抽提使用默禾医疗科技(上海)有限公司的唾液DNA提取试剂盒(磁珠法)进行提取。
1.收集好的样本置于恒温震荡混匀仪上，选择参数56℃，15min，800rpm/min。进行唾液样本前处理。
2.打开试剂盒，取出排管，上下摇晃6-10次，使排管⑦孔的磁珠混匀后，小心撕去封口膜；
3.在第①孔内加入300uL处理后唾液样本后，在第⑨孔内加入100ul Elutionbuffer,将排管放置至CTC-2000核酸提取仪抽屉，装上磁棒套。选择saliva DNA程序运行即可。
4.程序结束后于⑨孔收集提取后的DNA，进行后续实验或-20℃保存。
实施例3荧光PCR检测
3.1CYP3A4基因的检测
1.戴上手套，从试剂盒中取出CYP3A4 2×Master Mix、PCR H2O和八联管，短暂离心。
2.在CYP3A4 2×Master Mix管中分别加入165μL PCR H2O，充分混匀后离心。将八联管的盖子小心打开，盖子倒放在桌面上。
3.将混合好的CYP3A4 2×Master Mix分装到八联管中，每管分装8μL(分装到不同小管时须换枪头，因为每个八联管中已经加有引物和探针)；
4.在八联管中，分别加入1μL待检测的样本DNA。
5.将盖子按顺序盖上，一定要将盖子盖紧(防止PCR过程中蒸发)，然后离心数秒。
6.打开荧光定量PCR仪，将加好的八联管放置到荧光定量PCR仪上。
反应条件为：95℃10分钟→[95℃15秒、60℃1分钟]共40个循环。
反应体系(10μL)如下：
其中TaqMan荧光定量2×Master Mix(1mL)的组成如下表4所示：
表4TaqMan荧光定量2×Master Mix(1mL)
| 组分 | 2×浓度 |
| Tris-HCl(pH8.5) | 40mM |
| KCl | 40mM |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 10mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 5mM |
| dNTP | 0.4mM |
| Taq酶 | 0.7U |
| 甘油 | 12％ |
引物序列如下：
CYP3A4-3F：CTTACGCTTCTGCCAGTAG(SEQ ID NO.:9)
CYP3A4-3R：TATGTATGAACTGGCCACTC(SEQ ID NO.:10)
探针序列如下：
CYP3A4-5：5’FAM-TCTCCATGTACCATCCACTC-3’MGB(SEQ ID NO.:21)
CYP3A4-6：5’VIC-TCTCCATGTATCATCCACTC-3’MGB(SEQ ID NO.:22)
PCR扩增曲线如图1所示。结果表明，本发明经优化的第一试剂能够非常快速(约20个循环即可检测出)、灵敏和准确地区分CYP3A4的三种等位基因型。
(a)当样本为野生纯合型CYP3A4*1/*1时，只存在FAM荧光的扩增曲线而没有VIC荧光的扩增曲线(图1A)；
(b)当样本为突变纯合型CYP3A4*1G/*1G时，只存在VIC荧光的扩增曲线而没有FAM荧光的扩增曲线(图1B)；
(c)当样本为杂合型CYP3A4*1/*1G时，两种荧光都有扩增曲线(图1C)。
从图1中可以看出，基于本发明经优化的第一试剂的PCR的扩增效率非常高、灵敏度很高、特异性非常好。
3.2CYP3A5的检测
实验方法同实施例3.1，区别在于引物序列如SEQ ID NO.:11和12所示，探针序列如SEQ ID NO.:23和24所示，PCR反应体系中的2×Master Mix如表5所示。
引物序列如下：
CYP3A5-3F：GAGAGTGGCATAGGAGATAC(SEQ ID NO.:11)
CYP3A5-3R：AAGCCAGACTTTGATCATTA(SEQ ID NO.:12)
探针序列如下：
CYP3A5-5：5’FAM-TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3’MGB(SEQ ID NO.:23)
CYP3A5-6：5’VIC-TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3’MGB(SEQ ID NO.:24)
表5TaqMan荧光定量2×Master Mix(1mL)
| 组分 | 2×浓度 |
| Tris-HCl(pH8.5) | 40mM |
| KCl | 40mM |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 10mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 5.25mM |
| dNTP | 0.2mM |
| Taq酶 | 0.625U |
| 甘油 | 12％ |
PCR扩增曲线如图4所示。结果表明，本发明经优化的第二试剂能够非常快速(约20个循环即可检测出)、灵敏和准确地区分CYP3A5的三种等位基因型。
(a)当样本为野生纯合型CYP3A5*1/*1时，只存在FAM荧光的扩增曲线而没有VIC荧光的扩增曲线(图4A)；
(b)当样本为突变纯合型CYP3A5*3/*3时，只存在VIC荧光的扩增曲线而没有FAM荧光的扩增曲线(图4B)；
(c)当样本为杂合型CYP3A5*1/*3时，两种荧光都有扩增曲线(图4C)。
从图4中可以看出，基于本发明经优化的第二试剂的PCR的扩增效率非常高、灵敏度很高、特异性非常好。
对比例1
1.1CYP3A4基因的检测
实验方法同实施例3.1，区别在于引物序列如SEQ ID NO.:1和2所示，探针序列如SEQ ID NO.:13和14所示，PCR反应体系(10μL)如下：
其中TaqMan荧光定量2×Master Mix(1mL)的组成如下表6所示：
表6TaqMan荧光定量2×Master Mix
引物和探针序列如下：
CYP3A4-1F：AGCCTTCCTACATAGAGTCA(SEQ ID NO.:1)
CYP3A4-1R：AACTGCAGGAGGAAATTG(SEQ ID NO.:2)
CYP3A4-1：5’FAM-CCCTCCTTCTCCATGTACCA-3’MGB(SEQ ID NO.:13)
CYP3A4-2：5’VIC-TCCCTCCTTCTCCATGTATCA-3’MGB(SEQ ID NO.:14)
PCR扩增曲线如图2所示。从图2中可以看出，不管是野生纯合型(图2A)还是突变纯合型(图2B)，FAM和VIC两种荧光都有扩增曲线，无法判断哪个是野生型，哪个是突变型。结果表明，利用上述引物和探针不能区分CYP3A4的野生型和突变型。
1.2CYP3A5基因的检测
实验方法同对比例1.1，区别在于引物序列如SEQ ID NO.:3和4所示，探针序列如SEQ ID NO.:15和16所示。
引物和探针序列如下：
CYP3A5-1F：CAGCTTAACGAATGCTCTAC(SEQ ID NO.:3)
CYP3A5-1R：CACAGCAACCTTAGGTTCT(SEQ ID NO.:4)
CYP3A5-1：5’FAM-AGCTCTTTTGTCTTTCAATATC-3’MGB(SEQ ID NO.:15)
CYP3A5-2：5’VIC-AGCTCTTTTGTCTTTCAGTATC-3’MGB(SEQ ID NO.:16)
PCR扩增曲线如图5所示。从图5中可以看出，不管是野生纯合型(图5A)还是突变纯合型(图5B)，FAM和VIC两种荧光都有扩增曲线，无法判断哪个是野生型，哪个是突变型。结果表明，利用上述引物和探针不能区分CYP3A5的野生型和突变型。
对比例2
2.1CYP3A4基因的检测
实验方法同对比例1.1，区别在于引物序列如SEQ ID NO.:5和6所示，探针序列如SEQ ID NO.:17和18所示，PCR反应体系中的2×Master Mix如表7所示。
引物和探针序列如下：
CYP3A4-2F：CAGAGCCTTCCTACATAGAG(SEQ ID NO.:5)
CYP3A4-2R：GGCCCAATCAATTATCTTTA(SEQ ID NO.:6)
CYP3A4-3：5’FAM-TCTCCATGTACCATCCACTC-3’MGB(SEQ ID NO.:17)
CYP3A4-4：5’VIC-TCTCCATGTATCATCCACTC-3’MGB(SEQ ID NO.:18)
表7TaqMan荧光定量2×Master Mix
| 组分 | 2×浓度 |
| Tris-HCl(pH8.5) | 40mM |
| KCl | 40mM |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 10mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 5mM |
| dNTP | 0.4mM |
| Taq酶 | 0.7U |
| 甘油 | 12％ |
PCR扩增曲线如图3所示。结果表明利用上述引物和探针，虽然能区分CYP3A4的野生型和突变型，但扩增效率和灵敏度很低。野生纯合型只有FAM荧光有扩增曲线(图3A)，突变纯合型只有VIC荧光有扩增曲线(图3B)，杂合型两种荧光都有扩增曲线(图3C)。从图3中可以看出，虽然上述引物和探针能区分不同的基因型，但扩增曲线的CT值都在30之后，且荧光值较低。
2.2CYP3A5基因的检测
实验方法同对比例1.1，区别在于引物序列如SEQ ID NO.:7和8所示，探针序列如SEQ ID NO.:19和20所示，PCR反应体系中的2×Master Mix如表8所示。
引物和探针序列如下：
CYP3A5-2F：AGAGTGGCATAGGAGATACC(SEQ ID NO.:7)
CYP3A5-2R：GTGTGACACACAGCAAGAGT(SEQ ID NO.:8)
CYP3A5-3：5’FAM-TTGTCTTTCAATATCTCTTCCC-3’MGB(SEQ ID NO.:19)
CYP3A5-4：5’VIC-TTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-3’MGB(SEQ ID NO.:20)
表8TaqMan荧光定量2×Master Mix
PCR扩增曲线如图6所示。结果表明利用上述引物和探针，虽然能区分CYP3A5的野生型和突变型，但扩增效率和灵敏度很低。野生纯合型只有FAM荧光有扩增曲线(图6A)，突变纯合型只有VIC荧光有扩增曲线(图6B)，杂合型两种荧光都有扩增曲线(图6C)。从图6中可以看出，虽然上述引物和探针能区分不同的基因型，但扩增曲线的CT值都在30之后，且荧光值较低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海奥马生物科技有限公司
<120> 一种检测CYP3A多态性位点的试剂盒及其用途
<130> P2017-1548
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
agccttccta catagagtca 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
aactgcagga ggaaattg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cagcttaacg aatgctctac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cacagcaacc ttaggttct 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cagagccttc ctacatagag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ggcccaatca attatcttta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
agagtggcat aggagatacc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gtgtgacaca cagcaagagt 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cttacgcttc tgccagtag 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
tatgtatgaa ctggccactc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
gagagtggca taggagatac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
aagccagact ttgatcatta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ccctccttct ccatgtacca 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tccctccttc tccatgtatc a 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
agctcttttg tctttcaata tc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
agctcttttg tctttcagta tc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
tctccatgta ccatccactc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
tctccatgta tcatccactc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
ttgtctttca atatctcttc cc 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
ttgtctttca gtatctcttc cc 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
tctccatgta ccatccactc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
tctccatgta tcatccactc 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
ttgtctttca atatctcttc cc 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
ttgtctttca gtatctcttc cc 22
<210> 25
<211> 1001
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
aggctatgac cactagcatc aaataacata tgagaaagtg attgttacct ttcaaaaaaa 60
aaagtcacat gtctgtaacc aagaaaataa aaagagataa aaagagcaaa ttcctgtgtc 120
catatgtgga tacagctaag gggacatcac acaccactat ggtgcctgct gcaaacatgt 180
aattcacaac caaaaccaat gtgaaatgag tgtgagcaac aaatgcttat tgttagatgc 240
cactgaggtt tttggaggtt ttttacttag cattattgta gtaatagaaa gcagatgaac 300
cagagccagc acgttttaca aagatcttac gcttctgcca gtagcaacca tttgctatgt 360
ttctttcttt ttcttttcag agccttccta catagagtca gtgaaagaat cagtgattat 420
gctttttata aaaattctcc tgggaagtgg tgaggaggca tttttgctaa ggtttcacct 480
cctccctcct tctccatgta ycatccactc accttattgg gtaaaactgc atcaatttcc 540
tcctgcagtt tctgctggac atcagggtga gtggccagtt catacataat gaaggagaga 600
acactgctcg tggtttcata gccagcaaaa ataaagataa ttgattgggc cacgagctcc 660
agatcggaca gagctgaaag gagaggaaag acattttagg taaatcagat caatgtaggg 720
catcacagtt tagatgaaga gaaatctaag tgaagccctc aaatccctaa gggaaaagaa 780
tagaaaagca attcagaggt acactggggg tggtttcatt ctgatgtgta tcttacagaa 840
ccagaataag gcaaatcatt ttaatccagt tttccccaag gtcttcgaga atgtgggcca 900
tccactcctc ctcatgccac ccccgccacc tgcacagctg tgtaatttcc agagagagca 960
tttccgcata acatactcag tgttatgggt gtgttccttg a 1001
<210> 26
<211> 573
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
gaagcaagtg ggagaaagct ttgcctcttt gtacttcttc atcttctccc ctcaagtcct 60
cagaatccac agcgctgact gtggagtgct gtggagctgg catggcccat acaggcaaca 120
tgacttagta gacagatgac acagctctag atgtccatgg gccccacacc aactgccctt 180
gcagcattta gtccttgtga gcacttgatg atttacctgc cttcaatttt tcactgacct 240
aatattcttt ttgataatga agtattttaa acatataaaa cattatggag agtggcatag 300
gagataccca cgtatgtacc acccagctta acgaatgctc tactgtcatt tctaaccata 360
atctctttaa agagctcttt tgtctttcaa tatctcttcc ctgtttggac cacattaccc 420
ttcatcatat gaagccttgg gtggctcctg tgtgagactc ttgctgtgtg tcacacccta 480
atgaactaga acctaaggtt gctgtgtgtc gtacaactag gggtatggat tacataacat 540
aatgatcaaa gtctggcttc ctgggtgtgg ctc 573
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有第一试剂和/或第二试剂，其中，
(1)所述第一试剂包括：
针对CYP3A4基因的第一引物对、第一探针和第二探针；
其中，所述第一引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:9所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:10所示，
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.:21所示，和
所述第二探针的序列如SEQ ID NO.:22所示；
(2)所述第二试剂包括：
针对CYP3A5基因的第二引物对、第三探针和第四探针；
其中，所述第二引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:11所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:12所示，
所述第三探针的序列如SEQ ID NO.:23所示，和
所述第四探针的序列如SEQ ID NO.:24所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述各探针的5’端独立地修饰有荧光基团FAM或VIC，3’端独立地修饰有淬灭基团MGB。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括(a)用于扩增的试剂；和/或(b)用于检测的试剂。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中记载了利用所述第一试剂和/或第二试剂对CYP3A多态性位点的检测方法。
5.如权利要求1所述的试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒用于
(a)检测CYP3A多态性位点；和/或
(b)检测待测对象对选自下组的药物的代谢能力：阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼类、或其组合。
6.一种核酸扩增体系，其特征在于，所述体系包括：(a)用于扩增的缓冲体系以及(b)位于所述体系中的第一试剂和/或第二试剂，其中所述第一试剂、第二试剂如权利要求1中定义的。
7.一种实时荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)利用权利要求1所述的试剂盒或权利要求6所述的扩增体系，对待测样本进行实时荧光PCR。
8.一种检测CYP3A多态性位点的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)利用权利要求1所述的试剂盒或权利要求6所述的扩增体系，扩增待测样本的多核苷酸，得到扩增产物；和
(b)检测所述扩增产物的荧光，从而获得定量或定性的检测结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CYP3A多态性位点为CYP3A4*1G：rs2242480基因位点和/或CYP3A5*3：rs776746基因位点。
10.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂含有第一试剂和/或第二试剂，其中，
(1)所述第一试剂包括：
针对CYP3A4基因的第一引物对、第一探针和第二探针；
其中，所述第一引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:9所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:10所示，
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.:21所示，和
所述第二探针的序列如SEQ ID NO.:22所示；
(2)所述第二试剂包括：
针对CYP3A5基因的第二引物对、第三探针和第四探针；
其中，所述第二引物对的上游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:11所示，下游引物5’-3’序列如SEQ ID NO.:12所示，
所述第三探针的序列如SEQ ID NO.:23所示，和
所述第四探针的序列如SEQ ID NO.:24所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190621 |