CN114836548B - tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒 - Google Patents

tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒，包括：(1)抽提总RNA,其中tRNA不去氨基酸；(2)总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有全部脱酰化tRNA的总RNA；二者分别与相同tRNA接头连接、反转录后进行qPCR检测，其Ct值的差值即指示tRNA的氨酰化水平，通过与内参基因校正和数据标准化处理，即可计算tRNA的氨基酸载量水平。此外，本发明创新性的提出了简易的将细胞核和线粒体转录的全部tRNA和mRNA共反转录方法，克服了tRNA氨酰化检测的技术壁垒，使用常规qPCR技术即可实现tRNA氨酰化水平的定量检测。

Description

tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物化学技术领域，具体涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒。
背景技术
tRNA是氨基酸的载体，主要参与遗传密码的识别，是联系mRNA和蛋白表达的重要分子。目前已知人、鸡、鸭细胞核基因组中分别编码有415、271、361个tRNA基因；但其线粒体基因组均编码22种tRNA。由于tRNA分子片段较小，大约在73-96nt左右，常规方法不能检测此类小RNA分子。此外tRNA在细胞内参与mRNA翻译实际是以氨酰化tRNA的形式而发挥功能，目前tRNA主要有如下几个特征导致tRNA检测及其氨酰化水平检测存在困难：
第一、所有成熟tRNA的3’末端的CCA中的腺嘌呤核糖2’羟基和3’羟基是氨基酸分子中氨基连接的实际位置，tRNA 3’末端氨酰化妨碍了tRNA与接头的5’,3’磷酸二酯键的催化。
第二、tRNA含大量的转录后碱基修饰，尤其是反密码子中的第34位，但其反密码子35、36位极少被修饰；
第三、人、鸡、鸭细胞核DNA中编码了冗余的tRNA基因拷贝，高通量检测所有tRNA十分繁杂；
第四、人、鸡、鸭除细胞核DNA编码有大量tRNA基因，其线粒体基因组也编码有tRNA基因，其数量较少，均为22种，其中亮氨酸和丝氨酸有两种，其余均为一种。
第五、tRNA分子短，结构复杂，常规方法获得cDNA步骤冗长，大大限制tRNA检测方法的应用。
第六、细胞内实际参与翻译功能的tRNA是氨酰化形式的tRNA，但细胞内同时存在氨酰化的tRNA和未氨酰化的tRNA，常规手段不能专一检测tRNA的氨酰化水平。
目前虽然tRNA检测和tRNA氨酰化的高通量测序的检测方法已经建立了，但是其试验设备依赖性强、试验周期长、价格昂贵，大大的限制了tRNA生物学功能的研究。
qPCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，其作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。目前尚没有使用常规qPCR技术实现氨酰化水平检测相关方法的报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，所述方法包括：
(1)抽提总RNA；
(2)所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有脱酰化tRNA的总RNA；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无氨酰基tRNA尾部的ACC结合；
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值；
二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
进一步，所述独特接头核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞的核或线粒体tRNA氨酰化水平的定量检测。
进一步，可结合独特接头的通用特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述上游引物为SEQ ID NO.3所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞总tRNA氨酰化水平的定量检测。
进一步，所述人类细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.4～60所示；所述人类线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.137～158所示。
进一步，所述鸡细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～103所示；所述鸡线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.159～180所示。
进一步，所述鸭细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～73和SEQ IDNO.104～136所示；所述鸭线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.181～202所示。
本发明还提供用于人类、鸡或鸭总tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的接头、如SEQ ID NO.2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO.3所述上游引物。
本发明还提供用于人类细胞核中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的接头、如SEQ ID NO.2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO.4～60所述上游引物。
本发明还提供用于人类线粒体中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的接头、如SEQ ID NO.2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO.137～158所述上游引物。
上述用于tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法其中包含了tRNA含量的检测方法，即：
(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无氨酰化tRNA尾部的ACC结合；
(3)所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物，配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
(5)qPCR检测：上游引物为总tRNA通用上游引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得总tRNA的Ct值。
上述tRNA含量的检测方法针对每种tRNA检测即可得到tRNA含量谱，详见见图3实例中鸡细胞核和线粒体编码成熟tRNA的含量谱。
通用于人类、鸡和鸭细胞核和线粒体基因组成熟tRNA谱检测的接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5phos/CTATGGTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCTACTTCGGTAGGCTAAGGGAGAAGCCTTGACGTAATACGACTCACTATAGTGrGrN，SEQ ID NO.1；5phos表示5’端起始碱基有磷酸基团修饰，CTATGGTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCTACTTCGGTAGGCTAAGGGAGAAGCCTTGACGTAATACGACTCACTATAGT为脱氧核糖核酸序列，GrGr为核糖核酸序列，N为任意碱基。
用于人类、鸡和鸭细胞核编码的成熟tRNA谱检测的下游引物为相同的接头特异引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CTTCTCCCTTAGCCTACCGAAGT。所用上游引物组序列SEQ ID NO.3～136，其中细胞总tRNA水平检测的上游引物如SEQ ID NO.3所示：
CCTTGACGTAATACGACTCACTATAGTGG。SEQ ID NO.4～60为检测人类tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.61～103为检测鸡tRNA反密码子特异的上游引物组，其中SEQID NO.61～73与检测鸭tRNA反密码子特异的上游引物组相同；SEQ ID NO.104～136为检测鸭tRNA反密码子特异的上游引物组；具体引物序列见表1。
用于人类、鸡和鸭线粒体编码的tRNA组检测的下游引物为相同的接头特异引物(SEQ ID NO.2)，所用上游引物组序列SEQ ID NO.137～202，其中SEQ ID NO.137～158为检测人类线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.159～180为检测鸡线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.181～202为检测鸭线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；具体引物序列见表2。
本发明的有益效果在于：
1.本发明tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒，克服了tRNA氨酰化检测的技术壁垒，创新性的提出了细胞核和线粒体tRNA和mRNA共反转录方法，使用常规qPCR技术即可实现tRNA氨酰化水平的检测。
2.本发明利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的特点，将根据GtRNA2.0公布的人类、鸡和鸭(NCBI公布)细胞核基因组编码tRNA基因序列，以及NCBI中人类、鸡和鸭线粒体编码tRNA基因的序列，设计用于荧光定量的PCR引物和独特接头，经反复试验，优化qPCR反应体系和反应参数，建立了检测人类、鸡、及鸭细胞核及线粒体编码的成熟tRNA组及其氨酰化水平检测的试剂盒及方法。
3.本发明在tRNA组定量检测领域克服了上述诸多困难，有显著的技术优势和应用前景。第一，本发明扩大了应用的物种范围，涵盖人、鸡和鸭三个物种。第二，本发明不但可以检测基因组编码tRNA组，还可检测线粒体tRNA组。第三，本发明简化了引物组设计，仅需要tRNA反密码子特异的上游引物和共用的下游引物，同时tRNA反密码子特异的上游引物跨越了高修饰的34位碱基，覆盖了反密码子的34位到36位，能够确保tRNA检测是反密码子特异的，即能满足tRNA isodecoder的特异性。第四，本发明不仅能定量检测成熟tRNA水平，可同时定量检测tRNA的氨酰化水平。
4.本发明克服了tRNA检测步骤冗余、细胞中tRNA编码基因冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的独特接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类、鸡和鸭中细胞核和线粒体编码的所有成熟tRNA组及其氨酰化水平的检测，实现在三种物种中快速、准确、高通量的定量检测成熟tRNA组水平及其氨酰化的多寡。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明的工作原理图；
图2为鸭肝炎病毒(DHAV)感染后细胞核和线粒体部分tRNA的氨酰化水平检测；
图3为鸭肝炎病毒(DHAV)感染后细胞核和线粒体编码tRNA组的变化。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明中用于成熟tRNA含量检测方法，具体步骤如下：
(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与上述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；
(3)将步骤(2)所得混合液与共用下游引物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述下游引物为针对独特接头特异的共用下游引物；
(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；
(5)qPCR检测。
步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。
步骤(2)中，孵育的具体方法如下：
(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；
(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；
(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。
步骤(2-1)中，退火溶液的组成如下：接头2μl(20pm)，总RNA 400ng，无RNA酶水补充至9μl。
步骤(2-2)中，加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)。
步骤(2-3)中，连接反应体系的组成如下：步骤(2-2)所得溶液10μl，连接酶缓冲液(NEB,M0239L)2μl，T4 RNA连接酶(NEB,M0239L)0.1μl，无RNA酶水7.9μl。
步骤(3)中，退火溶液的组成如下：步骤(2)所得混合液20μl，特异性下游引物混合物3.42μl，无RNA酶水0.58μl。
步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。
步骤(4)的具体方法：加入共反转录反应液，按照说明书提供的步骤操作，37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix(Takara，RR036A)共反转录反应液。
优选的，步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，上游引物混合物(10pm)0.2μl，下游引物混合物(10pm)0.2μl，双蒸水3μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，59℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。
本发明基于上述含量检测的tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，所述方法包括：
(1)抽提总RNA；
(2)所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有脱酰化tRNA的总RNA；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无酰基的tRNA尾部ACC结合；
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值；二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
实施例1：
qPCR检测鸭肝炎病毒(DHAV)感染后tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU氨酰化水平
1.试验材料：
鸡胚成纤维细胞按照常规方法制备，RNA抽提:EZ-10DNAaway RNA小量提取试剂盒，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM,PH8.0)，T4 RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RT MasterMix(Takara,RR036Q)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme：Q712)。
2.试验方法(参考图1下半部分)
2.1采用试剂盒抽提鸡胚成纤维细胞DHAV感染细胞总RNA。
取4μl RNA(浓度为214ng/μl)加入1μl 5×脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入10μl TE缓冲液洗脱，即得含脱酰化tRNA的总RNA(7μl含400ng RNA)；而未经处理的RNA，含未氨酰化和氨酰化的tRNA，但仅有未氨酰化的tRNA能与tRNA接头连接。
2.2将抽提的tRNA与独特接头连接
具体步骤如下：
1.取2.1中脱酰化处理和未脱酰化的总RNA各400ng，分别加入2μl(20pm)tRNA接头，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃孵育3分钟。
2.在上述反应液体中分别加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃孵育20分钟。
3.在上述反应液中分别加入连接酶缓冲液2μl，T4 RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃孵育60分钟。
2.3mRNA与tRNA共反转录
具体步骤如下：
1.在2.2的20μl连接产物中，分别加入接头特异性下游引物2μl，加入无RNA酶水2μl补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。
2.在上述体液中分别加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
2.4qPCR反应体系配置及程序
具体步骤如下：
1.利用SYBRS Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置：2×SYBRS Premix ExTaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.2μl，其中上游引物为tRNA反密码子特异性引物(见表1)，下游引物与反转录引物相同；cDNA模板2μl(根据检测tRNA基因数量作适当的稀释)；加入双蒸水补充至10μl。
2.Real-Time PCR反应条件：
预变性95℃30s，变性95℃10s，退火延伸59℃30s；延伸72℃30s，45次循环。95℃60s，65℃60s，65℃-95℃每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线。
2.5计算DHAV感染细胞后tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平。
结论：
如图2所示，能够很好的检测tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平。ΔCt为tRNA检测Ct与GAPDH内参基因检测Ct的差值。在DHAV感染细胞的RNA中，脱酰化后的tRNAΔCt比未脱酰化的tRNAΔCt较低，经数据归一计算后，tRNA-Cys-GCA的氨酰化水平为96.61％，而tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平为80.90％。以上实例说明病毒感染细胞中的tRNA氨酰化水平存在一定的差异，这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA的氨酰化提供了重要的参考和技术支持。本实例是在鸡细胞中实施的，也可以广泛的应用于本发明涉及的人类和鸭细胞的tRNA氨酰化相关的科学研究。
实施例2：
qPCR检测鸭肝炎病毒(DHAV)感染后细胞核和线粒体编码tRNA组的动态变化
1.试验材料
鸡胚成纤维细胞按照常规方法制备，RNA抽提:EZ-10DNAaway RNA小量提取试剂盒，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM,PH8.0)，T4 RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RT MasterMix(Takara,RR036Q)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme：Q712)。
2.试验方法(参考图1)
2.1采用试剂盒抽提鸡胚成纤维细胞DHAV感染细胞和非感染细胞。
具体步骤与试剂盒说明书相同，本发明将去氨基酸步骤和RNA抽提合并以简化步骤，即在洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱。
2.2将抽提的tRNA与独特接头连接
具体步骤如下：
1.取400ng总RNA，加入2μl(20pm)tRNA接头，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃孵育3分钟。
2.在上述反应液体中加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃孵育20分钟。
3.在上述反应液中加入连接酶缓冲液2μl，T4 RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃孵育60分钟。
2.3mRNA与tRNA共反转录
具体步骤如下：
1.在2.2中连接产物20μl，加入接头特异性下游引物2μl，加入无RNA酶水2μl补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。
2.在上述体液中加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
2.4qPCR反应体系配置及程序
具体步骤如下：
1.利用SYBRS Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置：2×SYBRS Premix ExTaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.2μl，其中上游引物为tRNA反密码子特异性引物(见表1)，下游引物与反转录引物相同；cDNA模板2μl；加入双蒸水补充至10μl。
2.Real-Time PCR反应条件：
预变性95℃30s，变性95℃10s，退火延伸59℃30s；延伸72℃30s，45次循环。95℃60s，65℃60s，65℃-95℃每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线。
2.5采用2-ΔΔCt法计算DHAV感染细胞后细胞核和线粒体编码tRNA组的变化。
结论：
如图3所示，细胞核基因组编码的成熟tRNA均可被检测到。在DHAV感染细胞中，与非感染细胞相比大部分的细胞核基因组编码的tRNA表达下调，仅有tRNA-Arg-UCG、tRNA-Arg-ACG和tRNA-Gln-UUG上调。线粒体编码的22种tRNA中仅有tRNA-Asn-GTT上调，其余tRNA均出现不同程度的下调。这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA组变化提供了重要的参考和技术支持。本发明可以广泛的应用于tRNA生物学的科学研究，以及相关的分子生物学研究领域。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
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<210> 1
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctatggtggg tcggcatggc atctccacct cctcgcggtc cgacctgggc tacttcggta 60
ggctaaggga gaagccttga cgtaatacga ctcactatag tggn 104
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttctccctt agcctaccga agt 23
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttgacgta atacgactca ctatagtgg 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtrgagcg cgtgcttagc 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctaatggat aaggcgtctg acttcg 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtggtdagc atagctgcct tcc 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atagtggtta gtactctgcg ctgtg 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgagcggtct aaggcgctgg attaag 26
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggttagcgc gcggtactta t 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agttggtyag agcgtggtgc taat 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtctaggggt atgattctcg cttcgg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtctaggggt atgattctcg ctttgg 26
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttkgttaarg cgyckgtctc gt 22
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtctagyggy taggattcsk sgytttc 27
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtagagcgc rygcttcgc 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggtagagc gcatgctttg c 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcaatggata acgcgtctga ctacg 25
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctaatggat aaggcrtcwg mytccg 26
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctaatggata aggcaytggc ctcct 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggttagcgcr ttygrctgtt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtgagtatc cccgcctgtc 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcagkggta gagcatttga ctgca 25
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgtaatggt dagcactctg gactctg 27
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtgtaatgg ttagcactct ggactttg 28
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggttaggat tcggcgctct c 21
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tkyagtggta kmatkcwmgm ytccc 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttcagtggta gaattctygc ctgcc 25
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtggtctaag gcgccagact caa 23
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtctaaggcg ctgcgttcag 20
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagtggttaa ggcgttggac ttaag 25
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agyggtctaa ggcgctggat ttag 24
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctcagtcggt agagcatgrg actctt 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctcagtyggt agagcatcag actttt 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctcagttggg agagcgttag actgaa 26
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggtctagggg tatgattctc gcttagg 27
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tggccgagtg gttaaggcga tggactaga 29
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagtggttaa ggygttggac tcga 24
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtggttaagg cgatggactg ct 22
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgagtggtta aggcgwtgga cttga 25
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agkggttaga gcrctggtct tgt 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cggtagcgcg tctgactcca 20
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcagytggta gagcggagga ctgta 25
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgtagtggtt atcacgttcg cctaac 26
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agtggttatc acgttcgcct cac 23
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccatagtgta gtggttatca crtctgcttt ac 32
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aygagcgcry tggacttct 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
dggcagcgcg tcagtytcat 20
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctggttaaa gcgcctgtct agt 23
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctttgtgggt taaagtactt gtctggc 27
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cggtcagagc gttcggctat t 21
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggtaaaatgg ctgagtaagc attagactat aa 32
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agttcagttg gtagagcatc agactta 27
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atgtggagga agggagcatg tactcta 27
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gttggttaga gcgtgctgct act 23
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gtctggggtg caggcttca 19
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tggttagaaa tgtgcgctct ggg 23
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gaagcgtgct gggcccat 18
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gttggtaaga gcgtggtgct gat 23
<210> 59
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ggtaaatcaa aagcaactct ataagctatg taacaaac 38
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atagctcagt ggtagagagt gtacttatca 30
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggtagagcgc tcgcttagc 19
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cctaatggat aaggcgtctg acttcg 26
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tggtkagcat agctgccttc c 21
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
atagtggtya gtactctgcg ttgtg 25
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cggtctaagg cgctggatta ag 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggtyagcgcg cggtacttat 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
agttggttag agcgtggtgc taat 24
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aggggtatga ttctcgcttc gg 22
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gtctaggggt atgattctcg stttgg 26
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtggttatca cgttcgcctg ac 22
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ggtaaggcgt cggtctcgt 19
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gyggytagga tycsksgytt tc 22
<210> 73
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gctcagtggk agagcgc 17
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ggtagagcgc mtgctttgc 19
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
caatggataa cgcgyctgac tacg 24
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ctaatggata aggcatcagc ctccg 25
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ctaatggata aggcaytggc ctcct 25
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggttagcrcr ttcggctgtt 20
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gtggtragta tccccgcctg tc 22
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ctcagkggta gagcatttga ctgca 25
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
aawggtkagc actctggact ctg 23
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gtgtaatggt tagcactctg gactttg 27
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tggtyaggat tcggcgctct c 21
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ggtgtagtgg tatcatgcaa gattccc 27
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gtggtagaat tctygcctgc c 21
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tggtctaagg cgccagactc aa 22
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtctaaggcg ctgygttcag 20
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cgagtggtka aggcgttgga cttaa 25
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ggtcyaaggc gctggattta g 21
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gtcggtagag catgrgactc tt 22
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
cagtbggkag agcatcagac tttt 24
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
agytgggaga gcgttagact gaa 23
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
ggtctagggg tatgattctc gcttagg 27
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
cgagtggtta aggcgatgga ctaga 25
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ggtkaaggcg ttggactcga 20
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tggtkaaggy gatggactgc t 21
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
agkggtkaag gygttggact tga 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
agkggtyaga gcactggtct tgt 23
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ggtagcgcgt ctgactcca 19
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gytggtagag yggaggactg ta 22
<210> 101
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tgtagtggty atcacrtycg cctaac 26
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
grttatcacg ttygcctcac ac 22
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
agtgtagtgg ttatcacrtc tgctttac 28
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
agyggkagag crchtgcttt gc 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
atggayaacg cryctgacta cg 22
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tggataaggc atcagcctcc g 21
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ggayaaggca ytggcctcct 20
<210> 108
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
agcgcrttcg gctgtt 16
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ggtragtatc cccgcctgtc 20
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ctcagkggya gagcatttga ctgca 25
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gtgtaatggt kagcactctg gactctg 27
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ggkyagcact ctggactttg 20
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
tggkyaggat tyggcrctct c 21
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gtgtagtggt atcatgcaag aytccc 26
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gtggtagaat tctcgcctgc c 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ggtctaaggc gccagactca a 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gtcyaaggyg ctgcgttcag 20
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
agtggtgaag gcgttggact taa 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gtggtctaag gcgctggatt tag 23
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
gtyggtagag crtkrgrctc tt 22
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
cagtyggkag agcatcagac tttt 24
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
cagytgggag agygttagac tgaa 24
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gtctaggggt atgattctcg cttagg 26
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
cgagtggtka aggygatgga ctaga 25
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ggtgaaggcg ttggactcga 20
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tggtkaaggc gatggactgc t 21
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
agbggtkaag gcgttggact tga 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
agkggttaga gcactggtct tgt 23
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ggyagcgcgt ctgactcca 19
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
gctggtagag cggaggactg ta 22
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
tgtagtggtt atcacgttyg cctaac 26
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
gyggttatca crttcgcctc ac 22
<210> 133
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
tgtagtggty atcacrtctg ctttac 26
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
aatggatars gcaytggmct tct 23
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gcgygyyrgk cycat 15
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
btggttarag crcykgtcta gt 22
<210> 137
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gcttacctcc tcaaagcaat acactgaa 28
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
agcttaacac aaagcaccca acttac 26
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
agagcccggt aatcgcataa aacttaa 27
<210> 140
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
agaaatatgt ctgataaaag agttactttg atagag 36
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gtgataggtg gcacggagaa ttttg 25
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
agctaaataa gctatcgggc ccat 24
<210> 143
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
aatttaggtt aaatacagac caagagcctt ca 32
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
ggcttagctt aattaaagtg gctgatttgc 30
<210> 145
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ccagttgatt agggtgctta gctgtt 26
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
gctccgaggt gattttcata ttgaattgca 30
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
tggctgagtg aagcattgga ctgta 25
<210> 148
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
ggccatgggg ttggcttga 19
<210> 149
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
aaggtattag aaaaaccatt tcataacttt gtcaaag 37
<210> 150
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
cactgtaaag ctaacttagc attaaccttt taagt 35
<210> 151
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
actcttttag tataaatagt accgttaact tccaattaac 40
<210> 152
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tggtatatag tttaaacaaa acgaatgatt tcgactc 37
<210> 153
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
gtaaatatag tttaaccaaa acatcagatt gtgaatctg 39
<210> 154
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gagaaagctc acaagaactg ctaactc 27
<210> 155
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
cttttaaagg ataacagcta tccattggtc ttagg 35
<210> 156
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
gttcttgtag ttgaaataca acgatggttt ttc 33
<210> 157
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
gtccttgtag tataaactaa tacaccagtc ttgt 34
<210> 158
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
cagagaatag tttaaattag aatcttagct ttgggtg 37
<210> 159
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
cttaacccac aaagcatggc actgaa 26
<210> 160
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gcgtagctat aacttcaaag cattcagctt ac 32
<210> 161
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
gctcggcaaa tgcaaaaggc ttaa 24
<210> 162
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
cgtgcctgaa caaaaaggat cactatgat 29
<210> 163
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
agaaaataat atagagggag tatgaagagt tttgatc 37
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
gctaactaag ctatcgggcc cat 23
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
ctgtcaccaa accaaaggcc ttca 24
<210> 166
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
gccttagctt aattaaagcg tctgatttgc 30
<210> 167
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
caattggtgt tggcatttag ctgtt 25
<210> 168
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
gactctgtag tgaagttcat aatgagttgc a 31
<210> 169
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
gctgagtgtt gaagcgttag gctgta 26
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
ggtttgatgc ggttggcttg a 21
<210> 171
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
gagacgttag taaaccaatt acatagacct gtc 33
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
gctatgcacc agcactagcc tttt 24
<210> 173
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
ctcttctagt atactcatta caactgactt cca 33
<210> 174
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
gttagtctaa ctaagacagc tggtttcg 28
<210> 175
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
gcaaacatag tttaacccaa acattagatt gtg 33
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
cccaagccaa caagaactgc t 21
<210> 177
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
aggataagag caatccgttg gtcttag 27
<210> 178
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ccgtagttga gaacaacaat ggcttttc 28
<210> 179
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
ctctaatagt ttatgaaaaa cattggtctt gtaaacc 37
<210> 180
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
agagtagttt atttgaaaat accagctttg gg 32
<210> 181
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
cttaccacaa aagcatggca ctgaa 25
<210> 182
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
gctataaccc caaagcactc agcttac 27
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
cccggcaaat gcaaaaggct taa 23
<210> 184
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
gcctgaactc aaagggtcac tatgat 26
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
taatataagg gaagtatgga gagttttgat ctcttc 36
<210> 186
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
ctaatcaagc taccgggccc at 22
<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
ccacctaaac cgaaggcctt ca 22
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
gctttagctt aattaaagcg tctggtttgc 30
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
agtaggtttg ggcgtttagc tgtt 24
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
ccccggtaca ctctcgtgca 20
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
gctgagtgtt taaagcgtta ggctgta 27
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
agtggttaat gcagctggct tga 23
<210> 193
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
gagatgttag taaaccaatt acatagcctt gtc 33
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
gctatgcaac agcactagcc tttt 24
<210> 195
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
gctcttctag tatattaatt acaattgact tccaatctc 39
<210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
ctagcccaaa gacagctggt ttcg 24
<210> 197
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
gcatagttta aaccaaacat taggctgtg 29
<210> 198
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
gggaggttaa accaacaaga actgct 26
<210> 199
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
cttttaaagg ataatagtaa tccactggtc ttagg 35
<210> 200
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
cttgtagttg aaaataacaa taacggcttt tcg 33
<210> 201
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
actctaatag tttatacaaa acattggtct tgtaaacc 38
<210> 202
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
cagagaatag tttattgtaa aataccagct ttggg 35

Claims (4)

1.用于鸡胚成纤维细胞核中43种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的接头、如SEQ ID NO.2所示的通用特异性下游引物和如SEQ ID NO.61～103所示上游引物。
2.用于鸡胚成纤维细胞线粒体中22种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的接头、如SEQ ID NO.2所示的通用特异性下游引物和如SEQ ID NO.159～180所示上游引物。
3.权利要求1-2任意一种检测试剂盒在非疾病诊断目的的tRNA氨酰化水平定量qPCR检测中的应用。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒在非疾病诊断目的的tRNA氨酰化水平定量qPCR检测中的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
(1)抽提总RNA；
(2)所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有全部脱酰化的tRNA；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有接头连接的tRNA混合液；所述独特接头序列与去氨酰化tRNA尾部的ACC连接；
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值；二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
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