CN105008551B - Rna修饰的简易检测方法及用该检测方法的2型糖尿病的检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供用少量的RNA试样检测RNA中存在的修饰的方法。本发明的再一目的在于提供检测tRNA中存在的修饰,例如,硫甲基化的方法。本发明的另一目的在于提供通过检测tRNA的硫甲基化来诊断人2型糖尿病或者其风险的方法。本发明的特征在于,将RNA试样中的RNA所存在的修饰,用第1引物由RNA通过逆转录生成cDNA,将该cDNA的量与用第2引物由RNA通过逆转录生成的cDNA的量进行比较,从而检测RNA中存在的修饰(例如,硫甲基化)。
Description
技术领域
本发明涉及使用逆转录法检测RNA修饰的方法。本发明还涉及将逆转录法与核酸扩增法,例如PCR法组合来检测RNA中的修饰并对修饰的程度进行定量的方法。更详细而言,本发明涉及使用包括与RNA的修饰部位的区域结合的引物和与不含有RNA的修饰部位的区域互补结合的引物的至少2种引物进行逆转录,接着进行核酸扩增,例如PCR,从而检测和/或定量该修饰的方法。本发明还涉及使用该检测方法的对2型糖尿病的遗传易感性的检查方法。
背景技术
转运RNA(tRNA)是解读mRNA的信息(密码子)并使对应的氨基酸转移至合成中的多肽链的接头分子,是在蛋白质翻译中具有中心作用的小分子RNA。tRNA的反密码子环受到化学修饰,而其对于翻译的忠实度(保真度)是必要的,尤其是位于反密码子的第34位碱基和紧邻反密码子的第37位碱基的化学修饰具有控制翻译的正确性的重要作用。此外,认为tRNA的反密码子环的化学修饰的破坏与疾病相关。
2型糖尿病是因环境因子和遗传因子的组合而发病的疾病,世界范围内患者超过2亿人,在许多国家中患者数量正在增加。2型糖尿病以胰岛素抗性和/或胰腺β细胞中的胰岛素分泌的异常作为特征,但是主要的机理尚在讨论中。2007年以后,在世界各国积极进行了以2型糖尿病患者作为对象的大规模基因多态性流行病学研究,确定了多个与糖尿病的患病具有相关性的基因单碱基多态性(SNP)。其中,在多篇论文中报告了Cdkal1(cdk5regulatory associated protein 1-like 1)的SNPs与2型糖尿病的发病具有最高的相关性。而且,已明确对于拥有Cdkal1基因的风险等位基因(Risk allele)的人而言,葡萄糖响应性胰岛素分泌差,但与肥胖、胰岛素抗性不相关。另外,亚洲人种大多拥有该基因风险等位基因,考虑到风险等位基因拥有者的表现型,推测Cdkal1的SNPs与亚洲人种2型糖尿病的发病相关。
而且,已明确Cdkal1的生理功能是将与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺嘌呤硫甲基化而制成2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷(ms2t6A)的酶(非专利文献1:ArragainS.,et al.J.Biol.Chem.285,28425-28433(2010)和非专利文献2:富泽等,上原记念生命科学财团研究报告书,25(2011)论文编号77)。显示出ms2t6A修饰对于赖氨酸密码子的正确解码(decoding)是必要的(非专利文献1),在防止同源密码子(cognate codons)的错读方面,尤其是在翻译速度比较快时在防止错读方面发挥重要的作用(非专利文献3:富泽等,Endocrine Journal 2011,58(10),819-825)。
报告了如下内容:对于Cdkal1缺失小鼠,观察到线粒体ATP生成和第一相胰岛素分泌被损害,而且,胰腺β细胞特异性Cdkal1敲除小鼠显示2型糖尿病的疾病状态,被观察到胰岛肥大和血中葡萄糖的控制障碍,对由高脂肪食物诱发的内质网应激是过敏的(非专利文献3和非专利文献4:Wei,F.Y.et al.J.Clin.Invest.121,3598-3608(2011))。
即,由本发明人等揭示出如下机理:因遗传或环境因素而引起Cdkal1的表达量或活性降低时,赖氨酸tRNA的硫甲基化降低,结果,胰岛素的翻译精度降低,2型糖尿病发病,并已知赖氨酸tRNA的硫甲基化与糖尿病发病密切相关。另一方面,线粒体DNA编码的线粒体tRNA中也存在硫甲基化。报告了线粒体tRNA的硫甲基化被Cdk5rap1修饰,Cdk5rap1基因的单碱基多态性突变与白斑症的发病相关(非专利文献1和专利文献5:Reiter,V.etal.Nucleic Acids Res.40,6235-6240(2012))。因此,tRNA的硫甲基化作为疾病的新的生物标记而受到关注。
作为检测tRNA的硫甲基化的方法,通常使用利用质谱分析法的检测方法(非专利文献6:Suzuki,T.et al.Method.Enzymol.425,211-229(2007))。质谱分析法中,首先,从组织、细胞精制tRNA后,利用核酸酶将tRNA消化至数个寡核苷酸。然后,将被消化的寡核苷酸精制,通过利用反相液相色谱和质谱分析仪进行分析来检测硫甲基化。但是,利用该质谱分析进行的硫甲基化检测需要大量的RNA(mg单位),但临床样品的量通常受到限制,难以取得mg单位的样品。因此,难以使用临床样品通过质谱分析来检测硫甲基化。另外,利用质谱分析进行的硫甲基化检测方法由于如上所述需要多个前处理,因此到检测出硫甲基化为止花费数日,不仅不能进行迅速的检测,而且存在成本升高的问题。此外,难以同时处理多个试样。而且,质谱分析仪非常昂贵,此外,为了使用而需要熟练的经验,因此存在难以在通常的医疗机构、研究室中进行分析的问题。
如上所述,质谱分析法由于花费时间和成本、进而难以取得大量的临床样品的问题,因此作为RNA的硫甲基化的检测方法,质谱分析法无法与临床应用相应。因此,期望能够效率良好地即迅速且廉价地检测RNA的硫甲基化、进而能够使用少量样品检测的新的检测方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Arragain S.,et al.J.Biol.Chem.285,28425-28433(2010)
非专利文献2:富泽等,上原记念生命科学财团研究报告书,25(2011)论文编号77
非专利文献3:富泽等,Endocrine Journal 2011,58(10),819-825
非专利文献4:Wei,F.Y.et al.J.Clin.Invest.121,3598-3608(2011)
非专利文献5:Reiter,V.et al.Nucleic Acids Res.40,6235-6240(2012)
非专利文献6:Suzuki,T.et al.Method.Enzymol.425,211-229(2007)
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用少量的RNA试样检测和/或定量在RNA中存在的修饰的方法。本发明的再一目的在于提供一种检测和/或定量在tRNA中存在的修饰,例如,硫甲基化的方法。
本发明的另一目的在于提供通过检测和/或定量在RNA中存在的修饰来诊断与该修饰相关的疾病或者其风险的方法。例如,本发明的目的在于提供通过检测和/或定量赖氨酸tRNA的硫甲基化来诊断人2型糖尿病或者其风险的方法。
本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究,结果发现通过合用逆转录法和核酸扩增法(例如,定量PCR法)来检测RNA(例如,tRNA)中的修饰(例如,硫甲基化)的方法,从而完成本发明。
本发明如下所示。
(1)一种用于检测RNA中存在的RNA修饰的方法,将以下2个工序各自分别或者同时进行,测定由各工序生成的cDNA量的差,从而检测该RNA修饰,
a.使用第1引物,由该RNA通过逆转录生成cDNA的工序,其中,该第1引物是以与该RNA上的包含具有该RNA修饰的部位的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,
b.使用第2引物,由该RNA通过逆转录生成cDNA的工序,其中,该第2引物是以与该RNA上的具有该RNA修饰的部位的3’侧的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。
(2)上述(1)记载的方法,其中,将上述工序a和b分别进行。
(3)上述(1)或者(2)记载的方法,其中,利用核酸扩增反应或者荧光法测定上述cDNA量的差。
(4)上述(3)记载的方法,其中,上述核酸扩增反应是用定量PCR法或者实时定量PCR法进行的。
(5)上述(4)记载的方法,其中,上述cDNA量的差是以核酸扩增反应中的核酸的扩增速度的差来进行测定的。
(6)上述(1)~(5)中任一项记载的方法,其中,上述RNA是tRNA。
(7)上述(6)记载的方法,其中,上述RNA中存在的RNA修饰是tRNA中存在的硫甲基化、甲基化或者牛磺酸化。
(8)上述(7)记载的方法,其中,上述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA、与Trp对应的tRNA、与Phe对应的tRNA、或者与Ser(UCN)对应的tRNA中的任一种的第37位的腺苷的硫甲基化。
(9)上述(8)记载的方法,其中,上述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA的第37位的腺苷的硫甲基化。
(10)上述(1)~(9)中任一项记载的方法,其中,上述RNA含有来自人组织或者人血液的RNA。
(11)上述(10)记载的方法,其中,上述RNA含有来自人外周血的RNA。
(12)一种方法,其特征在于,对于RNA中存在的RNA修饰率已知的至少2个试样和RNA修饰率未知的试样,分别进行上述(1)~(11)中任一项记载的方法,将显示出对于各试样测定的具有cDNA量的差的参数进行比较,从而测定未知试样中的RNA修饰率。
(13)上述(12)记载的方法,其中,上述核酸扩增反应是定量PCR法或者实时定量PCR法,且上述参数是使用第1引物和第2引物时的用于靶核酸扩增的阈值循环数(threshold cycle)的差。
(14)一种方法,对于RNA中存在的RNA修饰率未知的试样进行上述(1)~(11)中任一项所述的方法,将显示出对于该试样测定的cDNA量的差的参数与预先确定的标准曲线进行比较,从而测定未知试样中的RNA修饰率。
(15)上述(14)记载的方法,其中,上述核酸扩增反应是定量PCR法或者实时定量PCR法,且所述参数是使用第1引物和第2引物时的用于靶核酸扩增的阈值循环数(threshold cycle)的差。
(16)一种用于检测RNA试样(例如,来自人组织或者人血液的试样)中存在的RNA修饰的试剂盒,含有第1引物和第2引物,
其中,所述第1引物是以与该RNA上的含有具有该RNA修饰的部位的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,
所述第2引物是以与该RNA上的具有该RNA修饰的部位的3’侧的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。
(17)上述(16)记载的试剂盒,其中,上述RNA是tRNA。
(18)上述(17)记载的试剂盒,其中,上述RNA中存在的RNA修饰是tRNA中存在的硫甲基化。
(19)上述(18)记载的试剂盒,其中,上述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA、与Trp对应的tRNA、与Phe对应的tRNA、或者与Ser(UCN)对应的tRNA中的任一种的第37位的腺苷的硫甲基化。
(20)上述(16)~(19)中任一项记载的试剂盒,其进一步含有用于进行PCR的其它引物。
(21)一种方法,使用上述(9)记载的方法,判定上述tRNA所来自的受试者是否是2型糖尿病患者或者是否具有该风险。
(22)上述(21)记载的方法,其中,上述tRNA是来自受试者的组织或者血液(优选为外周血)的tRNA。
(23)一种方法,使用上述(9)记载的方法,检验上述tRNA所来自的受试者的胰岛素分泌能力。
(24)上述(23)记载的方法,其中,上述tRNA是来自受试者的组织或者血液(优选为外周血)的tRNA。
根据本发明,能够使用少量的样品,迅速且廉价检测RNA的修饰,例如tRNA的硫甲基化,因此作为使用临床样品(例如,组织或者血液)的各种遗传异常(例如,2型糖尿病的遗传易感性,但不限于此)的检测方法是有用的。
附图说明
图1:左图表示第37位的腺嘌呤被硫甲基化的与赖氨酸对应的tRNA。右图表示利用Cdkal1的硫甲基化反应。
图2是将作为本发明的一个实施方式的使用第1和第2反向引物的RNA修饰的检测方法中的逆转录法和紧随其后的定量PCR法(qPCR-MtR法)的顺序的概要以赖氨酸tRNA作为模型而表示的图。
图3是使用从野生型和Cdkal1KO小鼠精制的赖氨酸tRNA,利用逆转录法和定量PCR法,检测赖氨酸tRNA的ms2修饰的结果。
图4是对使用精制RNA的结果,分别将计算修饰率(calculated ratio)和期待修饰率(expected ratio)标绘于Y轴和X轴而得的图。
图5是使用从野生型小鼠和Cdkal1KO小鼠分离的粗精制RNA,利用逆转录和定量PCR法,检测赖氨酸tRNA的ms2修饰的结果。
图6是对使用粗精制RNA的结果,分别将计算修饰率(calculated ratio)和期待修饰率(expected ratio)标绘于Y轴和X轴而得的图。
图7是对使用从野生型小鼠和Cdkal1KO小鼠分离的粗精制RNA(2ng),利用逆转录和定量PCR法,检测赖氨酸tRNA的ms2修饰的结果,分别将计算修饰率(calculated ratio)和期待修饰率(expected ratio)标绘于Y轴和X轴而得的图。
图8是使用来自具有Cdkal1SNP(rs775840)的2型糖尿病相关风险等位基因的人(Risk组)和健康人(不具有Cdkal1SNP的风险等位基因的人)(Non-risk组)的外周血的粗精制RNA,利用逆转录和定量PCR法,检测赖氨酸tRNA的ms2修饰的结果。
图9是使用来自具有Cdkal1SNP(rs775840)的2型糖尿病相关风险等位基因的人(图9b)和健康人(不具有Cdkal1SNP的风险等位基因的人)(图9a)的外周血的精制RNA进行质谱分析的结果。图9c表示总赖氨酸tRNA(ms2t6A+t6A)中的ms2未修饰赖氨酸tRNA(t6A)的比例。
图10是对线粒体tRNA的A37中的ms2修饰进行质谱分析的结果。上段表示被ms2修饰的寡核苷酸的质量色谱,下段表示没有被ms2修饰的寡核苷酸的质量色谱。
图11表示具有Cdkal1基因突变的组(以纯合具有的(C/C)组和以杂合具有的组(G/C))和不具有Cdkal1基因突变的组(G/G)的各个个体组中的赖氨酸RNA的硫甲基化修饰度。
图12表示赖氨酸tRNA的硫甲基化修饰度与胰岛素分泌能力的相关性。
具体实施方式
以下,对本发明作更详细说明,但本发明不受以下实施方式的限制。
本发明的特征在于,通过使用第1引物和第2引物进行逆转录而检测出RNA试样中的RNA上存在的修饰。更具体地,本发明的特征在于,使用第1引物,由RNA通过逆转录生成cDNA,将该cDNA的量与使用第2引物由RNA通过逆转录生成的cDNA的量进行比较,从而检测RNA上存在的修饰。
作为本发明的检测方法的对象的物质是RNA,例如,虽不限于此,但可举出tRNA、rRNA、snRNA、mRNA-like ncRNA、snoRNA、或者miRNA,优选为tRNA、rRNA、或者snRNA,更优选为tRNA。
此外,作为检测对象的tRNA也没有特别限制,例如,可举出与Lys对应的tRNA、与Trp对应的tRNA、与Phe对应的tRNA、或者与Ser(UCN)对应的tRNA等。
此外,本发明中,所谓“RNA试样”,没有特别限制,是指与RNA的种类、含量无关地含有RNA的试样。作为RNA试样,例如,可举出含有来自哺乳动物组织、脏器或者血液,例如人组织、脏器或者人血液的RNA的试样,但优选为含有来自不对受试者施加过度负担且采集容易的人外周血的RNA的试样。来自血液的白血球RNA的采集方法没有特别限制,例如,可举出利用Ficoll密度梯度离心法处理全血并浓缩白血球后,进行RNA提取的方法;将血液采集至RNA采血管,例如,PAXgene RNA采血管(日本Becton·Dickinson株式会社制)之后,按照制造商的方案不分离白血球地直接作为RNA试样的方法。
本发明的检测方法中,能够检测的RNA修饰例如,虽不限于此,但可举出硫甲基化、甲基化和牛磺酸化,优选为硫甲基化和甲基化,更优选为硫甲基化。在为被判断或推定与特定疾病的关联的RNA修饰时,使用本发明的方法,检测或者定量该修饰,从而能够判定是否罹患该疾病或是否具有该风险。例如,如上所述,与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺苷的硫甲基化与2型糖尿病关联,因此通过检测或者定量该RNA修饰,能够判定是否罹患2型糖尿病或是否具有该风险。
本发明的方法中能够检测的RNA修饰和判断与该修饰的关联的疾病(即,使用本发明的方法能够判定是否罹患该疾病或是否具有该风险的疾病),例如,可举出牛磺酸化和线粒体脑肌病、硫甲基化和糖尿病、甲基化和X染色体连锁性智力低下。
本发明中使用的第1引物是以与含有具有本发明的检测方法中应该检测的RNA修饰的部位(例如,硫甲基化的碱基,但不限于此)的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,逆转录法和根据需要而在本发明中与之组合的PCR法中的各个方法中,只要作为引物发挥功能,其长度就没有特别限制,例如,为10个碱基以上,优选为10~30个碱基,更优选为15~20个碱基。含有具有在寡核苷酸(引物)的设计中使用的上述RNA修饰的部位的区域只要含有该修饰部位,就没有特别限制,优选选择RNA修饰部位位于区域的(从中心开始)5’侧。通过这样设计第1引物,能够不受到具有RNA修饰的部位的影响或者减小影响而进行逆转录。
本发明中使用的第2引物是以从具有在本发明的检测方法中应该检测的RNA修饰的部位(例如,硫甲基化的碱基,但不限于此)起,与3’侧的任意区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,逆转录法和根据需要而在本发明中与之组合的PCR法中的各个方法中,只要作为引物能够发挥功能,其长度就没有特别限制,例如,为10个碱基以上,优选为10~30个碱基,更优选为15~20个碱基。由于第2引物互补结合的区域存在于具有RNA修饰的部位的3’侧,因此,在逆转录中,RNA修饰(例如,硫甲基化,但不限于此)阻碍逆转录。因此,观察到使用如上所述设计的第2引物进行逆转录时,修饰的tRNA的量越多,则逆转录产物的量越会降低这样的反比例相关性。另一方面,由于使用第1引物的逆转录与RNA修饰非依赖性地生成cDNA,因此使用第2引物生成的cDNA量与使用第1引物生成的cDNA量相比变少。第2引物互补结合的上述3’侧的任意区域没有特别限制,只要在逆转录中RNA修饰至少部分地,优选在实质上阻碍逆转录,就可以是任意的区域,但上述3’侧的任意区域优选以既不过于远离也不过于靠近RNA修饰部位的方式设计,例如,以从RNA修饰部位离开大约3~10个碱基,优选为大约3~5个碱基的位置开始的方式进行设计。
这样,在与RNA修饰部位的位置关系方面设计第1引物和第2引物,由此通过使用各引物的逆转录而生成的cDNA量更容易产生差异。
此外,本发明中使用的第1引物和/或第2引物可以用适当的标识剂,例如,放射性同位元素、酶、荧光物质、发光物质等进行标识。作为放射性同位元素,例如,可举出125I、131I、3H、14C,作为酶,例如可举出β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、苹果酸脱氢酶,作为荧光物质,例如,可举出荧光素、Alex Fluor,作为发光物质,例如,可举出鲁米诺。
本发明中使用的第1和第2引物可以基于作为检查对象的RNA和作为靶的RNA修饰(其位置和其种类),以与靶的区域互补结合的方式进行设计,使用DNA/RNA自动合成仪按照常规方法合成。这样的第1和第2引物可以各自分别在水或者适当的缓冲液(例如,TE缓冲液)中以成为适当的浓度的方式进行溶解并在约-20℃保存。
作为本发明的特征之一的由第1引物生成的cDNA量与由第2引物生成的cDNA量的差的检测,只要能够检测该差,就可以使用任意的方法,例如,可举出核酸扩增法(核酸扩增反应)、质谱分析法等,但优选为核酸扩增法。通过使用核酸扩增法,可以迅速且廉价地测定cDNA的量的差。应予说明,通过在逆转录时使用经荧光标识的核苷酸,也可省略其后的利用核酸扩增法进行的cDNA量的差的检测,但从检测灵敏度和检测精度的方面出发,优选将逆转录法和核酸扩增法组合。
作为核酸扩增反应,可举出定量PCR或者实时定量PCR,但优选举出使用SYBRGREEN的嵌入法、或者TaqMan(注册商标)探针法,通过使用这些方法,不仅可进行RNA修饰的检测,而且可进行测定对象试样之间的比较,进而可进行RNA修饰的定量。此外,只要满足检测目的,还可通过用荧光物质分别标识第1引物和第2引物并进行多重解析而以少的试样迅速检测RNA修饰。
在扩增使用第1引物或者第2引物生成的cDNA的上述核酸扩增反应中使用的引物只要是与作为逆转录产物生成的cDNA互补结合的一对引物(反向引物和正向引物),就可没有特别限制地使用,优选一对引物的一方与第1引物相同。
此外,作为本发明的一个实施方式的使用第1和第2引物由RNA通过逆转录生成cDNA,接着,将生成的cDNA通过实时定量PCR扩增的工序可以分别进行,或者,也可以是将与在逆转录中使用的引物相同的引物用于PCR,在实时装置中还进行逆转录反应的一步(One-step)定量RT-PCR。
与PCR法组合的本发明的检测方法中,由第1引物生成的cDNA量和由第2引物生成的cDNA量的差的检测可以经时(伴随PCR的循环数的增加)观察并检测DNA的扩增,或者,也可以以任意的PCR的循环数中的DNA量的差的方式进行检测。
作为本发明的一个实施方式的将逆转录法和定量PCR法组合的RNA修饰的检测方法,检测灵敏度非常高,例如,使用仅1ng的总RNA就能够进行有无RNA修饰的检测,与以往的质谱分析法相比具有约1000倍以上的灵敏度。此外,由于是逆转录后进行PCR的2步RT-PCR法或1步RT-PCR法,因此能够以短时间,例如在2~3小时内结束检测操作,此外,也能够同时处理大量的样品。此外,与质谱分析法相比,需要的机器也廉价且操作也简便。
本发明的另一实施方式是用于检测RNA试样中的RNA中存在的RNA修饰的试剂盒,该试剂盒含有第1引物和第2引物,其中第1引物是以与含有具有RNA修饰的部位的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,第2引物是以与具有RNA修饰的部位的3’侧区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。此外,上述试剂盒含有第1和第2引物,进而,根据检测方法,可以含有进行检测所必需的其它成分作为构成。例如,可以进一步含有用于进行PCR法的其它引物(正向引物和/或反向引物)或用于进行PCR的反应缓冲液、DNA聚合酶等。
本发明的再另一实施方式是用于检测RNA试样中的tRNA中存在的硫甲基化的方法,其特征在于,使用与tRNA互补结合的至少2个引物,即,作为以与含有应该检测的硫甲基化的碱基的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸的第1引物、和以与应该检测的硫甲基化的碱基的3’侧的任意的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。
第1引物和第2引物只要满足上述条件且作为逆转录法和根据需要而在本发明中与之组合的PCR法中的各个方法中作为引物发挥功能,就能够没有特别限制地设计,其长度没有特别限制,例如,可以设计为10个碱基以上,优选为10~30个碱基,更优选为15~20个碱基。
第1引物如上所述被设计为与含有靶的硫甲基化碱基部位的区域互补结合,更优选以靶的硫甲基化碱基部位与引物的几乎中心的位置相对应的方式进行设计。利用该第1引物进行逆转录时,硫甲基非依赖性地进行逆转录,逆转录产物的量与tRNA的总量相关。另一方面,第2引物由于以位于靶的硫甲基化碱基部位的3’侧的方式进行设计,因此,硫甲基化部位的硫甲基阻碍逆转录的效率,因此,使用第2引物进行逆转录时,产生被硫甲基化的tRNA的量越多,则逆转录产物的量越降低这样的反比例相关性。最终,与tRNA的硫甲基化的程度相关地使用第2引物生成的cDNA量与使用第1引物生成的cDNA量相比变少。
本发明的再一实施方式中,上述的硫甲基化的检测中,可以在逆转录后,进一步使用上述的核酸扩增法,例如,实时PCR(例如,使用SYBR GREEN的嵌入法、或者TaqMan(注册商标)探针法)测定由第1引物和第2引物生成的cDNA量的差。此外,如上所述,可以使用2步RT-PCR法或1步RT-PCR法中的任意一种。
本发明的再一实施方式中,提供使用检测上述tRNA的硫甲基化的方法,检测来自受试者的tRNA的硫甲基化(与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺嘌呤的硫甲基化),由此判定受试者是否是2型糖尿病患者或者是否具有该风险的方法。由此,能够进行2型糖尿病的正确、简便且迅速的检查,还能够进行2型糖尿病的发病前检查、风险检查、早期检查。
本发明中的“受试者”没有特别限制,包括2型糖尿病患者、对2型糖尿病具有易感性的人和健康人。
此外,通过使用本发明的检查方法,检查从患有2型糖尿病的患者采集的试样,能够判断作为2型糖尿病的原因的tRNA的硫甲基化是否存在异常。
本发明的另一实施方式中,提供针对2型糖尿病的遗传易感性的检查试剂盒,该试剂盒至少含有第1引物和第2引物,其中,第1引物是以与含有与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺苷的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,第2引物是以与赖氨酸对应的tRNA的第37位的3’侧的任意区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。
如上所述,使用本发明的检测方法时,能够短时间·低成本·高灵敏度地检测RNA修饰(例如,硫甲基化)。此外,使用本发明时,能够使用少量的RNA试样(例如,来自样本的外周血的tRNA),检测RNA修饰(例如,tRNA的硫甲基化),并进行疾病(例如,糖尿病)的发病风险的诊断,进而,针对患者,能够开发个性化医疗(符合个人体质的治疗,例如治疗药的种类、给药方法)。
实施例
以下,通过实施例,具体说明本发明,但本发明不局限于以下的实施例。
实施例1:tRNA的硫甲基化的检测
(1)与赖氨酸对应的tRNA(tRNALys(UUU))的硫甲基化
被确认与2型糖尿病的发病具有最高相关性的SNPs的Cdkal1是将与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺苷硫甲基化而制成2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷(ms2t6A)的酶。利用被硫甲基修饰(37A(ms2))的赖氨酸tRNA和Cdkal1进行的硫甲基化反应在图1中示意性地示出。
(2)tRNALys(UUU)的检测
tRNALys(UUU)的检测的概要图在图2中示出。以tRNALys(UUU)的独特部位(硫甲基化部位)作为靶的方式使用2个反向引物进行逆转录。第1反向引物以对含有硫甲基化部位(第37位的腺苷)的特异性区域退火的方式进行设计,另一方面,第2反向引物以对硫甲基化部位的3’方向的下游的特异性序列退火的方式进行设计。首先,将tRNALys(UUU)线性化(步骤1),接着,使用第1或者第2反向引物,进行逆转录(步骤2)。然后,对由第1反向引物或者第2反向引物中的任意一种生成的cDNA进行定量PCR而使其扩增(步骤3)。
完全被修饰的tRNALys(UUU)的逆转录中,由于第37位的腺苷的ms2修饰使逆转录减弱,因此由第2反向引物生成的cDNA量与由第1反向引物生成的cDNA量相比变少。另一方面,在部分被修饰的tRNALys(UUU)的情况下,与修饰的减少相应,由第2反向引物生成的cDNA量接近由第1反向引物生成的cDNA量。
(3)RNA的分离
(3-1)粗精制RNA的分离
总RNA分离物(粗精制RNA)是从细胞或者组织(小鼠肝脏),通过使用TRlzol试剂(Invitrogen)的硫氰酸胍/苯酚/氯仿法,按照制造商的方案进行分离的。
(3-2)RNA的精制
各个tRNALys(UUU)是按照Miyauchi,et al.Nucleic Acids Res.35,e24(2007)记载的方法,使用往复循环色谱(RCC)法进行精制的。
(3-3)来自外周血的RNA的分离
总RNA(粗精制RNA)是由1.5ml的外周血,使用QIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen),按照制造商的方案进行分离的。精制RNA是通过由50ml的外周血,添加过剩的QIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen)的低渗溶液而破坏红血球后,使用TRlzol精制白血球中的总RNA进行分离的。
(4)质谱分析
将分离·精制的各tRNA(tRNALys(UUU)、tRNATrp、tRNAPhe、tRNASer(UCN)和tRNALeu(UUR)消化而变为寡核苷酸后,按照Wei等(非专利文献4)中记载的方法,进行液相色谱/质谱分析。
(5)引物
将为了测定tRNALys的ms2修饰而设计的引物序列(正向引物(forward primer)序列(序列号2)、第1反向引物(reverse Primer r1)序列(序列号3)、第2反向引物(reversePrimer r2)序列(序列号4))与tRNALys序列(序列号1)(由箭头表示作为ms2修饰部位的第37位的腺苷(A37))一同在以下的表1中示出。
[表1]
将为了测定小鼠线粒体tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN)和tRNALeu(UUR)的ms2修饰而设计的引物序列(正向引物(forward primer)序列、第1反向引物(reverse Primer r1)序列、第2反向引物(reverse Primer r2)序列)与各tRNA序列(由箭头表示作为ms2修饰部位的A37)一同在以下的表2中示出。
[表2]
小鼠线粒体tRNA和引物的序列
将为了测定人线粒体tRNATrp、tRNAPhe、和tRNASer(UCN)、和tRNALeu(UUR)的ms2修饰而设计的引物序列(正向引物(forward primer)、第1反向引物(reverse Primer r1)序列、第2反向引物(reverse Primer r2)序列)与各tRNA序列(由箭头表示作为ms2修饰部位的A37)一同在以下的表3中示出。
[表3]
人线粒体tRNA和引物的序列
(6)逆转录和定量PCR(本说明书中,为了tRNA的硫甲基化的检测而使用时,有时称为“qPCR-MtR”)
将从细胞或者组织(例如,肝脏)分离的总RNA(粗精制或者精制RNA),除非另有说明,用RNAse-free水调制为100ng/ml。为了避免基因组的混入,20μl的反应液中,将2μl(200ng)的总RNA用5单位(Unit)的DNaseI(Roche),在37℃时分解20分钟,接着,通过在75℃时处理10分钟,使DNaseI热失活。DNase处理后,将消化的总RNA2.5μl与含有20μM的第1反向引物或者含有第2反向引物的1μl溶液混合,接着,在65℃进行10分钟热变性后,在冰上急速冷却至少5分钟。在冰上,以终浓度成为0.5单位/μl的方式添加重组逆转录酶(Transcriptor,Roche)。将逆转录在10μl的全反应容量中以55℃进行30分钟,接着,在85℃进行5分钟热失活。对于由第1或者第2反向引物合成的cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq Kit(Takara)和ABI PRISM 7300Real-Time PCR系统(Applied biosystems),按照制造商的方案,进行定量PCR。
(7)敲除小鼠和细胞培养
Cdkal1敲除小鼠是按照Wei,F.Y.et al.J.Clin.Invest.121,3598-3608(2011)(非专利文献4)记载的方法制作的。为了将分布不均的Cdk5rap1的表达去除,使具有与loxP序列邻近的Cdk5rap1的外显子4和5的转基因小鼠与在CAG启动子的控制下表达某种Cre重组酶的转基因小鼠进行交配。所有的动物实验按照取得熊本大学的动物伦理委员会的承认的流程手册(ID:B24-134、B24-132)进行。
(8)转染
HeLa细胞是利用含有10%FBS的高葡萄糖浓度DMEM培养基(Invitrogen)进行培养的。siRNA的转染按照以下方式进行。将HeLa细胞以成为30%的密度的方式播种于24孔板上。24小时后,将以人Cdk5rap1作为靶的siRNA(Dharmacon)或者阴性对照siRNA(Ambion),使用LIpofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen),以终浓度50nM导入细胞。转染3日后,对总RNA使用上述的方法进行分离。
(9)Cdkal1的单碱基基因多态性(SNP)的鉴别
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen),从200μl的外周血精制基因组DNA,用蒸馏水以成为10ng/μl的方式进行调制。Cdkal1的SNP(rs7754840)是使用Taqman SNPGenotyping Assay Kit(Appliedbiosystems)进行检查的。使用人的基因组试样的实验是已取得熊本大学的伦理委员会的承认(承认编号:基因组159)而进行的。
实施例2:使用野生型小鼠和CadKal1KO小鼠的精制RNA的ms2修饰的检测
按照上述记载的RNA的分离方法,由野生型小鼠的肝脏精制第37位的腺苷被ms2完全修饰的tRNALys(UUU),并由CadKal1KO小鼠的肝脏精制ms2修饰被完全停止的tRNALys(UUU)。使用精制的各tRNALys(UUU),进行逆转录,然后进行定量PCR。结果在图3中示出。图3a表示使用来自野生型小鼠的tRNALys(UUU)进行qPCR-MtR的结果,图3b表示使用来自CadKal1KO小鼠的tRNALys(UUU)进行qPCR-MtR的结果。
将完全被ms2修饰的野生型tRNALys(UUU)作为模板使用时,由第2反向引物(r2)得到的阈值循环数(threshold cycle:CT)CTr2与由第1反向引物(r1)得到的阈值循环数CTr1相比,显著增加(图3a)。另一方面,在缺失ms2修饰的tRNALys(UUU)情况下,CTr2与CTr1接近。根据这些结果,确认了使用第2反向引物时,因第37位的腺苷的ms2修饰而引起逆转录减少,在使用第1反向引物时,对逆转录没有影响。即,可以判定CTr2反映了ms2修饰的程度,CTr1反映了tRNA试样中的总tRNA分子。
实施例3:试样中的tRNA中的ms2修饰率的测定
可以使用惯用的ddCT法和以下的计算模型,并且作为表示修饰率的指标,可以使用任意的试样中的CTr1与CTr2之间的差(dCTr2r1=CTr2-CTr1)。即,dCTr2r1值越小,则tRNA的ms2修饰越少。此外,可以基于以下的计算式,对于tRNA的ms2修饰率,使用已知的2个参照试样,求出未知的试验试样中的tRNA的ms2修饰率。
[数学式1]
将具有ms2修饰的tRNA分子的总数设为Lms,将不具有ms2修饰的tRNA分子的总数设为Lt6,将总RNA分子数设为Ltotal。因此,绝对修饰率(x)由下式表示。
[数学式2]
逆转录期间,具有ms2修饰的tRNA由第1反向引物(r1)或者第2反向引物(r2)以各自的率,RTms r1或者RTms r2被转录。另一方面,不具有ms2修饰的tRNA由第1反向引物(r1)或者第2反向引物(r2),以各自的率,RTt6 r1或者RTt6 r2被转录。由于由r1进行的逆转录与ms2修饰没有关系,因此由下式(3)表示,另一方面,由于由r2进行的逆转录因ms2修饰而减少,因此由下式(4)表示。
[数学式3]
使用含有Lms和Lt6的总RNA试样进行逆转录时,可以由下式(5)~(7)表示。
[数学式4]
其中,R0或者M0分别是使用引物r1或者r2生成的cDNA量。R0a或者M0a分别是使用修饰率a的总RNA试样,由引物r1或者r2生成的cDNA量。以下的方程式(8)表示由接着的PCR引起的指数函数的扩增。
[数学式5]从而
其中,XT是靶分子的阈值数(threshold number),CTx是用于靶扩增的阈值循环数(threshold cycle),E是靶扩增效率。
使用从修饰率a的任意试样由引物r1或者r2生成的cDNA进行PCR时,由以下的关系式(9)表示。
[数学式6]
M0a除以R0a时,给出下式(10)。
[数学式7]
其中,CTr2a是由引物r2生成的M0a的扩增的阈值循环数,CTr1a是由引物r1生成的R0a的扩增的阈值循环数。
比较修饰率a或者b的试样,成为下式(11)。
[数学式8]
另一方面,由式(4)和式(7)求出下式(12)。
[数学式9]
由修饰率w、k或者s的各个试样推导出以下(13)的数学式。
[数学式10]
如果已经得知修饰率w和k,则可由数学式(13)求出修饰率s。即便修饰率w、k、s未知时,如下式所示,容易使用dCTr2r1来进行各个之间的修饰率的相对比较。
[数学式11]
如果k>w>s,则据此
ddCTkw>ddCTww=0>ddCTsw
dCTr2kr1k-dCTr2wr1w>dCTr2wr1w-dCTr2wr1w>dCTr2sr1s-dCTr2wr1w
∴dCTr2kr1k>dCTr2wr1w>dCTr2sr1s
实施例4:各种ms2修饰率的tRNA的测定
使用本发明的原理,测定各种ms2修饰率的tRNA的试样。通过将来自野生型小鼠的精制tRNALys(UUU)和来自CadKal1 KO小鼠的精制tRNALys(UUU)按照表所示的比例进行组合,调制具有各种ms2修饰率(25、50、75、和100%)的tRNA,进行qPCR-MtR。ddCT值是通过从样品1的dCTr2r1值减去各样品的dCTr2r1值而算出的。计算修饰率(calculated modificationratio)是按照实施例3的数学式算出的。结果示于以下的表4。
[表4]
通常的dCT值伴随着ms2修饰率的减少而减少。此外,以完全被ms2修饰的tRNA试样(样品编号5)和不具有ms2修饰的tRNA试样(样品编号1)作为参照,将部分被ms2修饰的试样(样品编号2~4)的计算上的修饰率与被期待的修饰率进行比较,结果可知计算值能够正确地预测期待值(图4)。由此,可知将已知修饰率的tRNA作为参照试样使用,或者使用预先求出的标准曲线,能够测定未知的试样中的tRNA的修饰率。
实施例5:使用粗精制RNA的ms2修饰的测定
使用少量的粗精制RNA,通过qPCR-MtR,进行ms2修饰的测定。从野生型小鼠和CadKal1KO小鼠,分别分离200ng的总RNA,使用第1或者第2反向引物,进行qPCR-MtR。结果由图5示出。图5a表示使用来自野生型小鼠的粗精制RNA进行qPCR-MtR的结果,图5b表示使用来自CadKal1KO小鼠的粗精制RNA进行qPCR-MtR的结果。与使用精制tRNALys(UUU)的实验结果一致,由来自CadKal1KO小鼠的总RNA得到的CTr2值与由来自野生型小鼠的总RNA得到的CTr2值相比显著减少。
进而,与实施例4同样,将来自野生型小鼠的总RNA(粗精制RNA)和来自CadKal1KO小鼠的总RNA(粗精制RNA)以特定的比例进行组合,由此调制具有各种ms2修饰率(25、50、75和100%)的RNA,同样进行qPCR-MtR。各样品的dCTr2r1值,基于样品1的dCTr2r1值进行标准化,以ddCT值示出。结果由以下的表5示出。
[表5]
循环数
dCT值伴随着ms2修饰率的减少而减少。此外,以完全被ms2修饰的tRNA试样(样品编号5)和不具有ms2修饰的tRNA试样(样品编号1)作为参照,将部分被ms2修饰的试样(样品编号2~4)的计算上的修饰率和期待的修饰率进行比较,结果可知计算值能够正确地预测期待值(图6)。由此,可知即便使用总RNA时,也能够使用已知修饰率的参照试样,或者,使用预先求出的标准曲线,测定未知的试样中的tRNA的修饰率。
实施例6:使用少量的粗精制RNA的ms2修饰的测定
与实施例5同样进行测定。但是,将使用的总RNA量设置为2ng。将由野生型小鼠和CadKal1KO小鼠得到的总RNA以成为1ng/μl的方式进行调制,使用第1或者第2反向引物,进行qPCR-MtR。结果由以下的表6和图7示出。可知即使RNA量为2ng,也能够充分检测。
[表6]
实施例7:使用来自外周血的RNA试样的测定
从具有Cdkal1SNP(rs775840)的2型糖尿病相关风险等位基因的人和健康人(不具有Cdkal1SNP的风险等位基因的人)采集外周血,进行以下实验。使用从外周血试样分离的总RNA(粗精制RNA)100ng,使用第1或者第2反向引物,进行qPCR-MtR。由于无法取得用于求出人的tRNALys(UUU)的绝对ms2修饰率的参照,因此使用dCTr2r1值,测定相对修饰水平。将从具有Cdkal1SNP(rs775840)的2型糖尿病相关风险等位基因的人(个体数:6)和健康人(个体数:7)各自的外周血1.5ml分离的总RNA的dCTr2r1值作为修饰指标(ModificationIndex)而进行比较。结果由图8示出。具有Cdkal1SNP的风险等位基因的人的dCTr2r1值与健康人的dCTr2r1值相比显著降低。这表明具有2型糖尿病相关Cdkal1SNP的人中,ms2修饰被抑制。
通过质谱分析确认qPCR-MtR的结果。从具有Cdkal1SNP的风险等位基因的人和健康人各自的外周血30ml分离的总RNA50μg精制tRNALys(UUU),进行精制tRNALys(UUU)的质谱分析。结果由图9示出。图9b是具有风险等位基因的人的结果,图9a是健康人的结果(质量色谱图:ms2t6A(m/z459)、t6A(m/z413))。将非修饰率作为t6A区域相对于t6A和ms2t6A的总计区域的比进行标准化。示出使用从相同个体分离的总RNA进行3次实验而得的平均值。如图9c所示,具有风险等位基因的人的ms2未修饰tRNALys(UUU)增加至1.47倍。
实施例8:
使用线粒体tRNA试样的测定
哺乳动物的线粒体tRNA也受到2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷(ms2t6A)修饰。线粒体tRNA中,tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN)受到ms2t6A修饰,tRNALeu(UUR)没有受到ms2t6A修饰。哺乳动物细胞中,Cdk5rap1在A37处将N6-异戊烯基腺苷(i6A)更换为ms2i6A。
对Cdk5rap1敲除(Cdk5rap1KO)小鼠中的线粒体tRNA的ms2i6A修饰,使用第1或者第2反向引物,进行qPCR-MtR,从而进行系统性调查。从野生型小鼠和Cdk5rap1KO小鼠分别调制总RNA(粗精制RNA),使用上述表3所示的引物,测定各自的tRNATrp、tRNAPhe、tRNASer(UCN)和tRNALeu(UUR)的dCTr2r1值。
结果由以下的表7示出。野生型小鼠(WT)的tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN)的dCTr2r1值与从Cdk5rap1KO小鼠得到的dCTr2r1值相比显著增加。这表明,敲除小鼠中tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN)的ms2修饰被抑制。另一方面,野生型小鼠的tRNALeu(UUR)的dCTr2r1值与从Cdk5rap1KO小鼠得到的dCTr2r1值几乎相同。
[表7]
n=3,进行t-检验来检验统计学差异
此外,对从野生型小鼠和Cdk5rap1 KO小鼠的肝脏分离·精制的线粒体tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN),分别通过质谱分析确认ms2修饰,结果确认tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer (UCN)的ms2修饰消失,与qPCR-MtR的结果一致。结果由图10示出。
实施例9:使用HeLa细胞的tRNA的ms2修饰的测定
调制导入有对Cdk5rap1的siRNA的HeLa细胞(KD)和导入有对照的siRNA的HeLa细胞(对照),从各细胞,按照实施例1记载的方法,分离粗精制RNA。使用分离的粗精制RNA,使用第1或者第2反向引物,进行qPCR-MtR,测定tRNATrp、tRNAPhe、tRNASer(UCN)、和tRNALeu(UUR)的dCTr2r1值。结果由以下的表8示出。
[表8]
tRNA样本 | tRNA<sup>Trp</sup> | tRNA<sup>Phe</sup> | tRNA<sup>Ser(UCN)</sup> | tRNA<sup>Leu(UUR)</sup> |
对照(dCT) | 3.733 | 2.702 | 2.175 | 0.333 |
KD(dCT) | 0.233 | -0.359 | -1.359 | 0.566 |
p值 | p=000002 | p=000186 | p=0.00002 | p=0.1 |
n=3,进行t-检验来检验统计学差异
使用HeLa细胞的结果也与使用小鼠的结果同样,从对照的细胞得到的tRNATrp、tRNAPhe和tRNASer(UCN)的dCTr2r1值与从敲除(KD)Cdk5rap1的细胞得到的dCTr2r1值相比显著增加。另一方面,对照tRNALeu(UUR)的dCTr2r1值与Cdk5rap1KD的dCTr2r1值几乎相同。
实施例10:Cdcak1基因突变和tRNALys(UUU)的修饰的相关性的研究
按照实施例1,从人的外周血液提取DNA和RNA。按照实施例1(9)的方法,鉴别与糖尿病的发病相关的Cdkal1基因突变,将危险型Cdkal1突变分为以纯合具有的组(C/C、n=20),将非危险型Cdkal1突变分为以纯合具有的组(G/G、n=31)和杂合组(G/C、n=35)。接着,使用各组的RNA,进行PCR法,测定tRNALys(UUU)的修饰,研究相对修饰率。结果由图11示出。其结果,具有提高糖尿病发病的风险的危险型Cdkal1基因突变的组与具有非危险型Cdkal1突变的组相比,硫甲基化的修饰率显著降低。将P<0.05作为显著。检验使用ANOVA。
实施例11:硫甲基化与胰岛素分泌能力的相关性的研究
为了研究tRNALys(UUU)的硫甲基化与胰岛素分泌能力的相关性,按照常规方法实施人的糖负荷试验。让一晚禁食的受试者28人(Cdkal1突变基因型:C/C,n=9;G/C,n=12;G/G,n=7)饮用含有75克葡萄糖的溶液(公差G),在饮用前和饮用后30分钟后采血,基于血中胰岛素、血糖值,算出胰岛素分泌能力(Corrected insulin response)。此外,从该血液样品精制RNA,通过PCR法检测硫甲基化修饰的程度,研究胰岛素分泌能力和硫甲基化的程度的相关性。结果由图12示出。结果确认硫甲基化修饰越低,则胰岛素分泌能力越低这样的正相关性。
上述的记载仅是对本发明的目的和对象进行说明,并不局限于所附的专利请求范围。在不偏离所附的专利请求范围的情况下,对于记载的实施方式的各种变更和置换基于本说明书记载的教示对于本领域技术人员而言是显而易见的。
使用本发明的检测方法,能够以短时间·低成本·高灵敏度检测RNA修饰(例如,硫甲基化)。此外,使用本发明的检测方法,能够使用少量的RNA试样(例如,来自外周血的tRNA),检测RNA修饰(例如,tRNA的硫甲基化),并能够进行疾病(例如,糖尿病)的发病风险的诊断。
Claims (17)
1.一种检测方法,是非疾病诊断方法,用于检测tRNA中存在的RNA修饰即硫甲基化、甲基化或者牛磺酸化,所述检测方法使用1种正向引物和2种反向引物,将以下2个工序各自分别或者同时进行,用定量PCR法或者实时定量PCR法测定由各工序生成的cDNA量的差,从而检测该RNA修饰,
a.使用第1反向引物,将该RNA用作模板,通过逆转录生成cDNA的工序,其中,该第1反向引物是以与该RNA上的包含具有该RNA修饰的部位的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,
b.使用第2反向引物,将该RNA用作模板,通过逆转录生成cDNA的工序,其中,该第2反向引物是以与该RNA上的具有该RNA修饰的部位的3’侧的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,将所述工序a和b分别进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述cDNA量的差是以核酸扩增反应中的核酸的扩增速度的差来进行测定的。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述RNA中存在的RNA修饰是tRNA中存在的硫甲基化。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA、与Trp对应的tRNA、与Phe对应的tRNA或者与Ser(UCN)对应的tRNA中的任一种的第37位的腺苷的硫甲基化。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA的第37位的腺苷的硫甲基化。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述RNA含有来自人组织或者人血液的RNA。
8.根据权利要求5所述的方法,其中,所述RNA含有来自人外周血的RNA。
9.根据权利要求6所述的方法,其中,所述RNA含有来自人外周血的RNA。
10.根据权利要求7所述的方法,其中,所述RNA含有来自人外周血的RNA。
11.一种非疾病诊断方法的检测方法,对于tRNA中存在的RNA修饰率已知的至少2个试样和RNA修饰率未知的试样分别进行权利要求1或2所述的方法,将显示出对于各试样测定的cDNA量的差的参数进行比较,从而测定未知试样中的RNA修饰率。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述参数是使用第1反向引物和第2反向引物时的用于靶核酸扩增的阈值循环数(threshold cycle)的差。
13.一种非疾病诊断方法的检测方法,对于tRNA中存在的RNA修饰率未知的试样进行权利要求1或2所述的方法,将显示出对于该试样测定的cDNA量的差的参数与预先确定的标准曲线进行比较,从而测定未知试样中的RNA修饰率。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述参数是使用第1反向引物和第2反向引物时的用于靶核酸扩增的阈值循环数(threshold cycle)的差。
15.一种试剂盒,其特征在于,用于检测试样中的tRNA中存在的RNA修饰即硫甲基化、甲基化或者牛磺酸化,含有1种正向引物和2种反向引物,所述2种反向引物为第1反向引物和第2反向引物,
其中,所述第1反向引物是以与该RNA上的含有具有该RNA修饰的部位的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,
所述第2引物是以与该RNA上的具有该RNA修饰的部位的3’侧的区域互补结合的方式设计的寡核苷酸,
通过定量PCR法或实时定量PCR法,测定使用所述第1反向引物扩增而得的DNA量与使用所述第2反向引物扩增而得的DNA量的差,从而检测该RNA修饰。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其中,所述RNA中存在的RNA修饰是tRNA中存在的硫甲基化。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其中,所述tRNA中存在的硫甲基化是与Lys对应的tRNA、与Trp对应的tRNA、与Phe对应的tRNA、或者与Ser(UCN)对应的tRNA中的任一种的第37位的腺苷的硫甲基化。
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