CN111316102A

CN111316102A - 使用甲硫氨酰-tRNA合成酶诊断胰腺癌的方法以及利用其的胰腺癌诊断试剂盒

Info

Publication number: CN111316102A
Application number: CN201880071609.4A
Authority: CN
Inventors: 金圣勋; 权南勋; 李东起; 林泛镇; 张星日
Original assignee: Wen Koute
Current assignee: Wen Koute
Priority date: 2017-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2020-06-19
Also published as: EP3677910A1; EP3677910A4; JP7134502B2; JP2020532747A; AU2018329359A1; CA3074684A1; KR102111699B1; AU2018329359B2; BR112020004391A2; US20210231669A1; EP3677910B1; WO2019050275A1; KR20190026633A

Abstract

本发明涉及一种使用甲硫氨酰‑tRNA合成酶(MRS)诊断胰腺癌的方法。在用作胰腺癌标志物时，MRS与诸如CEA的常规胰腺癌标志物相比，诊断准确性水平显著更高；因此，分析甲硫氨酰‑tRNA合成酶(MRS)在胰腺细胞中的表达状态具有清楚地确定胰腺癌存在或不存在的效果，并且即使在已经通过常规染色技术确定为非典型细胞的细胞中同样表现出了所述效果，因此其在胰腺癌的诊断中非常有用。

Description

使用甲硫氨酰-tRNA合成酶诊断胰腺癌的方法以及利用其的胰腺癌诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种使用甲硫氨酰-tRNA合成酶(methionyl-tRNA synthetase,MRS)诊断胰腺癌的方法，以及一种利用其诊断胰腺癌的试剂盒，更具体地，涉及一种检测从潜在患者采集的胰腺样品中的MRS蛋白以提供诊断胰腺癌所需信息的方法，一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物包含用于测量MRS蛋白表达水平的物质(agent)，以及一种用于诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒包含该组合物。

背景技术

本申请要求享有2017年9月5日提交的韩国专利申请第10-2017-0113255号的优先权和权益，其全文通过引用的方式并入本文中。

癌症总体是指一组疾病，其主要从无法控制的细胞增殖开始，侵入并破坏邻近的正常组织或器官，然后在其中创建新的生长位点，从而最终夺走个体的生命。尽管在过去十年中在调控细胞周期或凋亡，以及为了战胜癌症寻找包括致癌基因或癌症抑制基因的新靶标方面取得了显著进展，但是随着文明的发展，癌症的发病率也在提高。

其中，胰腺癌是一种致命癌症，其5年生存率为1-4％，中位生存期为5个月，与其他人类癌症相比，预后极差。胰腺癌的预后差，因为80-90％的胰腺癌患者被诊断为无法根治性切除胰腺癌以期望完全恢复的情况，而且胰腺癌的治疗主要依靠化疗。因此，与任何人类癌症相比，胰腺癌早期诊断技术的发展需求更加迫切。直到今天，已知对胰腺癌有效的几种化疗剂(包括5-氟尿嘧啶、吉西他滨和特罗凯)的治疗效果令人非常失望，并且化疗反应率仅为约15％。这些事实表明，需要更准确迅速的诊断技术来改善胰腺癌患者的预后。

术语“病理检查”是指主要通过利用提取的细胞、组织或器官从形态学角度来尝试阐明疾病起源的检查。病理检查是通过理解宏观发现、光学显微镜、电子显微镜等应用于疾病诊断的一种重要检查类型。此类病理检查包括病理组织学和病理细胞学。同时，活检和细胞学诊断之间存在许多差异，并且已知的是活检和细胞学诊断在使用已知癌症标志物的检测方法中，在诸如诊断敏感性和特异性的预后准确性方面显示出许多差异。因此，不确定传统上已知的癌症标志物是否可以实质上提供对特定样本(组织或细胞)的有效诊断。

鉴定非典型细胞中的困难也是对从身体分离出的细胞进行病理检查的障碍之一。自从1976年Melamed等人提出鳞状细胞非典型(atypia)，即非炎性变化但不足以诊断增生的细胞变化以来，关于非典型细胞的诊断、解释和治疗策略一直存在争议。为了解决这种争议，建立了Bethesda系统(TBS)。TBS极大地限制了术语“非典型细胞”的使用，因此该术语只能在无法将细胞变化诊断为炎性、恶化前或肿瘤的情况下使用，即具有不确定的意义。非典型细胞的治疗策略是困难的，因为对此可能有不同的看法。特别地，存在这样的问题：尽管实际上癌症在发展，但是在大多数情况下，非典型细胞的诊断结果在组织或细胞水平的检查中做出，或者癌症的诊断结果仅在组织样本中做出。当不能明确地区分不确定的组织结构或细胞形态对应于炎性病变还是新生物(neoplasm)时，则经常被诊断为不典型性(atypism)或细胞非典型。因此，需要通过其他检查手段等进行多次重复再次检查，导致浪费大量的时间和经济成本。

由于胰腺位于体内深处，因此当癌症发生在胰腺中时，很难检测到癌症。对于可以通过影像学检查可行手术(operable)的胰腺癌，需要在手术前通过对肿块性(mass)病变进行活检或在超声内窥镜下进行细胞学诊断来对胰腺癌进行明确的诊断。另外，在胰腺癌无法手术的情况下，需要活检或细胞学诊断以进行用于抗癌疗法或放疗的组织学诊断。用于诊断胰腺癌的代表性肿瘤标志物是CEA(参考值：5.0ng/mL)和CA19-9(参考值：37U/mL)。然而，CA19-9作为胰腺癌诊断标志物具有低特异性的问题。一份报告表明，接受健康检查的人中约有1％的人显示CA19-9水平升高，而CA19-9水平升高但没有症状的人中，只有2％实际上被发现患有癌症。美国癌症协会指南确定，CA19-9在筛查胰腺癌时敏感性或特异性较低。

此外，用于诊断胰腺癌的生物标志物的开发也在积极进行中。例如，韩国专利第10-0819122号公开了使用母系蛋白(matrilin)、转甲状腺素蛋白(transthyretin)和分层蛋白(stratifin)作为胰腺癌标志物，韩国专利公开第2012-0082372号公开了使用几种胰腺癌标志物。此外，韩国专利公开第2009-0003308号公开了一种通过检测个体的血液样品中REG4蛋白的表达水平来诊断胰腺癌的方法；韩国专利公开第2012-0009781号公开了一种测量从个体分离的癌组织中的XIST RNA的表达水平以提供诊断该个体的胰腺癌所需信息的分析方法；韩国专利公开第2007-0119250号公开了一种新的基因LBFL313家族，其在人胰腺癌组织中与在正常人胰腺组织中相比表达不同；且美国专利公开第2011/0294136号公开了一种使用诸如角蛋白8蛋白的生物标志物来诊断胰腺癌的方法。

然而，上述标志物的局限性在于，这些标志物在诊断效率和准确性上显示出很大的差异，且并非特别基于细胞学分析。对于不能清楚地区分它们是临床肿瘤细胞还是处于其他疾病状态的非典型细胞而言，非典型细胞是否对应于胰腺癌的准确诊断更为重要，但没有进行准确诊断的标志物。常规报道的胰腺癌诊断标志物在应用于细胞学诊断时无法获得有效的诊断，因为与在活检中使用不同，此类诊断标志物在细胞水平诊断中的敏感性和特异性较差。

因此，为了诊断胰腺癌，除肿瘤标志物外，还需要进行高价的彻底检查，例如电子计算机断层扫描(CT)、内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、超声内窥镜(EUS)和血管造影术。然而，即使通过这些检查，胰腺癌的准确诊断也非常困难。此外，大多数胰腺癌病例可能是在诊断时已是无法切除的晚期癌症病例，只有10-15％的胰腺癌病例可行手术。通过超声内窥镜细针抽吸技术检查对无法手术的患者进行胰腺癌诊断。然而，通过超声内窥镜细针抽吸检查进行的细胞学诊断在明确的诊断方面存在局限性，因为与术后的胰腺组织(周围结构完整)不同，所获得的细胞无法与周围的细胞或结构进行比较。

因此，胰腺癌细胞与其他疾病(例如，胰腺炎)的细胞之间的区别仍然主要取决于基于一般染色(例如H&E染色或巴氏染色)的病理诊断。然而，根据常规染色对胰腺癌的明确诊断可能会根据医护人员的经验和解释而造成不同的诊断，尤其是当通过H&E染色或巴氏染色通过胰腺细胞观察将胰腺细胞鉴定为非典型细胞时，很难区分胰腺细胞对应于胰腺癌还是良性疾病，并且因此是不能迅速进行针对患者疾病的准确诊断和治疗。由于对细胞学诊断的确认不准确，因此不能对可行手术的胰腺癌患者进行适当的治疗，相反，难以预防不必要的手术。因此，为了临床上增强胰腺癌的治疗效果，需要关于细胞学诊断的准确诊断。

具体实施方式

技术问题

为了找到能够在细胞水平上更准确地诊断胰腺癌的标志物，本发明人使用了从胰腺癌临床患者获得的胰腺细胞样品进行了仔细的细胞学分析，结果是本发明人首先确定了恶性肿瘤细胞可以通过检测胰腺细胞样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)的(高)表达而进行清楚地区分，特别是，甚至可以对那些通过常规病理细胞学使用H&E染色或巴氏染色鉴定为非典型细胞并因此不能确切地诊断出肿瘤或非肿瘤的细胞样品进行区分，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个方面提供了一种检测从潜在患者采集的胰腺样品中的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的方法，以提供诊断胰腺癌所需的信息。

本发明的一个方面提供了一种诊断胰腺癌的方法，该方法包括：

(a)测量从潜在患者采集的胰腺样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平；以及

(b)比较在步骤(a)中测量的甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与阴性对照的表达水平，并且当甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与阴性对照的表达水平相比增加时，则确定该潜在患者为胰腺癌患者。

本发明的另一个方面提供了：一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物包含用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质；以及一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，该试剂盒包括该组合物。

本发明的又一个方面提供了一种用于提高胰腺癌的细胞学诊断或活检的敏感度和特异性的方法，该方法包括：

(b)当步骤(a)中甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平增加时，确定该潜在患者为胰腺癌患者。

本发明的再一个方面提供了一种通过结合胰腺癌的细胞学诊断或活检中的形态学检查来进行区分胰腺癌细胞的方法，用于提供诊断胰腺癌所需信息的方法(一种用于诊断胰腺癌的方法)，其中该区分胰腺癌细胞的方法包括：

技术方案

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测从潜在患者采集的胰腺样品中的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的方法，以提供诊断胰腺癌所需信息。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诊断胰腺癌的方法，该方法包括：

根据本发明的另一个方面，本发明提供了：一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物包含用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质；以及一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，该试剂盒包括该组合物。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种提高胰腺癌的细胞学诊断或活检的敏感度和特异性的方法，该方法包括：

根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种通过结合胰腺癌的细胞学诊断或活检中的形态学检查来进行区分胰腺癌细胞的方法，用于提供诊断胰腺癌所需信息的方法(一种用于诊断胰腺癌的方法)，其中该区分胰腺癌细胞的方法包括：

在下文中，将对本发明进行详细描述。

在本公开全文中，可以以范围形式提出与本发明有关的各个方面或条件。在本说明书中，除非另有说明，否则范围值的描述涵盖边界值，换言之，其意指涵盖低于下限和高于上限的所有值。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的死板限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至5的范围的描述应当视为具有明确公开的子范围，例如1至3、1至4、2至5、2至3、2至4和3至4，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、3.5、4.3和5。无论范围的广度如何，这都适用。

如本文所使用的，术语“包括”与“包含”或“特征在于”同义使用，并且不排除在组合物或方法中未列举的其他元素或步骤。术语“由...组成”是指排除未单独描述的其他元素、步骤或成分。术语“基本上由...组成”是指在组合物或方法的范围内，该术语包括所描述的成分或步骤，以及基本上不影响组合物或方法的基本特征的任何元素或步骤。

如本文所使用的，术语“诊断”是指鉴定(确定)病理状况的存在或特征。具体地，在本发明中，诊断可以是通过确定MRS蛋白的表达或不表达或MRS蛋白的表达水平来鉴定是否存在胰腺癌。

如本文所使用的，术语“MRS”是指甲硫氨酰-tRNA合成酶，并且MRS是介导tRNA与氨基酸甲硫氨酸的氨酰化的酶。只要本发明的MRS蛋白包括本领域已知的MRS氨基酸序列，对其特异性序列及其生物学起源就没有特别限制。例如，MRS由人类中的MRAS基因编码，并且MRS的序列信息是已知的，Genbank登录号为例如NM_004990(mRNA)、NP_004981.2或P56192.2(蛋白质)。优选地，本发明的MRS可包含由SEQ ID NO:1定义的人MRS蛋白的氨基酸序列。更优选地，本发明的MRS蛋白可由SEQ ID NO:1所定义的氨基酸序列组成。MRS具有两个异构型：细胞质形式(细胞质甲硫氨酰-tRNA合成酶)；以及线粒体形式(线粒体甲硫氨酰-tRNA合成酶)。本发明中的MRS可以优选为细胞质形式。

如本文所使用的，术语“表达”是指细胞中蛋白质或核酸的产生。

如本文所使用的，术语“蛋白质”可与术语“多肽”或“肽”互换使用，并且是指例如氨基酸残基的聚合物，通常在自然界的蛋白质中发现。

如本文所使用的，术语“胰腺癌”是指具有快速增殖速率、浸润到周围组织中，以及转移到其他器官的特征的恶性新生物，包括胰腺中发生的恶性肿瘤或癌症。该恶性肿瘤或癌症与具有生长速率缓慢且非转移性特征的良性肿瘤不同。

胰腺中发生的癌症病例中超过90％是在胰管细胞中发育的，胰腺癌通常是指胰腺导管癌或胰腺导管腺癌。因此，本发明中的胰腺癌可优选地是指胰腺导管腺癌。

在本发明中，作为诊断目标的胰腺癌并不特别限于其原因，无论该胰腺癌是原发性癌症，还是由于转移而继发于胰腺的癌症。优选地，原发性癌症可以是诊断的目标。

如本文所使用的，术语“正常”是指不是恶性肿瘤或癌症的状态(恶性为阴性)，并且该术语旨在涵盖没有任何疾病的完全正常状态、诸如胰腺炎但不是恶性肿瘤(癌症)的另一种疾病状态，或/和与“良性”相对应的确定状态。如本文所使用的，在确定(最终)疾病的临床状态中被描述为“良性”的良性适应症与在相应检查中由“阳性”指示的阳性适应症区分开，并且由“阳性”指示的阳性适应症表示在相应的检查中有反应，或有结果表明在相应的检查中有癌症的可能性。

大约5-10％的胰腺癌患者具有遗传倾向性，并且在具有胰腺癌家族史的家庭人群中胰腺癌的发生率约为7.8％，高于一般人群中胰腺癌的发生率0.6％。胰腺癌的5年生存率在5％或更低，这表明预后极差。原因是：由于大多数胰腺癌病例是在癌症进展后发现的，因此只在在20％以内的癌症病例中可以进行手术切除；尽管肉眼看可完全切除，但微转移导致生存率的提高；并且胰腺癌对化疗和放疗的反应较低。

目前，通过使用电子计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)的活检来诊断胰腺癌，并且使用成像检查CT或MRI，但是其对应于间接诊断方法。最终，胰腺癌的诊断通过对应于病理学方法的活检或细胞学诊断来进行。通过与周围的结构或细胞进行比较，活检可以对特定区域的癌症进行明确的诊断，但是由于对单个细胞进行采集和涂片，所以细胞学诊断不能证明与周围组织的关系。因此，活检和细胞学诊断在根本上存在很多差异。

近年来，胰腺癌的存在或可能性是通过在诸如血浆的体液(作为用于诊断胰腺癌的临床样品)中同时进行蛋白质测定而确定的。然而，临床血清学仅用作用于诊断胰腺癌的参考资料，在胰腺癌的诊断中并未提供结论性信息。当前，关于胰腺癌最常用的肿瘤指示物的实例可以是碳水化合物抗原19-9(CA19-9)或癌胚抗原(CEA)。然而，已知CA19-9不适合诊断胰腺癌，因为即使在非癌性疾病(例如，肝炎、肝硬化和胰腺炎)的血液中CA19-9的水平也会升高，并且CA19-9并非胰腺癌特异性的，因为CA19-9是在血液中可检测到而在胰腺细胞本身中则不可检测的标志物。因此，CA19-9用于通过监测手术后的血清CA19-9水平来确定患者的预后。CEA在胰腺癌的准确诊断上也有局限性，因为CEA不能显示出足够的敏感性、特异性、阳性预测值和/或阴性预测值，这些事实在本文的实例中进行了很好的描述。

相反，本发明人不仅首先证实了MRS在胰腺癌中(高度)表达，而且还证实了使用MRS作为胰腺癌标志物可以在细胞学诊断和活检中产生高精度的诊断结果。也就是说，MRS在胰腺癌细胞而不是正常胰腺细胞(即，非肿瘤性胰腺细胞)中特异性高表达，并且已显示MRS显示出显著的效果，即MRS能够使胰腺细胞样本胰腺癌的确定比CEA的准确性更高，CEA被最广泛地用作胰腺癌的标志物，尤其在细胞学诊断中，使即使在常规病理细胞学(例如，H&E染色或巴氏染色)难以明确诊断的非典型细胞具有高精度的胰腺癌细胞区分。

因此，本发明提供了一种检测从潜在患者采集的胰腺样品中的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的方法，以提供诊断胰腺癌所需信息。即，本发明提供了一种通过测量对象样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平来诊断胰腺癌的方法。

具体地，该方法包括：

本发明的对象可以是动物，优选地为包括哺乳动物，尤其是人的动物，并且包括衍生自该动物的细胞、组织、器官等。更优选地，对象可以是需要进行诊断的人或患者。在本发明中，从对象或潜在患者提供样品的步骤可在步骤(a)之前执行。

如本文所使用的，术语“潜在患者”是指疑似患有胰腺癌的患者，并且是指通过诸如临床症状、血液学检查或影像学检查的各种检查怀疑患有胰腺癌的患者。

也就是说，潜在患者包括通过影像学检查能和不能诊断为胰腺癌的患者，并且是指即使患者通过影像学检查不能诊断为胰腺癌，但通过临床症状或血液学检查怀疑患有胰腺癌的患者。胰腺癌患者可能的临床症状的实例包括腹痛、黄疸、体重下降、消化不良和糖尿病，但这些症状并不是胰腺癌特有的。此外，在血液学检查中黄疸或糖尿病或肿瘤标志物(例如，CEA或CA19-9)的水平可能会提高。可以进行影像学检查，例如，腹部超声、腹部CT、腹部MRI和PET-CT，在这些影像学检查中，若胰腺肿块存在，则会造成疑似胰腺癌。这些影像学检查可能会导致疑似患有胰腺癌，但不能明确诊断为患有胰腺癌。胰腺癌的最终明确诊断是通过病理检查进行的。可以通过手术后获得的组织明确诊断可行手术患者，而不能手术的患者则主要通过细胞学诊断来作出明确诊断。

优选地，本发明的潜在患者(疑似胰腺癌患者)可以指具有诸如腹痛、黄疸、体重下降、消化不良和糖尿病的一般症状的患者，而不能仅通过诸如CT、超声和MRI的诊断设备就明确诊断为患有胰腺癌。更优选地，潜在患者可以是不能或不需要进行大范围的侵入性活检的患者(即，不可能或不必要做手术胰腺活检)，因此需要根据细胞学(细胞学诊断)来作出胰腺癌的明确诊断。换言之，潜在患者可以是需要通过细胞水平的分析来明确诊断胰腺癌的患者，但不限于此。

样品没有特别限制，只要样品是从待进行胰腺癌存在或不存在诊断的个体(患者)或对象中采集的即可；然而，例如，样品可以是胰腺组织或胰腺细胞。胰腺组织可以从包括胰管在内的胰腺的任何部位(特别是，疑似病变部位)获得。胰腺组织通常可通过胰腺的活检或手术获得。胰腺细胞的分离方法没有特别限制，可以理解为涵盖本领域中用于分离人组织细胞的当前方法以及将来出于相同目的而开发的新方法的概念。分离方法可以优选地是细胞刷检(brushing cytology)或细针抽吸术(FNA)，并且最优选地是超声内窥镜细针抽吸术(EUS-FNA)。

如本文所使用的，术语“通过通过细胞刷检采集”是指通过使用普通细胞刷刷胰腺，特别是胰管表面(特别是，疑似病变部位)来采集细胞的方式。

如本文所使用的，术语“通过细针抽吸术分离”是指采集方式为使用细胞学诊断中的普通细针抽吸和提取病变(疑似胰腺癌部位)的细胞。

优选地，在一个实施方案中，胰腺组织或胰腺细胞样品基本上包含胰管细胞。胰管区别于胰腺实质。

可以根据本领域已知的常规样品预处理方式(例如，固定、离心、涂片在载玻片上等)对获得的胰腺细胞或组织进行预处理。

在一个优选实施方案中，在提供在测试载玻片上之前，可以通过普通的石蜡块或石蜡切片制造方法对胰腺细胞或组织样品进行预处理。

在一个优选实施方案中，可以在通过普通的基于液体的单层载玻片制造方法(一种用于基于液体的细胞学的载玻片的制造方法)进行预处理之后，制备胰腺细胞或组织样品。例如，可以使用ThinPrep、SurePath、CellPrep等通过基于液体的单层附着方法将胰腺细胞或组织样品提供在测试载玻片上。

本发明的诊断胰腺癌的方法优选地可以是对胰腺细胞的分析。用于直接分析胰腺细胞的细胞学分析与活检存在许多差异，因此其与本文描述的现有技术文献中报道的胰腺癌诊断方法有很大差异。此外，本发明的方法利用胰腺细胞本身，因此不可能与其他器官的肿瘤混淆。

在常规的活检中，在内窥镜下观察目标部位，或者从疑似被转化为癌症的组织中采集具有约1g至10⁹个细胞的预定区域的组织，然后通过诸如染色的生化方式进行癌症诊断。已知通过与周围的结构或细胞进行比较，这种活检比较有助于明确诊断存在于特定区域的癌症。通过将总体趋势与周围正常组织进行比较，组织水平的标志物的表达模式也有助于明确诊断。然而，由于采集并涂抹了分离的细胞，因此细胞学诊断不能证明其与周围组织的关系，所以细胞学诊断在诊断中具有相当大的困难。因此，在细胞水平上的疾病诊断是重要的。

如本文所使用的，术语“检测”是指包括对靶物质(本发明中的标记蛋白、MRS或/和CK19)的存在(表达)或不存在的所有测量和鉴定，或靶物质的存在水平(表达水平)的变化的测量和鉴定。在相同的上下文中，测量蛋白质的表达水平是指测量蛋白质的表达或不表达(即，测量表达的存在或不存在)或测量蛋白质的定性或定量变化的水平。可以无限制地进行测量，包括所有定性方法(分析)和定量方法。在蛋白质水平的测量中，定性和定量方法的种类在本领域熟知的，并且本文所述的试验方法也包括在其中。各种方法的蛋白水平的具体比较是本领域熟知的。因此，MRS蛋白的检测是指涵盖检测MRS蛋白的存在或不存在，或鉴定该蛋白的表达水平的增加(上调)。

如本文所使用的，术语蛋白的“表达增加(或高表达)”是指先前未表达的蛋白被表达(即，检测到先前未检测到的蛋白)或相对于正常水平相对显示出了过表达(即，检测到的量增加了)。这可能意味着进行包括与阴性对照进行比较或对比的步骤。本领域技术人员应当理解，在定义的基础上，与之相反的术语的含义具有相反的含义。

在本发明中，MRS蛋白的检测不特别限于其方法，只要通过本领域已知的蛋白表达水平测量方法进行检测即可，例如，可以使用与蛋白特异性结合的抗体进行检测或测量。具体地，蛋白可以通过选自由以下各项所构成的组的任何一种进行检测：例如但不限于蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附测量(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳法、免疫组织染色法(包括免疫组织化学染色、免疫细胞化学染色和免疫荧光染色)、免疫沉淀测定法、补体固定测定、荧光激活细胞分选器(FACS)测定、表面等离子共振(SPR)测定或蛋白芯片测定。此外，根据本发明提供的用于测量MRS表达水平的物质和包括该物质的试剂盒的以下描述，可以理解该测量方法。

具体地，用于检测从潜在患者采集的胰腺样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白以提供用于诊断胰腺癌所需信息的方法，可以通过测量从潜在患者采集的胰腺样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的不表达或表达水平，以及当甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白被(高)表达时确定该潜在患者为胰腺癌患者而进行。该方法的优点在于，即使不与另一个对照组比较，也可以通过检测(高)MRS表达而以相当的准确度水平立即确定胰腺癌。在本发明的实例中对此进行了很好的描述。

根据本发明的实例，MRS在恶性肿瘤细胞中强烈(高度)表达。即，已证实，MRS可以以相当高的预定准确度水平用作胰腺癌诊断标志物。

特别地，证实了，即使在通过常规细胞病理学诊断(基于H&E染色、巴氏染色等)将胰腺细胞鉴定为非典型细胞并因此无法诊断，但随后通过患者的随访观察最终将患者诊断为胰腺癌的患者的胰腺细胞中，MRS也被高度表达和检测到。考虑到很难通过通常用于癌症诊断的常规细胞病理学诊断(基于H&E染色、巴氏染色等)来区分非典型细胞是对应于肿瘤还是对应于其他良性疾病(例如，胰腺炎)，所以确定此类非典型细胞是否与肿瘤相对应在临床上是非常重要的，并且当在非典型细胞中观察到MRS(高)表达时，将非典型细胞确定为肿瘤细胞，这是非常有意义的。

先前报道的胰腺癌诊断标志物在应用于细胞学诊断时无法实现有效的诊断，这与应用于活检时不同，因为这种诊断标志物在细胞水平上的诊断敏感度和特异性较差。根据本发明的另一个实例，在CEA作为最常用于胰腺癌诊断的诊断标志物之一的情况下，在胰腺细胞中未观察到CEA的表达，或者观察到了CEA的表达，但表达程度非常弱。此外，由于H&E染色，CEA在被鉴定为非典型细胞(之后最终被诊断为胰腺癌)的细胞中不表达。换言之，先前报道的胰腺癌诊断标志物在通过使用H&E染色等的常规细胞病理学诊断中不能清楚地鉴定为胰腺癌细胞或正常细胞的非典型细胞中没有显示出一致的表达，无法获得明确的诊断，但本发明的MRS可达到明确诊断被鉴定为甚至是非典型细胞的胰腺细胞是否是肿瘤细胞，从而导致更准确地诊断胰腺癌。

常规地，对于胰腺癌的诊断，需要进行高价的彻底检查，例如，电子计算机断层扫描(CT)、内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)、超声内窥镜(EUS)和血管造影术，但是即使通过这些检查，进行准确的诊断胰腺癌也是非常困难的。最终，需要进行病理学方法(例如，活检或细胞学诊断)以明确诊断胰腺癌。同时，大多数胰腺癌病例可能是在诊断时已无法切除的晚期癌症病例，只有10-15％的胰腺癌病例可行手术。通过超声内窥镜细针抽吸检查对无法手术的患者进行胰腺癌诊断。然而，通过超声内窥镜细针抽吸检查进行的细胞学诊断在明确诊断方面存在局限性，因为与术后的胰腺组织(周围结构完整)不同，所获得的细胞无法与周围的细胞或结构进行比较。

常规的细胞病理学诊断主要取决于常规染色，例如H&E染色或巴氏染色，以将胰腺癌细胞与其他疾病(例如，胰腺炎)的细胞区分开。然而，当基于这样的常规染色通过常规细胞病理学诊断方法对胰腺癌进行明确诊断时，根据医护人员的经验和分析技术会做出不同诊断，并且这些常规检查通常显示病理学发现为未明确鉴定为胰腺癌细胞或正常细胞(具有非胰腺癌细胞的广泛意义，例如包括胰腺炎细胞等)的非典型细胞，因此需要进行多次额外的重复再次检查。

尤其是，在通过H&E染色或巴氏染色在胰腺细胞观察中将胰腺细胞鉴定为非典型细胞时，很难区分胰腺细胞是否对应于胰腺癌或其他良性疾病，从而无法快速准确地对患病患者进行诊断和治疗。由于细胞学诊断的准确诊断被延迟，因此不能对可行手术的胰腺癌患者进行适当的治疗，并且相反，难以预防不必要的手术。因此，为了临床上提高胰腺癌的治疗效果，需要关于细胞学诊断的准确诊断。

考虑到难以通过通常用于癌症诊断的H&E染色或巴氏染色来区分非典型细胞是否对应于肿瘤或其他良性疾病，因此确定此类非典型细胞是否对应于肿瘤在临床上非常重要，并且当在非典型细胞中观察到(高)MRS表达时，可以将非典型细胞确定为肿瘤细胞，这是非常有意义的。此外，考虑到与细胞学诊断相比，需要相对大量的活检材料的活检增加了样品采集方面对患者的身体负担，并且在某些情况下，根据癌症的进展，手术是不可能的并且组织采集是不可能的，所以即使在细胞水平上也能提供准确诊断的本发明的MRS标志物具有更大的优点。

在本发明中，可以在检测MRS蛋白(或测量MRS蛋白表达水平的步骤)之前、同时或之后进行基于形态诊断的病理检查。也就是说，还可以在检测MRS蛋白(或测量MRS蛋白表达水平的步骤)之前、同时或之后进行以下步骤(i)和(ii)：

(i)用以下各项对从潜在患者采集的胰腺细胞进行染色：选自由染色细胞核的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、亚甲蓝、醋酸胭脂红、甲苯胺蓝、苏木精、赫斯特(Hoechst)所构成的组的至少一种染色溶液；以及选自由染色细胞质的伊红、结晶紫和橙黄G所构成的组的至少一种溶液；以及

(ii)通过对胰腺细胞进行染色，将胰腺细胞鉴定为恶性肿瘤细胞、非典型细胞或正常细胞。

在步骤(ii)中鉴定的非典型细胞应理解为未诊断和不可诊断的细胞，特别地，非典型细胞可能意味着还包括但不限于基于形态学诊断的病理检查中确定为疑似恶性。

根据基于形态学诊断的病理检查，细胞学诊断方法涉及上述步骤(i)和(ii)，并且之后进行在本发明的实例中使用的H&E染色和巴氏染色。如本文所使用的，术语“基于形态学诊断的病理检查”或“形态学检查”是指，当正常细胞转化为癌症时，异常形态学变化的检查。

对于异常形态变化的具体检查项目或其标准没有特别的限制，只要异常形态变化是本领域癌细胞形态变化的一种即可，但选自由以下各项组成的组中的至少一种：细胞聚集；核质比(N/C比)；核膜形状(核膜形状不规则)；染色质凝集；细胞核中出现核仁；以及可以检查有丝分裂的外观。形态学检查可以与上述用于提供诊断胰腺癌所需信息的方法同时、分开或相继进行。

在步骤(ii)中，可以基于当正常细胞转化为癌症时的异常形态变化，根据步骤(i)中的细胞染色结果将胰腺细胞样品鉴定为恶性肿瘤细胞、非典型细胞或正常细胞，并且鉴定的具体标准是本领域熟知的。“非典型细胞”是指不能通过形态变化清楚地鉴定为恶性肿瘤细胞(癌细胞)或正常细胞的细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，在步骤(ii)中，可以根据以下标准根据步骤(i)中的细胞染色结果，将胰腺细胞样品鉴定为恶性肿瘤细胞、非典型细胞或正常细胞：

当胰腺细胞显示出由以下各项所构成的组的两种或更多种类型的形态异常时，胰腺细胞鉴定为恶性肿瘤细胞：细胞三维涂片；核质比(N/C比)高；染色质凝集外观；粗型核膜；核仁外观和有丝分裂外观；

当胰腺细胞涂在一层；核质比(N/C比)小；并且核膜具有平滑形状时，则将胰腺细胞鉴定为正常细胞；并且

当胰腺细胞既没有导致恶性肿瘤细胞发生的细胞变化，也不能被确定为正常时，则将该胰腺细胞鉴定为非典型细胞。

当在MRS检测(表达水平测量)步骤之前、同时或之后进一步并行进行步骤(i)和(ii)时，仅通过细胞水平的检查(即，细胞学诊断)即可获得非常高准确度的诊断结果。例如，通过在检测MRS之前进行步骤(i)和(ii)而鉴定为恶性肿瘤细胞或正常细胞的胰腺细胞，可以通过在随后进行的MRS检测步骤中进一步重新分析MRS蛋白的表达水平(表达或不表达)而更准确地确定为对应于胰腺癌或确定为正常，导致诊断错误明显降低。或者，通过细胞染色鉴定为非典型细胞的胰腺细胞，可通过在MRS检测步骤中分析MRS的表达水平(或者表达或不表达)而明确确定与肿瘤对应。这样，可以在细胞水平上进行高准确度的明确诊断，从而极大地解决了常规病理学检查的问题(例如，在收到表示非典型细胞检查结果后需要再次进行活检以进行重新诊断的麻烦，以及由于需要多个组织样本以从活检组织样本中准确地明确确定胰腺癌而给患者带来的身体负担)，因此可以产生非常出色的诊断效果。

作为胰腺癌诊断标准的MRS检测水平(MRS表达水平，特别是MRS表达水平增加)可以根据本领域技术人员所选择的测量方法，通过检测(表达)的有无来确定，或者通过对检测(表达)水平进行分级来确定。例如，通过测量多个正常人和患者的样品中MRS的表达水平，根据MRS检测(表达)的水平对正常范围、胰腺癌发生范围等进行分类，然后进行数据存储和分析，以便可以提供适当的诊断标准。

此外，该方法可与阴性对照样品(特别是正常对照)比较进行。因此，该方法还可包括以下步骤：在检测MRS(测量MRS表达水平)之后，将在从潜在患者采集的胰腺样品中检测到的MRS蛋白水平与阴性对照样品进行比较。如本文所使用的，术语“正常对照”是指涵盖从待检查的潜在患者(与步骤(a)中待检查的患者相同的个体)的胰腺的正常部位采集的所有胰腺样品，或从另一个正常个体(没有胰腺癌的个体)采集的胰腺样本。如果从潜在患者采集的胰腺样品中检测到的MRS蛋白水平高于阴性对照(尤其是正常对照)的水平，则可以确定该潜在患者为胰腺癌患者。

关于此类对照的信息(例如，检测或表达的强度)可以以在本发明随后的描述中提供的用于测量MRS的表达水平的物质和包含该物质的试剂盒中指定的形式提供，或可以以其他形式从属提供。如果待检查的样品中MRS的表达水平与此类对照相比较高，则可以确定该样品对应于胰腺癌患者。

因此，根据一个方面，本发明提供了一种诊断胰腺癌的方法，该方法包括：

如本文所使用的，术语“正常胰腺细胞”或“正常对照”是指非肿瘤(癌性)胰腺细胞，并且该术语是指涵盖所有处于非肿瘤(癌)但有不同疾病(例如，胰腺炎)状态的胰腺细胞、良性细胞和完全健康的胰腺细胞(无疾病细胞)。

此外，本发明可提供一种通过包括步骤(a)和(b)来将非典型细胞区分为癌细胞(恶性肿瘤细胞)和正常细胞(非癌细胞)的方法。

如本文所使用的，术语“敏感度”是指在具有胰腺癌的最终临床病理诊断的样品或患者中，通过靶标检查(例如，本发明的检查)进行的确定为胰腺癌的比例。

如本文所使用的，术语“特异性”是指在最终临床病理诊断为正常的样品或患者中通过靶标检查(例如，本发明的检查)做出的确定为正常的比例。

当胰腺癌的诊断采用仅检测MRS的增加作为标志物的方式时，在组织和细胞水平的检查中诊断的敏感度显示为80％或更高的水平(80-100％，优选地为80-99％，更具体地为80-98％)。水平的特定值包括所有范围值，每个范围值都具有选自由以下各项所构成的组的两个值作为边界值：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。在本发明的一个实施方案中，具体地，在数值范围之外，可以选择80％和95％作为边界值，因此对于本领域技术人员明显的是，在80％至95％范围内的所有数值都意在涵盖于本发明中。在另一个实施方案中，敏感度可优选地为80-93％，更优选地为90-92％，并且最优选地为85-92％，但是不限于此。

此外，单独使用MRS作为标志物可能在组织和细胞水平的检查中显示出60-70％的特异性。更优选地，可以显示出62-68％的特异性。水平的特定值包括所有范围值，每个范围值都具有选自以下各项多构成的组的两个数字作为边界值：60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。在本发明的一个实施方案中，具体地，在数值范围之外，可以选择60％和65％作为边界值，因此对于本领域技术人员明显的是，在60％至65％范围内的所有数值都意在涵盖于本发明中。在又一个实施方案中，特异性优选地可以是60％-64％，但不限于此。

因此，本发明提供了一种用于提高胰腺癌的细胞学诊断或活检的敏感度和特异性的方法，该方法包括：

(a)测量从潜在患者采集的胰腺样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平；以及

对于本领域技术人员而言明显的是，敏感度和特异性的提高导致准确度的提高。因此，本发明的方法可理解为用于提高准确度的方法，并且使用MRS作为标志物可以导致准确度达80-100％，优选地为82-98％，并且更优选地为85-95％。水平的特定值包括所有范围值，每个范围值都具有选自由以下各项所构成的两个值作为边界值：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。在本发明的一个实施方案中，具体地，在数值范围之外，可以选择80％和90％作为边界值，因此对于本领域技术人员明显的是，在80％至90％范围内的所有数值都意在涵盖于本发明中。在又一个实施方案中，准确度优选地可以是80％-88％，但不限于此。

此外，本发明提供了一种通过结合胰腺癌的细胞学诊断或活检中的形态学检查来进行区分胰腺癌细胞的方法，用于提供诊断胰腺癌所需信息的方法(一种诊断胰腺癌的方法)，其中该区分胰腺癌细胞的方法包括：

作为优选实例，形态学检查旨在包括通过包括前述步骤(i)和(ii)而进行的检查，并且包括遵循这种方式的所有其他形态检查。将参考以上细节对其进行描述，并且本领域技术人员可以通过适当的选择来使用以上方式。

当除了形态学检查之外辅助地(即，作为辅助疗法)进行时，包括步骤(a)和(b)的方法可以与形态学检查同时、分开或相继进行。此外，包括步骤(a)和(b)的方法可以在形态学检查之前、同时或之后进行。

如上所述，MRS作为细胞学诊断的标志物具有优异的胰腺肿瘤(癌症)诊断作用。因此，本发明提供了一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物包含用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质，或用于诊断胰腺癌的试剂盒。

此外，本发明提供了一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物由用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质，或用于诊断胰腺癌的试剂盒组成。

此外，本发明提供了一种用于诊断胰腺癌的组合物，该组合物基本由用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质，或用于诊断胰腺癌的试剂盒组成。

此外，本发明提供了用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质在制备用于诊断胰腺癌的制剂中的用途。

用于测量MRS蛋白的表达水平的物质不特别局限于其种类，只要已知该物质可用于本领域中的蛋白表达水平的测量即可。优选地，该物质可以是与MRS蛋白特异性结合的抗体或适体。

如本文所使用的，术语“抗体”是指与抗原位点特异性结合的免疫球蛋白。更具体地，该术语表示糖蛋白，其包含通过二硫键结合在一起的至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步细分为高可变区(称为互补决定区(CDR))，在其之间分布有称为框架区(FR)的其他保守区。VH和VL分别由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

本发明中的抗MRS抗体是仅与MRS蛋白特异性结合而不与包括不同类型的氨酰-tRNA合成酶在内的其他蛋白发生反应的抗体。本发明中与MRS蛋白特异性结合的抗体可优选地为与包含由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列的蛋白(MRS)特异性结合的抗体。抗MRS抗体可以通过本领域中的常规方法来制备，例如，将MRS基因克隆到表达载体中以获得由该基因编码的蛋白质，并将由此获得的蛋白质注射到动物中以产生抗体。可以通过MRS全长序列蛋白产生MRS抗体。或者，可以使用包含MRS抗原位点的MRS蛋白片段来产生MRS蛋白特异性抗体。对本发明的抗体的具体序列和形式没有特别限制，包括多克隆抗体或单克隆抗体。此外，抗体不特别限于所提供的免疫球蛋白的类型，并且例如，可以选自由IgG、IgA、IgM、IgE和IgD所构成的组，并且可以优选地是IgG抗体。此外，本发明的抗体包括特殊抗体和重组抗体(例如，人源化抗体和嵌合抗体)，只要该抗体可以与MRS蛋白特异性结合即可。此外，整个抗体的一部分也包括在本发明的抗体中，只要该部分具有抗原-抗体结合特性(应答)即可，并且与MRS特异性结合的免疫球蛋白抗体的所有类型均包括在本发明的抗体中。例如，本发明的抗体不仅可包括具有两个全长轻链和两个全长重链的全形式抗体，而且可包括抗体分子的功能片段，即Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、双抗体(diabody)、scFv等，其具有抗原结合功能。

Fab(抗原结合片段)是抗体的抗原结合片段，由重链和轻链组成，重链和轻链均由一个可变结构域和一个恒定结构域组成。F(ab')₂是通过抗体的胃蛋白酶水解产生的片段，而F(ab')₂具有其中两个Fab分子通过二硫键在重链铰链区连接的形式。F(ab')是单体抗体片段，其中重链铰链通过还原其二硫键而添加到与F(ab')₂片段分离的Fab上。Fv(可变片段)是仅由重链和轻链的各个可变区组成的抗体片段。scFv(单链可变片段)是重组抗体片段，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性肽接头彼此连接。术语“双抗体”是指其中scFv的VH和VL由于其经由非常短的接头的连接而不能彼此结合，分别以相同的形式与另一scFv的VL和VH结合以形成二聚体的片段。为了本发明的目的，抗体的片段不限于其结构或形式，只要抗体的片段保持与人源的MRS蛋白的结合特异性即可。

在本发明中，抗MRS抗体(包括其功能片段)不特别限于与抗体相互作用(即结合)的MRS位点，只要该抗体可以与MRS蛋白特异性结合即可。但是，优选地，该抗体可以是抗体或其功能片段，其特异性结合至包含MRS中由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列的表位区域。更优选地，本发明的抗体可以是与SEQ ID NO:1所定义的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白中的包含第861至第900的氨基酸区域的表位特异性结合的抗体或其片段。

在本发明的一个实例中，本发明人证实了，对于胰腺癌细胞中MRS的高敏感度检测(染色)，获得了具有MRS中SEQ ID NO:2所定义的氨基酸序列区域作为表位的抗体，并且此类抗体可提供对MRS的高敏感度检测。

与包含由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列的表位区域特异性结合的抗体不特别限于其特异性序列，只要该抗体具有所需的特异性结合能力即可，但是优选地，该抗体可以包括：

轻链可变区(VL)，其包含：包含由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16定义的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)；由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18定义的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR2)；以及包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20定义的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR3)；

轻链可变区(VH)，其包含：包含由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:22定义的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)；包含由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:24定义的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR2)；以及包含由SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26定义的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR3)。

在本发明的抗体(包括其功能片段)中，作为具有CDR构型的优选实例，轻链可变区可以包含由SEQ ID NO:28定义的氨基酸序列，重链可变区可以包含由SEQ ID NO:30定义的氨基酸序列。

在本发明的抗体(包括其功能片段)中，作为具有CDR构型的另一个优选实例，轻链可变区可以包含由SEQ ID NO:32定义的氨基酸序列，重链可变区可以包含由SEQ ID NO:34定义的氨基酸序列。

作为最优选的实例，本发明提供了一种抗体，该抗体由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的轻链和SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的重链组成。

作为另一个最优选实例，本发明提供了一种抗体，该抗体由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成的轻链和SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的重链组成。

在本发明中，检测剂(通常是抗体及其功能片段)可以用一般的可检测部分进行标记，以进行其“检测”。例如，可以通过使用文献[Current Protocols in Immunology，第1卷和第2卷，1991，Coligen等人，Ed.Wiley-Interscience，纽约，N.Y.,Pubs]中描述的技术用放射性同位素或荧光标记对检测剂进行标记。此外，可以使用各种酶-底物标记，并且酶标记的实例包括：诸如果蝇荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)的萤光素酶、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、诸如辣根过氧化物酶(HRPO)的过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如，尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体缀合的技术描述于例如文献[O'Sullivan等，1981，用于酶学方法中酶免疫测定的酶-抗体缀合物的制备方法(Methods for the Preparationof Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods inEnzyme)，(J.Langone&H.Van Vunakis,eds.),Academic press,N.Y.,73:147-166]。标记可以通过使用各种已知技术直接或间接缀合至抗体。例如，抗体可以与生物素缀合，并且与上面引用的三类广泛类别有关的任何标记可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素可以选择性地与抗生物素蛋白结合，因此，该标记可以以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了获得标记与抗体的间接缀合，可以将抗体与小半抗原(例如，地高辛)缀合，并且可以将上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如，抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标志物与抗体的间接缀合。

如本文所使用的，术语“适体”是指能够与样品中待检测的分析物特异性结合的物质，其中该适体是指本身具有稳定的三维结构的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)，样品中靶蛋白的存在可以通过适体特异性鉴定。可以根据一般的适体制备方法，通过确定和合成对待鉴定的靶蛋白具有选择性和高结合能力的寡核苷酸的序列，然后修饰该寡核苷酸的5'-末端或3'-末端以具有-SH、-COOH、-OH或-NH₂，从而使得将5'-末端或3'-末端结合至适体芯片的官能团，而制备适体，但不限于此。

为了测量MRS蛋白的表达水平，本发明的用于诊断胰腺癌的试剂盒不仅可以包括选择性识别MRS蛋白的抗体或适体，还可以包括一种或多种其他组成成分、溶液或适用于分析的设备。

在特定方面，该试剂盒可以是诊断试剂盒，其包含进行蛋白质免疫印迹法、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组织染色测定、免疫沉淀测定、补体固定测定、FACS、SPR或蛋白芯片测定所需的已知必要成分和辅助成分，但不限于此。

例如，该试剂盒可包括对MRS蛋白具有特异性的抗体。该抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，其对靶标志物蛋白具有高特异性和亲和性，并且与其他蛋白质几乎没有交叉反应性。此外，该试剂盒可包括对任何对照蛋白具有特异性的抗体。该试剂盒中提供的抗体本身可以用可检测的部分进行标记，如上所述。另外，该试剂盒还可包含能够检测结合抗体的单独试剂，例如，标记的二抗、生色团、酶(例如，与抗体缀合的形式)及其底物，或其他能够结合抗体的材料。此外，本发明的试剂盒可以包含洗涤液或洗脱液，其可以去除过量的生色底物、未结合蛋白等，而仅保留结合至抗体的蛋白标志物。

用于测量MRS蛋白的表达水平的物质还可以意指包括用于检测MRS基因(MARS)的表达水平的物质。蛋白质表达水平的增加伴随着来自编码该蛋白的基因的转录本(例如，mRNA)的增加，因此，本领域技术人员显然可以理解，不仅可以使用检测MRS蛋白本身的手段，而且还可以使用间接检测与MRS的表达直接相关的转录本的手段。

用于检测MRS mRNA的物质没有特别限制，只要该物质是与MRS mRNA特异性结合或杂交的配体即可，例如可以是引物(对)或探针。

术语“引物”是指具有短的游离3'羟基的短核酸序列，其中该核酸序列可与互补模板形成碱基对，并充当模板链复制的起点。引物可在适当的缓冲剂和温度条件下，在存在聚合试剂(即，DNA聚合酶或逆转录酶)和四种不同的三磷酸核苷的情况下启动DNA合成。PCR条件以及有义和反义引物的长度可以根据本领域已知的技术适当选择。

引物的序列不必一定与模板的核苷酸序列的一部分完全互补，并且只要引物与模板杂交以在引物可进行其固有行动的范围内具有足够的互补性，引物就是有利的。因此，在本发明中用于测量MRS mRNA表达水平的引物不一定需要与MRS编码基因序列完全互补，并且只要该引物的长度和互补性适合以通过DNA合成扩增MRS mRNA或MRS cDNA的特定部分来测量MRS mRNA的量的目的，引物就足够了。用于扩增的引物由一组(或一对)引物组成，该引物在待扩增的MRS mRNA的特定区域的两端分别互补地与模板(或有义)和相对侧(反义)结合。参考MRS mRNA或cDNA的核苷酸序列，本领域技术人员可以容易地设计引物。

术语“探针”是指多核苷酸的片段(例如，RNA或DNA)，其能够特异性结合特定基因的mRNA或互补DNA(cDNA)，并且具有几至几百个碱基对的长度。由于探针是标记的，因此该探针可用于检查待结合的靶mRNA或cDNA存在或不存在，或其表达水平。为了本发明的目的，可以通过与来自对象的样品杂交来测量MRS mRNA的表达水平，从而将与MRS mRNA互补的探针用于诊断。可以根据本领域已知的技术适当地选择探针和杂交条件。

本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相合成或其他熟知的方法化学合成。另外，可以在不妨碍与MRS mRNA的杂交的范围内，通过本领域已知的方法对该引物或探针进行各种修饰。修饰的实例是甲基化、加帽、用其类似物取代至少一个天然核苷酸、在核苷酸之间修饰(例如，用不带电荷的接头修饰(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的接头(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行修饰)，以及使用荧光或酶与标记材料结合。

本发明的诊断试剂盒不仅可包括将MRS mRNA识别为用于测量MRS表达水平的标志物的引物或探针，还可包括一种或多种适于分析的其他成分、溶液或装置。该试剂盒的种类没有特别限定，只要试剂盒是提供引物(引物对)或探针作为构成的已知诊断试剂盒即可，例如其实例可包括用于聚合酶链反应(PCR)、RNase保护测定、northern印迹法、southern印迹法或DNA微阵列芯片的试剂盒。

例如，用于诊断的试剂盒可包含进行聚合酶链反应所需的基本元素。用于聚合酶链反应的试剂盒包含对标志物基因(mRNA)具有特异性的各个引物对。引物是具有对每个标志物基因(mRNA)的核酸序列具有特异性的序列的核苷酸，并且具有约7-50bp的长度，更优选地约10-30bp。此外，用于聚合酶链反应的试剂盒可包含对对照基因的核酸序列具有特异性的引物。此外，用于聚合酶链反应的试剂盒可包括试管或适当的容器、缓冲剂(pH和镁浓度不同)、脱氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和逆转录酶、DNAse和RNAse抑制剂、DEPC-水、灭菌水等。

本发明人发现，在胰腺癌的诊断中，MRS在大多数正常细胞中不表达，但是少数正常细胞MRS表达经常显示假阳性，并且这种假阳性判定是由正常腺泡细胞中MRS的高表达造成的。由于测试各种标志物组合以排除这种假阳性反应并找到具有更高准确度(包括敏感度和特异性)的方法，开发了本发明的MRS和CK19的双重染色方法。本发明人首先确定，当CK19，除MRS外，还专门用作胰腺癌诊断中的附加双重标志物时，胰腺癌在细胞学诊断中的诊断准确度基本上为(几乎)100％。因此，可以将在常规细胞学诊断中被归类为非典型细胞的样品区分为胰腺癌和非胰腺癌(正常)。

因此，本发明提供了一种用于检测从潜在患者采集的胰腺样品中的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)和细胞角蛋白19(CK19)蛋白的方法，以提供诊断胰腺癌所需信息。即，本发明提供了一种通过测量对象样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)和细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平来诊断胰腺癌的方法。

具体地，该方法可包括：

(a)测量从潜在患者采集的胰腺样品中MRS蛋白和CK19蛋白的表达水平；以及

(b)当步骤(a)中CK19蛋白被表达且MRS蛋白的表达水平增加时，确定该潜在患者为胰腺癌患者。

如本文所使用的，“CK19”是指细胞角蛋白19，并且CK19是属于I型角蛋白的中间丝蛋白，并且主要在上皮细胞中表达且负责上皮细胞的结构完整性。本发明的CK19蛋白特别限于其特定序列及其生物学来源，只要该CK蛋白包括本领域已知的CK19氨基酸序列即可。例如，CK19由人类中的KRT19基因编码，并且CK19的序列信息由Genbank登录号已知，例如NM_002276.4(mRNA)或NP_002267.2(蛋白)。优选地，本发明的CK19可包含由SEQ ID NO:3定义的人CK19蛋白的氨基酸序列。更优选地，本发明的CK19蛋白可以由SEQ ID NO:3所定义的氨基酸序列组成。

在本发明中，MRS和CK19蛋白的检测不特别限于其方法，只要通过本领域已知的蛋白表达水平测量方法进行检测即可。例如，可以分别使用与蛋白质特异性结合的抗体来检测或测量MRS和CK19蛋白质。具体地，本发明中蛋白的检测可以通过选自由以下各项所构成的组的方法进行：包括但不限于蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳法、免疫组织染色法(包括免疫组织化学染色、免疫细胞化学染色和免疫荧光染色)、免疫沉淀测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选器(FACS)测定、表面等离子共振(SPR)测定或蛋白芯片测定。

具体地，用于检测从潜在患者采集的胰腺样品中MRS和CK19蛋白以提供诊断胰腺癌所需信息的方法，可通过以下进行：测量从潜在患者采集的胰腺样品中MRS和CK19蛋白表达存在或不存在或MRS和CK19蛋白的表达水平，以及当CK19蛋白在胰腺样品中被表达且MRS蛋白在胰腺样品中(高)表达而将潜在患者确定为胰腺癌患者。该方法的优点在于，通过检测MRS蛋白和CK19蛋白的(高)表达，即使在不进行特定比较步骤的情况下，也可以非常准确地获得直接确定胰腺癌(特别是胰腺导管癌或胰腺导管腺癌)。在本发明的实例中对此进行了很好的描述。

此外，可以通过与阴性对照样品(特别是正常对照样品)进行比较来进行确定，并且参照上述描述可以理解这种检测或表达强度的比较。具体地，与阴性对照相比，显示出CK19蛋白的表达且MRS蛋白表达增加的细胞可以被确定为胰腺癌细胞。

因此，根据一个方面，本发明提供了

一种诊断胰腺癌的方法，该方法包括：

(b)比较在步骤(a)中测量的甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与阴性对照的表达水平，并且当甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与阴性对照的表达水平相比增加并且CK19蛋白表达时，则确定该潜在患者为胰腺癌患者。

特别地，证实了，即使在通过常规细胞病理学诊断(基于H&E染色、巴氏染色等)将胰腺细胞鉴定为非典型细胞，因此无法诊断，但通过之后对患者的随访观察而最终将患者诊断为患有胰腺癌的患者的胰腺细胞中，MRS和CK19也被高度表达和检测到。考虑到通过通常用于癌症诊断的常规病理细胞学，难以区分非典型细胞是否对应于肿瘤疾病或对应于其他良性疾病，所以确定此类非典型细胞是否对应于肿瘤在临床上是非常重要的，并且当在非典型细胞中观察到MRS的(高)表达时，可以确定该非典型细胞是肿瘤细胞，这是非常有意义的。特别地，MRS与CK19的组合利用显著减少了由于腺泡细胞引起的假阳性确定的错误，从而显著提高了胰腺癌的诊断准确度。

此外，考虑到与细胞学诊断相比，需要相对大量的活检材料的活检增加了样品采集方面对患者的身体负担，并且在某些情况下，根据癌症的进展，手术是不可能的并且组织采集大量组织是不可能的，因此在细胞水平上也能提供准确诊断的本发明的方法具有更大的优点。

当胰腺癌的诊断采用将MRS和CK19都用作标志物并检测其增加的方式时，在组织和细胞水平的检查中，敏感度、特异性、阳性预测值和/或阴性预测值基本上(几乎)都为100％。

具体地，选自由敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值所构成的组的至少一种显示出80％或更高的水平(80-100％，优选地为85-99％，更优选地为90-98％)。水平的特定值包括所有范围值，每个范围值都具有选自以下各项的两个值作为边界值：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。在本发明的一个实施方案中，具体地，在数值范围之外，可以选择80％和95％作为边界值，因此对于本领域技术人员明显的是，在80％至95％范围内的所有数值都意在涵盖于本发明中。在另一个实施方案中，敏感度、特异性、阳性预测值和/或阴性预测值显示出85％或更高的水平(85-100％，优选地为87-99％，更优选地为90-98％)，但不仅限于此。

因此，本发明提供了一种提高胰腺癌的细胞学诊断或活检的敏感度和特异性的方法，该方法包括：

(a)测量从潜在患者采集的胰腺样品中甲硫氨酰-tRNA合成酶和细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平；以及

(b)当步骤(a)中细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平被检测到，且甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平增加时，确定该潜在患者为胰腺癌患者。

对于本领域技术人员而言明显的是，敏感度、特异性、阳性预测值和/或阴性预测值的提高导致准确度的提高。因此，本发明的方法可以理解为用于提高准确度的方法，并且准确度可显示优选地为90-100％，更优选地为90-99％的水平。该水平的特定值包括所有范围值，每个范围值均具有选自由以下各项所构成的组的两个值作为边界值：90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％和100％。在本发明的一个实施方案中，具体地，在数值范围之外，可以选择92.5％和99.5％作为边界值，因此对于本领域技术人员明显的是，在93.5％至99.5％范围内的所有数值都意在涵盖于本发明中。在又一个实施方案中，准确度可以优选地为93-98％，更优选地为95-98％，但是不限于此。

(b)当步骤(a)中细胞角蛋白19(CK19)蛋白被检测到且甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平增加时，确定该潜在患者为胰腺癌患者。

作为优选实例，形态学检查旨在包括通过包括前述步骤(i)和(ii)而进行的检查，并且旨在包括遵循这种方式的所有其他形态学检查。将参考以上细节进行描述，并且本领域技术人员可以通过适当的选择来使用以上方式。

步骤(a)和(b)的具体描述如上所述，并且当这些步骤被辅助进行时(即作为辅助疗法)，这些步骤可以与形态学检查同时、分开或相继进行。此外，包括步骤(a)和(b)的确定方法可以在形态学检查之前、同时或之后进行。

此外，本发明提供了用于诊断胰腺癌的组合物或用于诊断胰腺癌的试剂盒，该组合物和试剂盒各自包含用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)和细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平的物质(特别是用于MRS或CK19的每个试剂)。

另外，本发明提供了用于诊断胰腺癌的组合物或用于诊断胰腺癌的试剂盒，该组合物和试剂盒各自由用于测量MRS和CK19蛋白表达水平的物质组成。

此外，本发明提供了用于诊断胰腺癌的组合物或用于诊断胰腺癌的试剂盒，该组合物和试剂盒各自基本上由用于测量MRS和CK19蛋白表达水平的物质组成。

此外，本发明提供了用于测量MRS蛋白的表达水平的物质在制备用于诊断胰腺癌的制剂中的用途。

在本发明中，用于测量CK19蛋白的表达水平的物质不特别局限于其种类，只要已知该试剂可用于本领域中的蛋白表达水平的测量即可。优选地，该试剂可以是针对CK19蛋白具有特异性的抗体或适体，并且其具体描述遵循上述抗MRS抗体和适体的描述。

用于测量CK19蛋白的表达水平的物质还可以意指包括用于检测CK19基因(KRT19)的表达水平的物质。蛋白表达水平的增加伴随着来自编码该蛋白的基因的转录本(例如，mRNA)的增加，因此，本领域技术人员显然可以理解，不仅可利用检测CK19蛋白本身的手段，而且可利用间接检测与CK19蛋白的表达直接相关的转录本的手段。用于检测CK19 mRNA的物质并不具体局限于其种类，只要该物质与CK19 mRNA特异性结合或杂交的配体即可，例如可以是引物(对)或探针，其描述遵循用于MRS mRNA的上述引物(对)或探针的描述。

为了测量MRS蛋白和/或CK19蛋白的表达水平，本发明的用于诊断胰腺癌的试剂盒不仅可以包括选择性识别蛋白的抗体或适体、与编码蛋白的mRNA特异性结合(杂交)的配体，或引物(对)、探针，还可包括一种或多种其他适合分析的成分、溶液或装置。参照以上描述，将理解根据特定检测方法的试剂盒的种类以及由此产生的特定组分。

有益效果

作为胰腺癌标志物的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)显示出比常规胰腺癌标志物(例如，CEA)更高的诊断准确度，因此可以通过分析甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)在胰腺细胞中的表达或不表达而清楚地确定是胰腺癌还是非胰腺癌，甚至在通过常规染色被鉴定为非典型细胞的细胞中也可以达到等价效果，因此MRS非常有助于胰腺癌的诊断。

附图说明

图1示出了通过使用经si-MRS处理的H460细胞的细胞裂解物，比较本发明的抗MRS抗体(1E8和8A12)与已知的市售MRS抗体(Ab50793)的MRS结合强度和特异性的蛋白质免疫印迹结果。

图2示出了通过使用PANC-1细胞系(胰腺癌细胞系)和SCK细胞系(非胰腺癌细胞系)的细胞裂解物，比较本发明的抗MRS抗体(1E8和8A12)与已知的市售MRS抗体(Ab137105)的MRS结合强度和特异性的蛋白质免疫印迹结果。

图3是描绘了用于研究1E8抗体与其他氨酰-tRNA合成酶(ARS)和AIMP蛋白的交叉反应性而进行的ELISA的结果的图。

图4是描述了用于研究8A12抗体与其他氨酰-tRNA合成酶(ARS)和AIMP蛋白的交叉反应性而进行的ELISA的结果的图。

图5示出了用于研究1E8抗体对MRS+AIMP3蛋白的抗体亲和性而进行的表面等离子共振(SPR)试验的结果。

图6示出了证实1E8抗体对AIMP3无反应的表面等离子共振(SPR)试验结果。

图7示出了用于研究8A12抗体对MRS+AIMP3蛋白的抗体亲和性而进行的表面等离子共振(SPR)试验的结果。

图8示出了证实8A12抗体对AIMP3无反应的表面等离子共振(SPR)试验结果。

图9比较了使用本发明的抗MRS抗体(1E8和8A12)与使用市售MRS抗体(Ab137105)对PANC-1细胞系(胰腺癌细胞系)和SCK细胞系(非胰腺癌细胞系)的免疫荧光染色结果。

图10示出了通过由用于临床部位患者样品处理的Thinprep装置(Hologic.Inc)制造类似于PANC-1细胞系的临床条件的Thinprep载玻片而进行的本发明的1E8和8A12抗体的免疫荧光染色的结果。

图11示出了从正常患者(每个数字均表示患者代码)分离的胰腺细胞中的H&E染色结果、MRS表达或不表达的观察结果以及CEA表达或不表达的观察结果。

图12示出了从胰腺癌患者(每个数字均表示患者代码)分离的胰腺细胞中的H&E染色结果、MRS表达或不表达的观察结果，以及CEA表达或不表达的观察结果。

图13示出了通过H&E染色被鉴定为非典型细胞并且随后被明确诊断为胰腺癌的患者胰腺细胞学诊断样品中MRS表达或不表达的观察结果以及CEA表达或不表达的观察结果(每个数字均表示患者代码)。

图14示出了MRS在正常胰腺组织的正常腺泡细胞中的表达水平的观察结果。

图15示出了在胰腺癌细胞(PANC-1细胞系)中对MRS和CK19蛋白的双重检测的结果，描绘了每种标志物的染色强度。

图16示出了在非胰腺癌细胞(CT26细胞系)中MRS和CK19蛋白的双重检测结果，描绘了未检测到每种标志物。

图17示出了在包含多个胰腺腺泡细胞的细胞样品中通过常规病理细胞学(巴氏染色)的染色图像和通过本发明双重染色的结果。

图18示出了通过常规病理细胞学(巴氏染色)被归类为非典型细胞，因此不可诊断，但最终诊断为患有胰腺癌的患者的胰腺细胞样品中进行本发明的双重染色的结果。

图19示出了通过常规病理细胞学(巴氏染色)而被诊断为疑似胰腺癌(恶性)而未诊断，但最终诊断为患有胰腺癌的患者的胰腺细胞样品中进行本发明的双重染色的结果。

图20示出了通过常规病理细胞学诊断为患有胰腺癌并且最终诊断为患有胰腺癌的患者的胰腺细胞样品中进行本发明的双重染色的结果。

图21示出了通过常规病理组织学(H&E染色)确定为胰腺癌组织的组织(其中胰腺癌细胞与正常细胞共存在)中进行本发明的MRS检测和另外的CK19检测的结果。

图22示出了通过常规病理组织学(H&E染色)确定为正常胰腺组织的组织中进行本发明的MRS检测和另外的CK19检测的结果(箭头表示用CK19染色的胰管区域)。

具体实施方式

在下文中，将对本发明进行详细描述。

然而，以下实施例仅用于阐述本发明，而并不意在限制本发明的范围。

实施例1：构建用于检查胰腺癌的本发明方法的有用抗体(获得对MRS具有高特异性的抗体)

已知在体内，甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)以与氨酰-tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白3(AIMP3)结合的状态存在，并且这种结合被UV照射等破坏。因此，为了基本准确地对MRS进行检测，即使在MRS与AIMP3结合的情况下，也仅需要特异性检测MRS。然而，当前的AIMP类型和ARS类型在蛋白结构方面具有许多相似性，因此商业抗体具有显示出与其他AIMP和ARS类型的交叉反应性的问题。为了本发明的胰腺癌检查方法的诊断准确度，本发明人产生了如下文所述与其他蛋白没有交叉活性的高敏感度MRS抗体。

1-1.产生MRS-AIMP3蛋白

从大肠杆菌中表达并纯化MRS-AIMP3共纯化蛋白，具体实验方法如下。转化BL21DE3菌株以表达MRS(SEQ ID:1)和AIMP3(SEQ ID NO:40，NCBI ref.NM_004280.4)，并在LB培养基中培养，然后培养单菌落，使得在5ml的含氨苄青霉素的LB液体培养基中达到OD600值为0.6-0.8。加入1mM IPTG后，将细胞在37℃孵育3小时，然后仅通过离心10分钟获得细胞。利用考马斯染色用细胞溶液进行SDS-PAGE，以检查蛋白的表达。此后，采集具有IPTG诱导过表达的细胞溶液，并离心以获得细胞。用1ml的DPBS使细胞松弛，然后使用超声发生器进行细胞裂解，然后将裂解的细胞离心，以分离出MRS-AIMP3共纯化蛋白。

1-2.通过注射MRS-AIMP3蛋白进行小鼠免疫

为了获得制备杂交瘤细胞所需的免疫小鼠，将实施例1-1中获得的MRS-AIMP3共纯化蛋白主要注射入四只8至10周龄小鼠的腹腔中。从Orient Bio Co.(韩国京畿道城南市)购买重25-30g的10周龄BALB/c小鼠。使动物在预定条件(温度：20±2℃，湿度：40-60％，光照循环：12小时亮/暗循环)下充分适应，然后用于本研究。动物实验依据首尔国立大学机构动物护理和使用委员会的准则进行。两周后，将相同剂量的MRS-AIMP3共纯化蛋白二次注入小鼠的腹腔，以增强初次免疫后小鼠的免疫力。一周后，在细胞融合的前三天，将MRS-AIMP3共纯化蛋白用增压器注射到小鼠的尾静脉。用乙醚对免疫小鼠进行麻醉后，使用肝素化注射器从心脏抽血。之后，使血液在4℃静置过夜，然后离心分离出血清。对分离的血清进行适当分配，并保存在–80℃。

1-3.制备杂交瘤细胞

首先，制备骨髓瘤细胞用于细胞融合。将骨髓瘤细胞培养至细胞密度为2.5-5×10⁴细胞/毫升。在细胞融合前24小时，通过1/3稀释制备骨髓瘤细胞。用乙醚将实施例1-2中免疫的小鼠麻醉，然后收获脾脏，之后分离B细胞。用SF-DMEM2(DMEM+2×AA)洗涤脾脏，然后进行细胞洗脱。采集细胞悬浮液，置于试管中，使其静置以沉淀重物。将上清液转移至新的试管中，然后以1500rpm离心5分钟。通过去除上清液来采集离心的脾脏细胞，并轻敲试管，然后用SF-DMEM2进行填充。将B细胞和骨髓瘤细胞分别离心并洗涤，然后再次重复洗涤。除去洗涤过的骨髓瘤细胞的上清液，并轻敲试管，然后用SF-DMEM2进行填充。此外，去除洗涤后的B细胞的上清液，轻敲试管，并用1ml的裂解缓冲剂(LB)进行处理，以裂解红细胞(RBC)，然后用SF-DMEM2进行填充。然后，将B细胞和骨髓瘤细胞分别离心，并除去离心后的脾脏细胞和骨髓瘤细胞的上清液，轻敲试管，然后用10ml的SF-DMEM2进行填充。将B细胞和骨髓瘤细胞分别在e试管中稀释100倍，并计数以确定其浓度[B细胞浓度(1×10⁸、8×10⁷、5×10⁷)，骨髓瘤细胞浓度(1×10⁷、8×10⁶、5×10⁶)]。B细胞和骨髓瘤细胞的比例确定为10:1。将具有确定浓度的B细胞和骨髓瘤细胞一起放在试管中，并离心。除去离心后的细胞的上清液，然后将试管倒置在酒精棉片上，并半干燥30秒至1分钟，然后敲击。在移液的同时，将PEG(2ml)缓慢加入到试管中1分钟，接着加入SF-DMEM2，并摇动试管，然后离心。离心后，除去上清液，并且在不敲的情况下，以逐渐增加的速度逐滴添加HT培养基[1ml的HT50×(HT(sigma)1小瓶+SF-DMEM1 10ml)、10ml的FBS、30ml的SF-DMEM1(DMEM+1×AA)]，达到50ml。将该悬浮液再次在5％CO₂培养箱中于37℃孵育3小时。

1-4.选择产生MRS特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞

为了在上述实施例1-3中制备的融合细胞组中选择特异性识别MRS但不能识别AIMP3的细胞，并研究抗体的产生或不产生，进行了以下试验。

首先，在细胞融合后8-9天更换培养基，并在cDMEM2中孵育，直到细胞在96孔和24孔中充分生长。更换培养基后，在第5-7天采集颜色已改变的孔中的上清液，并用cDMEM2进行填充，然后对每个融合细胞产生的抗体与MRS和AIMP3的结合进行ELISA试验。ELISA试验后，选择孔，并将选择的孔中的细胞转移至24孔中，然后进行孵育。在24孔中进行孵育后，再次进行ELISA试验。具体地，检查24孔中的融合细胞的浓度，并将融合细胞在15ml的培养物中稀释，以在96孔板中达到0.5细胞/孔。以每孔150μl分配融合细胞稀释液。通过显微镜检查含有一个细胞的孔。采集含有生长至一定程度的细胞的孔中的上清液，并通过ELISA和蛋白质免疫印迹法研究由各个融合细胞产生的抗体与MRS和AIMP3的结合，来进行初步筛选。将基于初步筛选而选择的融合细胞转移至24孔中，并在24孔中进行孵育，然后进行离心，接着采集上清液，并通过ELISA和蛋白质免疫印迹法进行二次筛选。通过ELISA检查在24孔中生长的融合细胞的吸光度(OD值)，从而仅选择吸光度超过1.0的融合细胞。将选择的细胞转移至25T/C培养瓶中，并在25T/C培养瓶中进行孵育，然后离心，之后采集上清液，并通过ELISA和蛋白质免疫印迹法进行三次筛选。将基于三次筛选选择的融合细胞再次转移至75T/C培养瓶中，并在75T/C培养瓶中进行孵育，之后通过ELISA检查吸光度，以选择能够很好地识别MRS但不能识别AIMP3的细胞，从而最终确保“1E8”和“8A12”克隆。

1-5.培养产生MRS特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞以及纯化抗体

可以通过以下两种方法从实施例1-4中选择的最终融合细胞(杂交瘤细胞“1E8”和“8A12”)获得针对MRS的单克隆抗体。

1)给7至8周龄的雌性小鼠的腹腔注射500μl的姥鲛烷。采集在75T/C培养瓶中培养的融合细胞并离心，然后除去上清液，之后将细胞置于磷酸盐缓冲剂中，并进行移液。施用姥鲛烷7-10天后，将实施例1-4中选择的融合细胞以8×10⁵至4×10⁷个细胞的量注射到小鼠的腹腔中。当小鼠的腹腔在12周后充满腹水时，使用18G注射器针头提取腹水。将腹水在4℃保持过夜，然后在第二天离心，从而除去含有黄色脂肪层的物质，仅分离上清液。分配分离出的上清液，并在–20℃储存。

为了从腹水中纯化抗体，在柱中填充适量的蛋白A(已储存在储液(20％乙醇)中)，然后让20％乙醇流过该柱，之后用5倍体积的结合缓冲剂(20mM磷酸钠，pH为7.0)洗涤该柱。用适量的磷酸盐缓冲剂稀释腹水，然后将其装载到蛋白A柱上。使用3倍体积的结合缓冲剂(20mM磷酸钠，pH为7.0)进行结合后，用3倍体积的洗脱缓冲剂(0.1M甘氨酸缓冲剂，pH为3.0-2.5)对5ml的级分进行洗脱。每个级分用35μl的中和缓冲剂(1M Tris-HCl，pH为9.0)进行中和。通过SDS-PAGE检查级分的纯度，并用Ammersharm GE柱脱盐。

2)将实施例1-4中获得的杂交瘤细胞在补充有GlutaMAX(Gibco)(最终5mM)和1x胆固醇脂质浓缩物(Gibco)的无血清培养基(Thermo)中适应(产生8A12抗体的杂交瘤细胞也称为34-8F2)。之后，使用Cellstack-5(纽约州康宁市Corning)以860ml的最大培养体积培养细胞。将GlutaMAX(Gibco)(最终5mM)和1x胆固醇脂质浓缩物(Gibco)添加到少血清培养基(Thermo)中，并以1.4-2.0X10⁵细胞/毫升的初始细胞浓度接种细胞。接种4-5天后，通过以2000rpm离心10分钟而除去细胞，并回收培养上清液。检查上清液的pH，然后使用所制备的20X结合溶液(1M磷酸氢二钾，pH为9.0)将pH调节至7.6。之后，使用0.22μm的过滤器过滤上清液，得到中和的抗体培养液。

通过蛋白A柱纯化所获得的抗体培养液。在使10柱体积的蒸馏水流过蛋白A柱之后，使等量的1X结合溶液(50mM磷酸氢二钾，pH为9.0)流过其中。此后，使获得的抗体培养液流过其中，以使抗体与蛋白A结合，然后用1X结合溶液(50mM磷酸氢二钾，pH为9.0)进行洗涤。为了洗脱与蛋白A结合的抗体，使2柱体积的洗脱溶液(0.2M柠檬酸，pH为3.0)流过其中，从而获得洗脱液。用1M的Tris中和洗脱液后，通过测量280nm处的吸光度而确定抗体的浓度。

之后，将GE PD-10柱用25ml生理盐水平衡，然后离心(1,000g，2分钟)。之后，将从蛋白A柱获得的2.5ml抗体洗脱液添加至GE PD-10柱，随后离心(1000g，2分钟)，从而采集与生理盐水交换的抗体溶液。通过测量280nm处的吸光度来确定抗体浓度，然后分配抗体溶液，并在-80℃保存。

1-6.抗体测序和克隆

1E8和8A12克隆表达抗体分别由YBIO公司和Abclon公司(韩国)克隆和测序。简而言之，首先从1E8或8A12杂交瘤细胞中提取RNA，以合成cDNA。然后，使用对VL、CL、VH和CH1具有特异性的引物进行PCR。在琼脂糖凝胶上纯化具有预期大小的PCR产物，通过测序鉴定其序列，并通过Kabat编号鉴定CDR区。表1示出了1E8抗体的抗原结合区的测序结果，表2示出了8A12抗体的抗原结合区的测序结果。由鉴定的序列合成Fab分子，并通过ELISA证实其显示出对MRS的高结合能力。

还证实了，上述鉴定的序列与抗体的蛋白质测序结果(质谱结果)一致，该抗体是在将杂交瘤细胞注入实施例1-5的小鼠腹腔中后通过腹水纯化获得的。

将获得的1E8 Fab或8A12 Fab序列克隆到小鼠IgG重链序列载体(pFUSE-mIgG2a-Fc，InvivoGen)和小鼠轻链(pFUSE2-CLIg-mK，InvivoGen)序列载体中。然后，使用PEI(Polysciences，23966-2)将载体共转化到自由式293F细胞，以便抗体重链和轻链在细胞中一起共表达。将转化的293F细胞在37℃和8％CO₂的条件下培养7天。然后，获得细胞，并离心，获得上清液。检查上清液的pH，然后使用所制备的20X结合溶液(1M磷酸氢二钾，pH为9.0)将上清液的pH调节至7.6。之后，使用0.22μm的过滤器过滤上清液，以获得中和的抗体培养液。通过实施例1-5的2)中所述的方法，从抗体培养液中获得抗体。证实了，如此获得的全1E8 IgG抗体由含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链组成。还证实了，如此获得的全8A12 IgG抗体由含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链组成。

[表1]

[表2]

1-7.验证抗体对MRS的结合特异性的比较-蛋白质免疫印迹法

为了研究在以上实施例中获得的1E8和8A12抗体的MRS结合能力，进行了以下蛋白质免疫印迹试验。将H460细胞在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，GE Life Sciences)和1％青霉素(HyClone，GE Life Sciences)的DMEM(HyClone，GE Life Sciences)中孵育。将所有细胞在5％CO₂和37℃的条件下孵育。将孵育的H460细胞用si-MRS处理72小时。然后，获得H460细胞，并进行裂解，然后将H460细胞裂解物进行蛋白质免疫印迹。重复该试验两次。在使用前，将1E8或8A12抗体作为一抗稀释至1:5000(0.2μg/ml)，采用相同的方法使用目前市售的MRS抗体(Abcam，Ab50793)比较结合能力，并将微管蛋白用作对照。

试验的结果如图1所示，常规的市售MRS抗体在si-MRS处理组中从未检测到MRS，与本发明的8A12和1E8抗体相比，即使在si-MRS非处理组中也显示出显著低的检测能力(与MRS的结合能力)。相反，与常规的市售MRS相比，本发明的8A12和1E8抗体显示出显著优异的MRS特异性结合能力和敏感度，特别是8A12抗体显示出非常优异的结合能力和敏感度。

此外，使用PANC-1胰腺癌细胞系和SCK细胞系(非胰腺癌细胞系)进一步研究了8A12和1E8抗体的MRS结合能力。使用市售的MRS抗体(Abcam，Ab137105)作为对照(抗体在使用前稀释至1:1000，0.137μg/ml)，并以与上述除si-MRS处理过程之外的相同的方式进行蛋白质免疫印迹。

试验结果如图2所示，本发明的8A12和1E8抗体进行了MRS特异性检测，但是在相同条件下，常规的市售抗体Ab137105显示出许多非特异性条带，这表明选择性可检测性非常低。在目前的试验条件下，在SCK细胞系(非胰腺癌细胞系)中几乎没有检测到MRS。

1-8.验证与其他蛋白的交叉反应性-ELISA

为了研究在上述实施例中获得的8A12抗体是否与其他氨酰-tRNA合成酶(ARS)蛋白具有交叉反应性，进行了以下试验。

在96孔板(Corning 3690平底，96孔半面积板)上，MRS蛋白(His-MRS和完整MRS)和其他ARS蛋白(无DX2标签、34S-DX2、34S-AIMP2、His-CRS、His-AIMP1、His-GRS、His-WRS和His-KRS)以1μg/ml的浓度包被每孔。将1E8或8A12抗体以500ng/ml的浓度添加至包被有相应ARS蛋白的96孔板中，然后孵育1小时。此后，加入HRP缀合的抗小鼠IgG二抗，之后孵育1小时，然后通过ELISA测量450nm处的吸光度。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)用作底物。

结果如图3所示，1E8抗体仅与MRS结合并发生反应，而不与其他ARS和AIMP蛋白反应。结果如图4所示，8A12抗体仅与MRS结合并发生反应，而不与其他ARS和AIMP蛋白反应。结果证实，1E8和8A12抗体与其他ARS和AIMP蛋白不具有交叉活性，并且仅特异性检测到MRS。

1-9.利用表面等离子共振验证抗体亲和性

为了研究1E8和8A12抗体的MRS特异性亲和性，使用MRS-AIMP3共纯化蛋白(以下称为MRS+AIMP3蛋白)和AIMP3蛋白进行了表面等离子共振(SPR)试验。将MRS+AIMP3或AIMP3蛋白包被在CM5芯片上，并使不同浓度的1E8或8A12抗体流下，从而测量与该蛋白的结合反应程度。以30μl/min的流速注入分析物样品或缓冲剂8分钟，然后洗涤20分钟。

结果如图5和图6所示，1E8抗体与MRS+AIMP3蛋白结合，但不与AIMP3蛋白结合。还可以验证，1E8抗体针对MRS的KD值为5.42nM。

如图7和图8所示，可验证，8A12抗体与MRS+AIMP3蛋白结合，而不与AIMP3蛋白结合。还可以验证，8A12抗体针对MRS的KD值为1.56nM。

1-10.验证MRS抗体的结合位点

为了研究1E8或8A12抗体的结合位点(表位、主要结合位点)，进行了以下试验。

首先，考虑到GST、催化结构域和tRNA结合结构域位点，构建了在MRS完整蛋白中具有不同长度和基因座的多个MRS片段，并将MRS完整蛋白或每个MRS片段克隆到pcDNA3载体(EV)中。在SEQ ID NO:1的MRS的整个氨基酸序列中，在包含几个小单位结构域的基因座上选择相应的MRS片段的基因座，包括aa 1-266的片段、aa 267-597的片段、aa 1-598的片段、aa 598-900的片段、aa 660-860的片段、aa 660-900的片段、aa 730-900的片段等。在片段中，将Myc蛋白缀合至每个肽的N-末端，并将Myc蛋白用作对照。然后，根据制造商的说明，使用Turbofect(Thermo)将2μg的克隆载体DNA转染到H460细胞中。24小时后，收获细胞，并进行蛋白质免疫印迹法。对于一抗，在使用前将1E8和8A12抗体以1:5000(0.2μg/mL)进行稀释。

通过该试验，显示1E8和8A12抗体的表位至少存在于SEQ ID NO:1的MRS蛋白中的aa 598-900区。

因此，构建了几个小单位结构域，包括aa 811-840的片段、aa 821-850的片段、aa831-860的片段、aa 841-870的片段、aa 846-875的片段、aa 851-880的片段、aa 856-885的片段、aa 861-890的片段、aa 866-895的片段和aa871-900的片段，并且将每种肽以300ng/孔包被在96孔ELISA板上，并按照通用方案进行ELISA。将作为一抗的1E8或8A12抗体稀释至10nM(1xPBST-Tween 0.05％)，并将作为二抗的HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(Thermo)稀释至1:10000(1xPBST-Tween 0.05％)。测量450nm处的吸光度。

试验结果证实，1E8和8A12抗体特异性识别MRS蛋白中aa 861-900的区域(AQKADKNEVA AEVAKLLDLK KQLAVAEGKP PEAPKGKKKK，SEQ ID NO:2)作为表位。这些试验结果表明，可以将aa 861-900的区域识别为表位的其他结合分子(其他抗体及其功能片段)也具有优异的MRS特异性结合能力和MRS鉴定能力。

下文中，将针对本发明人发明的新型胰腺癌检查方法，对使用上述构建的具有优异的MRS检测能力的抗体的实例进行描述。

1-11.利用本发明的抗MRS抗体进行胰腺癌细胞染色以及与市售抗体效果的比较

对于PANC-1胰腺癌细胞系和SCK细胞系(非胰腺癌细胞系)，使用1E8或8A12抗体进行MRS荧光染色。将市售的MRS抗体(Abcam，Ab137105)用作对照。具体地，如下进行染色。用含0.2％Tween 20的PBS对载玻片上制备的每种类型的靶细胞进行处理，以提高其细胞渗透性，然后用2％山羊血清封闭1小时。将载玻片与1μg/ml的作为一抗的本发明的抗体(由Oncotag生产的1E8或8A12抗体)或Ab137105抗体(Abcam)在37℃孵育1小时，并用0.05％TBST(500μl)洗涤3次。之后，将作为与荧光物质缀合的二抗的Alexa-488缀合的二抗(购自Molecular Probes，Cat.No.A11001)稀释至1:100，将载玻片与二抗一起在黑暗环境中在室温进行孵育，并用0.05％TBST(500μl)洗涤3次。将载玻片上的组织用20μl的添加了DAPI的封片溶液(含有DAPI的ProLong Gold防褪色剂/Molecular Probes，Cat.No.P36931)进行处理，然后用盖玻片覆盖载玻片，然后用共聚焦激光显微镜和荧光显微镜进行观察。

如图9所示，市售的Ab137105抗体已经在实施例1-7中鉴定出其MRS特异性较差，对PANC-1胰腺癌细胞和SCK细胞(非胰腺癌细胞)非特异性染色，但是本发明的1E8和8A12抗体仅特异性染色MRS。

此外，本发明的1E8和8A12抗体的染色效果通过使用用于临床部位中患者样品处理的Thinprep装置(Hologic公司)来制作的与PANC-1细胞系的临床状况类似的Thinprep载玻片而进行研究(参见下文的实施例2)。

结果如图10所示，本发明的1E8和8A12抗体可以与在临床部位经常使用的样品提供方法(Thinprep载玻片等)一起使用。

实施例2：在细胞学诊断中胰腺癌细胞特异性MRS表达检测方法(染色法)的建立以及效果验证

方法

1)通过超声内窥镜细针抽吸(EUS-FNA)获得胰腺细胞作为样本。首先，将线性阵列超声内窥镜EUS(产品名称：GF-UCT140或GF-UCT180，日本Olympus)引导至胃或十二指肠，并使用安装在EUS前端的超声装置通过超声成像鉴定胰腺肿块。通过使细针抽吸的细针(产品名称：22G Echo-ultraTM，爱尔兰科克市Cook Medical)进入超声引导的肿块中，来采集胰腺细胞。

之后，使用Cellient自动化细胞块系统(Hologic)通过常规方法将采集到的胰腺细胞作为Cellient石蜡切片提供在载玻片上(Antonio Ieni等人，超声内窥镜引导下细针抽吸胃肠道实体瘤病变中的细胞阻滞程序(Cell-block procedure in endoscopicultrasound-guided-fine-needle-aspiration of gastrointestinal solid neoplasticlesions)，World J Gastrointest Endosc，2015年8月25日；7(11):1014-1022)。或者，可以利用ThinPrep(Hologic.Inc)通过常规方法涂片或通过在ThinPrep载玻片上直接涂片来提供胰腺癌细胞(de Luna R等人，ThinPrep与常规制剂在胰腺细针抽吸活检中的比较(Comparison of ThinPrep and conventional preparations in pancreatic fine-needle aspiration biopsy)，Diagnostic Cytopathology，2004年2月，30(2):71-6)。对每个细胞样品进行以下检查方法，并比较其结果。

2)常规细胞学检查的病理结果可能是通过使用迄今经常使用的H&E染色的染色结果得出的。根据通用方案，使用苏木精和伊红进行H&E染色(参见下面实施例3中的方案细节)。或者，可以通过巴氏染色的染色结果得出病理结果。根据通用方案(参见下面实施例3中的方案细节)，使用苏木精、OG-6(橙黄G-6)和伊红天青进行巴氏染色。用常规方法除去石蜡并进行水合后，用染色物质处理石蜡切片样品。

在以下情况下，细胞确定为良性(正常)细胞：细胞涂在载玻片上一层；核质比(N/C比)小；以及核膜具有平滑形状。在以下情况下，细胞确定为恶性细胞：细胞是三维涂片；核/质比高；染色质看起来凝集；核膜具有粗糙形状；以及出现核仁和有丝分裂。当细胞变化未达到恶性细胞但不能诊断为良性时，这些细胞被鉴定为非典型细胞。

3)最终的临床诊断结果是由医生根据影像学检查(腹部超声、腹部电子计算机断层扫描、腹部磁共振成像、内窥镜逆行胆管造影和正电子发射断层扫描)和病理学检查(细胞学诊断和活检)的测量结果，通过全面的最终确定得出。

4)本发明人开发了如下用于测量胰腺细胞和正常胰腺细胞(包括良性胰腺炎细胞而不是癌细胞)中MRS表达水平的免疫组织化学(特别是免疫荧光染色)。具体地，石蜡切片进行如下处理。

①去除石蜡：将石蜡在60℃的烤箱中溶解

②水合：用二甲苯洗涤5分钟，3次，用100％乙醇洗涤2次，用95％乙醇洗涤2分钟，用90％乙醇洗涤2分钟，用70％乙醇洗涤2分钟，用D.W洗涤2分钟，然后用PBS洗涤5分钟

③提高渗透性的处理：用0.2％Triton X-100处理30分钟，并用PBS洗涤5分钟

④预处理：用2％山羊血清封闭1小时

⑤一抗处理：将抗MRS抗体(代表性地使用本发明的8A12抗体，Oncotag)稀释至1:300，在4℃与稀释的抗体一起进行孵育，并用PBS洗涤5分钟3次。

⑥显色：将与Alexa-488缀合的二抗(购自Molecular Probes，Cat.No.A11001)作为与荧光物质缀合的二抗，稀释至1:200-1:300，在黑暗环境中在室温与二抗一起孵育1小时，并用PBS洗涤5分钟3次

⑦用20μl的添加有DAPI的封片溶液(含有DAPI的ProLong Gold抗褪色剂/Molecular Probes，Cat.No.P36931)对载玻片上的组织进行处理，并用盖玻片覆盖载玻片。

通过包括步骤③至步骤⑦的方法对Thinprep载玻片进行处理，但不去除石蜡，并通过共聚焦激光显微镜和荧光显微镜观察通过该方法制备的参考样品。

根据阳性细胞样品(PANC-1，见图15)和阴性细胞样品(CT-26，见图16)，在参考样品中确定MRS染色强度，与阴性细胞对照相比显示出2倍或更多倍增加的细胞确定为胰腺癌细胞。通过将这些结果与样本的病理结果和最终临床诊断结果进行比较，来检查诊断的准确度(敏感度和特异性)。

结果

具体的试验结果在下表3、表4和表5中示出。将本发明的通过MRS染色的胰腺癌区分方法应用于14个良性胰腺细胞样品和94个胰腺癌(恶性)细胞样品中的结果显示，使用H&E染色的常规病理细胞学结果显示出约75.5％的敏感度，而本发明的MRS染色显示的敏感度为92.6％。特别地，即使通过常规的细胞病理学检查被分类为非典型的细胞样品也可以区分胰腺癌或非胰腺癌，因此通过常规的病理细胞学检查得出的阴性预测值(NPV)为36％，而通过MRS染色得出的阴性预测值显著高。这些结果表明，在本发明中，在胰腺癌中使用MRS作为标志物的染色方法即使在细胞水平也显示出高区分能力(诊断能力)，如后述的实施例3所示，本发明中用作标志物的MRS与常规的市售胰腺癌标志物(已知的胰腺癌标志物，例如CEA)明显不同，后者在细胞水平的诊断(即，细胞学诊断)中难以表现出其有效性。

[表3]

比较的详细内容：基于最终临床病理诊断结果，比较常规病理细胞学结果和根据本发明的MRS免疫染色结果

[表4]

比较总结：比较常规病理细胞学结果与最终临床病理诊断结果(在上表3中所示的常规病理细胞学结果中，恶性阳性和疑似恶性的确定归类为最终呈阳性，而非典型和恶性阴性的确定归类为最终呈阴性)

PPV：阳性预测值，NPV：阴性预测值

[表5]

比较总结：比较根据本发明的MRS免疫染色结果与最终临床病理诊断结果

PPV：阳性预测值，NPV：阴性预测值

实施例3:比较市售胰腺癌标志物CEA与本发明的MRS在细胞水平上的胰腺癌区分能力

方法

1)患者组和获得用于细胞学诊断的胰腺细胞样品

本研究是使用通过超声内窥镜下细胞抽吸(细针抽吸)从26位疑似胰腺癌患者采集和获得的26例胰腺细胞样品进行的，并通过了江南延世大学医院研究伦理委员会的批准。通过超声内窥镜细针抽吸(EUS-FNA)采用与实施例2相同的方法从患者获得胰腺细胞样品。之后，使用Cellient自动化细胞块系统(Hologic)，通过常规方法以Cellient石蜡切片或Thinprep的状态制备所采集的胰腺细胞(参见实施例2)。

通过随访观察，最终将26位疑似胰腺癌患者诊断为胰腺癌(13例)和正常胰腺(13例)。在最终被诊断为胰腺癌的13例患者中，病理学家通过组织学观察将其中七例归类为具有胰腺癌细胞，而另外六例通过组织学观察归类为具有非典型细胞，并通过随访观察最终诊断为胰腺癌。

在采集胰腺细胞时向患者提供了书面知情同意书，并且由病理学家在组织学上确认为胰腺细胞、非典型细胞和正常细胞(参见实施例2中的确定标准)。对于每种试验，附图中示出了获得的26个样品中正常细胞、肿瘤细胞和非典型细胞的各个类型的代表性诊断病例。

2)常规细胞学诊断染色

H&E染色：通过用二甲苯处理5分钟三次、用100％乙醇处理2分钟、用95％乙醇处理2分钟、用90％乙醇处理2分钟、用70％乙醇处理2分钟、用自来水处理10分钟，而对石蜡切片样品进行石蜡去除和水合。将样品与苏木精在室温孵育30秒，并用自来水洗涤10分钟。将样品与伊红在室温孵育1分钟，并用自来水洗涤10分钟。通过用70％乙醇处理1分钟、用90％乙醇处理1分钟、用95％乙醇处理1分钟、用100％乙醇处理1分钟，以及用二甲苯处理5分钟三次，而对样品进行脱水和澄清处理。将封片溶液滴在载玻片上的组织上后，用盖玻片覆盖载玻片，然后在光学显微镜下观察样品。

巴氏染色：根据装置中嵌入的方案，使用Thermo Scientific公司的Varistain24-4染色剂进行巴氏染色。方案在下表6中示出。

[表6]

3)通过常规染色根据形态病理学的细胞学诊断的确定标准

恶性肿瘤形态学诊断中最关键的证据是侵入周围正常组织的侵袭性生长，但是与有助于证明癌症与周围组织之间关系的活检不同，细胞学诊断不能证明与周围组织之间的关系，因为提取和涂片单个细胞。因此，作为备选，评估单个细胞的非典型。非典型是指，细胞核扩大和细胞质减少导致核质比(N/C比)高、染色质部分聚集而在细胞核中分布不均匀、细胞核中出现核仁、出现有丝分裂等。当显示出所有这些非典型结果，并且其程度很严重时，可以做出恶性肿瘤的诊断，但是如果部分地显示该细胞结果或其程度较弱，则应该将细胞分类为非典型细胞。原因是，即使在诸如严重炎症的良性病变中，也可能显示部分这些结果。相反，未显示任何这些结果的细胞可确定为正常细胞。当然应该假定可以在采集细胞的位置观察到细胞。

4)比较用CEA(已知的市售胰腺癌标志物)和用本发明的MRS进行的染色

用与实施例2中所述相同的方式进行MRS免疫染色。通过与实施例2中相同的程序进行MRS免疫染色，不同之处在于，癌胚抗原(CEA)抗体(购自Dako，Cat.No.M7072)用于最佳处理条件。

5)统计分析

试验结果表示为基于三个或更多个独立试验结果的平均值±标准偏差。为了获得统计学意义，使用Student's t检验分析数据，以比较多个组之间的差异。当P值小于0.05时，确定试验结果具有统计学意义。

结果

3-1.正常细胞进行免疫染色

通过EUS-FNA对从正常患者或胰腺癌患者的胰腺中分离的细胞进行H&E染色分析，对已经确定为正常的细胞使用MRS或CEA抗体进行免疫荧光染色。结果示于图11中。

如图11所示，从4位患者获得的胰腺细胞在H&E染色中未发现肿瘤特征，因此被确定为正常细胞，并且在被确定为正常的胰腺细胞中，MRS和CEA均未染色。

3-2.肿瘤细胞进行免疫染色

对从胰腺癌患者的胰腺分离出的细胞进行H&E染色的分析，在已经确定为肿瘤细胞的细胞上用MRS或CEA抗体进行免疫荧光染色。结果示于图12中。

如图12所示，从四位患者中获得的胰腺细胞在H&E染色中确定为肿瘤细胞。在所有四位胰腺癌患者的肿瘤细胞中，MRS均被强染色，与正常细胞MRS染色组相比，显示出具有统计学意义的结果(p＝0.019)。然而，仅在两位患者样品中微弱地观察到CEA染色，这表明，与正常细胞MRS染色组相比不具有统计学意义(p＝0.187)。

3-3.非典型细胞进行免疫染色

在患者的胰腺细胞上进行MRS或CEA染色，这些胰腺细胞是仅通过H&E染色不能明确确定其为肿瘤细胞，而之后通过对患者预后的随访观察最终确定为肿瘤细胞的非典型细胞。结果示于图13中。

如图13所示，尚无法明确区分通过H&E染色归类为非典型细胞的胰腺细胞是肿瘤细胞还是正常细胞。同时，非典型细胞组中包括的所有患者随后均被诊断为患有胰腺癌。在所有四位胰腺癌患者的肿瘤细胞中，MRS均被强染色，与正常细胞MRS染色组相比，显示出具有统计学意义的结果(p＝0.020)。然而，在所有四个非典型胰腺细胞中均未观察到CEA染色。

从实施例3的结果可以看出，对从疑似患有胰腺癌的患者中分离出的胰腺细胞进行H&E染色和MRS染色可以以比其他肿瘤标志物更高的准确率诊断胰腺癌。此外，常规肿瘤标志物(例如，CEA)不能清楚地区分即使通过H&E染色也不能被确定为肿瘤细胞或正常细胞的胰腺细胞是肿瘤细胞还是正常细胞，但是MRS是非常有意义的胰腺癌诊断标志物，因为MRS可以以非常高的准确度清楚地区分非典型细胞是否是肿瘤细胞。

实施例4：建立高准确度胰腺癌区分方法-MRS双重染色

4-1.寻找假阳性结果的原因

如实施例3所示，已经证明，与常规的现有胰腺癌标志物(例如，CEA)相比，MRS能够以更高的准确度诊断胰腺癌。然而，上述实施例中的试验是在已经明确确定的样品上进行的，因此，有必要研究从疑似患有胰腺癌的患者采集组织后，MRS在盲态下的诊断准确性如何。此外，如实施例2所示，MRS在胰腺癌诊断中显示出非常优异的敏感度，但是与确定胰腺癌的敏感度相比，单独的MRS显示出些稍微低的特异性趋势。本发明人在测试MRS对于从新患者获得的胰腺样品中区分胰腺癌的能力时，观察到，在病理细胞学中被确定为阴性(非胰腺癌)的十个样品中，三个样品似乎显示出MRS表达。即，已经证实，在一些正常的胰腺细胞样品中MRS的表达高，会导致假阳性结果的错误(可能做出确定将非胰腺癌样品诊断为胰腺癌)。

由于检查通过进行H&E染色以及之后进行MRS染色将整个样本区分为癌组织和正常组织而导致假阳性确定的原因的结果，如图4所示证实，在正常胰腺组织的正常腺泡细胞(存在于胰腺实质中的细胞)中，MRS表达较高。

4-2.建立用于提高MRS诊断准确度的策略

如实施例4-1中的结果所示，即使在正常的腺泡细胞中也表达高水平的MRS，因此，单独的MRS在胰腺癌的确定中会导致假阳性率(即，在单独使用MRS进行确定时，诊断的特异性相对较低)。因此，通过从结果的解释中排除这种腺泡细胞，而寻求降低假阳性率的策略。

在进行了各种试验后，本发明人首先确定，通过在几种辅助标志物候选物中使用MRS和细胞角蛋白19(CK19)作为双重标志物，可以在细胞水平上以非常高的准确度来区分胰腺癌(特别是胰腺导管癌)。因此，发明了如下使用MRS和CK19的双重染色。

4-3.建立双重染色

对于石蜡切片样品，将石蜡在60℃的烤箱中熔化，并通过用二甲苯洗涤5分钟3次、用100％乙醇洗涤2次、用95％乙醇洗涤2分钟、用90％乙醇洗涤2次、用70％乙醇洗涤2次以及用D.W洗涤2分钟而进行石蜡去除和水合。

对于MSR和CK19的双重染色，建立了特定的试验方案，使得MRS检测为绿色(AlexaFluor 488)，CK19检测为红色(Texas Red)。首先，用0.2％Triton X-100对细胞进行处理，以提高细胞渗透性。用2％山羊血清(一种封闭液)孵育1小时。之后，将胰腺细胞(样本)与一抗甲硫氨酰-tRNA合成酶抗体(1:200)和抗CK19抗体(1:100)在4℃孵育过夜。之后，将细胞浸入1X TBST中至少30次(假定一次)，洗涤细胞三次或更多次，然后与Alexa Fluor 488-缀合和Texas Red-缀合二抗(1:200至1:300，ThermoFisher Scientific，目录号A-11001/SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，目录号sc-278)在黑暗中在室温孵育1小时。通过浸入1XTBST中至少30次(假定一次)，将细胞洗涤3次或更多次。之后，将添加有DAPI的封片溶液(具有DAPI的ProDong Gold防褪色剂，Molecular probes，Cat.No.P36931)滴到载玻片上的组织上，然后用盖玻片覆盖细胞，并通过荧光显微镜观察样品。

胰腺癌区分标准如下表7所示。当检测到高水平的MRS和CK19时(表达增加)，该细胞被确定为胰腺癌细胞。也就是说，对于MRS(+)和CK19(+)，这些细胞被分类为阳性，而其他细胞则被分类为阴性。

[表7]

MRS	CK19	读出
			+	+	癌症
+	-	腺泡细胞
			-	+	胰管细胞
-	-	纤维化细胞或其他

当与CK19的表达一起，样本样品中的MRS水平与阴性细胞样品(CT-26)相比增加2倍或更多时，确定该细胞为胰腺癌细胞。染色强度基于阳性细胞样品(PANC-1)和阴性细胞样品(CT-26)的强度。

图15示出了在通过本发明的双重染色的细胞学诊断而进行的胰腺癌区分中，用于胰腺癌细胞(PANC-1细胞系)染色的MRS和CK19的染色图案(每个标志物的染色强度)，该胰腺癌细胞是为阳性对照设置而培养的。证实了在胰腺癌细胞中高强度地检测到MRS和CK19(即，每种标志物的表达显著增加)。

图16示出了在通过本发明的双重染色的细胞学诊断而进行的胰腺癌区分中，用于对为阴性对照设置而培养的非胰腺癌细胞(CT26细胞系)进行染色的MRS和CK19的染色图案(各标志物的染色强度)。在非胰腺癌细胞中基本上未检测到MRS和CK19。

图17示出了当用MRS和CK19对从患者采集的胰腺腺泡细胞样品进行染色以研究通过本发明的双重染色进行的腺泡细胞在细胞学诊断中的染色图案时，各标志物的染色强度。在腺泡细胞中，由于只有MRS的检测强度较高，因此仅强烈显示绿色信号。

实施例5：本发明的双重染色对胰腺癌区分能力的细胞学诊断评价

通过将本发明的双重染色应用至从与上述实施例使用的患者不同的患者获得的29个新的胰腺癌细胞样本，而进行胰腺癌区分。通过EUS-FNA以与上述相同的方式采集这些胰腺癌细胞。在对病理诊断结果或最终临床诊断结果不知情的情况下进行本发明的双重染色。

5-1.通过常规病理细胞学归类为非典型细胞因此无法诊断，但最终被诊断为患有胰腺癌的患者的染色图案

在通过常规病理细胞学通过巴氏染色已被分类为非典型细胞并且在最终临床诊断中被诊断为恶性的细胞样品中，本发明的双重染色被用于区分是否是胰腺癌。

如图18所示，由于本发明的双重染色，MRS(绿色)和CK19(红色)均显示高水平的检测强度，因此可以将细胞样品确定为恶性肿瘤细胞(即，胰腺癌)。通过常规病理细胞学鉴定的非典型细胞是无法诊断的，因此需要再次进行检查。证实了本发明的染色方法降低了再次检查的风险，并且在将非典型细胞区分(确定)为胰腺癌细胞或良性细胞中是非常有用的。

5-2.由于通过常规病理细胞学检查为疑似胰腺而未诊断癌患者而最终被诊断为胰腺癌的染色图案

在尚未通过巴氏染色通过常规病理细胞学诊断为胰腺癌，因此暂时被诊断为疑似胰腺癌(恶性)，但在最终临床诊断中被诊断为恶性肿瘤细胞的细胞样品中，本发明的双重染色用于区分胰腺癌细胞和良性细胞。

如图19所示，由于本发明的双重染色，MRS(绿色)和CK19(红色)均显示高水平的检测强度，因此可以将细胞样品确定为恶性肿瘤细胞(即，胰腺癌)。因此，再次证实了本发明的染色方法可降低再次检查的风险，并且在未诊断细胞的情况下在胰腺癌的区分(确定)中是非常有用的。

5-3.常规病理细胞学诊断出患有胰腺癌而最终被诊断为患有胰腺癌的患者样本中的染色图案。

在通过常规病理检查通过巴氏染色的结果分析已鉴定为非典型细胞，并且在最终临床诊断中被诊断为恶性肿瘤细胞的细胞样品中，本发明的双重染色用于区分胰腺癌细胞和良性细胞。

如图20所示，MRS(绿色)和CK19(红色)都显示出高水平的检测强度，因此可以将细胞样品确定为恶性肿瘤细胞(即，胰腺癌)。

5-4.总体结果

对各细胞样本进行本发明的双重染色获得的确定结果、最终临床病理诊断结果和病理细胞学诊断结果进行比较，比较结果示于表8中。由于本发明的双重染色，将细胞样本分类为MRS(+)和CK19(+)为胰腺癌阳性，而另一例为胰腺癌阴性(即，MRS或CK19之一被染色，或MRS(-)和CK19(-))。

[表8]

比较本发明的MRS和CK19双重染色的检查结果与最终临床病理诊断结果

PPV：阳性预测值，NPV：阴性预测值

如上表8所示，显示通过本发明的MRS和CK19双重染色确定胰腺癌的敏感度为100％，特异性为100％，阳性预测值(PPV)为100％，阴性预测值(NPV)为100％，这表明诊断准确度得以提高。

如实施例5所示，本发明的双重染色可以清楚地将恶性肿瘤细胞和非肿瘤细胞与通过常规方法不能诊断和未诊断的细胞(包括非典型细胞)区分开，从而显著提高了细胞学诊断效率。

实施例6：本发明双重染色在手术活检中对胰腺癌区分能力的评估

本发明的双重染色用于同时含有胰腺癌和周围正常胰腺区域的临床组织。将通过手术获得的组织用常规方法进行石蜡包埋，然后切片。根据本发明的双重染色和确定结果示于下表9中。如下表9所示，与细胞学诊断样品不同，该组织样品在胰腺组织中被区分为腺泡和胰管，因此可以根据区域分开确定。

[表9]

如上表9所示，试验结果证实，通过本发明的双重染色，区分胰腺癌和正常胰腺的准确度达到了100％(敏感度为100％，特异性为100％)。特别证实了，本发明的双重染色可用于提供有关正常腺泡细胞的信息，从而显著提高了诊断准确度。

图21和图22示出了用于胰腺组织样本的代表性诊断案例的各自类型。图21示出了通过H&E染色的病理结果确定为胰腺癌组织的胰腺组织的染色图案，其中通过仅染色MRS就可以在胰腺癌组织中高表达MRS；仅通过染色CK19就可在胰腺癌组织中表达CK19；并且最后，在共染色(本发明的双重染色)中检测到高水平的MRS和CK19。

图22示出了通过H&E染色被确定为正常胰腺组织的正常组织的染色图案，其中腺泡细胞和胰管细胞被证实同时存在。仅通过MRS染色就可以对腺泡细胞进行染色，而仅通过CK19染色就可以仅在胰管细胞中以红色(箭头)高度检测和观察到CK19。最后，在共染色(本发明的双重染色)中，在腺泡细胞中高度检测到MRS，并且在胰管细胞中以红色(箭头)高度检测并观察到CK19。

工业实用性

如上文所述，本发明涉及一种使用甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)诊断胰腺癌的方法。甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)作为胰腺癌标志物，显示出比诸如CEA的常规胰腺癌标志物更高的诊断准确度，因此可以通过分析甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)在胰腺细胞中的表达或非表达而清楚确定胰腺癌，甚至在通过普通染色鉴定为非典型细胞的细胞中也能达到等价效果，因此MRS可非常有助于胰腺癌的诊断，所以MRS在体外诊断行业具有很高的工业实用性。

<110> 温口特

<120> 使用甲硫氨酰-tRNA 合成酶诊断胰腺癌的方法以及利用其的胰腺癌诊断试剂盒

<130> OP20-0013/PCT/CN

<150> KR 10-2017-0113255

<151> 2017-09-05

<150> PCT/KR2018/010369

<151> 2018-09-05

<160> 72

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 900

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of MRS(methionyl-tRNA synthetase)

<400> 1

Met Arg Leu Phe Val Ser Asp Gly Val Pro Gly Cys Leu Pro Val Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Glu Val Leu Ile Ser Thr

20 25 30

Val Gly Pro Glu Asp Cys Val Val Pro Phe Leu Thr Arg Pro Lys Val

35 40 45

Pro Val Leu Gln Leu Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ala

50 55 60

Ile Cys Arg Tyr Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Glu Gln Asp Asp Leu

65 70 75 80

Thr Asn Gln Trp Leu Glu Trp Glu Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ala Leu

85 90 95

Ser Ala Ala Leu Tyr Tyr Leu Val Val Gln Gly Lys Lys Gly Glu Asp

100 105 110

Val Leu Gly Ser Val Arg Arg Ala Leu Thr His Ile Asp His Ser Leu

115 120 125

Ser Arg Gln Asn Cys Pro Phe Leu Ala Gly Glu Thr Glu Ser Leu Ala

130 135 140

Asp Ile Val Leu Trp Gly Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gln Asp Pro Ala

145 150 155 160

Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ser Ala Leu His Ser Trp Phe Gln Thr Leu

165 170 175

Ser Thr Gln Glu Pro Cys Gln Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Gln

180 185 190

Gln Gly Val Leu Ala Leu Arg Pro Tyr Leu Gln Lys Gln Pro Gln Pro

195 200 205

Ser Pro Ala Glu Gly Arg Ala Val Thr Asn Glu Pro Glu Glu Glu Glu

210 215 220

Leu Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Met Ala Val Thr Ala Trp

225 230 235 240

Glu Lys Gly Leu Glu Ser Leu Pro Pro Leu Arg Pro Gln Gln Asn Pro

245 250 255

Val Leu Pro Val Ala Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Thr Ser Ala Leu

260 265 270

Pro Tyr Val Asn Asn Val Pro His Leu Gly Asn Ile Ile Gly Cys Val

275 280 285

Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn

290 295 300

Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Thr Glu Thr

305 310 315 320

Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro Gln Glu Ile Cys Asp Lys Tyr

325 330 335

His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg Trp Phe Asn Ile Ser Phe Asp

340 345 350

Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Gln Asp

355 360 365

Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly Phe Val Leu Gln Asp Thr Val

370 375 380

Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala Arg Phe Leu Ala Asp Arg Phe

385 390 395 400

Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp

405 410 415

Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile Asn Ala Val Glu Leu Lys Lys

420 425 430

Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys Pro Val Val Gln Ser Ser Gln

435 440 445

His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu Glu Lys Arg Leu Glu Glu Trp

450 455 460

Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp Trp Thr Pro Asn Ala Gln Phe

465 470 475 480

Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr

485 490 495

Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp

500 505 510

Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile

515 520 525

Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu

530 535 540

Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala Lys Asp Asn Val Pro Phe His

545 550 555 560

Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr

565 570 575

Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu Tyr Leu Asn Tyr Glu Asp Gly

580 585 590

Lys Phe Ser Lys Ser Arg Gly Val Gly Val Phe Gly Asp Met Ala Gln

595 600 605

Asp Thr Gly Ile Pro Ala Asp Ile Trp Arg Phe Tyr Leu Leu Tyr Ile

610 615 620

Arg Pro Glu Gly Gln Asp Ser Ala Phe Ser Trp Thr Asp Leu Leu Leu

625 630 635 640

Lys Asn Asn Ser Glu Leu Leu Asn Asn Leu Gly Asn Phe Ile Asn Arg

645 650 655

Ala Gly Met Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly Gly Tyr Val Pro Glu Met

660 665 670

Val Leu Thr Pro Asp Asp Gln Arg Leu Leu Ala His Val Thr Leu Glu

675 680 685

Leu Gln His Tyr His Gln Leu Leu Glu Lys Val Arg Ile Arg Asp Ala

690 695 700

Leu Arg Ser Ile Leu Thr Ile Ser Arg His Gly Asn Gln Tyr Ile Gln

705 710 715 720

Val Asn Glu Pro Trp Lys Arg Ile Lys Gly Ser Glu Ala Asp Arg Gln

725 730 735

Arg Ala Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala Val Asn Ile Ala Ala Leu Leu

740 745 750

Ser Val Met Leu Gln Pro Tyr Met Pro Thr Val Ser Ala Thr Ile Gln

755 760 765

Ala Gln Leu Gln Leu Pro Pro Pro Ala Cys Ser Ile Leu Leu Thr Asn

770 775 780

Phe Leu Cys Thr Leu Pro Ala Gly His Gln Ile Gly Thr Val Ser Pro

785 790 795 800

Leu Phe Gln Lys Leu Glu Asn Asp Gln Ile Glu Ser Leu Arg Gln Arg

805 810 815

Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser Pro Lys Pro Ala Val Val Glu

820 825 830

Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln Ile Gln Ala Leu Met Asp Glu

835 840 845

Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg Glu Leu Lys Ala Gln Lys Ala

850 855 860

Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Leu Leu Asp Leu Lys

865 870 875 880

Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys Pro Pro Glu Ala Pro Lys Gly

885 890 895

Lys Lys Lys Lys

900

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody epitope(main binding site)

<400> 2

Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Leu

1 5 10 15

Leu Asp Leu Lys Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys Pro Pro Glu

20 25 30

Ala Pro Lys Gly Lys Lys Lys Lys

35 40

<210> 3

<211> 400

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of CK19(Cytokeratin 19)

<400> 3

Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr Ser Ser Phe Gly

1 5 10 15

Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Arg Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg

20 25 30

Ala Pro Ser Ile His Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Ser

35 40 45

Ser Ala Arg Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Tyr Gly Gly Gly

50 55 60

Tyr Gly Gly Val Leu Thr Ala Ser Asp Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp

85 90 95

Lys Val Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu Glu Val Lys Ile

100 105 110

Arg Asp Trp Tyr Gln Lys Gln Gly Pro Gly Pro Ser Arg Asp Tyr Ser

115 120 125

His Tyr Tyr Thr Thr Ile Gln Asp Leu Arg Asp Lys Ile Leu Gly Ala

130 135 140

Thr Ile Glu Asn Ser Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu

145 150 155 160

Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu Gln Ala Leu Arg

165 170 175

Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu

180 185 190

Leu Thr Leu Ala Arg Thr Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu Gly Leu Lys

195 200 205

Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Ile Ser Thr

210 215 220

Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Gln Val Ser Val Glu Val Asp Ser Ala

225 230 235 240

Pro Gly Thr Asp Leu Ala Lys Ile Leu Ser Asp Met Arg Ser Gln Tyr

245 250 255

Glu Val Met Ala Glu Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu Ala Trp Phe Thr

260 265 270

Ser Arg Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Gly His Thr Glu Gln

275 280 285

Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu Val Thr Asp Leu Arg Arg Thr Leu Gln

290 295 300

Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met Lys Ala Ala Leu

305 310 315 320

Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gln Leu Ala

325 330 335

His Ile Gln Ala Leu Ile Ser Gly Ile Glu Ala Gln Leu Gly Asp Val

340 345 350

Arg Ala Asp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Arg Leu Met Asp

355 360 365

Ile Lys Ser Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Ser Leu Leu

370 375 380

Glu Gly Gln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala Ser Lys Val Leu

385 390 395 400

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR1

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR1

<400> 5

aagtccagtc agagcctttt atatagtagc aatcaaaaga actacttggc c 51

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR2

<400> 6

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR2

<400> 7

tgggcatcca ctagggaatc t 21

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR3

<400> 8

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL CDR3

<400> 9

cagcaatatt atagctatcc gacg 24

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR1

<400> 10

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR1

<400> 11

agtgattatg cctggaac 18

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR2

<400> 12

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR2

<400> 13

tacataagct acagtggtcg cactagctac aaatcatctc tcaaaagt 48

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR3

<400> 14

Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH CDR3

<400> 15

gactatggta acttcgtagg ttacttcgat gtc 33

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR1

<400> 16

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR1

<400> 17

aaggcgagtc aggacattaa tagctattta agc 33

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR2

<400> 18

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR2

<400> 19

cgtgcaaaca gattggtaga t 21

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR3

<400> 20

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL CDR3

<400> 21

ctacagtatg atgagtttcc tcggacg 27

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR1

<400> 22

Ser Glu Tyr Ala Trp Thr

1 5

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR1

<400> 23

agtgagtatg cctggacc 18

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR2

<400> 24

Tyr Ile Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Leu Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR2

<400> 25

tacataaact acaatggcaa cactaactta aatccatctc tcaaaagt 48

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR3

<400> 26

Ser Leu Trp Pro Arg Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH CDR3

<400> 27

tcactttggc ccaggggctg gtttgcttac 30

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL

<400> 29

gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagaatt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH

<400> 30

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH

<400> 31

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaatc cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtcg cactagctac 180

aaatcatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctggagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagagactat 300

ggtaacttcg taggttactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

360

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Met

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL

<400> 33

gacattctga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatgtatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggccaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttcctcggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 34

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH

<400> 34

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Glu

20 25 30

Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Leu Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Trp Pro Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 35

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH

<400> 35

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc agtgagtatg cctggacctg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataaact acaatggcaa cactaactta 180

aatccatctc tcaaaagtcg aatctctatc attcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac aactgaggac acagccacat attactgtgc aagatcactt 300

tggcccaggg gctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 36

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 light chain

<400> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Arg Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 37

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 Heavy chain

<400> 37

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Asn Phe Val Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile

210 215 220

Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile

245 250 255

Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp

260 265 270

Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His

275 280 285

Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg

290 295 300

Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys

305 310 315 320

Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu

355 360 365

Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp

370 375 380

Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu

405 410 415

Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His

420 425 430

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 38

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 light chain

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Met

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Arg

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 39

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 Heavy chain

<400> 39

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Glu

20 25 30

Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Leu Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Trp Pro Arg Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

260 265 270

Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val

290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr

355 360 365

Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr

370 375 380

Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys

405 410 415

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu

420 425 430

Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 40

<211> 174

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AIMP3(Aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting

multifunctional protein 3)

<400> 40

Met Ala Ala Ala Ala Glu Leu Ser Leu Leu Glu Lys Ser Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ser Lys Gly Asn Lys Tyr Ser Ala Gln Gly Glu Arg Gln Ile Pro Val

20 25 30

Leu Gln Thr Asn Asn Gly Pro Ser Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ile Ala

35 40 45

Ala His Leu Val Lys Gln Ala Asn Lys Glu Tyr Leu Leu Gly Ser Thr

50 55 60

Ala Glu Glu Lys Ala Ile Val Gln Gln Trp Leu Glu Tyr Arg Val Thr

65 70 75 80

Gln Val Asp Gly His Ser Ser Lys Asn Asp Ile His Thr Leu Leu Lys

85 90 95

Asp Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Asp Lys Val Tyr Leu Thr Gly Tyr Asn

100 105 110

Phe Thr Leu Ala Asp Ile Leu Leu Tyr Tyr Gly Leu His Arg Phe Ile

115 120 125

Val Asp Leu Thr Val Gln Glu Lys Glu Lys Tyr Leu Asn Val Ser Arg

130 135 140

Trp Phe Cys His Ile Gln His Tyr Pro Gly Ile Arg Gln His Leu Ser

145 150 155 160

Ser Val Val Phe Ile Lys Asn Arg Leu Tyr Thr Asn Ser His

165 170

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR1

<400> 41

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

20 25 30

<210> 42

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR1

<400> 42

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaatc cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc 90

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR2

<400> 43

Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 44

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR2

<400> 44

tggatccggc agtttccagg aaacaaactg gagtggatgg gc 42

<210> 45

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR3

<400> 45

Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Glu

1 5 10 15

Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 46

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR3

<400> 46

cgaatctcta tcactcgaga cacatccaag aaccagttct tcctggagtt gaattctgtg 60

actactgagg acacagccac atattactgt gcaaga 96

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR4

<400> 47

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VH FR4

<400> 48

tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tca 33

<210> 49

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR1

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys

20

<210> 50

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR1

<400> 50

gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgc 69

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR2

<400> 51

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR2

<400> 52

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttac 45

<210> 53

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR3

<400> 53

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 54

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR3

<400> 54

ggggtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag aattcactct caccatcagc 60

agtgtgaagg ctgaagacct ggcagtttat tactgt 96

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR4

<400> 55

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1E8 VL FR4

<400> 56

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 30

<210> 57

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR1

<400> 57

Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr

20 25 30

<210> 58

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR1

<400> 58

gatgtgaagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ttcaatcacc 90

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR2

<400> 59

Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 60

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR2

<400> 60

tggatccggc agtttccagg aaacaaactg gaatggatgg gc 42

<210> 61

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR3

<400> 61

Arg Ile Ser Ile Ile Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln

1 5 10 15

Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 62

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR3

<400> 62

cgaatctcta tcattcgaga cacatccaag aaccagttct tcctgcagtt gaattctgtg 60

acaactgagg acacagccac atattactgt gcaaga 96

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR4

<400> 63

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 64

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VH FR4

<400> 64

tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33

<210> 65

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR1

<400> 65

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 66

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR1

<400> 66

gacattctga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgc 69

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR2

<400> 67

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Met Tyr

1 5 10 15

<210> 68

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR2

<400> 68

tggttccagc agaaaccagg gaaatctcct aagaccctga tgtat 45

<210> 69

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR3

<400> 69

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 70

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR3

<400> 70

ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga tctggccaag attattctct caccatcagc 60

agcctggaat atgaagatat gggaatttat tattgt 96

<210> 71

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR4

<400> 71

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 8A12 VL FR4

<400> 72

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 30

Claims

1.一种诊断胰腺癌的方法，所述方法包括：

(b)比较在步骤(a)中测量的所述甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与阴性对照的表达水平，并且当所述甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平与所述阴性对照的表达水平相比增加时，则确定所述潜在患者为胰腺癌患者。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括检测细胞角蛋白19(CK19)蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是胰腺细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述胰腺细胞通过细针抽吸进行分离。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中在测量所述MRS蛋白的表达水平之前、同时或之后，所述方法还包括以下步骤：

(i)用以下对从所述潜在患者采集的胰腺细胞进行染色：选自由4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、亚甲蓝、醋酸胭脂红、甲苯胺蓝、苏木精、赫斯特所构成的组的至少一种细胞核染色溶液；以及选自由伊红、结晶紫和橙黄G所构成的组的至少一种细胞质染色溶液；以及

(ii)通过对所述胰腺细胞进行染色，将所述胰腺细胞鉴定为恶性肿瘤细胞、非典型细胞或正常细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(ii)中，基于步骤(i)中所述染色的结果：

当所述胰腺细胞显示出选自由以下各项所构成的组的两种或更多种类型的形态异常时，所述胰腺细胞被鉴定为恶性肿瘤细胞：三维细胞涂片；高核质比(N/C比)；染色质凝集外观；粗型核膜；核仁外观和有丝分裂外观；

当所述胰腺细胞涂在一层；核质比(N/C比)小；且所述核膜具有平滑形状时，所述胰腺细胞被鉴定为正常细胞；并且

当所述胰腺细胞既没有导致恶性肿瘤细胞的细胞变化，也不能被确定为正常时，所述胰腺细胞被鉴定为非典型细胞。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述方法包括当所述CK19蛋白被表达且所述MRS蛋白的表达水平与所述阴性对照的表达水平相比增加时，将所述胰腺细胞确定为胰腺癌细胞。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白的表达水平使用蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫染色法、免疫沉淀测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选器(FACS)测定、表面等离子共振(SPR)测定或蛋白芯片测定中的任何一种来进行测量。

9.一种用于诊断胰腺癌的组合物，所述组合物包含用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质。

10.如权利要求9所述的组合物，还包含用于测量细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平的物质。

11.如权利要求9所述的组合物，其中所述甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白包含由SEQ IDNO:1定义的氨基酸序列。

12.如权利要求9或10所述的组合物，其中所述物质是与所述蛋白特异性结合的抗体或适体。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述抗体是与MRS中的包含由SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列的表位区域特异性结合的抗体或其功能片段。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体包括：

包含由SEQ ID NO:28定义的氨基酸序列的轻链可变区(VL)和包含由SEQ ID NO:30定义的氨基酸序列的重链可变区(VH)，或者

包含由SEQ ID NO:32定义的氨基酸序列的轻链可变区(VL)和包含由SEQ ID NO:34定义的氨基酸序列的重链可变区(VH)。

15.如权利要求9或10所述的组合物，其中所述物质是与编码所述蛋白的mRNA特异性结合的引物或探针。

16.一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求9或10所述的组合物。

17.一种用于提高胰腺癌的细胞学诊断或活检的敏感度和特异性的方法，所述方法包括：

(b)当步骤(a)中所述甲硫氨酰-tRNA合成酶蛋白的表达水平增加时，确定所述潜在患者为胰腺癌患者。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述方法具有80％或更高的敏感度。

19.如权利要求17所述的方法，其中步骤(a)还包括测量细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述方法具有80％或更高的敏感度和80％或更高的特异性。

21.用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)蛋白的表达水平的物质在制备用于诊断胰腺癌的制剂中的用途。

22.用于测量甲硫氨酰-tRNA合成酶(MRS)和细胞角蛋白19(CK19)蛋白的表达水平的物质在制备用于诊断胰腺癌的制剂中的用途。