KR100954322B1 - 췌장암과 관련된 신규한 ｌｂｆｌ313 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 췌장암에 있어서의 유전자 발현의 변화에 관한 것으로, 비-암화된 췌장조직에 비하여 차별화되게 발현된 암화된 췌장조직에서의 인간 유전자 패밀리를 이용하여 췌장암을 정확하게 진단 및/또는 치료할 수 있는 조성물 등을 제공한다.

췌장암, 악성종양, 유전자 패밀리

Description

췌장암과 관련된 신규한 ＬＢＦＬ313 유전자{Gene family(LBFL313) associated with pancreatic cancer}

도 1은 LBFL313(SEQ ID NO:2)의 분비에 대한 예측된 신호 서열을 나타낸 도면이다. 상기 분석은 시그날아이피 3.0 서버(SignalIP 3.0 Server)를 사용하여 이루어졌다(www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/).

도 2는 LBFL313이 세포의 배양 상층액에서 감지된 것을 보여주는 웨스턴 분석의 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 세포 증식(패널 A), 운동성(패널 B), 및 침윤성(패널 C)에 대한 CHO 세포의 LBFL313 과발현 효과를 나타낸 도면이다.

도 4는 종양 형성(tumorigenesis, 패널 A) 및 미세혈관(microvessel) 형성(패널 B)에 대한 누드 마우스의 LBFL313 과발현 효과를 나타낸 도면이다.

도 5는 췌장 생검 샘플 및 항-LBFL313 항체를 이용한 LBFL313 발현의 면역조직화학적 분석의 대표적인 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 췌장 암 세포주의 침윤성에 대한 폴리클로날 항-LBFL313 항체의 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 췌장암 환자의 인간 조직에 있어서의 유전자 발현의 변화에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 그에 상응하는 정상 췌장 조직 및 다른 악성종양과 비교하여 췌장암 조직에서 차별화되게 발현되는 인간 유전자에 관한 것이다.

남성 및 여성 모두에서 암 사망률 중 4번째 요인인 췌장암은 선진국의 주요한 건강상의 이슈이며, 매우 불량한 예후를 가지고 있다(Faint et al. (2004) Datamonitor DMHC2045; Garcea et al. (2005) Pancreatology 5:514-529; Kern et al. (2002) Cancer Biol Therapy 1:607-613; Laheru and Jaffee (2005) Nature Rev Cancer 5:59-467; Li et al.(2004) Lancet 363:1049-1057). 일년에 약 30,000명의 미국인이 이 병이 발병되어 죽는다. 과도한 외과 및 의학적 치료에도 불구하고, 평균기대수명이 국부 질환 환자의 경우에는 약 15-18개월이고, 전이성 질환 환자의 경우에는 3-6개월이다. 거의 100%의 췌장암 환자들은 전이를 경험하며, 그들의 제한되지 않은 성장으로 신진대사를 약화시키는 작용으로 인하여 죽음에 이르며, 절제수술을 하지 않은 환자들이 총5년을 생존할 가능성은 5% 미만에 불과하다. 또한, 특이적이지 않은 초기 증상으로 인하여 초기 진단이 어렵다는 문제점이 있다. 현재, 췌장암의 초기 감지법은 아직 개발 중에 있어 상용화되어 있지 않으며, 종래의 암치료법으로는 예후 또는 질병 결과에 거의 영향을 미치지 않는다. 췌장암의 불량한 예후는 늦은 표시, 공격적인 국부 침입, 초기 전이 및 화학요법에 대한 불충분한 반응으로 인한 것이다.

많은 다른 악성 질병과 같이 췌장암은 획득 돌연변이(acquired mutation)의 축적으로 발생한다. 원암유전자(protooncogenes)의 활성화, 종양 억제유전자(tumor suppressor genes)의 불활성화, 및 유지 유전자(maintenance genes)의 기형을 포함한 다중 유전적 및 후생유전적 변화가 췌장암의 발생, 지속된 성장, 및 전이와 관련이 있다. 이와 같은 유전자 내의 축적된 돌연변이가 "PanINs"(췌장 상피내 종양형성, Pancreatic Intraepithelial Neoplsia) 단계 동안 예상가능한 시간 안에 발생하는 것으로 알려져 있다(Hruban et al. (2000) Clin Cancer Res 6:2969-2972; Kern et al. (2002) Cancer Biol Therapy 1:607-613; Li et al. (2004) Lancet 363:1049-1057). K-ras의 돌연변이는 PanIN-1의 절반쯤에서 발생한다. PanIN-2 단계는 K-ras 돌연변이 속도의 부가의 변화 및 증가, 및 다수의 p16 기형의 외양으로 표시되며, p53 돌연변이의 존재를 나타낼 수 있는 p53 단백질 패밀리발현은 더 진보된 PanINs에서 때때로 나타난다. 종양 억제 유전자, TP53, DPC4 및 BRCA2의 손실은 췌장 종양형성, PanIN-3의 발생 후기에 생기는 것으로 보인다.

췌장암 중 췌장관에서 발생하는 췌관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma)이 90% 이상을 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암을 말하는 것이다. 췌관 선암은 췌장 선암 또는 췌장 선관암이라 불리기도 한다. 췌관 선암의 85% 이상이 췌장암 발생에서 활성화시킨 K-ras 유전자 점돌연변이(point mutation)를 가지고 있다(Li et al. (2004) Lancet 363:1049-1057; Xiong (2004) Cancer Chem Pharm 54:S69-77). K-ras 돌연변이는 세포 증식을 유도하여 이 유전자에 점돌연변이를 포함하는 세포상에 형질전환 성질을 부여하도록 하는 세포내 신호 경로(intracellular signaling pathway)인 Ras-Raf-MEK-ERK의 구성성분 활성화를 야기시킨다. 라스(ras) 돌연변이는 종양 단계 또는 예후에 연관되지 않으며, K-ras 발암유전자가 발암의 개시에 관련될 수 있으나 인간 췌장암의 악성일 가능성 또는 촉진에 연관되지는 않는 것을 가리킨다. 라스(ras) 패밀리의 주요한 다운스트림 타겟(downstream target) 중의 하나는 포스포이노시톨 3 키나제(phosphoinositol 3 kinase, PI3K)이다. PI3K의 활성화는 화학요법 또는 분자 약물표적화 약제에 의하여 유도된 세포사멸(apotosis)에 대한 췌장암 내성에 관련된다.

p16 종양 억제 유전자의 불활성화는 약간 후에 발생한다. p16 유전자는 프로모터 메틸화(promoter methylation)와 연관된 돌연변이, 동형접합 결실(homozygous deletion) 또는 전사 사일런싱(transcriptional silencing)에 의하여 실질적으로 모든 선관 선암(ductal adenocarcinomas)내에서 불활성화된다(Kern et al. (2002) Cancer Biol Therapy 1:607-613; Maitra et al. (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226). p16 단백질은 p16/Rb 경로를 통하여 세포 사이클을 조절하므로, p16 유전자의 유전적인 불활성화는 세포 사이클의 결정적인 조절인자가 췌장암에서는 분실된 것을 의미한다. 중요하게도 p16 유전자 내의 유전 돌연변이는 가족성 이형성 다중 몰 흑색종(Familial Atypical Multiple Mole김 Melanoma, FAMMM) 증상의 원인이며, FAMMM 환자는 흑색종 및 췌장암을 발병시키는 증가된 위험률을 가지고 있다.

TP53 유전자 불활성화는 거의 언제나 2번째 대립유전자(allele)의 손실과 연결된 한 대립유전자 내에서 유전자 내의 돌연변이에 의하여 발생된다(Maitra et al. (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226). p53의 기능부전은 두개의 결정적인 세포수의 조절, G1/S 세포 사이클 체크포인트 및 G2/M 저지의 유지를 의미하며 대부분의 췌장암 내에서 조절되지 않는다.

SMAD4로 알려져 있는 DPC4 유전자는 췌장암에서는 1/2 이상, 동형접합 결실에 의하여 35% 및 잔여의 대립유전자의 손실과 연결된 유전자 내의 돌연변이에 의하여 20% 불활성화된다(Maitra et al. (2006) Best Pract Res Clin Gastroenterol 20:211-226; Wilentz et al. (2000) Am J Pathol 156:37-43). 그러나 DPC4의 유전적 비활성화는 다른 종양 형태에서는 거의 드물게 보이는 것이다. dpc4 단백질은 TGF-B 경로를 통한 신호 및 성장 조절에 있어서 결정적인 역할을 한다.

DNA 교정(DNA repair)과 관련된 BRCA2 유전자는 췌장암의 적은 퍼센트(~10%)로 타겟될 뿐이나, 가족직접성(familial aggregation) 췌장암을 야기시킨다(Maitra et al. (2006) Best Parct Res Clin Gastroenterol 20:211-226; Murphy et al. (2002) Cancer Res 62:3789-3793). (6174delT BRCA2 유전자 돌연변이라 불리우는) BRCA2 유전자의 단일염기쌍의 캐리어는 췌장암을 발병시킬 10배로 증가된 위험률을 가지고 있다.

p65(RelA)/p50 헤테로다이머로서 주류를 이루어 존재하는 전사인자인 핵인자 카파비(Nuclear factor κB, NF-κB) 또한 췌장암과 연관된 유전자 중의 하나로 여겨진다(Garcea et al. (2005) Pancreatology 5:514-529; Xiong (2004) Cancer Chem Pharm 54:S69-77). NF-κB의 p65 서브유니트인 RelA는 췌장암의 약 67%에서 구조적으로 활성화되나, 건강한 췌장 조직에서는 그렇지 않으며, IκBα는 인간 췌장종양 조직 및 세포주에서는 과발현된다. RelA의 구조적 활성화는 췌장 종양 세포내에서 라스(ras)와 같은 상행 신호경로(upstream signaling pathway)와 상호연관되어 있는 것으로 보인다. NF-κB는 췌장암내의 세포독성 약제에 의하여 유도된 세포사멸에 대한 종양 내성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 시사되어 왔다. 다른 결과 또한 췌장의 세포성장을 촉진하는 것으로 보이는 NF-κB의 주요한 메카니즘이 세포사멸의 저해를 통해서라는 것을 보여준다.

췌장암을 보다 정확히 진단할 수 있는 물질 및/또는 방법에 대한 기술이 요구되어 왔다. 또한, 췌장암을 효과적으로 치료할 수 있는 물질 및/또는 방법에 대한 기술도 요구되어 왔다.

상기한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 췌장암을 정확하게 진단할 수 있는 물질, 조성물 및/또는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 췌장암을 효과적으로 치료할 수 있는 물질, 조성물 및/또는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

본 발명은 이하 LBFL313이라 지칭하는, 정상 췌장 조직과 비교하여 췌장암 조직 내에 다르게 발현된 신규한 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 서열목록 1(SEQ ID NO:1) 또는 그와 상보적인(complement) 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 (a) 서열목록 1의 염기서열을 포함하는 단리된 핵산분자; (b) 서열목록 2의 아미노산서열을 코딩하는 단리된 핵산분자; (c) 암에서 발현되는 단백질을 코딩하며, 서열목록 1의 염기서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단리된 핵산분자; 및 (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산분자와 상보적인 서열을 포함하는 단리된 핵산분자;로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산분자를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 함유하는 하나 또는 그 이상의 발현조절인자(expression control elements)와 실시가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 더욱 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하도록 형질전환된 호스트 세포, 및 단백질이 발현되는 조건하에서 본 발명의 핵산 분자로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 단백질 제조방법을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 서열목록 2(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열을 포함하거나 SEQ ID NO:2와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 보여주는 단리된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합한 단리된 항체 또는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 췌장암 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 핵산 분자를 발현하는 세포를 약제에 노출시키는 단계; 및 약제가 상기 핵산 분자의 발현을 조절하는지의 여부를 결정하여 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 약제를 동정하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 약제를 동정하는 방법을 더욱 제공한다.

본 발명은 단백질을 발현하는 세포를 약제에 노출시키는 단계; 및 약제가 상기 단백질의 농도(level) 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는지의 여부를 결정하여 단백질의 농도 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는 약제를 동정하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 단백질의 농도 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는 약제를 동정하는 방법을 더욱 제공한다.

본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 약제를 효과적인 양으로 투입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 방법을 더욱 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 적어도 하나의 활성을 조절하는 약제를 효과적인 양으로 투입하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 단백질의 적어도 하나의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 단백질을 잠재적 결합 파트너(potential binding parter)에 노출시키는 단계; 및 상기 잠재적 결합 파트너가 상기 단백질에 결합하는지를 결정하여 단백질에 대한 결합 파트너를 동정하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 단백질에 대한 결합 파트너를 동정하는 방법을 더욱 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 방해하거나 조절할 수 있는 약제를 동정하는 방법을 더욱 제공한다. 특별히, 상기 단백질 또는 그 단편 및 결합 파트너를 테스트 약제에 접촉시키고 상기 테스트 약제가 본 발명에 따른 단백질을 상기 결합 파트너에 결합시키는 것을 방해하거나 감소시키는지를 결정함으로써 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 방해, 감소 또는 조절하는 능력에 대하여 약제를 테스트할 수 있다.

본 발명은 상기 단백질을 결합 파트너로 결합시키는 것을 감소시키거나 방해하는 약제를 효과적인 양으로 투입하는 단계를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 결합 파트너와 본 발명에 따른 단백질의 회합결합을 감소 또는 방해하는 방법을 더욱 제공한다. 본 방법은 본 발명에 따른 단백질 또는 결합 파트너에 결합하는 약제를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 단백질은 리간드, 치료약 품 또는 다른 형태의 작은 화학 분자를 제공하기 위한 합리적인 약품 디자인을 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 양자택일로 작은 분자 또는 상기에 기술한 스크리닝 검사에 의하여 동정한 다른 화합물은 합리적인 약품 디자인에서 "리드 화합물(lead compound)"로 작용할 수 있다.

본 발명은 프로모터 또는 인핸서 요소에 실시가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 암세포 내로 삽입하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하도록 변형된 비-인간 유전자이식 동물(non-human transgenic animlas) 또는 본 발명에 따른 암호화된 폴리펩티드의 발현이 방지될 수 있게 돌연변이된 핵산 분자를 포함하도록 변형된 비-인간 유전자이식 동물을 더욱 제공한다.

본 발명은 또한 이 동물의 게놈으로부터 SEQ ID NO:1의 모든 또는 일부분을 포함하는 모든 또는 일부분의 유전자가 이 동물의 게놈으로부터 탈락(knock-out)되거나 결실삭제된 비-인간 유전자이식 동물을 포함한다.

본 발명은 검체의 조직, 혈액, 소변 또는 다른 샘플을 획득하는 단계 및 본 발명에 따른 핵산 분자의 발현 정도 또는 폴리펩티드를 결정하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법을 더욱 제공한다.

본 발명의 조성물은 희석액(diluent) 등을 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

I. 일반적인 사항

1. 전반적인 기술

본 발명은 정상 인간의 췌장 조직과 비교하여 인간 췌장암 조직에 다르게 발현된 신규의 유전자 패밀리의 동정에 대한 것이다. 이 유전자 패밀리는 SEQ ID NO:1의 인간 cDNA에 해당된다.

본 발명에 의한 유전자 및 단백질은 췌장암을 감지하거나 샘플 내의 정상 조직과 췌장암을 식별하기 위한 진단 약제 또는 마커로 사용될 수 있다. 그들은 또한 유전자 발현 또는 활성을 조절하는 약제에 대한 타겟으로 작용할 수 있다. 예를 들면, 췌장암의 증식성 과정을 포함하여 종양의 성장과 연관된 생물학적 과정을 조절하는 약제를 확인할 수 있다.

2. 구체적인 실시예

A. 췌장암과 연관된 단백질

본 발명은 단리 단백질, 단백질의 대립유전자 변형, 및 단백질의 보존적 아미노산 치환을 제공한다. 여기에 기재한 바와 같이, 부분적으로 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 SEQ ID NO:2에 나타낸 인간 아미노산 서열을 갖는 단백질을 가리킨 다. 이 용어는 또한 자연적으로 발생하는 대립유전자 변형 및 특별하게 상기에 기재된 것과 약간 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 나타낸다. 상기에 기재된 것과 약간 다른 아미노산 서열을 포함한다 할지라도 대립유전자는 이들 단백질과 연관된 동일한 또는 유사한 생물학적 기능을 여전히 가질 것이다.

여기에 기재된 바와 같이, SEQ ID NO:2의 인간 아미노산 서열과 연관된 단백질 패밀리는 인간에 더하여 유기체로부터 단리되었던 단백질을 가리킨다. 이들 단백질과 연관된 다른 일부 단백질 패밀리를 확인하고 단리하기 위하여 사용된 방법들이 하기에 기재된다.

본 발명의 단백질은 바람직하게는 단리형이다. 여기에 사용한 바와 같이, 일반적으로 단백질과 연관된 세포 구성성분으로부터 단백질을 제거하기 위하여 물리적, 기계적 또는 화학적 방법들이 사용될 때, 단백질이 단리된다고 한다. 당업자는 단리 단백질을 얻기 위한 표준 정제 방법을 용이하게 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질은 SEQ ID NO:2의 삽입, 결실 또는 보존적인 아미노산 치환 변형을 더욱 포함한다. 여기에 사용한 바와 같이, 보존적인 변형은 단백질의 생물학적 기능에 역으로 작용하지 않는, 아미노산 서열의 변경을 의미한다. 치환, 삽입 또는 결실은 변경된 서열이 단백질과 연관된 기능을 방해하거나 붕괴할 때 단백질에 역으로 작용한다고 한다. 예를 들면, 단백질의 전체 전하, 구조 또는 소수성/친수성 성질은 생물학적 활성에 역으로 작용하지 않고 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들면 단백질의 생물학적 활성에 역으로 작용하지 않고, 펩티드가 보다 소수성이 되거나 친수성이 되도록 아미노산 서열은 변경될 수 있다.

통상적으로, 대립유전자 변형, 보존적 치환 변형, 및 일부 단백질 패밀리는 SEQ ID NO:2에 기재된 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70% 또는 75%의, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80-90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92-94%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 서열을 정렬시키고 필요시 최대 퍼센트의 상동성을 갖기 위한 간격을 도입한 후에 서열 동일성의 일부분으로서 보존적 치환을 고려하지 않고(연관 매개변수에 대해서는 섹션 B 참조), 서열 후보의 아미노산 서열 잔기의 퍼센트가 SEQ ID NO:2와 동일하듯이 이러한 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 여기에 정의된다. 융합 단백질, 또는 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 펩티드 서열로의 삽입은 상동성에 작용한 것으로 파악되지 않는다.

그리하여 본 발명에 따른 단백질은 SEQ ID NO:2에 개시된 아미노산 서열을 가진 분자; 이들 단백질의 적어도 약 3,4,5,6,10,15,20,25,30,35의 연속적인 서열 또는 보다 많은 아미노산 잔기를 가진 그 단편; 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 개시된 코딩 서열로 또는 안에서 N- 또는 C-말단이 삽입된 아미노산 서열 변형체; 적어도 하나의 잔기가 치환된 개시된 서열의 아미노산 서열 변형체, 또는 상기에 정의된 그 단편을 포함한다. 또한 펩티드 또는 폴리펩티드로 불리우는 이러한 단편은 명백한 소수성 부위뿐만 아니라 기존의 단백질 도메인에 해당하는 아미노산 서열의 부위로 확인되는 단백질의 항원성 부위, 기능성 부위를 포함할 수 있다. 맥벡터(MacVector, Oxford Molecular)와 같은 일반적으로 사용할 수 있는 단백질 서열 분석 소프트웨어를 사용함으로써 이들 부위는 용이하게 확인 할 수 있 다.

예상된 변형체는 예를 들면, 상동성 재배열, 특정부위 또는 PCR 돌연변이 유발, 및 토끼, 마우스, 돼지, 소, 양, 말 및 비인간 영장류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 동물 종의 이에 상응하는 단백질, 및 대립 유전자 또는 다른 자연적으로 발생하는 단백질 패밀리의 변형체; 및 자연적으로 발생하는 아미노산 이외의 작용기(예를 들면, 효소 또는 방사성 동위원소와 같은 감지가능한 작용기)로 치환, 화학적, 효소적 또는 다른 적절한 수단에 의하여 공유적으로 변형된 유도체에 의하여 예정된 돌연변이를 포함하는 것을 더욱 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩티드 및 희석액을 포함하는 조성물을 더욱 포함한다. 적절한 희석액은 수용성 및 비-수용성 용매 또는 그 조합일 수 있으며, 부가의 성분, 예를 들면, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성, 용해도, 활성도, 및/또는 저장에 기여하는 수-용해성 염 또는 글리세롤을 포함할 수 있다.

하기에 기술한 바와 같이, (1) 단백질의 레벨 또는 적어도 하나의 활성도를 조절하는 약제를 확인하기 위하여, (2) 단백질의 결합 파트너를 확인하기 위하여, (3) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생산하는 항원으로서, (4) 치료제 또는 타겟으로서, 및 (5) 췌장암 및 다른 증식성 질병의 진단 약제 또는 마커로서 단백질 패밀리의 일부를 사용할 수 있다.

B. 핵산 분자

본 발명은 SEQ ID NO:2를 갖는 단백질 및 바람직하게는 단리형태인 여기에 기술된 연관 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 더욱 제공한다. 여기에 사용된 바와 같이, "핵산"은 상기에 정의된 바와 같이 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 RNA 또는 DNA로 정의되며, 이 펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 보완적이고, SEQ ID NO:1의 핵산에 하이브리다이제이션(hybridization, 혼성화)하고 적절히 엄격한 조건하에서 그것에 안정하게 결합된 상태이며, SEQ ID NO:2의 펩티드 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 약 80-90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92-94%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 SEQ ID NO:1의 오픈리딩프레임(open reading frames)에 대한 적어도 50%, 60%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 약 80-90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92-94%, 및 더더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 보여준다.

본 발명은 SEQ ID NO:1의 상보적인 결합에 특이적으로 하이브리다이제이션하는 단리 핵산 분자, 특히 오픈리딩프레임에 대하여 특이적으로 하이브리다이제이션하는 분자를 더욱 포함한다. SEQ ID NO:1의 상보적인 결합에 특이적으로 하이브리다이제이션하는 이러한 분자는 일반적으로 엄격한 하이브리다이제이션 조건하에서 그와 같이 한다.

자연산 또는 합성된 것으로부터 유래되었거나 아니던 간에 대체 뼈대(alternative backbones)를 기초로 하거나 대체 염기(alternative bases)를 포함하는 핵산뿐만 아니라 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스 분자가 특히 계획된 것이 다.

뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 레벨에서의 상동성 또는 동일성은 서열 유사성 탐색을 위하여 맞춰진 블라스트피(blastp), 블라스트엔(blastn), 블라스트엑스(blastx), 티블라스트엔(tblastn) 및 티블라스트엑스(tblastx)를 이용한 알고리즘을 사용한 블라스트(BLAST; Basic Local Alignment Search Tool) 분석에 의하여 결정된다(Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 및 Karlin et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 둘 다 참고문헌으로 기재됨). 블라스트 프로그램에 의하여 사용된 접근은 쿼리 서열(query sequence) 및 데이타베이스 서열 사이에서 갭이 있거나 없는 유사한 세그먼트를 우선 고려하고 나서 확인될 모든 매치(matches)의 통계학적 중요성을 평가하고 결국에는 사전선택된 중요성의 경계를 만족하는 이들 매치를 요약하는 것이다. 서열 데이타베이스의유사성 탐색에서의 기본적인 이슈를 검토하기 위하여, Altschul 문헌을 참조한다(Altschul et al. (1994), Nat. Genet. 6:119-129). 컷오프, 매트릭스 및 필터 (낮은 복잡도)를 제외하고 (즉, 데이타베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계학적 중요성 경계) 히스토그램, 기재, 배열에 대한 서치 파라미터는 디폴트로 설정한다. 블래스트피, 블라스트엑스, 티블라스트엔, 및 티블라스트엑스에서 사용된 디폴트 스코링 매트릭스(default scoring matrix)는 블러섬62 매트릭스(BLOSUM62 matrix, Henikoff et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 참조문헌으로 모두 기재됨)로, 길이가 85개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 쿼리 서열을 위하여 권장된다.

블라스트에 대해서, 스코링 매트릭스는 N(곧, 부적당하게 짝지워진 잔기에 대한 페날티 스코어)에 대한 M(즉곧, 짝지워진 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어)의 비에 의하여 설정되며, 여기에서 M 및 N에 대한 디폴트 값은 각각 5와 -4이다. 4개의 블라스트엔 파라미터는 하기와 같이 조절된다: Q=10 (갭 생성 페날티); R=1- (갭 연장 페날티); 윙크=1 (쿼리를 따라 매번 깜박거리는 위치에서 단어 히트를 생성); 및 갭더블유(gapw)=16 (갭이 벌어진 배열이 생성된 것에서 윈도우 두께를 설정). 동등한 블라스트피 파라미터 설정치는 Q=9; R=2; 윙크=1; 및 갭더블유=32였다. GCG 패키지 버젼 10.0에서의 서열 사이의 최적합(bestfit) 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 페날티) 및 LEN=3 (갭 연장 페날티)을 사용하며 단백질의 동등한 설정치 GAP=8 및 LEN=2이다.

"엄격한 조건(stringent conditions)"은 (1) 세척을 위하여 낮은 이온 세기 및 고온에서 실시, 예를 들면, 50℃에서 0.015M NaCl/0.0015M 소듐사이트레이트/0.1% SDS, 또는 (2) 하이브리다이제이션하는 동안 포름아마이드와 같은 변성 약제, 예를 들면, 42℃에서 0.1% 소혈청 알부민를 포함하는 50%(v/v) 포름아마이드/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM NaCl, 75mM 소듐 시트레이트를 포함하는 50mM 소듐 포스페이트 완충액을 사용하는 것이다. 다른 예는 42℃의 50% 포름아마이드, 5×SSC(0.75M NaCl, 0.075M 소듐 시트레이트), 50mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5×덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA(50㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트에서 하이브리다이제이션하고 42℃의 0.2×SSC 및 0.1% SDS에서 세척한다. 당업자는 명백하고 감지가능한 하이브리다이제이션 신호를 얻기 위하여 적절하게 엄격한 조건을 용이하게 결정하고 변경할 수 있다. 바람직한 분자는 상기한 조건하에서 SEQ ID NO:1의 상보적인 결합에 하이브리다이제이션하고 기능성 또는 전체 길이의 단백질을 암호화하는 분자이다. 더욱 더 바람직한 하이브리다이제이션된 분자는 상기한 조건하에서 SEQ ID NO:1의 오픈리딩프레임의 상보쇄(complement strand)에 하이브리다이제이션된 것이다.

여기에 사용된 바와 같이, 핵산 분자는 핵산 분자가 다른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 오염물질로부터 실질적으로 분리되었을 때 "단리"되었다고 한다.

상기의 핵산 분자는 Escherichia coli DH5α/p313-JF3의 형태로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대전광역시 유성구 어은동 52)에 2006년 6월 5일자, 기탁번호 KCTC 10954BP로 기탁되었다.

본 발명은 개시된 핵산 분자의 단편을 더욱 제공한다. 여기에 사용된 바와 같이, 핵산 분자의 단편은 코딩 또는 코딩되지 않은 서열의 작은 부분을 가리킨다. 단편의 크기는 의도된 용도에 의하여 결정될 것이다. 예를 들면, 단편이 단백질의 활성 부위를 암호화하기 위하여 선택된다면, 그 단편은 단백질의 기능성 부위를 암호화하기에 충분히 클 필요가 있을 것이다. 예를 들면, 예측된 항원 부위에 대응하는 펩티드를 암호화하는 단편이 준비될 수 있다. 만약에 단편이 핵산 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용된다면, 단편 길이는 프로빙/프라이밍하는 동안에 상대적으로 적은 수의 긍정 오류위양성(false positives)를 얻기 위해 선택된다(섹션 G를 참조).

유전자증폭기술(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 프로브 또는 특이적 프라이머로서, 또는 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 합성하기 위하여 사용된 본 발명에 따른 핵산 분자의 단편(곧, 합성 올리고뉴클레오티드)은 화학적 기술, 예를 들면, 매튜치 등(Matteucci et al., (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191)의 포스포라미다이트(phosphoramidite) 방법 또는 자동화 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다. 더욱이, 보다 더 큰 DNA 세그먼트는 다양한 유전자의 모듈라 세그먼트를 확인하는 올리고뉴클레오티드 그룹의 합성한 후에 완전하게 변형된 유전자를 만들기 위하여 올리고뉴클레오타이드의 리라이게이션을 하는 잘 알려진 방법에 의하여 제조할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 진단용 및 프로브용 감지가능한 라벨을 포함하기 위하여 더욱 변형될 수 있다. 다양한 이러한 라벨은 본 발명의 분야에서는 알려져 있으며, 여기에 기술된 암호화하는 분자와 함께 용이하게 사용될 수 있다. 적절한 라벨로 비오틴, 방사선 동위원소로 식별되거나 또는 형광성으로 라벨된 뉴클레오티드 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 본 발명에 의한 핵산 분자의 라벨링된 변형체를 얻기 위하여 이와 같은 모든 라벨을 용이하게 사용할 수 있다.

C. 기타 연관된 핵산분자의 단리

상기에서 설명한바와 같이, 전술한 서열을 추가하여 다른 군의 단백질 그룹 을 암호화하는 핵산분자를 단리하기 위하여 SEQ ID NO:1을 가지는 핵산분자의 동정 및 분석은 당업자에게 있어 자명하다. 게다가 현재 알려져있는 SEQ ID NO:2를 가지는 단백질을 추가하여 다른 군의 단백질 그룹을 암호화하는 핵산분자를 단리하기 위한 방법 또한 당업자에게 자명하다.

이를테면, 당업자는 고유의 세포로부터 준비된 스크린 발현 라이브러리의 항체 프로브를 생산하기 위한 SEQ ID NO:2의 핵산서열을 즉시 사용할 수 있다. 전형적으로, 정제된 단백질(하기에 나타낸) 또는 단일 항체로 면역화된 토끼와 같은 포유류로부터 얻은 다클론 혈청은 다른 군의 단백질 그룹의 적절한 코딩 서열을 얻기 위하여 람다 gtll 라이브러리와 같은 유전자 발현 라이브러리 또는 포유류 cDNA 프로브를 사용할 수 있다. 클론된 cDNA 서열은 융합단백질로 발현될 수 있고, 자체 조절 서열을 사용하여 직접적으로 발현할 수 있거나 또는 효소의 발현을 위한 각각의 숙주에 알맞은 조절 서열을 사용한 구성에 의해 발현될 수 있다.

대신에, 전술된 코딩 서열의 일부는 합성될 수 있고 어떠한 포유류로부터 얻어진 단백질 그룹의 군을 암호화하는 DNA를 얻기위한 프로브로서 사용되어진다. 약 18-20의 뉴클레오티드(6-7의 아미노산 가지를 암호화하는)를 포함하는 올리고머가 제조되고 불필요한 수준의 위양성(false positives)을 제거하기 위하여 충분히 엄격한 조건 또는 엄격한 조건하에서 하이브리드(hybrid, 혼성체)를 얻기 위한 스크린 지노믹 DNA(screen genomic DNA) 또는 cDNA로 사용된다.

게다가, 올리고핵산 프라이머 쌍은 핵산분자를 암호화하는 클론을 선별하기 위한 PCR에 사용하기 위하여 제조될 수 있다. 당업계에서 잘 알려진 PCR 프라이머 의 사용에 있어서 PCR 변성/풀림/연장 주기는 다른 암호화된 핵산분자의 단리에 즉시 사용하기에 적합할 수 있다.

단백질 그룹의 다른 군을 암호화하는 핵산분자는 또한 PSI-BLAST(Altschul et al. (1997), Nucl . Acids Res. 25:3389-3402); PHI-BLAST(Zhang et al.(1998), Nucl. Acid Res. 26:3986-3990), 3D-PSSM(Kelly et al.(2000), J. Mol . Biol. 299:499-520); 그리고 다른 컴퓨터적 분석 방법(Shi et al.(1999), Biochem . Biophys, Res. Commun. 262:132-138 및 Matsunami et al.(2000), Nature 404:601-604)과 같은 방법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 컴퓨터적인 방법을 사용 가능한 다른 서열 정보 또는 지노믹유전자의 존재하에 동정되어질 것이다.

D. 핵산분자를 포함하는 rDNA 분자

본원발명은 나아가 코딩 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자(rDNAs)를 제공한다. 상기에서, rDNA 분자는 인시츄(in-situ)에서의 분자적 조작을 한 DNA 분자를 말한다. rDNA 분자를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌("Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. In the preferred rDNA molecules, a coding DNA sequence is operably linked to expression control sequences and/or vector sequences")에 나타나 있다. 우선적으로 DNA 서열을 코딩하는 rDNA 분자는 조절 서열 및/또는 벡터 서열을 발현할 수 있도록 결합된다.

본 발명에서 하나의 단백질 그룹을 암호화하는 서열의 벡터 및/또는 발현 조 절 서열의 선택은 공지되어 있으며, 단백질 발현 및 형질변환된 숙주세포의 바람직한 기능적 특성에 의해 즉시 결합된다. 본 발명에 의해 고안된 벡터는 적어도 숙주의 염색체 안에 직접적으로 복제 또는 삽입될 수 있고, 또한 바람직하게는 rDNA 분자에 포함된 구조유전자를 발현한다.

공지된 기술인 사용실시가능하게 결합된 단백질의 암호화된 서열 발현 조절에 사용된 발현 조절 인자는 프로모터, 구성 프로모터, 분비 시그널 및 기타 조절인자를 유도할 수 있는 발현조절인자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 유도 가능한 프로모터는 숙주 세포의 환경이 영양분에 민감한 것과 같이 즉시 조절된다.

실시예에서, 코딩된 핵산분자를 포함하는 벡터는 예로, 직접적인 자율 복제가 가능하고 박테리아 숙주 세포, 형질변환된 세포와 같은 원핵 숙주세포에서 염색체외적(extrachromosomally)으로 재조합 DNA 분자를 유지할 수 있는 DNA 서열을 가지는 원핵세포의 레플리콘(Prokaryotic replicon)을 포함할 것이다. 이러한 레플리콘은 당업계에 잘 알려져있다. 게다가, 원핵세포의 레플리콘을 포함한 벡터는 약제내성과 같은 검출 마커를 발현하는 유전자를 또한 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아의 약제내성 유전자는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린에 저항성을 갖는다.

원핵세포의 레플리콘을 포함하는 벡터는 E. coli와 같은 박테리아 숙주 세포의 코딩 유전자 서열을 직접적으로 발현(전사 및 번역)시킬 수 있는 원핵 또는 박테리오파지 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리메라아제와 결합하고 전사를 수행하기 위한 DNA 서열에 의해서 형성된 발현 조절 인자이다. 박테리아 숙주에 적합한 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 세그먼트에 삽입하기 편리한 제한부위를 포함하는 플라스미드 벡터를 제공한다. 이러한 전형적인 플라스미드 벡터는 BioRad Laboratories(Richmond, CA)에서 구입 가능한 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329와 Pharmacia(Piscataway, NJ)로부터 구입가능한 pPL 및 pKK223가 있다.

원핵세포에 적합한 발현 벡터는, 바람직하게는, 척추동물의 세포에 적합하고 코딩 서열을 포함하는 rDNA 분자를 만드는데 또한 사용될 수 있다. 공지된 기술인 바이러스성 벡터를 포함하는 원핵세포 발현 벡터는 여러가지 상업적 재료로 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 벡터는 이상적인 DNA 세그먼트를 삽입하기 편한 제한부위를 포함하여 제공된다. 이러한 전형적인 벡터는 pSVL 및 pKSV-10(Pharmacia), pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies, Inc), pTDT1(ATCC, #31255), 상기의 pCDM8 벡터 및 유사 진핵 발현 벡터가 있다. 벡터는 필요에 따라 조직 특이적 프로모터를 포함하여 조작될 수 있다.

본 발명에서 rDNA 분자를 제작하는데 사용되는 진핵세포 발현 벡터는 진핵세포에 효과적인 선별 마커를 포함하며, 바람직하게는 약제내성 선별 마커를 포함한다. 바람직한 약제내성 마커는 예를 들어, 네오마이신 포스포트렌스퍼라아제(neo) 유전자(Southern et al.(1982), J. Mol . Anal. Genet. 1:327-341)와 같은 네오마이신 저항성을 발현하는 유전자이다. 대신에, 선별마커로 분리된 플라스미드, 두개의 벡터가 숙주 세포에 동시전이에 의해 삽입되어진것 및 선별마커용으로 적합한 약제에서 배양에 의해 선별된 것이 존재할 수 있다.

E. 외부에서 공급된 코딩 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포

본 발명은 본원발명의 단백질로 암호화된 핵산분자로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 숙주세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 원핵세포는 본 발명의 단백질 발현에 유용하지만 이에 한정되지는 않으며, 세포주는 세포 배양 방법 및 발현 벡터의 증식과 유전자 산물의 발현에 적합하다. 바람직하게는 진핵 숙주 세포는 이스트, 곤충 및 포유류 세포, 더욱 바람직하게는 마우스, 랫, 원숭이 또는 사람의 세포주와 같은 척추동물의 세포를 포함하지만 이제 한정되지는 않는다. 바람직하게는 진핵 숙주세포는 ATCC의 CCL61로부터 구입 가능한 차이니즈 햄스터의 난소(CHO) 세포, ATCC의 CRL 1658로부터 구입가능한 NIH 스위스 마우스의 배아세포(NIH/3T3), 베이비 햄스터의 신장세포(BHK) 및 유사 진핵세포 조직 배양 세포주를 포함한다.

어떠한 원핵세포 숙주는 본 발명의 단백질을 암호화하는 rDNA 분자를 발현하는데 사용되어질 수 있다. 바람직하게는 원핵세포 숙주는 E.coli이다.

본 발명의 rDNA 분자를 가지는 적합한 세포 숙주의 형질변환은 공지된 기술이며, 전형적으로 벡터의 유형에 의존적이며 숙주수의 시스템을 사용한다. 원핵 숙주세포의 형질변환에는 전기천공법(electroporation) 및 염 처리 방법이 전형적으로 사용된다(예를 들어, Cohen et al. (1972), Proc . Natl . Acad , Sci. USA 69:2100 및 Sambrook et al., supra를 참고). rDNA를 포함하는 벡터를 가지는 척추동물 세포의 형질전환에는 전기천공법, 양이온 계면활성제 또는 염 처리 방법을 전 형적으로 사용하며, 예를 들어 "Graham et al. (1973), Virol. 52:456; Wigler et al. (1979), Proc . Natl . Acad . Sci. USA 76:1373-1376"에서 확인할 수 있다.

성공적으로 형질전환된 세포는 예를 들어, 본 발명의 rDNA 분자를 포함하는 세포는 공지된 기술인 선별 마커를 사용하여 선별하는 방법을 포함한 기술에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rDNA가 도입된 세포는 단일 군락을 만들기 위해 복제된다. 이 군락으로부터 얻어진 세포는 파쇄되고, 용해되어 "Southern, (1975) J. Mol . Biol. 98;503 또는 Berent et al., (1985) Biotech. 3:208"에 기술되어 있는 것과 같은 방법을 사용하여 DNA 내용물에 rDNA가 존재하는가를 검사할 수 있고 또는 단백질은 면역학적 방법을 통한 세포 검정으로부터 얻어진다.

F. rDNA 분자를 사용한 재조합 단백질의 생산

본 발명은 전술한 핵산분자를 사용하여 단백질을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 보편적으로, 재조합 형태 단백질의 생산은 다음의 단계를 가진다.

첫째, 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산분자를 얻는다. 상기 핵산분자는 예를 들면, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 53-643 또는 53-640를 포함할 수 있으며, 또는 상기 서열을 필수구성 성분으로하여 이루어지거나, 상기 서열로 이루어질 수 있다. 만일 암호화 서열이 이러한 오픈-리딩-프레임(open-reading-frame)과 같이 인트론에 의해 중단되지 않으면 이는 어떠한 수용세포에서의 발현에도 적합하다.

따라서 핵산분자는 바람직하게는 오픈-리딩-프레임 단백질을 포함하는 발현체를 형성하기 위해 상기와 같이 적절한 조절 서열을 가지는 사용실시가능한 연쇄에 위치한다. 발현체는 적합한 수용세포의 형질변환에 사용되고 형질변환된 수용세 포는 재조합 단백질의 생산이 가능한 환경하에서 배양된다. 임의로 재조합 단백질은 배지 또는 세포로부터 단리되고; 단백질의 회수 및 정제는 약간의 불순물이 있는 상태에서는 필요하지 않다.

전술한 각 단계는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이상적인 코딩 서열은 유전자 단편으로부터 얻어질 수 있고 적합한 수용세포에 즉시 사용된다. 다양한 수용세포에서 사용가능한 발현벡터의 제작은 상기 언급한 바와 같이 적합한 레플리콘 및 조절 서열을 사용하는 것이 가능하다. 조절서열, 발현벡터 및 형질변환 방법은 앞서 언급한대로 유전자 발현을 위해 사용된 숙주세포의 유형에 의존한다. 일반적으로 사용할 수 없는 적합한 제한부위는 이러한 벡터 안에 삽입하기 위한 절제가능한 유전자를 생산하기 위하여 코딩 서열의 끝부분에 첨가할 수 있다. 당업자들은 이미 공지된 어떠한 수용세포/발현 시스템에도 재조합 단백질을 생산하기 위한 본 발명의 핵산 분자를 즉시 적용가능할 것이다.

G. 췌장암에 관련된 유전자를 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 약제를 동정하는 방법

본 발명의 다른 실시예는 SEQ ID NO:2의 핵산 서열을 가지는 단백질과 같은 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 이런 검정은 본 발명에서 핵산의 발현 정도 변화를 관찰하는 수단으로 이용가능하다. 세포에서 핵산 발현의 상행 및 하행 조절이 가능하다면 이 약제는 본 발명의 핵산 발현을 조절하기 위해 사용된다.

하나의 검정 방법은, 보고 유전자(reporter gene)를 포함하는 세포주와 SEQ ID NO:1의 53-643 뉴클레오디드로 정의된 오픈 리딩 프레임안의 뉴클레오티드가 융합하고/거나 5' 및/또는 3' 조절인자 및 검정가능한 융합 파트너가 얻어질 수 있다. 많은 검정가능한 융합 파트너가 알려져 있고 개똥벌레 루시페라아제 유전자 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(Alam et al. (1990), Anal. Biochem. 188:245-254)를 암호화하는 유전자를 포함하여 손쉽게 이용가능하다. 보고 유전자 융합체를 포함하는 세포주는 약제에 노출되어 적절한 환경과 시간 하에 검사된다. 약제에 노출된 샘플과 보고 유전자의 차별적인 발현과 대조군은 본 발명의 핵산 발현을 조절하는 약제로 동정한다.

추가적인 검정 방법은 SEQ ID NO:2를 가지는 단백질과 같은 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 약제의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, mRNA 발현은 본 발명의 핵산 하이브리다이제이션에 의해 즉시 측정할 수 있다. 약제에 노출된 세포주는 적절한 환경과 시간 하에서 검사되고 총 RNA 또는 mRNA는 "Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001"에 기술되어 있는 것과 같은 표준 방법에 의해서 동정된다.

바람직한 세포는 사람의 조직으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 암환자로부터 배양된 세포 또는 생검조직이다. ATCC 유관상피암(breast ductal carcinoma) 세포주(Catalogue Nos. CRL-2320, CRL-2338 및 CRL-7345), ATCC 대장선암(colorectal adenocarcinoma) 세포주(Catalogue Nos. CCL-222, CCL-224, CCL- 225, CCL-234, CRL-7159 및 CRL-7184), ATCC 폐선암(lung adenocarninoma) 세포주(Catalogue Nos. CRL-5944, CRL-7380 및 CRL-5907), ATCC 난소선암(ovary adenocarcinoma) 세포주(Catalogue Nos. HTB-161, HTB-75 및 HTB-76), ATCC 췌장선암(pancreatic adenocarcinoma) 세포주(Catalogue Nos. HTB-79, HTB-80 및 HTB-2547), ATCC 전립선선암(prostate adenocarcinoma) 세포주(Catalogue Nos. CRL-1435, CRL-2422 및 CRL-2220) 및 ATCC 위선암(gastric adenocarcinoma) 세포주(Catalogue Nos. CRL-1739, CRL-1863 및 CRL-1864)가 사용될 수 있다. 대신에, 다른 유효한 세포 또는 세포주도 사용할 수 있다.

대조군 세포와 약제에 노출된 세포 사이의 RNA 발현 정도의 차이를 검출하기 위한 프로브는 본 발명의 핵산으로부터 제조되어질 수 있다. 바람직하게는, 매우 엄격한 조건 하에서 표적 핵산만을 하이브리다이제이션하는 프로브를 제작한다. 단지 매우 상보적인 핵산 하이브리드는 매우 엄격한 조건 하에서 형성된다. 따라서, 엄격한 검정 조건은 하이브리드를 형성하기 위해서 존재하는 두 개의 핵산 가닥 사이의 상보성을 결정한다. 엄격함은 프로브:표적 하이브리드 및 프로브:비표적 하이브리드 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위해 선택된다.

프로브는 공지된 방법에 의해서 본 발명의 핵산으로부터 제작된다. 예를들어, 프로브의 G+C 구성 및 프로브의 길이는 표적 서열에 결합하는 프로브에 영향을 줄 수 있다. 프로브의 특이성을 최적화하기 위한 방법은 "Sambrook et al., supra 및 Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999"에 기술되어 있으며 일반적으로 사용할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건은 "Sambrook et al. 및 Ausubel et al."에 기술된 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 각각의 프로브에 사용할 수 있다. 폴리 A RNA(poly A RNA)에 풍부한 RNA 또는 총 세포의 RNA의 하이브리다이제이션은 어떠한 방법으로도 가능하다. 예를 들어, 폴리 A RNA에 풍부한 RNA 또는 총 세포의 RNA는 고체 지지체에 부착시킬 수 있고 적어도 하나 이상의 프로브에 노출된 고체 지지체는 프로브가 특이적으로 하이브리다이제이션 할 수 있는 조건하에서 본 발명의 서열 중 적어도 하나 또는 한 부분을 포함한다. 대신에, 본 발명의 서열 중 적어도 하나 또는 한 부분을 포함하는 핵산 단편은 실리콘 칩, 다공성 유리 웨이퍼 또는 막과 같은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체 지지체는 부착된 서열이 특이적으로 하이브리다이제이션될 수 있는 조건하에서 샘플로부터 폴리A RNA 또는 총 세포의 RNA에 노출될 수 있다. 이러한 고체 지지체와 하이브리다이제이션 방법은 널리 사용가능하며, 예를 들어, "Beattie, (1995) WO 95/11755"에 기술되어 있다. SEQ ID NO:2 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 상행 또는 하행 조절하는 약제에 노출된 세포군 및 비처리 세포군으로부터 얻은 RNA 샘플을 특이적으로 하이브리다이제이션하기 위해 주어진 프로브의 활성 측정을 통해 동정한다.

mRNA의 질적 및 양적 분석을 위한 하이브리다이제이션은 또한 RNA 분해효소 보호법(RNase protection assay)(예를 들어 RPA, Ma et al. (1996), Methods 10:273-238 참고)의 사용에 의해 수행될 수 있다. 간단하게, 유전자 산물을 암호화하는 cDNA 및 파지 특이적 DNA 의존 RNA 폴리머라아제 프로모터(예를 들어, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라아제)를 포함하는 발현 매체는 cDNA 분자의 3' 말단, 파지 프로모터의 하행부분을 선형화하고, 이런 선형화된 분자는 그 후에 시험관 내에서 전사에 의해 cDNA의 표지된 안티센스의 전사물을 합성하기 위한 주형으로서 사용된다. 표지된 전사물은 80% 포르마이드, 40mM 파이프(Pipes), pH 6.4, 0.4M NaCl 및 1mM EDTA를 포함하는 완충용액에서 45℃ 에서 하루동안 배양하여 단리된 RNA 혼합물(예를 들어, 총 또는 분별된 mRNA)에서 하이브리다이제이션된다. 하이브리드는 40㎕/㎖ 리보뉴클레아제 A 및 2㎕/㎖ 리보뉴클레아제를 포함하는 완충용액에서 분해된다. 외부 단백질의 추출 및 불활성화 후에 샘플은 분석을 위한 우레아/폴리아크릴아마이드 겔에 로딩한다.

또 다른 검정법은, 인스턴트 유전자 산물의 발현에 영향을 주는 약제의 동정을 위해, 생리학적으로 본 발명의 유전자 산물을 발현하는 세포 또는 세포주는 첫번째로 동정된다. 또한 동정된 세포 및/또는 세포주는 전사 기구의 조절 능력 같은 필수적인 세포 조직을 포함하며 적절한 표면 형질도입 구조 및/또는 시토졸 캐스캐이드를 가지는 외부 접촉 약제에 대해서 유지된다. 게다가, 이러한 세포 또는 세포주는 인스턴트 유전자 산물을 암호화하는데 사용가능한 비-번역된 5' 프로모터 포함 구조 유전자는 하나 또는 그 이상의 항원성의 단편과 융합되어 인스턴트 유전자 산물을 만든다. 상기 단편은 상기 프로모터의 전사적 조절 하에서 폴리펩타이드로서 발현된다. 이 프로모터의 분자량은 자연적으로 존재하는 폴리펩타이드와 구별 되거나 면역학적으로 별개의 태그 또는 기타 검출 마커를 포함할 수 있다. 이러한 과정은 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra 참고).

상기와 같이 형질변환되거나 트렌스펙션된 세포 또는 세포주는 적절한 환경 하에서 시약에 노출된다. 예를 들어, 약제학적으로 사용가능한 부형제 내에서 시약은 생리학적 pH에서의 인산완충식염유(Phosphate buffered saline; PBS), 생리학적 pH에서의 이글스 평형염액(Eagles balanced salt solution; BSS)과 같은 수용성 생리학적 버퍼내에서 세포에 노출되고, 혈청을 포함하는 PBS 또는 BSS나 PBS 또는 BSS 및/또는 혈청을 포함하는 조절된 배양액에서 세포를 37℃에서 배양한다. 상기의 조건은 당업자의 판단에 따라 조절되어질 수 있다. 이어서 시약에 노출된 상기 세포는 분열될 수 있고 용해물의 폴리펩타이드는 단편화된다. 폴리펩타이드 단편은 모아지고 항체에 접촉된 단편은 면역학적 검정법(예를 들어 ELISA, 면역침강 또는 웨스턴 블롯)으로 수행할 수 있다. "시약에 노출된" 샘플로부터 단리된 단백질 전체는 단지 부형제에 노출된 세포의 대조샘플과 비교되어질 수 있고, 대조 샘플과 비교하여 "시약에 노출된" 샘플로부터 면역학적으로 발생된 시그널의 증가 또는 감소는 시약의 유효성을 구별하는데 사용되어질 수 있다.

H. 췌장암 관련 단백질의 레벨 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는 약제를 동정하는 방법

본 발명의 다른 상세한 설명에는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 단백질과 같은 본 발명의 단백질의 레벨 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법 또는 검정은 소기의 활성을 관찰하거나 발견하는 수단으로 활용될 수 있고 특히 췌장암을 치료하는 약제를 동정하는 데에 매우 유용하다.

하나의 형식에서, 본 발명 단백질의 상대량은 약제에 노출되고 측정되어야 하는 세포군 중에서 노출되지 않은 조절 세포군과 비교하여 검정될수 있다. 이러한 형식에서 특정 항체와 같은 프로브는 다른 세포군에서 단백질의 차별화된 발현을 관찰하는데 사용된다. 세포계 또는 세포군은 측정되어야 하는 약제에 적절한 환경과 시간의 조건 하에서 노출된다. 세포의 용해물은 노출된 세포계 또는 세포군 그리고 노출되지 않은 조절 세포계 또는 세포군으로부터 만들어질수 있다. 그리고 상기 세포의 용해물은 프로브를 사용하여 분석된다.

항체 프로브들은 펩티드, 폴리펩티드 또는 본 발명의 단백질이 만약 충분한 길이이거나 또는 적당한 보균자캐리어와 접합한 면역기제를 강화해야 할 필요가 있는 경우에 이들을 사용한 적절한 면역 프로토콜에서 적당한 포유류 숙주를 면역시킴으로써 만들어질 수 있다. BSA, KLH 또는 다른 보균캐리어 단백질과 같은 보균자캐리어를 갖는 면역 접합을 제조하는 방법은 공지된 기술이다. 몇몇 환경에서는 카르보디이미드(carbodiimide) 시약을 사용하는 직접 접합이 효과적일수 있고, 다른 상황에서는 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)에서 제공하는 연결 시약이 합텐 접근 가능성을 제공하는데 이상적일 수 있다. 합텐 펩타이드는 예를 들어 보균자캐리어와 연결을 용이하게 하기 위해 시스테인 잔류 또는 곳곳에 놓인 시스테인 잔류와 함께 아미노 또는 카르복시 말단까지 연장될수 있다. 면역원의 투여는 일반적으로 주사로 이루어지는데 적당한 시간과 적당한 보조약을 사용하며 이는 공지된 기술이다. 면역화 일정동안, 항체 역가는 항체 형성의 타당성을 결정하는데 사용된다.

이러한 방식으로 생산된 폴리클로날 항혈청은 몇몇 외용약(application)과 의약 조성물에 적합하며 단일클론의 조제를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 소기의 단일클론 항체를 분비하는 불멸화된 세포계는 코흘러 및 밀스테인(Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497)의 표준 방법을 사용하거나 또는 림프구 또는 비장 세포의 불멸화를 초래하는 변용형을 사용함으로써 제조될 수 있으며 이는 공지된 기술이다. 소기의 항체를 분비하는 불멸화된 세포계는 펩티드 합텐, 폴리펩티드 또는 단백질이 항원인 면역측정법에 의해 구분된다. 소기의 항체를 분비하는 적절한 불멸화된 세포가 동정되면, 세포들은 생체 밖(in vitro)에서 배양되거나 복수(ascites fluid)에서 생산된다.

이후 소기의 단일클론의 항체는 배양 상등액 또는 복수 상등액으로부터 재생회수된다. 단일클론의 항체 또는 면역학적으로 중요한 (항원을 묶는항원과 결합하는) 부분을 포함하고 있는 폴리클로날 항혈청의 단편들은 길항제 뿐만 아니라 온전한 항체로 사용될 수 있다. Fab, Fab’ 또는 바람직하게는 F(ab’)₂ 와 같은 면역적으로 반응하는(항원을 묶는항원과 결합하는) 항체 단편들을 특히 치료환경에서 사용하는 것은 전체 면역글로불린 항체에 비해 일반적으로 면역성이 떨어진다.

항체 또는 항원과 결합하는 단편들은 또한 현대 기술을 사용하여 재조합형 수단에 의해 생산될 수 있다. 특히 특히 소기의 단백질 부분과 결합하는 항체 부위는 또한 단백질의 소기의 구역을 묶는 항체 구역은 인체에 적응된 인간화 항체(humanized antibodies)와 같은 다수 종 기원의 키메라의 환경에서 생산될 수 있다. 상기의 방법으로 검정된 약제는 임의로 선택되거나 또는 논리적으로 선택, 고안될 수 있다. 언급한 바와 같이, 약제가 임의로 선택되었다는 것은 약제를 본 발명의 단백질의 군집이 단독으로 또는 관련 기질, 접합 파트너 등이 포함된 서열이 고려되지 않은채 임의로 선택되었을 때를 말한다. 임의로 선택된 약제의 예로는 화학 라이브러리 또는 펩티드 결합 라이브러리 또는 미생물의 배양액으로 사용되는 것이다.

언급한 바와 같이, 약제가 논리적으로 선택되거나 고안된다는 것은 목표 부위의 서열과 약제의 작용과 관련하여 그것의 구조를 고려한 계획된 근거를 바탕으로 약제가 선택되었을 때를 말한다. 약제는 이러한 부위들을 구성하는 펩티드 서열을 이용함으로써 논리적으로 선택되거나 논리적으로 고안될 수 있다. 예를 들어, 논리적으로 선택된 펩티드 약제는 아미노산 서열이 일치하는 펩티드 또는 기능적으로 일치하는 부위의 유도체제가 될 수 있다.

본 발명의 약제는 예를 들면 펩티드, 작은 분자, 비타민 유도체제 그리고 탄수화물이 될 수 있다. 우성 음성(dominant negative)주 음성 단백질, 이러한 단백질을 암호화한 DNA, 이러한 단백질의 항체, 이러한 단백질의 펩티드 단편 또는 이러한 단백질의 모방은 기능에 영향을 미치기 위해 삽입될 수 있다. 언급된 “모방(Mimic)”은 국소해부학적, 기능적으로는 모 펩티드(parent peptide)와 유사하나 화학적으로 모 펩티드와 다른 구조를 제공하기 위해 펩티드 분자의 하나 또는 여러 부위(region)의 변형을 일컫는 말이다.(참고 : Molecular Biology and Biotechnology, Meyers, ed., pp.659-664, VCH Publishers, Inc., New York, 1995). 당업자들은 본 발명의 약제의 구조적인 본질에 있어서는 한계가 없다는 것을 쉽게 알아낼 수 있을 것이다.

본 발명의 펩티드 약제는 주지된 바와 같이 표준 고체상(또는 용해상) 펩티드 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 더구나, 이러한 펩티드를 암호화 한 DNA는 상용으로 구할 수 있는 올리고핵산 합성 수단을 사용하여 합성될 수 있고 표준 재조합형 생산 시스템을 이용하여 재조합형으로 생산될 수 있다. 암호화된 비유전자(non-gene-encoded) 아미노산이 포함되어야 하는 경우 고체상의 펩티드 합성을 사용하여 생산하는 것이 필요하다.

본 발명의 다른 종류의 약제는 본 발명의 단백질의 결정적 위치와 면역반응을 하는 항체들이다. 항체 약제는 항원 구역부위로서 항체에 의해 목표로 정해지는 단백질의 부분들을 포함하는 펩티드와 적당한 포유류 개체의 면역을 통해 획득될 수 있다.

I. 췌장암과 관련된 단백질의 적어도 하나 이상의 활성 또는 발현을 조절하는 약제의 사용

실시예에서 언급된 바와 같이, 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 갖는 본 발명의 단백질과 핵산은 췌장암 조직에서 특이하게 발현된다. 작용약제 또는 길항제와 같은, 단백질의 적어도 하나 이상의 활성 또는 단백질의 발현을 상행 또는 하행 조절하는 약제는 단백질의 기능 및 활성과 연관된 생물학적 그리고 병리적인 과정을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이는 본 발명의 동족체 및 유사체로 쓰이는 것으로 동정된 약제를 포함한다.

언급된 바와 같이, 개체는 어떤 포유동물도 가능한데 포유류가 본 발명의 단백질에 의해 전달되는 병리적 또는 생물학적 과정의 조절을 필요로 하는 한 그러하다. “포유동물”이라는 용어는 포유류 종에 속하는 개체를 말한다. 본 발명은 특히 인간개체의 치료에 유용하다.

병리적 과정은 유독한 효과를 만들어내는 생리학적 과정들의 범주를 일컫는다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 발현은 세포 배양성장(cell growth) 또는 과(過)형성(hyperplasia)과 관련이 있을 수 있다. 언급된 바와 같이, 약제가 과정의 정도나 심각성을 감소시킬 때를 일컬어 약제가 병리적 과정을 조절한다라고 한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 적어도 하나 이상의 활성 또는 발현을 상행 또는 하행조절하는 약제의 투여에 의해 질병의 경과가 조절되거나 암이 예방될 수 있다.

본 발명의 약제는 단독으로 제공되거나 특정한 병리적 과정을 조절하는 다른 약제와 결합하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제는 다른 주지의 약물과 결합하여 투여될 수 있다. 언급한 바와 같이, 2개의 약제가 결합하여 투여된다는 말은 두 개의 약제가 동시에 투여되거나 또는 약제가 동시에 작용하는 방식으로 개별적으로 투여될 때를 일컫는다.

본 발명의 약제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피 또는 구강적 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여된 투약은 수용자의 나이, 건강 그리고 체중, 동시 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 그리고 소기의 효과의 본질에 따라 달라질 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 단백질의 적어도 하나 이상의 활성이나 발현을 조절하는 하나 이상의 약제들을 포함하는 혼합물을 제공한다. 개별적인 요구들은 다양하지만, 각 성분의 효과적인 양의 최적의 범위를 결정하는 것은 주지된 기술에 속한다. 전형적인 투약량은 0.1에서 100㎍/kg (몸무게)이다. 가장 바람직한 투약량은 0.1에서 1㎍/kg (몸무게)이다.

약리 작용을 가지는 약제와 더불어, 본 발명의 혼합물은 작용 부위로의 전달을 위해 약리적으로 이용될 수 있도록 활성 구성성분을 조제하는 과정을 용이하게 하는 첨가제와 보조제로 이루어진 적당한 약리 수용가능 캐리어(CARRIER)를 포함한다. 비경구 투약의 적당한 제형은 수용성 소금염과 같은 수용성 형태의 활성 구성성분 수용액을 포함한다. 또한 적절한 유지성 주입 현탁액으로서 활성 구성성분의 현탁액이 투여될 수 있다. 수성 주입 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시킬 수 있는 물질을 포함하는데 예를 들면 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 그리고 덱스트란이다. 선택적으로, 현탁액은 안정제를 포함할 수도 있다. 또한 리포좀은 세포로 전달하기 위해 약제를 캡슐에 넣는 데에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 전신 투여를 위한 약제 제형은 장, 비경구 또는 국부성의 투약을 위해 제조될 수 있다. 실제로, 이 세가지 유형의 제형은 주 성분의 전신 투약을 가능하게 하기 위해 동시에 사용될 수 있다.

경구 투약을 위한 적당한 제형은 딱딱하거나 부드러운 젤라틴 캡슐, 환약, 코팅된 알약을 포함한 알약, 엘릭시르(elixirs), 현탁액, 시럽 또는 흡입제를 포함하고 그것들의 방출 조절 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 방법들을 수행할 때, 본 발명의 혼합물은 단독으로 또는 결합의 형태로 사용되거나 다른 치료약 또는 진단약과 결합하여 사용된다. 상세한 설명에서, 본 발명의 혼합물은 일반적으로 수용된 의료행위에 따라 이러한 병들에 대해 대체로 미리 정해진 다른 혼합물들과 같이 투여될 수 있다. 본 발명의 혼합물은 보통 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 랫과 같은 포유동물의 생체내 또는 시험관 내에서 이용될 수 있다.

J. 결합 파트너를 동정하는 방법

본 발명의 또 다른 상세한 설명에서는 본 발명의 단백질의 결합 파트너를 동정하고 단리하는 방법을 제시하고 있다. 일반적으로, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질과 잠재적인 결합 파트너의 결합이 허용되는 상황에서 세포의 부분 단편, 또는 추출물 또는 잠재적인 결합 파트너와 혼합된다. 혼합 후, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 본 발명의 단백질과 결합하게 되는 다른 분자들이 혼합물로부터 분리된다. 본 발명의 단백질에 결합된 결합 파트너는 제거된 후 분해된다. 결합 파트너를 동정하고 단리하기 위해 완전한 아미노산 서열 SEQ ID NO:2와 같은 완전한 단백질이 사용된다. 대안으로, 단백질 단편이 사용되기도 한다.

언급된 바와 같이, 세포 추출물은 용해되거나 파쇄된 세포로부터 만들어진 부분 또는 조제를 일컫는다. 세포 추출물의 바람직한 근원은 암종으로부터 나온 조직배양 세포 또는 생검 조직과 같은 형질변환된 세포 또는 인간 종양에서 파생된 세포들이다. 대안으로, 세포 추출물은 정상 조직 또는 이용가능한 세포계로 준비할 수 있다.

세포의 추출물을 획득하기 위한 다양한 방법들이 있다. 세포들은 물리적 또는 화학적 파쇄 방법을 사용하여 파쇄될 수 있다. 물리적인 파쇄 방법의 예로는 초음파 분해와 기계 전단이 있으며 이에 국한되는 것은 아니다. 화학적인 세포 용해 방법의 예로는 계면활성제 용해와 효소 용해가 있으며 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자들은 본 방법을 사용하여 추출물을 획득하기 위해 세포 추출물을 준비하는 방법을 쉽게 수용할 수 있다.

세포 추출물이 준비되면, 이 추출물은 단백질과 결합 파트너의 결합이 발생할 수 있는 상황에서 본 발명의 단백질과 혼합된다. 다양한 환경이 사용될 수 있는데, 가장 바람직한 환경은 인간 세포의 세포질과 매우 유사한 환경이다. 오스몰농도, pH, 온도 그리고 사용된 세포 추출물의 농도와 같은 특징들은 단백질과 결합 파트너의 결합을 최대한 활동하도록 변경될 수 있다.최적화하기 위해 다양화되어질 수 있다.

적절한 환경에서 혼합한 후, 결합된 합성물은 혼합물에서 분리된다. 혼합물을 분리하기 위한 다양한 기술들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질에 특수한 항체가 결합 파트너 합성물을 면역침전하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 크로마토그래피와 밀도/침전물 원심분리와 같은 일반적인 화학 분리 기술이 사용될 수도 있다. 추출물의 비결합 세포 성분을 제거한 후, 결합 파트너는 종래의 방법을 사용하여 합성물로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 소금염 농도나 혼합물의 pH를 변경함으로써 분리를 할 수 있다.

혼합된 추출물로부터 결합된 결합 파트너 한 쌍을 분리하는 것을 돕기 위해, 본 발명의 단백질은 고체 지지체에 고정된다. 예를 들면, 단백질은 니트로셀룰로오스 매트릭스 또는 아크릴 비드에 부착될 수 있다. 단백질을 고체 지지제에 부착하는 것은 펩티드/결합 파트너 한 쌍을 추출물의 다른 성분으로부터 분리하는 것을 돕는다. 동정된 결합 파트너는 단독의 단백질이거나 둘 이상의 단백질로 이루어진 합성물이다. 대안으로, 결합 파트너는 Takayama et al.(1997)의 절차에 따른 Far-Western 검정, Methods Mol.Biol. 69:171-184 또는 Sauder et al. (1996), J.Gen. Virol. 77:991-996을 사용하여 동정될 수 있고 또는 단백질이 붙어있는 에피토프나 GST 융합 단백질 사용을 통해 동정될 수 있다.

대안으로, 효모의 두 이종의 하이브리드 시스템(yeaste two-hybrid system) 또는 다른 생체내 단백질-단백질 결합 분석장치에 사용될 수 있다. 효모의 두 이종의 하이브리드 시스템은 다른 단백질 파트너 쌍을 동정하는데 사용되어 왔고, 여기에 언급한 핵산 분자를 사용하는데 손쉽게 이용될 수 있다.

K. 췌장암과 관련된 단백질의 결합 파트너의 사용

일단 단리되면, 상기에 기재된 방법을 이용하여 얻은 본 발명에 따른 단백질의 결합 파트너, 및 그 동족체 및 유사체는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 파트너는 종래기술을 사용하여 결합 파트너를 결합시키는 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 결합 파트너를 결합시키는 항체는 본 발명에 따른 단백질에 의하여 중재된 생물학적 또는 병리학적 공정을 조절하기 위한 치료제로서, 또는 결합 파트너를 정제하기 위하여, 본 발명에 따른 단백질의 활성을 검사하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용도는 하기에 자세하게 기재되어 있다.

L. 췌장암과 관련된 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 저해하는 약제를 동정하는 방법

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 감소시키거나 저해하는 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명에 따른 단백질은 테스트할 약제가 있을 때와 없을 때에 결합 파트너와 혼합된다. 단백질의 회합결합을 허용하는 조건하에서 혼합한 후에, 약제가 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 감소시키거나 저해했는지를 결정하기 위하여 두 개의 혼합물을 분석비교한다. 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 저해하거나 감소시키는 약제는 테스트용 약제를 포함하는 샘플에 존재하는 회합결합량을 감소시키는 것으로 확인될 것이다.

여기에 사용된 바와 같이, 약제가 존재하여 결합파트너가 본 발명에 따른 단백질과 회합결합하는 정도를 감소시키거나 저해시킬 때, 약제가 본 발명에 따른 단 백질과 결합 파트너와의 회합결합을 감소시키거나 저해하는 것으로 나타난다. 한 부류의 약제는, 또 다른 부류의 약제가 본 발명에 따른 단백질에 결합함으로써 회합결합을 감소시키거나 저해하는 동안에 결합 파트너에 결합함으로써 회합결합을 감소시키거나 저해할 것이다.

상기 검사에 사용된 결합 파트너는 단리된 것일 수 있고 완전하게 특성을 부여한 단백질일 수 있으며 또는 본 발명에 따른 단백질 또는 세포 추출물에 존재하는 것으로 확인된 결합 파트너에 결합한 부분적으로 특성을 부여한 단백질일 수 있다. 결합 파트너가 확인 가능한 성질, 예를 들면, 분자량이 확인되었다면 본 발명에 따른 검사가 사용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다.

상기 방법에서 검사된 약제는 무작위 추출로 선택되거나 합리적으로 선택되거나 설계될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너의 회합결합에 연관된 특이적인 서열을 고려하지 않고 약제가 무작위로 선택될 때 약제는 무작위 선택된다고 한다. 무작위로 선택된 약제의 실례는 화학 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리 또는 유기체의 성장 배양액의 사용이다.

여기에 사용된 바와 같이, 타겟 부위의 서열 및/또는 약제 작용과 연관된 배열을 고려하는 작위적인 근거(nonrandom basis)에 기초하여 약제가 선택될 때 약제는 합리적으로 선택되고 설계된다고 한다. 본 발명에 따른 단백질에 대한 결합 파트너의 접촉 부위를 구성하는 펩티드 서열을 이용함으로써 약제는 합리적으로 선택되거나 합리적으로 설계될 수 있다. 예를 들면, 합리적으로 선택된 펩티드 약제는 아미노산 서열이 결합 파트너에 대한 본 발명에 따른 단백질의 접촉 부위와 동일한 펩티드일 수 있다. 이와 같은 약제는 결합 파트너에 결합함으로써 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너의 회합결합을 감소시키거나 저해할 것이다.

본 발명에 따른 약제는 예를 들면, 탄수화물뿐만 아니라 펩티드, 소분자, 비타민 유도체일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 약제의 구조적인 성질에 대해서는 제한이 없음을 용이하게 인식할 것이다.

본 발명에 따른 한 부류의 약제는 아미노산 서열이 본 발명에 따른 단백질의 아미노산 서열을 기초로 선택되는 펩티드 약제이다. 본 발명에 따른 펩티드 약제는 본 발명의 기술분야에서는 알려진 표준 고상(또는 용액상) 펩티드 합성법을 사용하여 제조할 수 있다. 더욱이, 이들 펩티드를 암호화하는 DNA는 상업적으로 활용가능한 올리고뉴클레오티드 합성 기구를 사용함으로써 합성될 수 있고, 표준 재조합체 제조 시스템을 이용함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 아미노산이 암호화된 비-유전자가 포함된다면, 고상 펩티드 합성을 사용한 제조를 필요로 한다.

본 발명에 따른 또 다른 부류의 약제는 본 발명에 따른 단백질 또는 결합 파트너의 결정적인 위치와 면역반응성을 가진 항체이다. 상기에 언급한 바와 같이, 항체는 펩티드로 적절한 포유류 검체를 면역시킴으로써 얻을 수 있으며, 항원성 부위, 본 발명에 따른 단백질 또는 결합 파트너의 이들 부분으로 포함할 수 있고, 항체에 의하여 타겟될 것으로 의도된다.

하기에 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질의 활성과 관련된 중요한 최소한의 잔기 서열은 두 개의 하이브리드 스크리닝 및 잠재적으로 연관된 분자의 확인에 대한 미끼로 효과적으로 사용될 수 있는 기능적인 선형 도메인을 정의한다. 이러한 단편을 사용하면, 전체 길이의 분자를 사용하는 것에 대립한 것으로서 스크리닝의 특이성이 매우 증가할 것이다. 이와 유사하게, 이 선형 서열은 또한 친화도 매트릭스로 사용될 수 있으며 또한 생화학적 친화도 정제 방법을 사용하여 결합 단백질을 단리시키기 위하여 사용될 수 있다.

M. 췌장암과 관련된 단백질과 결합 파트너와의 회합결합을 저해하는 약제의 사용

실시예에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 본 발명에 따른 단백질 및 핵산은 췌장암 조직에서 상이하게 발현된다. 확인된 단백질의 동족체 및 유사체를 포함한 본 발명에 따른 단백질의 결합 파트너와의 상호작용을 감소시키거나 저해하는 약제는 단백질의 기능 및 활성과 연관된 생물학적 및 병리학적 방법을 조절하기 위하여 사용될 수 있다.

여기에서 사용한 바와 같이, 검체는 본 발명에 따른 단백질에 의하여 중개된 병리학적 또는 생물학적 방법의 조절을 필요로 하는 포유류라면, 모든 포유류가 될 수 있다. "포유류"라는 용어는 포유류(강)에 속하는 개체를 의미한다. 본 발명은 특히 인간 검체의 치료에 유용하다.

병리학적적인 방법과정은 해로운 효과를 발생시키는 생물학적 방법과정의 카테고리를 의미한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단백질의 발현은 세포 성장 또는 과증식형성과 연관될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 약제가 방법과정의 정도 또는 강도를 감소시킬 때, 약제가 병리학적 방법과정을 조절한다고 한다. 예를 들면, 췌장암은 예방될 수 있거나 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너와의 상호작용을 감소시키거나 저해하는 약제를 투입함으로써 질병의 진행이 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 약제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피성 또는 구강의 경로를 통하여 투입될 수 있다. 선택적으로 또는 동시에, 경구로 투입될 수 있다. 투입된 투약량은 수령인의 연령, 건강상태, 및 몸무게, 수반하는 치료제의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도, 및 바람직한 효과의 성질에 따라서 결정될 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 단백질과 결합 파트너의 회합결합을 저해하는 하나 또는 그 이상의 약제를 포함하는 조성물을 제공한다. 개체의 요구가 변함에 따라, 각 구성요소의 효과적인 양의 적정범위는 본 발명의 기술분야에서 결정할 수 있다. 일반적인 투약량은 몸무게(㎏)당 0.1 내지 100㎍이다. 바람직한 투약량은 몸무게(㎏)당 0.1 내지 10㎍이다. 가장 바람직한 투약량은 몸무게(㎏)당 0.1 내지 1㎍이다.

약리적 활성 약제에 더하여, 본 발명의 조성물은 작용부위에 전달하기 위하여 제약적으로 사용될 수 있는 조제품으로 활성 화합물을 가공하는 첨가제 또는 보조제를 포함하는 적절하게 약제학적으로 허용된 캐리어를 포함할 수 있다. 비경구 투약을 위한 적절한 제형은 수용해성 형태의 활성 화합물, 예를 들면 수용해성 염의 수용성 용액을 포함한다. 더욱이, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액을 투입할 수 있다. 적절한 지방 친화성의 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들면, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수용성 주사 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 소듐 카복실메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다. 또한 세포 내로 약제를 전달하기 위하여 캡슐화하기 위하여 리포좀을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조직적인 투여를 위한 약제학적인 제형은 장관, 비경구 또는 국소 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 사실상 모든 세 가지 타입의 제형은 활성 성분의 조직적인 투여를 위하여 동시에 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 적절한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환약, 코팅된 정제를 포함한 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 조절된 방출형을 포함한다.

본 발명의 방법을 실시하는 데에 있어서, 본 발명의 화합물은 단독 또는 조합하거나, 또는 다른 치료제 또는 진단 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물은 일반적으로 허용되는 치료에 따른 조건을 위하여 일반적으로 처방되는 다른 화합물과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 생체내에서, 통상적으로 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 랫 및 마우스와 같은 포유류, 또는 시험관 내에서 사용될 수 있다.

N. 합리적인 제약 디자인 및 조합화학(combinatorial chemistry)

본 발명은 더욱이 합리적인 제약 디자인 및 조합화학을 포함한다. 당업자들은 췌장암 치료를 위하여 개발될 수 있는 화합물을 확인하는 데에 본 발명을 이용 하고 개발하는 데에 적절한 방법을 인식할 것이다. 폴리펩티드가 관련된 합리적인 제약 디자인은 상호작용하는 디자인된 제약으로 일차 펩티드를 확인 및 정의하고, 일차 타겟 펩티드를 사용하여 이차 펩티드에 대한 필요조건을 정의한다. 정의된 이러한 필요조건으로, 모든 또는 실질적으로 모든 정의된 필요조건에 맞는 적절한 펩티드 또는 비-펩티드를 누구나 찾아내고 준비할 수 있다. 그리하여, 합리적인 제약 디자인의 하나의 목표는 예를 들면, 초과 또는 미만의 유력한 리간드 형태인 약제를 형성하기 위하여 관심의 대상이 되는 또는 그들과 상호작용하는 소분자(예를 들면, 작용물질(agonists), 길항제(antagonists), 널 화합물(null compounds))의 생물학적으로 활성인을 갖는 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 유사체를 제조하기 위한 것이다(Hodgson (1991), Bio. Technology 9:19-21를 참조). 조합화학은 화합물의 생물활성을 하나씩 대신에 한꺼번에 합성 및 테스트하는 과학이며, 그 목적은 이전에 가능했던 것보다 신속하게 그리고 보다 경제적으로 약제 및 물질을 알아내는 것이다. 최근에 컴퓨터 이용 단백질 모델링 및 신약 개발의 접근법의 개발로 인하여 보다 더 직접적으로 합리적인 약제 디자인 및 조합화학이 관련되고 있다(미국특허 4,908,773; 5,884,230; 5,873,052; 5,331,573; 및 5,888,738).

분자 모델링을 합리적인 약제 디자인 및 조합화학을 위한 도구로 사용하는 것이 컴퓨터 그래픽의 도입으로 인하여 매우 증가하고 있다. 컴퓨터 스크린의 3차원 상으로 분자를 보여주는 것이 가능할 뿐만 아니라, 효소 및 수용체 및 테스트할 합리적으로 디자인된 유도체 분자와 같은 거대분자의 상호작용을 검사하는 것이 가능하게 된다(Boorman (1992), Chem. Eng. News 70:18-26). 사용자에게 친숙한 소프트웨어 및 하드웨어의 막대한 양이 현재 사용 중이며, 사실상 모든 제약회사는 합리적인 제약 디자인에 노력을 기울이는 컴퓨터 모델링 그룹을 가지고 있다. 예들 들면, 모레큘러몰리큘러 시뮬레이션사(Molecular Simulations Inc.; www.msi.com)는 사용자가 아미노산 서열로부터 출발해서 단백질 또는 폴리펩티드의 2차원 또는 3차원상의 모델을 만들어내고, 이를 다른 2차원 및 3차원 모델과 비교하여 화합물, 약제 및 펩티드과 3차원 모델과의 상호작용을 실시간으로 분석하는 것이 가능한 매우 복잡한 몇 개의 프로그램을 판매한다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서는 상호작용하는 본 발명에 의한 단백질 및 분자의 부위("결합 파트너"로 총괄하여 지칭함)를 펩티드, 펩티노미메틱스(peptinomimetics) 및 화학물질과 같은 다른 분자와 비교하여 치료작용이 예측가능해지고 설계될 수 있도록 소프트웨어가 사용된다(Schneider (1998), Genetic Engineering News December: page 20; Tempczyk et al. (1997), Molecualr Simulations Inc. Solutions April; and Butenhog (1998) Molecular Simulations Inc. Case Notes (August 1998) for a discussion of molecular modeling).

O. 유전자 치료

또 다른 실시예에서는, 단백질의 기능 및 활성과 관련된 생물학적 및 병리학적 방법을 조절하는 수단으로서 유전자 치료가 사용될 수 있다. 이는 프로모터 또는 인핸서에 실시가능하게 연결되어 상기 단백질의 발현이 상기 암의 억제를 야기시키며, 여기에서 상기 프로모터 또는 인핸서 요소가 유전자 구조물을 조절하는 프 로모터 또는 인핸서 요소인, 모든 SEQ ID NO:2의 서열 또는 적어도 일부분을 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자 구조물, 또는 선택적으로 모든 SEQ ID MO:1의 비-코딩 부위 또는 일부분을 포함하는 유전자 구조물을 암세포 내로 삽입하는 단계를 포함한다.

상기에 언급한 구조물은, 상기 단백질의 발현은 모든 적절한 프로모터(예를 들면, 인간 거대세포 바이러스(cytomegalovirus, CMV), 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40), 또는 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoters))의 지시를 받고, 모든 적절한 포유류 조절 요소에 의하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 바람직하다면, 신경 세포, T세포, 또는 B세포내의 유전자 발현을 우선적으로 지시하는 것으로 알려진 인핸서는 발현을 지시하도록 사용될 수 있다. 사용된 인핸서는 제한 없이 그 발현에 특이적인 조직 또는 세포로서 특징 지워진 것들을 포함할 수 있다. 양자택일로, 만약에 LBFL313의 게놈 클론이 치료 구조물(예를 들면, 그 후에 상기에 언급된 핵산 분자로 하이브리다이제이션 함으로써 단리시키는 것)로서 사용된다면, 동족 조절 서열에 의하여, 바람직하다면 상기에 기재한 모든 프로모터 또는 조절 요소를 포함하여 이종 기원으로부터 유래된 조절 서열에 의하여 조절이 중재될 수 있다.

암세포 내로 구조물을 삽입시키는 것은 생체 내, 예를 들면, 바이러스 또는 플라스미드 벡터내에서 이루어진다. 또한, 이러한 방법은 시험관 내에서의 용도로도 활용될 수 있다. 그리하여 본 발명에 따른 방법은 세포가 시험관 내에서 유전적으로 변형되고 나서 호스트숙주에 투여되거나 특히 이러한 치료법에 적합한 벡터 를 포함하는 적절한 다수의 방법을 사용하여 생체 내에서 실시된 유전자 변형 중의 하나인 다른 형태의 유전자 치료법에 용이하게 활용할 수 있다.

레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 암과 관련될 수 있는 세포(예를 들면, 상피세포)에 대하여 적절한 굴성을 가진 다른 바이러스 벡터는 치료 유전자 구조물에 대한 유전자 전달 운반 시스템으로 사용될 수 있다. 이 목적에 유용한 다수의 벡터는 일반적으로 알려져 있다(Cozzi PJ, et al., (2002) Prostate, 53(2); 95-100; Bitzer M, Lauer U., (2002) Dtsch Med Wochenschr. 127(31-32); 1623-1624; Mezzina and Danos (2002), Trends Genet. 8:241-256; Loser et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:161-171; Pfeifer and Verma (2001), Annu, Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211). 레트로바이러스 벡터는 특히 임상 셋팅에서는 충분히 개발되어 사용되어 왔다(Anderson et al. (1995), 미국특허 5,399,346). 비-바이러스 접근법 또한 암을 경험할 것으로 다른 방법으로 예측된 세포 내로 치료 DNA를 도입하는 데에 사용될 수 있다(Jeschke et al. (2002) Curr. Gene Ther. 1:267-278; Wu et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Wu et al. (1989), J. Biol. Chem. 264:16985-16987). 예를 들면, 라이포펙션(lipofection), 아시알로로소뉴코이드 폴리라이신 콘쥬게이션(asialorosonucoid polylysine conjugation), 또는 보다 덜 바람직하게 수술 조건하에서의 미세주사에 의하여 유전자는 뉴런 또는 T 세포 내로 도입될 수 있다.

상기에 기재된 방법 중 어느 것이라도 치료 핵산 구조물은 바람직하게는 암 발병 부위에 (예를 들면, 주사에 의하여) 바람직하게 적용된다. 그러나 암 발병 근처의 조직에 또는 암을 경험할 것으로 예측되는 세포를 공급하는 혈관에 또한 적용될 수 있다.

P. 형질전환 동물

cDNA 서열 SEQ ID NO:1과 상응하는 조작된 유전자 또는 변종, 특정유전자가 결여된 유전자 또는, 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:2를 암호화한 해독틀, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35의 연속적인 서열을 갖는 그것들의 단편들 또는 아미노산 잔기로 이루어진 형질전환 동물 역시 본 발명에 속한다. 형질전환 동물은 유전적으로 조작되었다. 형질전환 동물들은 유전적으로 조작된 동물들을 말하는 것으로 재조합체, 외인성 또는 클론 유전자 물질이 실험상 전이된 것을 말한다. 이러한 유전자 물질은 통상 "전이 유전자(transgene)"라고 부른다. SEQ ID NO:1 형태를 갖는 이와 같은 경우, 전이 유전자의 핵산 서열은 특정 핵산 서열이 일반적으로 발견되지 않는 게놈의 유전자좌에서 또는 전이 유전자의 일반적인 유전자좌에서 통합될 수 있다. 전이 유전자는 표적 동물 종보다는 동종 또는 이종의 게놈으로부터 유래된 핵산 서열로 이루어져 있다.

발명의 또 다른 양태로, SEQ ID NO:1로 이루어진 유전자의 전체 또는 일부분이 삭제된 형질전환 동물을 만들 수 있다. SEQ ID NO:1에 상응하는 유전자가 하나 이상의 인트론을 포함하고 있는 이러한 경우에, 전체 유전자-모든 엑손, 인트론 그리고 조절 서열-가 삭제될 수 있다. 대안으로, 전체 유전자보다 적은 부분이 삭제될 수 있다. 예를 들어, 하나의 엑손 또는 인트론이 삭제되어 본 발명의 단백질의 조작된 변형이 발현된 동물을 생산할 수 있다.

"생식세포계 형질전환동물(germ cell line transgenic animal)"이란 유전자 변경이나 유전자 정보가 생식계 세포에 삽입된 후 유전자 정보를 자손에게 전이시킬수 있는 능력을 갖게 되는 형질전환 동물을 일컫는다. 만약 자손이 실제로 몇몇 또는 모든 변경과 유전자 정보를 소유하게 된다면 그들도 역시 형질전환 동물이 되는 것이다.

유전자 변경 또는 유전 정보는 수용자가 속해 있는 동물의 종에게 외래일수 있고, 특정한 개별 수용자에게만 외래일 수도 있으며, 수용자에 의해 이미 소유된 유전 정보일 수도 있다.

형질전환 동물을 다양한 방법으로 만들어 낼 수 있는데 그 방법으로는 핵내 주입, 전기 침공, 미세주입법(microinjection), 배아줄기 세포 내 유전자 적중 그리고 재조합체 바이러스와 레트로바이러스 감염 등이 있다. (미합중국 특허 번호 4,736,866; 미합중국 특허 번호 5,602,307; Mullins et al. (1993), Hypertension 22:630-633; Brenin et al. (1997), Surg. Oncol. 6:99-110; Recombinant Gene Expression Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 62), Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997 참고)

다수의 재조합체 또는 형질전환 마우스가 생산됐는데 다음의 것들을 포함하고 있다 : 활성화된 발암유전자 서열을 발현하고(미합중국 특허 4,736,866); 원숭이 바이러스 40 T-항원을 발현하고(미합중국 특허 5,728,915); 인터페론 조절인자 1 (IRF-1)의 발현이 부족하며(미합중국 특허 5,731,490); 도파민 기능장애를 보이고(미합중국 특허 5,723,719); 혈압조절에 관여하는 인간 유전자 중 적어도 하나를 발현하며(미합중국 특허 5,731,489); 알츠하이머 병이 자연적으로 생기는 조건과 매우 유사성을 나타내고(미합중국 특허 5,720,936); 세포부착을 조절하는 능력이 감소되고(미합중국 특허 5,602,307); 소 성장 호르몬 유전자를 소유하고 있으며(Clutter et al. (1996), Genetics 143:1753-1760); 또는 인간 항체 반응을 일으키는 능력이 있다(McCarthy (1997), Lancet 349-405).

생쥐와 쥐가 유전자 도입 실험에서 가장 잘 선택되기는 하지만 몇몇 경우에서는 다른 종의 동물을 사용하는 것이 더욱 바람직하거나 필수적이다. 유전자 도입 절차는 양, 염소, 돼지, 개, 고양기이, 원숭이, 침팬지, 햄스터, 토끼, 소와 돼지 쥐와 같은 다양한 비 생쥐(non-murine) 동물들을 사용함으로써 성공적으로 행해져 왔다(Kim et al. (1997, Mol . Reprod . Dev. 46:515-526; Houdebine (1995), Reprod. Nutr . Dev. 35: 609-617; Petters (1994), Reprod . Fertil . Dev. 6:643-645; Schnieke et al. (1997), Science 278:2130-2133; Amoah(1997), J. Animal Sci. 75:578-585 참고.).

핵산 단편을 재조합체 포유류 적합 세포에 삽입하는 방법은 다발 핵산 분자의 공동 변환을 촉진하는 방법이면 무엇이든 가능하다. 형질전환 동물을 생산하는 자세한 절차는 미합중국 특허 5,489,743과 미합중국 특허 5,602,307에 개시된 것을 포함하여 당업자에게 자명하다.

Q. 진단 방법들

본 발명의 단백질과 유전자들이 암에 걸리지 않은 췌장 조직과 비교하였을 때 췌장암 조직에서 다르게 발현되었기 때문에, 본 발명의 단백질과 유전자는 췌장암을 진단 또는 감시하는데 사용하거나, 병의 진행을 추적하고 암에 걸리지 않은 췌장 조직 샘플로부터 췌장 세포를 분화시키는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 본 발명의 단백질을 사용하여 암을 진단하는 방법은 살아있는 개체로부터 조직을 획득하는 것이다.

핵산이나 본 발명의 단백질 분자를 검출하는 검정은 모든 형식에서 가능하다. 핵산 분자에 대한 전형적인 검정은 하이브리다이제이션 또는 형식에 바탕을 둔 PCR을 포함한다. 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 검출을 위한 전형적인 검정은 인시츄(in situ) 결합 검정등과 같은 가능한 형식으로 항체 프로브들을 사용하는 것을 포함한다(Harlow & Lane, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998 참고.) 바람직한 실시예에서 검정은 적절한 조절과 함께 실행된다.

일반적으로, 본 발명의 진단은 실시예가 핵산에 바탕을 둔 검정인지 또는 단백질에 바탕을 둔 검정인지에 따라 분류될 수 있다. 몇몇 진단 검정은 본 발명 내 돌연변이, 다형현상성(polymorphisms), 또는 종양적 변이에 기여하는 핵산 또는 단백질을 검출한다. 다른 진단 검정은 단백질 활동의 결함을 동정하고 구별하는데, 이는 본 발명 RNA 또는 암과 같은 질병으로부터 고통을 받고 있는 생물의 단백질 수준과 비슷한 실험된 생물내의 단백질과 본 발명 수준의 RNA를 검출함으로써 이루어지거나, 질병으로부터 고통을 받지 않는 생물과는 다른 실험된 생물내의 단백질과 본 발명 수준의 RNA를 검출함으로써 이루어진다.

또한, 다음의 상세한 설명에서 기재된 방법들과 약제를 혼합함으로써 단백질의 활동성 또는 수준농도의 이상을 신속하게 검출 및 동정하는 것이 가능한 키트의 생산도 고려될 수 있다. 진단 키트는 특히 본 발명의 하나 이상의 단백질 발현 또는 RNA의 수준을 결정하는데 사용될 수 있는, 본 발명의 단백질 또는 핵산 프로브 또는 항체 또는 이들 조합의 돌연변이 형태를 검출하는, 핵산 프로브 또는 항체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 키트들의 검출 성분은 전형적으로 다음 약제들 중 하나 이상과 결합하여 제공된다. 흡수 능력이 있는 지지체 또는 결합 DNA, RNA 또는 단백질이 종종 제공된다. 유효한 지지체는 양성으로 대전된 치환기의 배열을 가짐으로써 분석될 수 있는 니트로 셀룰로오스 막, 나일론 또는 유도된 나일론을 포함한다. 제한효소, 조절 약제, 완충액, 증폭 효소 그리고 송아지 흉선이나 연어정자 DNA와 같은 비 인간 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 이러한 키트들에 제공될 수 있다.

유용한 핵산 기반 진단 기술은 직접적인 DNA 서열 결정(direct DNA sequencing), 구배 젤 전기 영동(gradient gel electrophoresis), 서던 블롯 분석(Southern Blot analysis), 단일쇄 확정 분석(single-stranded confirmation analysis, SSCA), RNA 분해효소 보호 분석법(RNase protein assay), 점적 분석(dot blot analysis), 핵산 증폭(nucleic acid amplification), 특정 대립 유전자 PCR(allele-specific PCR) 그리고 이러한 접근법들의 조합을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 분석들의 기점은 생물학적 샘플에서 핵산을 단리시키고 정제시키는 것이다. 조직 생검은 좋은 샘플이 될 수 있다. 핵산은 샘플로부터 추출되고 프라이머(primer)를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 DNA 증폭 기술로 증폭될 수 있다. 당업자는 다형현상성의 존재를 확정하는 데에 유효한 방법들을 쉽게 인지할 수 있다. 또한, 당해 기술분야에서 다룰 수 있는 배열(array) 기술은 본 발명의 이러한 점에 적용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 array 의 구체적인 한 예로 Genechips^TM 가 알려져 있으며, 미합중국 특허 5,143,854와 PCT 공개공보 WO 90/15070과 92/10092에 일반적으로 기재되어 있다.

다양한 표지와 접합 기술은 당업자에게 자명하며 다양한 핵산 검정에 이용된다. PCR 또는 하이브리다이제이션에 이용되는 표지 핵산을 생산해 내는 방법에는 미량표지, 닉 트랜슬레이션(nick translation), 종단 표지(end-labelling) 또는 표지 뉴클레오티드를 이용한 PCR 증폭 등이 있다. 대안으로, 본 발명의 단백질을 암호화한 핵산은 mRNA 프로브를 생산하는 매개체(벡터)로 복제될 수 있다. 이러한 매개체들은 주지된 기술이며, 상업적으로 이용이 가능하며, T7, T3 또는 SP6와 같은 적절한 RNA 중합효소와 표지 뉴클레오티드를 첨가함으로써 체외에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용될 수 있다. Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), U.S. Biochemical Corp (Cleveland, OH)와 같은 다수의 회사들이 이러한 절차들을 위한 실험 계획안과 상업적인 키트를 제공하고 있다. 적당한 정보제공 분자 또는 표지는 방사핵, 효소, 형광 약제, 화학 발광 약제, 유색 약제뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기입자(magnetic particles) 등을 포함한다.

단백질 기반의 보다 바람직한 진단에서, 본 발명의 항체는 다수의 항체들이 지지체의 서로 다른 지역에 부착되어 있어 서로 겹치지 않는 순서 배열 내 지지체에 부착되어 있다. 당업자는 단백질 기반 진단 검정을 쉽게 인지할 수 있다. 단백질은 생물학적 샘플로부터 획득할 수 있으며 전통적인 접근법(즉, 방사능, 비색 또는 형광)에 의해 표지된다. 본 발명의 단백질의 돌연변이 또는 야생형의 알려진 농도의 표지된 표준을 사용하여, 연구자는 샘플에서 본 발명의 단백질의 농도를 정확하게 결정할 수 있고 이러한 정보를 통해 특정한 형식의 단백질의 발현 수준을 평가할 수 있다. 농도계측의 전통적인 방법 역시 이러한 단백질의 발현 수준이나 농도를 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법들은 대량 진단 분석 분야의 당업자에게 자명한 것이다. 앞서 언급한 바와 같이, 당업계에서 다룰 수 있는 array 기술은 본 발명의 이러한 부분에 사용될 수 있고, 항체 결합 패턴과 진단 정보를 최대화하려는 시도로서 단백질 배열을 파편으로 나타낸다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자와 단백질 내 다형현상성의 존재와 검출은 암이나 생물내 유사한 질환의 진단을 가능케 한다. 또한, 항체, 본 발명의 유전자 또는 단백질의 특정 다형 변형에 특정한 검출 성분으로 이루어진 진단 키트를 제조하는 것도 포함된다. 검출 약제는 전형적으로 다음 약제들 중 하나 이상의 조합으로 제공될 것이다. 흡수 능력이 있는 지지체 또는 결합 RNA 또는 단백질이 종종 제공된다. 이와 같은 목적에 유효한 지지체는 양성으로 대전된 치환기의 배열을 가짐으로써 분석될 수 있는 니트로 셀룰로오스 막, 나일론 또는 유도된 나일론과 Genechips^TM 또는 그들의 등량을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 역전사 효소 그리고/또는 태크 중합효소와 같은 효소들 중 하나 이상이 이러한 키트들에 제공될 수 있는데 이는 dNTP, 완충액, 또는 송아지 흉선이나 연어 정자 DNA와 같은 비 인간 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 키트 검정 결과는 건강의료 제공자 또는 진단 시험소에 의해 해석될 수 있다. 대안으로, 진단 키트는 자가 진단을 위해 개개인에게 생산, 판매될 수 있다.

다형현상성의 부재 또는 존재에 따른 질병의 진단에 더하여, 암을 포함한 몇몇 질병들은 특정 조직내 또는 본 발명의 단백질 발현의 벗어난 패턴내의 본 발명의 단백질 또는 유전자의 편중된 수준에 유래한다. 예를 들어 다양한 조직내 발현의 수준을 감시함으로써 진단을 할 수 있고 질병 상태가 동정될 수 있다. 이와 유사하게, 특정 조직내 본 발명의 다양한 단백질의 발현 수준의 비율을 결정함으로써 (즉, 발현 패턴) 건강 또는 질병의 예후가 만들어 질 수 있다. 다양한 조직내 본 발명의 단백질의 발현 수준은 건강한 개체뿐 아니라 암으로 고통받고 있는 개체로부터 결정된다. 이러한 가치들은 데이터베이스에 기록되고 실험된 개체에서 얻어진 가치들과 비교된다. 더구나, 건강한 개체와 질병에 걸린 개체의 다양한 조직 내 발현의 비율과 패턴은 데이터 베이스에 기록된다. 이러한 분석들은 "질병 상태 프로필(disease state profiles)"이라고 일컬으며, 하나의 질병 상태 프로필 (즉, 건강하거나 질병에 걸린 개체로부터)과 시험된 개체로부터 나온 다른 질병 상태 프로필을 비교함으로써, 임상의사는 신속하게 질병의 존재 또는 부재를 진단 할 수 있다.

앞서 언급한 핵산과 단백질 기반 진단 기술은 조직내 본 발명의 유전자 또는 단백질의 발현 수준 또는 양 또는 비율을 검출하는 데에 사용된다. 예를 들면, 정량적인 노던 하이브리다이제이션(quantitative Northern hybridization), 인시츄 분석(in situ analysis), 면역조직화학, ELISA(효소면역측정법), 유전자칩 배열 기술(genechip array technology), PCR(중합연쇄반응) 그리고 웨스턴 블롯 등을 통해, RNA 또는 본 발명의 단백질의 특정한 단백질(야생형 또는 돌연변이)의 발현 수준 또는 양이 신속하게 결정되고 이러한 정보를 통해 발현의 비율이 확인 될 수 있다. 대안으로, 분석되어야 하는 본 발명의 단백질은 현재 알려져 있지 않으나 앞서 언급한 상동성 지역 중 하나 이상을 소유하고 있는 것을 바탕으로 동정된 패밀리 멤버가 될 수 있다.

더 이상의 기재가 없더라도, 앞서 기재된 설명과 다음의 실례를 사용하여 당업자는 본 발명의 구성성분들을 만들고 이용하며 청구항에 기재된 방법들을 행할 수 있다. 따라서 특히 본 발명의 상세한 설명에 초점을 맞춘 하기의 실시예들은 본 발명에 기재된 것들에 한정되지 않는다.

[실시예 1]

췌장암에서 차별화되게 발현된 mRNA의 동정

한국인 환자들로부터 유래된 환자의 조직샘플을 얻고 이를 2개의 그룹으로 분류하였다. 첫번째 그룹은 췌관 선암으로 진단된 환자들로 구성하였다. 여섯 명의 남성과 세 명의 여성으로 이루어진 이 그룹의 환자들의 나이는 51-70세였다. 두번째 환자들의 그룹은 정상 췌장을 가지는 환자들로 구성되었다. 세 명의 남성으로 구성된 이 그룹의 환자들의 나이는 63-66세였다. 각각의 조직샘플들의 조직학적 분석이 수행되었으며, 각각의 샘플들은 비-암화된 범주와 암화된 범주로 분리되었다.

약간의 변형(minor modification)을 거쳐 상기 샘플들은 어피매트릭스 유전자칩 발현 분석 매뉴얼(Affymetrix GeneChip Expression Analysis Manual)에 따른 실험방법에 따라 준비되었다. 먼저, 냉동된 조직이 스펙 서티프렙 6800 동결 분쇄기(Spex Certiprep 6800 Freezer Mill)를 이용하여 분말로 분쇄되었다. 총 RNA가 이후 트리졸(Life Technologies)을 사용하여 추출되었다. 그 다음, mRNA가 올리고텍 mRNA 미디 키트(Oligotex mRNA Midi Kit; Qiagen)를 사용하여 분리되었다. 이후, 1-5mg의 mRNA를 사용하여 이중쇄의 cDNA가 슈퍼스크립트 쵸이스 시스템(SuperScript Choice system; Gibco-BRL)을 사용하여 제작되었다. 제1쇄의 cDNA 합성은 T7-(dT24) 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성되었다. 상기 cDNA는 이후, 페놀-클로로포름으로 추출되고 에탄올 침전되어 최종 농도가 1mg/ml로 되었다.

상기 cDNA 2mg로부터 일반적인 방법에 따라 cRNA가 합성되었다. cRNA에 비오틴을 라벨링 하기 위하여, 뉴클레오티드 Bio-11-CTP 및 Bio-16-UTP(Enzo Diagnostics)이 상기 반응중에 첨가되었다. 37℃에서 6시간동안 반응시킨 다음, 라벨링된 cRNA가 RT-PCR RNA 분리 키트 프로토콜(Rneasy Mini kit protocol; Qiagen)에 따라 세척되었다. 이후 상기 cRNA는 94℃에서 35분간 단편화(5' 단편화 버퍼: 200 mM 트리스-아세테이트(pH 8.1), 500mM KOAc, 150mM MgOAc) 되었다.

상기 단편화된 cRNA 55mg가 어피매트릭스 휴먼 게놈 U133(Affymetrix Human Genome U133)의 어레이(array)세트에 24시간동안 60rpm, 45℃의 하이브리다이제이션 오븐에서 하이브리다이제이션되었다. 상기 제조된 칩은 세척되고, 스트렙타비딘 피코에리트린(Streptavidin Phycoerythrin(SAPE); Molecular Probes)에 의해 어피매트릭스 플루이딕스 상(Affymetrix fluidics stations)에서 염색되었다. 염색을 강화하기 위하여, SAPE 용액이 항-스트렙타비딘 비오틴화 항체(anti-streptavidin biotinylated antibody; Vector Laboratories)와 함께 염색과정중에 두 번 첨가되었다. 프로브 어레이에로의 하이브리다이제이션은 플루오로메트릭 스캐닝(fluorometric scanning; Hewlett Packard Gene Array Scanner)에 의하여 측정되었다. 상기 하이브리다이제이션 및 스캐닝 이후, 마이크로 어레이 이미지들은 주요한 칩의 하이브리다이제이션에서의 결점 또는 비정상을 찾기 위한 정성조절(Quality Control)을 위하여 분석되었다. 상기 모든 칩들이 정성조절, 어피매트릭 마이크로어레이 수트(Affymetrix Microarray Suite(v5.0) 및 LIMS(v3.0)을 통과하였다.

암화 및 비암화된 췌장샘플들 간의 차별적인 유전자의 발현은 어피매트릭스 휴먼 유전자칩 세트 U133(Affymetrix human GeneChip sets U133)을 사용하여 하기의 통계적인 방법에 의하여 결정되었다.

(1) 각각의 유전자에 대하여, U133의 시그널 값들은 어피매트릭스 마이크로어레이 수트(Affymetrix Microarray Suite(v5.0))에 의하여 결정되었으며, "부존 재(Absent)"(미검출), "존재(Present)"(검출) 또는 "경계(Marginal)"(확실하게 미검출되거나 검출되지 않음)로 각각의 유전자칩 요소들이 지칭되었다.

(2) 암화된 췌장 샘플그룹에서 40%이상 존재하는 것으로 지칭되는 상기 원칙을 이용하여, 하나의 유전자 세트가 추가적인 분석을 위하여 선택되었다.

(3) 모든 시그널 값들이 대수적인 비율(logarithmic scale)로 변형되었다.

(4) 데이타 분석을 위하여 분산분석(Analysis of Variance; ANOVA) 방법이 사용되었다(Steel et al., Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach, Third Ed., McGraw-Hill, 1997).

상기 칩데이터의 분석은 LBFL313 마커의 발현이 정상 췌장조직 샘플들에 비하여 췌장암 샘플에서 현저하게 상승조절(up-regulated)(11.13-fold, p=0)된다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 LBFL313의 상승조절이 췌장암의 진단으로 될 수 있다는 것을 의미한다.

LBFL313(서열목록 1)의 발현 정도는 어피매트릭스 유전자칩 U133에서의 칩 서열단편 No.228058_at 에 의하여 측정될 수 있다. Gene Logic, Inc.(Gaithersburg, MD)의 유전자발현 종양학 데이터베이스(GeneExpress Oncology Database^TM)을 사용한 복합적인 검사를 통하여 다양한 악성종양들에서의 228058_at 의 발현 정도들이 정상 콘트롤 조직들과 비교되어 하기 표 1에 제시되었다. 상기 표에서는 폴드 변화(fold-change) 및 변화의 방향(상승- 또는 하강-조절)도 함께 제시되었다. 폴드 변화가 1.5를 넘는 경우가 유의성 있는 것으로 고려되었다.

칩 서열단편 No.228058_at 에 부착된 샘플에 의하여 결정된 유전자칩 발현 결과는 태그만 검정법(Taqman® assay; Perkin-Elmer)를 사용하는 정량적인 RT-PCR(Q-RT-PCR)에 의하여 확인되었다. 특정한 어피매트릭스 단편(Affymetrix fragment; 228058_at)의 서열정보 파일로부터 디자인된 PCR 프라이머들이 상기 분석방법에서 사용되었다. 각각의 RNA샘플(총RNA 10ng)에 있는 표적 유전자들은 외부의 돌출된 참고 유전자(reference gene)에 비례하여 검정된다. 이러한 목적으로, 테트라사이클린 저항성 유전자는 외부에 첨가된 스파이크로서 사용된다. 이 방법은 일정한 양의 테트 스파이크 역치값(Tet spike Ct value)과 비례하는 표적 mRNA의 사이클 역치값(Ct)을 측정함으로써 상대 발현률을 제공한다. 샘플집단은 U133 유전자칩에 의해 분석된 조직 RNAs를 포함한다. 게다가, 유전자칩에 의해 분석되지 않은 몇몇의 샘플들은 Q-RT-PCR에 의해 발현의 검증을 위해 사용된다. Q-RT-PCR 자료는 일반 췌장 생검 조직과 비교하여 췌장선암에서 관찰된 LBFL313의 상승조절을 뒷받침한다.

[표1]

조직	병리/형태	폴드 변화	변화의 방향성	P 값
유방	침투성 소엽암종	1.64	상승	0.19
	침투성 관암종 및 소엽암종	1.59	상승	0.06
경부	편평 상피 세포암	1.61	상승	0.38
결장	점액성 선암	1.88	상승	0.05
십이지장	선암	1.69	상승	0.19
식도	선암	1.83	상승	0.15
간	간세포암	1.52	상승	0.02
폐	선암	1.52	상승	0.21
난소	점액성 낭선암	9.65	상승	0
	장액성 낭선암	2.15	상승	0.13
췌장	선암	8.62	상승	0
피부	기저 세포암	-3.01	하강	0.01
	악성 흑색종	-6.61	하강	0
	편평 상피 세포암	-3.82	하강	0.03
위	인환 세포암	2.40	상승	0.03

[실시예 2]

차별화되게 발현된 mRNA 종에 상응하는 전장 cDNA(full-length cDNA; LBFL313)의 클로닝

SEQ ID NO:1을 가지는 전장 DNA는 올리고-풀링(oligo-pulling) 방법에 의하여 얻어진다. 간단히 말해, 유전자 특이적인 올리고는 LBFL313의 서열에 기초하여 디자인된다. 올리고는 바이오틴으로 라벨링되고 샘브루크 등의 방법을 사용하여 사람의 태반 자료실로부터 2㎍의 단일쇄 플라스미드 DNA(cDNA 재조합체)와 하이브리다이제이션하기 위해 사용된다. 하이브리다이제이션된 cDNA는 스트렙타비딘이 결합된 비드에 의하여 분리되어지고 열을 가하여 추출된다. 추출된 cDNA는 이중쇄 플라스미드 DNA로 전환되어 E.coli 세포(DH10B)를 형질변환하는데 사용되고 가장 긴 cDNA가 얻어진다. 그 후의 양성선택(positive selection)은 유전자 특이적인 프라이머를 사용한 PCR에 의해 결정되고, cDNA 클론은 DNA 서열분석을 행한다.

차별화되게 조절된 mRNA에 대응하는 전장 휴먼 cDNA의 핵산 서열은 상기 언급된 SEQ ID NO:1로 검출되었다. cDNA는 777 염기쌍을 포함한다.

53-640 핵산(정지 코돈을 포함하는 53-643)에서 SEQ ID NO:1의 cDNA 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임은 196 아미노산 단백질을 암호화한다. SEQ ID NO:1에 의해 암호화된 예측 단백질에 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 나타났다.

SEQ ID NO:2는 자칼린-유사 렉틴 도메인(Jacalin-like lectin domain)을 포함한다:이 도메인을 포함한 단백질은 렉틴이며, 이것은 단백질에서 1 내지 6쌍이 발견된다. 이 도메인은 또한 동물의 전립선 스페르민 결합 단백질(prostatic spermine-binding protein)(Raval et al. (2004) Glycobiology 14:1247-1263)에서 발견된다. 도1은 SignalIP 3.0 Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP)에 의해서 분석된 시그날 서열의 결과를 나타낸다. 분비를 위한 전위 시그널 서열(potential signal sequences) 절단 부위는 아미노산 위치 40(Ala) 및 41(Gly)의 사이라고 예측된다.

노던블롯에 의한 분석은 LBFL313에 대응하는 mRNA 전사체의 사이즈를 결정하기 위해 수행된다. 다양한 사람의 조직으로부터 얻은 총 RNA들을 포함하는 노던블롯이 사용되고(Human 12-Lane MTN Blot, Clontech, Palo Alto, CA), 228058_at 서열을 포함하는 EST는 랜덤 프라이머 방법에 의해 방사성 표지되어 블롯에서의 프로브로 사용된다. 이 블롯은 42℃에서 50% 포르마미드, 5X SSPE, 0.1% SDS, 5X Denhart's 용액 및 0.2mg/ml 청어의 정자 DNA에서 하이브리다이제이션되고, 실온에서 0.1% SDS를 포함하는 0.2X SSC로 세척한다. 노던블롯은 대략 0.8Kb 크기의 이 유전자의 단일 전사체를 나타낸다. 이것은 LBFL313 클론(SEQ ID NO:1)의 크기와 유사하다.

[실시예 3]

LBFL313 로 트렌스펙션된 세포주의 생산

LBFL313의 암호화 부위(coding region)는 BamHI 부위를 포함한 전방향 프라이머(5'-TTGGGATCCGTATAAAGGCGATGTGGAGG-3') 및 XbaI 부위를 포함한 역방향 프라이머(5'-ACC ATC TAG AGC GAC CCA CGG GTG AGT-3')에 의해서 증폭된다. PCR은 제품의 사용설명서에 따라 택플러스 프리시젼 DNA 폴리머라아제(TaqPlus precision DNA polymerase; Stratagene, CA)를 사용하여 수행된다. PCR 증폭 사이클은 94℃에서 2분간 초기 변성 및 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 27주기를 포함하고 72℃에서 10분간의 최종 연장에 의해 얻어진다. PCR 생성물은 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1-mycHis(Invitrogen)의 BamHI 및 XbaI 부위를 복제한다. 복제된 플라스미드(pLFG250)는 최초의 구조를 확인하기 위한 클로닝 부위의 영역을 따라 연속된다. 아 충만상태의(subconfluent) CHO 세포들은 제조회사의 설명서에 따라 리포펙타민플러스 시약(LipofectaminePLUS reagent; Invitrogen)만을 사용하여 pLFG250 또는 pcDNA3.1-mycHis 벡터로 안정하게 트렌스펙션된다. 24시간 후, 트렌스펙션된 세포들은 선별을 위해 10% FBS 및 400㎍/㎖ G418(Sigma)을 포함한 Ham's F12(Invitrogen)에서 배양된다. 선별배지는 이틀에 한번씩 교환하고 10-12일 후의 클로닝 환(cloning ring)은 양성 클론의 동정에 사용된다. 배양을 확장시켜 LBFL313의 발현을 검사한다. 세포는 50mM HEPES(pH 7.2), 150mM NaCl, 25mM 베타-글리세로포스페이트, 25mM NaF, 5mM EGTA, 1mM EDTA, 1% NP-40, 1mM 오르토바나듐산화나트륨, 0.1mM PMSF 및 프로테아제 저해제인 프로테아제 저해제 칵테일(류펩틴(Leupeptin), 펩스타틴(Pepstatin), 아프로티닌(Aprotinin) 및 안티파인(antipain) 각 5㎕/㎖)을 포함한 용해 버퍼에서 용해시킨다. 배양액은 15㎕의 부피로 만든 10k로 절단된 마이크로콘(Amicon)에 의해 농축된다. 단백질은 4x SDS 로딩 버퍼에서 95℃에서 5분간 배양에 의해 감소된다. 폴리펩타이드는 12% SDS-PAGE 겔상의 10mA/gel에서 분해되고 4℃의 200mA/gel에서 2시간 동안 0.45㎛ 이모빌론 피-트렌스퍼 맴브레인(Immobilon P-transfer menmbrane; Millipore)에서 전기영동에의해 트렌스펙션된다. 막은 5%(w/v) 무지방 우유를 포함한 TBST 버퍼(25mM Tris, pH 7.5; 125mM NaCl 및 0.1%(v/v) Tween-20)에서 1시간동안 블로킹된다. 블롯은 항-히스 HRP 항체(anti-His HRP antibody; Santa Cruz)와 함께 하룻동안 배양하여 프로브를 부착한다. 면역활성 물질은 제작회사의 설명서에 따라 강화된 화학발광(chemiluminescence)법(Slpis Biotech)에 의해 시각화된다. 도2에 나타낸 것과 같이, LBFL313 단백질은 세포 추출물이 아닌 배양 상층액에서만 검출된다. 이것으로 LBFL313이 분비된 단백질을 암호화한다는 예상을 확인하였다.

[실시예 4]

세포의 증식, 이동 및 전이에서 LBFL313 과발현의 분석

세포의 증식, 성장률에 있어서 LBFL313 과발현의 효과를 측정하기 위해서 세 포수 계수법을 사용하였다. 12웰 플레이트에서 4x10⁴의 세포를 배양하였다. 플레이트는 37℃ 및 5% CO₂에서 12일간 배양되고 세포의 수는 매일 혈구계산기로 측정하였다. 결과는 평균값과 3중의 표준 편차값을 합하여 나타내었다. 도3A에 나타낸 것과 같이 LBFL313의 과발현은 CHO세포의 빠른 분화를 유도하였다. LBFL313 과발현 PANC-1 췌장암 세포주에서도 비슷한 효과를 나타내었다.

이동과 전이는 보이덴 챔버(Boyden Chamber) 검정법에 의하여 연구되었다. 48웰 보이덴 챔버와 뉴로 프로브 48웰 마이크로 챔버(Neuro Probe 48well micro chamber; Neuroprobe) 모두에서 시행되었다. 세포는 트립신 저해제, 콩 트립신 저해제(Soybean trypsin inhibitor)에서(Sigma)트립신화되고 재현탁된다. 세포는 무혈청 배지에서 ml당 2x10⁶의 농도로 최종 농축되어 현탁되고 펠릿화된다. 낮은 웰의 챔버를 30㎕의 표준배양액으로 가득 채운다. 챔버는 폴리카보네이트 필터(polycarbonate, 8㎛ 직경 구멍 크기, Neuroprobe)를 사용하여 조립되었다. 세포 전이 검정법을 위해, 1mg/ml의 마트리겔 기저막 매트릭스(Matrigel^TM Basement Membrane Matrix; BD biosciences)는 각각의 필터(500㎍/필터)에 층을 만들어 자연 건조한다. 세포 현탁액(1x10⁵ 세포/웰)의 50㎕ 샘플을 윗부분에 첨가한다. 챔버는 37℃ 및 5% CO²에서 배양되고 배양시간은 분석할 세포형에 따라 다양하다: CHO 이동 검정법의 경우에는 24시간동안, CHO 전이 검정법의 경우에는 48시간 및 PANC-1 이동 및 전이 검정법의 경우에는 18시간이다. 배양 마지막에 필터 상부 표면의 세포 는 기계적으로 제거된다. 필터는 메탄올로 고정되고 김사염색(Giemsa stain), 변경된 용액에 의하여 염색되어진다. 필드당(100x) 이동된 세포의 수는 광학 현미경(Olympus)하에서 계산된다. 각 샘플은 3중으로 검정된다. 도3B와 도3C에서 나타난것과 같이 CHO 세포 운동성과 전이성은 LBFL313의 과발현에 의해 증가된다. LBFL313 과발현 PANC-1 췌장암 세포주에서도 비슷한 효과를 나타낸다.

[실시예 5]

누드 마우스 내의 종양 형성에 대한 LBFL313 과발현의 효과

생체내 종양 성장에 대한 LBFL313 과발현의 생물학적 효과를 검사하였다. CHO 세포를 면역결핍 누드 마우스의 측면 내로 피하주사하였다. LBFL313 벡터(pLFG250) 또는 벡터 단독으로 트랜스펙션되지 않거나 또는 안전하게 트랜스펙션된 융합성 CHO 세포를 트립신 처리하고 3.3×10⁷세포/㎖의 밀도의 세포를 PBS에서 다시 서스펜전시켰다. 각 타입의 5백만의 CHO 세포를 5마리의 8주 된 늙은 암컷 Balb/C(nu/nu) 마우스의 측면 내에 피하주사하였다. 마우스의 성장 과정에서 종양의 길이와 너비를 측정하였다. 종양의 부피를 식 종양 부피=(길이)×(너비)²/2를 이용하여 계산하였다. 37일 후에, 마우스를 희생시키고 종양을 분석하였다. 도 4A에서 보는 바와 같이, LBFL313-트랜스펙션된 세포에 의하여 생성된 종양의 크기는 위 대조군 세포에 의하여 형성된 것보다 5배 이상 컸다.

종양에 의해 유도된 혈관신생의 정도를 결정하기 위하여, 종양 이종 이식의 파라핀 섹션을 항-인자 Ⅷ 모노클로날 항체(Dako)로 염색하였다. 마우스 각 그룹 의 종양에서 얻은 파라핀-함몰 조직 섹션(3-5㎛의 두께)을 크실렌 내에서 탈-파라핀화하고 등급별 에탄올 시리즈(100-90-80-70-50-30%) 내에서 재수화시키고 PCS 세척하였다. 내생성 퍼옥시다제를 상온에서 15분 동안 0.3%(v/v)의 과산화수소 메탄올 용액에 슬라이드를 담굼으로써 블록킹시켰다. 각각 4분 동안 PBS로 3회 세척한 후에, 섹션을 상온에서 1시간 동안 10%(v/v)의 노말 당나귀 혈청 PBS 용액 내에 담굼으로써 블록킹시켰다. 각각 4분동안 PBS로 3회 세척한 후에, 블록킹된 섹션을 항-인자 Ⅷ 모노클로날 항체(폰 비레브란드 인자(von Willebrand factor), 1:50 희석, Dako)에서 상온에서 2시간 동안 배양시켰다. 2시간 후에, 각각 4분동안 PBS로 3회 세척한 후에, 슬라이드를 상온에서 30분 동안 비오틴화된 링크 유니버설(biotinylated Link universal)과 함께 배양시키고 각각 4분 동안 PBS로 3회 세척하고, 접합된 스트렙토아비딘-HRP(sterptoavidin-HRP, Dako)으로 상온에서 15분 동안 배양시켰다. PBS로 3회 세척한 후에, 섹션을 크로모겐(chromogen)과 함께 배양시키고 증류수로 세척하였다. 인자 Ⅷ 섹션은 대조염색을 하지 않았다.

미세혈관의 수는 패드로 등에 의한 방법으로 결정하였다(Padro et al. (2000) Blood 95:2637-2644). 미세혈관 카운팅을 광학현미경을 이용하여 독립된 숙련연구자에 의하여 동시에 분석하였다. 연구자들은 임상병리학적인 발견에 대해서는 알고 있지 않았다. 전체 섹션을 필드 대 필드(field per field) ×100 배율에서 가장 심한 혈관화(vascularization)를 보여주는 영역을 찾아내기 위하여 조직적으로 스캐닝하였다. 그리고 나서, 배율을 ×200 또는 ×400으로 바꾸고, 연구자가 가장 많은 수의 미세혈관이 ×400 필드 내에 있을 때까지 슬라이드를 보존하도 록 하였다. 이 영역은 양쪽 연구자를 일치시켜 관측자 내에 존재하는 미세혈관 카운팅의 에러를 줄인 후에 핫 스폿(hot spot)이라 정의하였다. 각각의 핫 스폿에서 양쪽 연구자들이 ×400 필드에서 개개 미세혈관의 카운팅을 실시하였다. 도 4B에서 보는 바와 같이, 모조 대조군 세포보다 LBFL313-트랜스펙션된 세포가 주입된 마우스에서 보다 많은 수의 미세혈관이 카운트되었다. 생체 내 실험은 LBFL313에 의한 침윤성 종양 형성 및 강화된 혈관형성을 의미한다.

[실시예 6]

폴리클로날 항- LBFL313 항체의 생산

LBFL313의 전장 cDNA를 전방향 프라이머(forward primer, 5'-CTAAGGCCCAGCCGGCCGGGAAGATGTATGGCCCTGGA-3') 및 역방향 프라이머(backward primer, 5'CATAGGCCCCACCGGCCGAGCGACCCACGGGTGAGTT-3')를 이용하여 PCR을 함으로써 증폭시켰다. PCR는 제품의 사용설명서에 따라서 택플러스 프리시젼 DNA 폴리머라제(TagPlus precision DNA polymerase: Stratagene, CA)를 이용하여 실시하였다. PCR 증폭 사이클은 94℃에서 5분 및 30분; 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 변성시키고 의 30주기를 포함하고, 72℃에서 10분 동안 최종적으로 연장시켰다. PCR 생성물은 1.5% TAE 겔 상에서 시각화시키고, 제품의 사용설명서에 따라서 지모클린 겔 DNA 리커버리 키트(Zymoclean Gel DNA recovery kit, Zymo Research, CA)를 이용하여 겔을 정제하였다. 정제된 DNA를 pLFG106 펙터의 SfiI 부위내로 삽입시켜 재조합 LBFL313-Fc 융합 단백질을 제조하였다. pLFG106은 신호 서열, 인간 IgG의 Fc 부위, 및 pcDNA3.1(invitrogen)의 백본 내의 DHFR 유전자를 포함하는 발현 벡터이다. PLFG106 또한 클로닝 부위 및 Fc 부위 사이에 트롬빈 인식 서열을 포함하고 있다. LBFL313-Fc 발현 플라스미드는 ExGen 500 약제(Fermentas, Lithuania)을 사용하여 제품 설명서에 따라서 DHFR-결핍 CHO 돌연변이체 세포주 내로 안정하게 트랜스펙션되었다. 안정하게 트랜스펙션된 세포는 2주간 G418 800㎍/㎖(Invitrogen, CA) 및 10%로 희석된 FBS를 포함하는 뉴클레오티드가 없는 MEM-α(Invitrogen, CA) 내에서 선택하였다. 안정한 트랜스펙턴트를 10mM 농도의 메토트렉사트(Sigma, MO)에서 2주 동안 더욱 적응시켰다. 배지 내로 분비된 재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질은 항-인간 Fc 항체(Sigma, MO)를 이용한 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA법을 실시함으로써 확인하였다.

재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질의 대규모의 발현은 롤러 보틀(1750㎠)을 이용하여 실시하였다. 재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질을 발현하는 안정한 트랜스펙턴트는 IMDM/5% FBS에서 성장하였다. 롤러 보틀 배양액을 3×10⁸ 세포로 접종시키고, 장치를 37℃의 배양기 내에서 5rpm의 속도로 회전시켰다. 세포를 5일동안 배양시키고, 배지를 3일마다 무혈청 배지로 교환하였다. 수확된 무혈청 배지 내의 세포 파편들은 10분동안 6,000rpm의 속도로 원심분리하여 제거하였다. 재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질을 정제하기 위하여 10K MWCO 멤브레인(Pellicon 2, Milipore)을 통한 농축기(Concentrator, ProFlux M12, Amicon)를 이용하여 무세포 배지를 농축 처리하였다. 20mM 소듐 포스페이트(pH 8.0)로 예비-평형시킨 10-㎖ 단백질 A 아가로즈 칼럼(Pierce)으로 농축된 배지를 통과시켰다. 10mM 소듐 포스 페이트 완충액으로 결합되지 않은 단백질을 칼럼 밖으로 세척하였다. 그리고 나서 칼럼을 0.1M 시트레이트(pH 3.0)으로 용출시키고, 500㎕ 1M Tris-HCl(pH 9.0)를 포함하는 튜브로 4.5㎖의 분획을 수집하였다. 분획을 포함하는 재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질로 풀을 형성하였으며, 세파로즈 200HR 레진(Amersham, IL)을 이용한 크기별-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 실시하여 더욱 정제시켰다.

재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질로부터 트롬빈 절단 캡쳐 키트(Thrombin Cleavage Capture Kit, Novagen)에 의하여 C-말단 Fc는 절단되었으며, 이뮤노퓨러알 고정 단백질 A(ImmunoPureR Immobilized Protein A, Pierce)에 의하여 제거되었다. 요약하자면, 재조합체 LBFL313-Fc 융합 단백질을 20℃에서 하룻밤동안 비오틴화된 트롬빈에서 배양시켰다. 단백질 분해 후에, 비오틴화된 트롬빈을 스트렙트아비딘 아가로즈 비드에 의하여 제거하였다. 생성된 용액인 재조합체 LBFL313 및 Fc의 혼합물을 이뮤노퓨러알 고정 단백질 A 칼럼(Pierce)을 2회 통과시켜 분리하였다. 재조합체 LBFL313의 순도를 SDS-PAGE 겔을 통하여 확인하였다.

정제된 재조합체 LBFL313를 표준 방법을 이용하여 2마리의 토끼를 면역시키는 데에 사용하였다. 면역된 혈청을 수집하고 나서 제품의 사용설명서에 따라서 이뮤노퓨어알 IgG 정제 키트(ImmunoPureR (A Plus) IgG Purification Kit, Pierce)를 이용하여 정제하였다. 재조합체 인간 Fc와 결합된 아미노링크R 고정화 키트(AminoLinkR (A Plus) Immobilization Kit, Pierce)를 이용하여 더욱 정제하였다. 정제된 폴리클로날 항체는 LBFL313를 발현하는 췌장암 세포로부터 얻은 조건 부의 배지의 웨스턴 블롯에서 약 21kDa의 단백질을 감지하였다. 항체의 특이성은 PANC-1 세포가 트랜스펙션된 LBFL313의 조건부 배지로부터 얻은 LBFL313 단백질의 강화된 감지로 확인된 반면에, PANC-1 세포가 트랜스펙션만 된 벡터로부터는 어떠한 강화도 없었다.

[실시예 7]

LBFL313 발현의 면역조직화학적 분석

조직 마이크로어레이 슬라이드를 크실렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 4분 동안 실시하였다. 그리고 나서, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다.

1차 항체는 1:500의 희석에서 폴리클로날 항-LBFL313 항체였다. 블록화된 섹션을 1차 항체 내에서 4℃에서 하룻밤 동안에서 배양시켰다. 다음의 반응을 LSAB+ 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA) 및 권장 과정을 이용하여 실시하였다. 끝으로, 슬라이드를 3-아미노-9-에틸-카바졸(DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) 용액으로 대조염색하였다.

모든 경우에서 종양 세포의 세포질에서 면역반응성이 관찰되었다. 면역반응성은 H-스코어법(H-score method)에 의하여 평가하였다. 염색의 강도는 각각 음성, 약한, 중간, 및 강한 갈색 염색의 존재에 해당하는 0, 1, 2 및 3으로 평가하였다. 다른 강도로 염색된 세포의 퍼센트를 결정하고 하기의 식에 적용하였다: H-score=(강도 스코어 1에 염색된 세포의 %)+2×(강도 스코어 2에 염색된 세포의 %)+3×(강도 스코어 3에 염색된 세포의 %). 종양 조직 및 인접 비-종양 조직의 H-스코어를 윌콕손 부호순위 검정(Wilcoxon signed rank test)을 이용하여 분석하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 종양 조직은 인접 비-종양 조직보다 상당히 높은 LBFL313 발현을 보여준다.

[실시예 8]

췌장암 세포 침습성에 대한 항- LBFL313 의 효과

인간 췌장암 세포주의 침습성에 대한 항-LBFL313 항체의 효과를 결정하기 위하여, 항-LBFL313 항체 또는 정상노말 토끼 IgG의 존재하에 보이덴 챔버 분석(Boyden Chamber assay)을 실시하였다. 요약하자면, 다섯 종류의 췌장암 세포주, CFPAC-1, MiaPaCa-2, PANC-1, AsPC-1 및 BxPC-3을 트립신화시키고 트립신 저해제(Sigma) 용액내에서 재서스펜션시켰다. 세포를 펠렛화시키고, PBS, 항-LBFL313 항체, 또는 노말 토끼 IgG의 존재하에 무혈청 배지에서 서스펜션시켜 최종 농도를 1~5×10⁶세포/㎖로 만들었다. 챔버의 보다 낮은 웰은 표준 배지 30㎕로 채웠다. 챔버를 1㎎/㎖의 마트리젤TM 기저막 멤브레인 매트릭스(MatrigelTM Basement Membrane Matrix, BD biosciences)로 윗부분이 코팅된 8㎛의 직경 기공크기의 폴리카보네이트 필터(Neuroprobe)를 이용하여 조립하였다. 세포 서스펜션의 50㎕를 상부 구획에 첨가하였다. 챔버를 37℃ 및 5% CO²에서 24시간 동안 배양시켰다. 배양의 마지막에는 필터의 상부 표면상의 세포를 기계적으로 제거하였다. 필터를 메탄올로 고정시키고 지엠사 새틴 변형 용액(Giemsa satin, Sigma)으로 염색시켰다. 필드 당 이동된 세포 수(100×)를 광학현미경(Olympus)을 이용하여 카운트하였다. 각각의 샘플을 3중으로 분석하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 항-LBFL313 항체는 용량-의존 방식으로 인간 췌장암 세포주의 침윤성을 효과적으로 저해하였다. 이와 유사한 효과가 위암 세포주, AGS 및 N87에서 관찰되었다.

본 발명에 따르면, 정상 췌장 조직 및 다른 악성 조양과 비교하여 다르게 발현되는 췌장암 환자의 인간 조직에 있어서의 유전자 발현의 변화를 이용하여, 췌장암을 정확하게 진단할 수 있는 물질, 조성물 및/또는 방법 등을 제공하고, 췌장암 치료 약제를 동정하는 방법, 치료용 조성물 및/또는 치료방법 등을 제공할 수 있다.

이상에서 본 발명의 기재된 구체예를 중심으로 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<110> KOH, Sang Seok SONG, Si Young KIM, Sun A LEE, Yang Soon JEON, Sun Bok PARK, Eui Chul KIM, Young Gun <120> GENE FAMILY(LBFL313) ASSOCIATED WITH PANCREATIC CANCER <130> PA06-0135 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (53)..(643) <400> 1 cgcttcttcc ttctggatgg gggcccaggg ggcccaggag agtataaagg cg 52 atg tgg agg gtg ccc ggc aca acc aga cgc cca gtc aca ggc gag agc 100 Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser 1 5 10 15 cct ggg atg cac cgg cca gag gcc atg ctg ctg ctg ctc acg ctt gcc 148 Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala 20 25 30 ctc ctg ggg ggc ccc acc tgg gca ggg aag atg tat ggc cct gga gga 196 Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala Gly Lys Met Tyr Gly Pro Gly Gly 35 40 45 ggc aag tat ttc agc acc act gaa gac tac gac cat gaa atc aca ggg 244 Gly Lys Tyr Phe Ser Thr Thr Glu Asp Tyr Asp His Glu Ile Thr Gly 50 55 60 ctg cgg gtg tct gta ggt ctt ctc ctg gtg aaa agt gtc cag gtg aaa 292 Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Leu Leu Val Lys Ser Val Gln Val Lys 65 70 75 80 ctt gga gac tcc tgg gac gtg aaa ctg gga gcc tta ggt ggg aat acc 340 Leu Gly Asp Ser Trp Asp Val Lys Leu Gly Ala Leu Gly Gly Asn Thr 85 90 95 cag gaa gtc acc ctg cag cca ggc gaa tac atc aca aaa gtc ttt gtc 388 Gln Glu Val Thr Leu Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Thr Lys Val Phe Val 100 105 110 gcc ttc caa gct ttc ctc cgg ggt atg gtc atg tac acc agc aag gac 436 Ala Phe Gln Ala Phe Leu Arg Gly Met Val Met Tyr Thr Ser Lys Asp 115 120 125 cgc tat ttc tat ttt ggg aag ctt gat ggc cag atc tcc tct gcc tac 484 Arg Tyr Phe Tyr Phe Gly Lys Leu Asp Gly Gln Ile Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 ccc agc caa gag ggg cag gtg ctg gtg ggc atc tat ggc cag tat caa 532 Pro Ser Gln Glu Gly Gln Val Leu Val Gly Ile Tyr Gly Gln Tyr Gln 145 150 155 160 ctc ctt ggc atc aag agc att ggc ttt gaa tgg aat tat cca cta gag 580 Leu Leu Gly Ile Lys Ser Ile Gly Phe Glu Trp Asn Tyr Pro Leu Glu 165 170 175 gag ccg acc act gag cca cca gtt aat ctc aca tac tca gca aac tca 628 Glu Pro Thr Thr Glu Pro Pro Val Asn Leu Thr Tyr Ser Ala Asn Ser 180 185 190 ccc gtg ggt cgc tag ggtgggg tatggggcca tccgagctga ggccatctgt 680 Pro Val Gly Arg *** 195 gtggtggtgg ctgatggtac tggagtaact gagtcgggac gctgaatctg aatccaccaa 740 taaataaagc ttctgcagaa tcaaaaaaaa aaaaaaa 777 <210> 2 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala Gly Lys Met Tyr Gly Pro Gly Gly 35 40 45 Gly Lys Tyr Phe Ser Thr Thr Glu Asp Tyr Asp His Glu Ile Thr Gly 50 55 60 Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Leu Leu Val Lys Ser Val Gln Val Lys 65 70 75 80 Leu Gly Asp Ser Trp Asp Val Lys Leu Gly Ala Leu Gly Gly Asn Thr 85 90 95 Gln Glu Val Thr Leu Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Thr Lys Val Phe Val 100 105 110 Ala Phe Gln Ala Phe Leu Arg Gly Met Val Met Tyr Thr Ser Lys Asp 115 120 125 Arg Tyr Phe Tyr Phe Gly Lys Leu Asp Gly Gln Ile Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Pro Ser Gln Glu Gly Gln Val Leu Val Gly Ile Tyr Gly Gln Tyr Gln 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ile Lys Ser Ile Gly Phe Glu Trp Asn Tyr Pro Leu Glu 165 170 175 Glu Pro Thr Thr Glu Pro Pro Val Asn Leu Thr Tyr Ser Ala Asn Ser 180 185 190 Pro Val Gly Arg *** 195

Claims (26)

1. (a) 서열목록 1의 염기서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   (b) 서열목록 2의 아미노산서열을 코딩하는 단리된 핵산분자;

   (c) 암에서 발현되는 단백질을 코딩하며, 서열목록 1의 염기서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단리된 핵산분자; 및

   (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산분자와 상보적인 서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산분자를 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 핵산분자가 서열목록 1의 53번째부터 640번째까지의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 핵산분자가 서열목록 1의 53번째부터 643번째까지의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 핵산분자가 서열목록 1의 53번째부터 643번째까지의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제
6. (a) 서열목록 1의 염기서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   (b) 서열목록 2의 아미노산서열을 코딩하는 단리된 핵산분자;

   (c) 암에서 발현되는 단백질을 코딩하며, 서열목록 1의 염기서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단리된 핵산분자; 및

   (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산분자와 상보적인 서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산분자를 가지는 벡터를 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
7. (a) 서열목록 1의 염기서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   (b) 서열목록 2의 아미노산서열을 코딩하는 단리된 핵산분자;

   (c) 암에서 발현되는 단백질을 코딩하며, 서열목록 1의 염기서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단리된 핵산분자; 및

   (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산분자와 상보적인 서열을 포함하는 단리된 핵산분자;

   로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산분자를 가지도록 형질전환된 비인간 형질전환세포를 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 서열목록 2의 아미노산서열을 포함하는 단백질; 및

    서열목록 2의 아미노산서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단백질;

    로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
14. 서열목록 2의 아미노산서열을 포함하는 단백질; 및

    서열목록 2의 아미노산서열과 95%이상의 동일성을 가지는 단백질;

    로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 폴리펩티드와 결합되는, 단리된 항체 또는 항원과 결합된 단리된 항체를 포함하는 췌장암 진단 또는 치료용 조성물.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
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26. 삭제

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