KR20100034720A

KR20100034720A - 피에이유에프(ｐａｕｆ) 특이적인 인간 단일클론항체, 이를 포함하는 암 치료용 조성물, 이를 이용하는 암의 진단방법

Info

Publication number: KR20100034720A
Application number: KR1020090090278A
Authority: KR
Inventors: 고상석; 이양순; 손미진; 김수진; 유경숙; 박은혜
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2010-04-01
Also published as: KR101098186B1; KR20110122807A; WO2010036031A2; WO2010036031A3

Abstract

본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 암과 관련된 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이유에프 (PAUF) 핵산분자와 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자를 포함하는 암 진단용 마커, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함하는 암 진단용 조성물 및 암을 진단하는 방법, 및 상기 마커의 수준, 활성 등을 측정하여 암 치료 또는 예방용 조성물을 스크리닝하는 방법 및 상기 마커의 수준, 활성 등을 감소시키는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이유에프 (PAUF) 핵산분자는 암 발병에 대해 매우 특이적이며, 특히 췌장암에 있어 마커 또는 치료 타겟이 된다. 또한, 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 항-피에이유에프(PAUF)항체 또는 그의 기능적인 단편은 췌장암, 위암을 비롯한 여러 암세포에서 발현하는 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하여 조기에 암 진단이 가능하며, 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 억제하여 암 세포의 성장, 침윤 및 이동을 억제한다.

피에이유에프(PAUF) 단백질, 피에이유에프(PAUF) 핵산분자, 항 피에이유에프 항체, 인간 단일클론항체, 췌장암, 진단

Description

피에이유에프(ＰＡＵＦ) 특이적인 인간 단일클론항체, 이를 포함하는 암 치료용 조성물, 이를 이용하는 암의 진단방법{PAUF-SPECIFIC HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING THE SAME AND METHOD FOR DETECTING CANCER USING THE SAME}

본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 암과 관련된 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이유에프 (PAUF) 핵산분자와 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자를 포함하는 암 진단용 마커, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함하는 암 진단용 조성물 및 암을 진단하는 방법, 및 상기 마커의 수준, 활성 등을 측정하여 암 치료 또는 예방용 조성물을 스크리닝하는 방법 및 상기 마커의 수준, 활성 등을 감소시키는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

노년 인구 증가, 산업의 급격한 발달에 의한 환경 악화로 인해 세계 암 발생률은 매년 5% 이상 증가하고 있고, WHO의 보고서에 의하면 향후 25년 내 암 발생인구는 3천만명으로 늘어나고 이 중 2천만명의 인구가 암으로 사망할 것으로 추정하고 있다 (안순길 (2003) 항암제 연구개발 동향, 보건산업기술동향 2003 여름:10-18). 국내 통계청의 2006년 사망 및 사망 원인 통계 결과에 따르면 암은 3대 사망 원인으로 가장 높은 순위를 차지하고 있으며, 사망률이 가장 많이 증가한 사인으로 조사되었다. 또한 암으로 인한 사회 경제적 손실 비용이 한해 약 11조 3000여억원에 달한다는 연구결과는 암의 예방 및 치료, 관련 연구의 중요성이 높음을 시사하고 있다 (Faint et al. (2004) Pipeline Insight: Cancer Overview, Datamonitor DMHC2025).

췌장암은 발병률에 있어서는 전체 암환자의 약 2%를 차지하여 그리 높지 않은 편이나 사망률은 전체 암 관련 사망의 4위로 매우 높은 것으로 알려져 있다. 이는 췌장암이 초기에는 징후가 나타나지 않아 초기 진단이 어렵고 전이율이 높아서, 발견되는 시점에서는 이미 외과적 절제술이 불가능한 광범위하게 전이된 말기단계로 진행되어 있는 경우가 많으며, 결정적으로 효과적인 치료제가 없는 특성 때문이라 할 수 있다 (Faint et al. (2004) Datamonitor DMHC2045; Garcea et al. (2005) Pancreatology 5:514-529).

뿐만 아니라, 현재 혈액을 포함하는 인간유래의 체액에서 췌장암을 진단 할 수 있는 방법은 없다. 현재 MRI, CT 등의 방법으로 검진이 가능하나 이러한 방법으 로 검진이 가능할 경우는 이미 말기 상태이다. 또한 췌장암 혈액검사로 사용되는 CA19-9측정법은 특이도가 매우 낮아 진단의 목적으로는 사용이 불가능하며 질환의 치료 모니터링의 한 방법에 국한되어 사용되고 있다. (보건복지부 고시 암검진방법). 진행성 췌장암은 원격 전이의 존재로 인해 외과적 절제술이 가능한 환자의 비율이 전체 췌장암 환자의 10~15%정도이며, 절제술과 화학 요법 등을 병행하여 집중적인 치료를 받는 경우에도 평균 생존 기간 연장이 15~18개월 정도로 매우 낮은 편에 속한다. 절제술이 불가능한 환자의 경우 인간 췌장암 세포의 세포 사멸을 유도하고 종양의 성장 및 진행을 억제할 수 있는 정맥 투여용 2-디옥시시티틴 뉴클레오사이드 유사체인 젬시타빈(Gemcitabine)을 기본 처방으로 사용하고 있으나, 효과가 좋지 않고 부작용이 많아 환자의 삶의 질을 떨어뜨린다는 평가를 받고 있다. 따라서, 상기 질병에 대한 효과적이고 새로운 치료제의 개발의 필요성이 강력히 요구되고 있다 (Faint et al. (2004) Datamonitor DMHC2045; Garcea et al. (2005) Pancreatology 5:514-529; Kern et al. (2002) Cancer Biol Therapy 1:607-613; Laheru and Jaffee (2005) Nature Rev Cancer 5:459-467).

현재 임상적으로 사용하고 있는 항암제는 화학요법제와 생물요법제로 분류할 수 있다. 과거 활발히 개발되었던 화학요법제는 암 세포에 독성을 나타내는 약제들로서, 암 세포와 함께 정상 세포에도 독성을 나타내는 문제와 세포 내 방어 기작의 일종으로 나타내는 약제 내성 문제가 있다는 점에서 한계를 보이고 있다. 이에 최근에는 인체의 면역 기능을 회복시키거나 증가시켜 암 세포의 활동력을 약화시킴으 로서 그 진행을 저해시킬 수 있는 개념의 생물요법제가 그 대안으로 대두되어 활발히 개발되고 있다. 현재 사용되거나 개발되고 있는 생물요법제로는 사이토카인류, 단일클론항체 등 재조합 항체, 핵산분자 치료제 및 신생혈관형성 억제제 등이 있다 (김열홍 외 (2004) 암유전체 연구와 새로운 항암제의 개발, 보건산업기술동향 2004-여름 55~61; 안순길 (2003) 항암제 연구개발 동향, 보건산업기술동향 2003-여름 10~18).

이 중 치료용 단일클론 항체는 대표적인 생물요법제로서 반응 특이성이 높아 질환 특이적 타겟에게만 작용하므로 종래의 세포독성을 가진 화학치료제보다 부작용이 낮은 것으로 알려져 있다. 항체는 여러 가지 기작으로 치료효과를 나타내는데, 해당 항원과 특이적으로 결합하여 신호전달을 저해하거나 교차 결합(cross-linking)에 의한 세포 사멸을 유도할 수 있으며 또한 생체 내 면역 시스템을 활성화하여 그 효과를 나타낼 수도 있다. 그러므로 항암제로서의 단일 클론 항체는 특이적으로 암세포를 추적하여 타겟의 기능을 억제함은 물론 면역반응을 일으킴으로써 암세포를 효과적으로 제거할 수 있는 장점을 가짐으로써 점차 암 치료의 주류로 자리매김해 가고 있다. 이미 항체 치료제로 사용되는 단일클론 항체 중 2005년 기준 20 종류 이상의 단일클론 항체가 진단 및 치료용으로 승인 되었고, 이 중 절반 이상이 각종 암의 진단 및 치료용으로 개발되었다.

이에, 본 발명자들은 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이 유에프 (PAUF) 핵산분자는 암 발병에 대해 매우 특이적이며, 특히 췌장암에 있어 마커 또는 치료 타겟이 된다는 것을 발견하고, 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 항-피에이유에프(PAUF)항체 등을 개발하여 상기 항체가 췌장암, 위암을 비롯한 여러 암세포에서 발현하는 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하여 조기에 암 진단이 가능하며, 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 억제하여 암 세포의 성장, 침윤 및 이동을 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 피에이유에프(PAUF)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 또는 그들의 기능적인 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 암호화하는 핵산분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자를 포함하는 암 진단용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 수준, 이를 암호화 하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 수준, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제1항의 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 피에이유에프(PAUF) 단백질 수준의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는 피에이유에프(PAUF) 단백질 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 수준, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 수준, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 성장 및 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제 공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 피에이유에프(PAUF)에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 또는 이의 기능적인 단편에 관한 것이다.

피에이유에프는 암에서 과별현되고, 특히 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 과발현된다.

본 발명자들는 피에이유에프가 췌장암 초기에 과발현되는 것을 확인하였고, 정상세포주에 비하여 췌장암세포주는 물론 췌장암환자에게서도 과발현 된다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 또한 피에이유에프를 과발현하는 세포주에서는 암세포성장, 전이 및 침투가 잘 일어난다는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 피에이유에프의 존부, 수준을 측정하거나 암의 성장, 전이 및 침투를 억제하기 위해 사용하고자 피에이유에프에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하였다.

보다 구체적으로, 하나의 일 양태로 상기 인간 단일클론항체 또는 그의 기능 적인 단편은 (a) 서열번호 25로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 26으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 27로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; (b) 서열번호 31로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 32로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 33으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; (c) 서열번호 37로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 38로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 39로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (d) 서열번호 43으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 44로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 45로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

또한, 다른 양태로 상기 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편은 (a) 서열번호 28로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 29로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 30으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; (b) 서열번호 34로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 35로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 36으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; (c) 서열번호 40으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 41로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 42로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (d) 서열번호 46으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 47로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 48로 정의되는 중쇄 가 변영역 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 '피에이유에프(PAUF, Pancreatic Adenocarcinoma Upregulating Factor)'는 신규단백질로 본 발명자에 의해 명명되었다. 바람직하게는 서열번호 50으로 정의된다.

상기 피에이유에프 단백질에는 단리 단백질, 단백질의 대립유전자 변형, 및 단백질의 보존적 아미노산 치환 형태가 포함된다. 여기에 기재한 바와 같이, 부분적으로 '단백질' 또는 '폴리펩티드'는 서열번호 50에 나타낸 인간 아미노산 서열을 갖는 단백질을 가리킨다. 이 용어는 또한 자연적으로 발생하는 대립유전자 변형 및 특별하게 상기에 기재된 것과 약간 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 상기에 기재된 것과 약간 다른 아미노산 서열을 포함한다 할지라도 대립유전자는 이들 단백질과 연관된 동일한 또는 유사한 생물학적 기능을 여전히 가질 것이다.

아울러, 여기에 기재된 바와 같이, 서열번호 50의 인간 아미노산 서열과 연관된 단백질 패밀리는 인간에 더하여 유기체로부터 단리되었던 단백질을 가리킨다.

상기 피에이유에프 단백질은 바람직하게는 단리형이다. 여기에 사용한 바와 같이, 일반적으로 단백질과 연관된 세포 구성성분으로부터 단백질을 제거하기 위하여 물리적, 기계적 또는 화학적 방법들이 사용될 때, 단백질이 단리된다고 한다. 당업자는 단리 단백질을 얻기 위한 표준 정제 방법을 용이하게 사용할 수 있다.

상기 피에이유에프 단백질은 서열번호 50의 삽입, 결실 또는 보존적인 아미노산 치환 변형을 더욱 포함한다. 여기에 사용한 바와 같이, 보존적인 변형은 단백질의 생물학적 기능에 역으로 작용하지 않는, 아미노산 서열의 변경을 의미한다. 치환, 삽입인 또는 결실은 변경된 서열이 단백질과 연관된 기능을 방해하거나 붕괴할 때 단백질에 역으로 작용한다고 한다. 예를 들면, 단백질의 전체 전하, 구조 또는 소수성/친수성 성질은 생물학적 활성에 역으로 작용하지 않고 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들면 단백질의 생물학적 활성에 역으로 작용하지 않고, 펩티드가 보다 소수성이 되거나 친수성이 되도록 아미노산 서열은 변경될 수 있다.

통상적으로, 대립유전자 변형, 보존적 치환 변형, 및 일부 단백질 패밀리는 서열번호 50에 기재된 서열과 적어도 약 50%, 60%, 70% 또는 75%의, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80-90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92-94%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 서열을 정렬시키고 필요시 최대 퍼센트의 상동성을 갖기 위한 간격을 도입한 후에 서열 동일성의 일부분으로서 보존적 치환을 고려하지 않고, 서열 후보의 아미노산 서열 잔기의 퍼센트가 서열번호 50과 동일하듯이 이러한 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 여기에 정의된다. 융합 단백질, 또는 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 펩티드 서열로의 삽입은 상동성에 작용한 것으로 파악되지 않는다. 그리하여 상기 단백질은 서열번호 50에 개시된 아미노산 서열을 가진 분자; 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 개시된 코딩 서열로 또는 안에서 N- 또는 C-말단이 삽입된 아미노산 서열 변형체; 적어도 하나의 잔기가 치환된 개시된 서열의 아미노산 서열 변형체, 또는 상기에 정의된 그 단편을 포함한다. 또한 펩티드 또는 폴리펩티드로 불리우는 이러한 단편은 명백한 소수성 부위뿐만 아니라 기존의 단백질 도메인에 해당하는 아미노산 서열의 부위로 확인되는 단백질의 항원성 부위, 기능성 부위를 포함할 수 있다. 맥벡터(MacVector, Oxford Molecular)와 같은 일반적으로 사용할 수 있는 단백질 서열 분석 소프트웨어를 사용함으로써 이들 부위는 용이하게 확인할 수 있다.

예상된 변형체는 예를 들면, 상동성 재배열, 특정부위 또는 PCR 돌연변이 유발, 및 토끼, 마우스, 돼지, 소, 양, 말 및 비인간 영장류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 동물 종의 이에 상응하는 단백질, 및 대립 유전자 또는 다른 자연적으로 발생하는 단백질 패밀리의 변형체; 및 자연적으로 발생하는 아미노산 이외의 작용기(예를 들면, 효소 또는 방사성 동위원소와 같은 감지가능한 작용기)로 치환, 화학적, 효소적 또는 다른 적절한 수단에 의하여 공유적으로 변형된 유도체에 의하여 예정된 돌연변이를 포함하는 것을 더욱 포함한다.

또한, 그 피에이유에프의 단백질 및 핵산분자의 서열은 GeneBank에 등록되어있으며(Accession number EF067313), 바람직하게 피에이유에프(PAUF) 핵산분자는 서열번호 49로 정의된다.

상기 피에이유에프 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 사용되는 항체는 항원 결합을 위한 특이적 CDRs(Complementarity Determining Region)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

바람직하게, 본원 발명의 단일클론항체는 특이적 서열, 보다 바람직하게 경쇄 CDR, 중쇄 CDR 각각, 또는 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR 을 포함한다. 본원 발명의 단일클론항체는 공지된 치료용 항체의 FR(framework regions)에 CDRs을 이식함으로써 수득할 수 있음은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 피에이유에프에 대한 특이적인 항체는 다클론항체 또는 단일클론항체이며, 바람직하게는 단일클론항체이며 가장 바람직하게는 상기 기술한 인간 단일클론항체 또는 이의 기능적인 단편이다.

본 발명의 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로 단일 항원선 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 다클론항체는 일반적으로 교차반응이 있어 특이성이 낮고, 항혈청의 로트마다 항체가와 특이성이 변동하는 결점이 있기 때문에, 다클론항체를 이용한 진단약의 제조는 본질적으로 품질관리가 어렵다는 문제점이 있는 반면, 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

피에이유에프에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 다클론항체는 피에이유에프 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명에서는 공지의 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody library) 및 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여, PAUF에 특이적으로 결합하는 인간단일클론항체를 선별할 수 있다(실시예 1 참고).

생물학 관련 연구에서 파아지 디스플레이 기술의 가장 성공적인 활용 예는 항체 라이브러리로부터 다양한 유전자 재조합 항체 절편 (scFv 또는 Fab 형태)을 선별하는 것이라 할 수 있으며, 이 기술을 이용할 경우 파아지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 항원과의 친화도 선별 과정을 거쳐 생체내 (in vivo) 진단 및 치료제로 단시일 내에 활용될 수 있는 수 많은 인간 항체들을 획득할 수 있다.

일반적으로 항체 디스플레이 라이브러리는 파아지미드 벡터에 이미 마련된 gIII의 5' 단말 부위에 나이브 (naive), 면역화되거나 (immunized) 반-합성 유래에서 얻어진 항체 유전자를 클로닝 한 후 대장균에 도입함으로서 제작된다. 항체 유전자가 삽입되어 있는 파아지미드 클론들은 대장균 내에서 항체-pIII 융합 단백질을 발현하며, 유전자재조합 파아지의 형성에 필요한 자연형 (wild type, wt) pIII 등과 같은 모든 구조 단백질들은 M13K07 혹은 VCSM13과 같은 헬퍼 파아지에 의해 제공되며, 파아지 구조 (phage rescue)라고 불리는 과정을 통해 대장균 내에서 유전자 재조합 파아지가 생성되게 된다. 이러한 과정을 통해 생성된 유전자 재조합 파아지는 표면에 wt pIII와 항체-pIII 융합 단백질을 동시에 디스플레이하며, 파아지미드 DNA가 유전자 재조합 파아지 안에 우선적으로 패키징되면서 결과적으로 유전형-표현형 연관 (genotype-phenotype linkage)을 형성하게 되는 것이다. 이러한 파아지 패키징 (phage packaging) 과정은 이론적으로 유전자 재조합 파아지의 표면에 항체 절편의 단가 (oligovalent) 디스플레이를 가능케 하며, 따라서 이러한 과정의 결과로 얻어지는 파아지 디스플레이 기술의 강력한 선별 능력은 수많은 타겟 분자-비특이적인 백그라운드 클론들 중에서 오직 타겟 분자-특이적인 기능성 있는 항체 클론만을 패닝에 의해 분리해 낼 수 있게 해 준다.

본 발명의 인간 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법인 친화성크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피 등을 이용하여 정제하여 사용될 수 있다.

구체적인 일 실시예로서 본 발명자들은, 본 발명의 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해 선별한 항체의 경쇄와 중쇄를 항체 생산용 발현 벡터에 재조합 하였다. 상기 발현 벡터를 DHFR 결핍 CHO 세포주(CHO-DG44)에 형질전환하였다. 형질전환된 유전자의 증폭을 위하여 DHFR의 저해제인 메토트렉세이트(MTX ; methotrexate)를 선택배지에 첨가하고 그 농도를 단계적으로 증가시켜 항체의 발현량이 높은 세포주를 획득하고 상기 세포주를 대량으로 배양하였다 (실시예 3 참고).

상기 본 발명의 항체는 피에이유에프(PAUF)를 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')_2, 및 Fv 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 상 기 피에이유에프(PAUF)에 대한 결합 기능을 보유하기 위해서 바람직하게, (a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로부터 선택되는 서열로 정의되는 경쇄 가변영역; 및/또는 (b) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로부터 선택되는 서열로 정의되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 인간 단일클론항체의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 및 서열번호 12로부터 선택될 수 있고, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로

부터 선택될 수 있다. .

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피에이유에프(PAUF) 특이적 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산분자에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 핵산 분자는 경쇄 가변영역으로서 서열번호 1을 암호화하는 서열번호 17로 정의되는 염기서열, 서열번호 2를 암호화하는 서열번호 18의 염기서열, 서열번호 3을 암호화하는 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 4를 암호화하는 서열번호 20의 염기서열 중에서 선택되는 염기서열을 포함할 수도 있으며, 중쇄 가변영역으로서 서열번호 5를 암호화하는 서열번호 21로 정의되는 염기서열, 서열번호 6을 암호화하는 서열번호 22의 염기서열, 서열번호 7을 암호화하는 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 8을 암호화하는 서열번호 24의 염기서열 중 선택되는 염기서열을 포함할 수도 있다.

이러한 본 발명의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 항체 단편은 피에이유에프 단백질이 발현되는 다양한 암세포에서 피에이유에프(PAUF)와 특이적으로 결합하여 상기 암의 성장, 이동 및/또는 전이를 억제하여 암을 치료할 수 있게 한다. 바람직하게, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암이다.

본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 핵산분자의 신규한 용도에 관한 것으로서, 암과 관련하여 피에이유에프(PAUF)의 진단 마커 또는 치료 타깃으로서 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 신규한 용도는 피에이유에프(PAUF)가 암에서 과발현되고 이를 과발현하는 세포주에서는 암세포성장, 전이 및 침투가 잘 일어난다는 본 발명자들의 발견에 기초한 것이다.

일 양태로, 본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자를 포함하는 암 진단용 마커에 관한 것이다.

본 발명의 마커는 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에 특이적이며 특히, 췌장암에 특이적이다.

본 발명자들은 췌장암 환자에게서 피에이유에프(PAUF) 단백질이 측정되는 것을 확인하였으며, 특히 정상인의 경우 모두 음성으로 나타나 전체 진단 특이도는 100%를 보였으며 췌장암 양성 검체 13개 검체 중 8검체가 양성으로 판정되 61.5%의 민감도를 보였으며 음성으로 보인 검체의 경우도 다른 검체 대비 다소 높은 수치를 나타냄을 확인하였다(도 7). 본 실험 결과는 피에이유에프(PAUF) 단백질이 암 진단용 마커로써 유용함을 보여준다(실시예 8 참고).

다른 양태로, 본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.

상기 항체는 바람직하게는 본 발명에 따른 인간 단일클론항체 또는 이의 기능적인 단편이다.

다른 양태로, 본 발명은 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 항체 단편을이용하여 피에이유에프(PAUF) 단백질 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 항체 단편을 생물학적 시료와 접촉시켜 피에이유에프(PAUF) 단백질 수준의 증가 또는 감소를 측정하면 피에이유에프(PAUF) 단백질을 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 항체 단편은 피에이유에프 단백질이 발현되는 다양한 암세포에서 피에이유에프(PAUF)와 특이적으로 결 합하여 상기 암의 성장, 이동, 침윤 및/또는 전이를 억제하여 암을 치료할 수 있게 한다. 바람직하게, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암이다.

본 발명의 조성물 및 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있고, 그 외에도 항원-항체 결합체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 고상체, 칩, 혹은 비드에 항원 혹은 항체를 고정화 하는 방법, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다(도 7 참고). 또한, 상기 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트 키트로 제작될 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물 및 키트는 암의 발병, 발전 및 경감 등을 분석할 수 있다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어 '진단'은 질병 유무의 판단뿐만 아니라, 질병의 발병, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물 및 키트는 피에이유에프(PAUF)의 과발현에 의하여 발병 및 발전되는 암, 바람직하게는 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암, 가장 바람직하게는 췌장암을 진단하는 데 특히 유용하다.

본 발명의 진단용 조성물은 암의 상태(conditions), 특히 췌장암의 상태를 우수한 효율로 진단할 수 있도록 하며, 더욱이 초기에 암을 분별적으로 진단할 수 있는 장점이 있다.

또 다른 일 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 핵산분자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 피에이유에프(PAUF) 단백질의 수준, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 수준, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 측정값이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시험물질은 암 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계.

본 명세서에서 사용되는 용어 '예방'은 본 발명에 따른 스크리닝 방법으로 수득한 물질 또는 본 발명에 따른 피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질, 예를 들어, 피에이유에프(PAUF)와 특이적으로 결합하는 단백질, 압타머, 펩타이드, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '치료'는 본 발명에 따른 스크리닝 방법으로 수득한 물질 또는 상기의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 피에이유에프 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '시험물질'은 피에이유에프 단백질의 수준, 피에이유에프 핵산분자의 수준 또는 피에이유에프 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interferenceRNA), 펩티드, 단백질, 앱타머 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 피에이유에프 단백질의 수준, 피에이유에프 핵산분자의 수준 또는 피에이유에프 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 피에이유에프 단백질의 수준, 피에이유에프 핵산분자의 수준 또는 피에이유에프 단백질의 활성이 감소-조절(downregulation)되면, 상기 시험물질은 암 치료 또는 예방용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명에서 '핵산분자 또는 단백질 수준 측정'이란, 생물학적 시료에서 발현된 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산분자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 말한다.

피에이유에프 핵산분자의 수준 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법 을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RTPCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual,3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 피에이유에프 핵산분자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 피에이유에프 핵산분자의 수준 변화를 측정한다.

피에이유에프 단백질의 수준의 변화 측정은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 피에이유에프 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton,Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology,Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

또한, 피이에프유 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질, 압타머, 펩타이드 등으로도 단백질의 수준을 확인할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것이다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 피에이유에 프(PAUF) 핵산분자에서 단백질로의 유의한 수준의 증가 여부를 판단하여, 암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란, 피에이유에프(PAUF)와 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로, 본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 성장 및 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물에는 피에이유에프(PAUF)와 특이적으로 결합하는 단백질, 압타 머, 펩타이드, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자에 따라 결정된다.

또 다른 구체적인 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 상기한 항체와 결합될 수 있는 치료제로서, 방사성 핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등을 포함한다. 상기한 약제 및 독소에는, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 암의 성장 및 전이 억제용 조성물 또는 암의 치료 또는 예방 용 조성물은 상기 피에이유에프(PAUF) 특이적인 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편을 이용하여 다양한 암세포에서 피에이유에프(PAUF)의 기능을 저해하여 암의 성장 및 전이를 억제하고 암을 치료하고자 하는 것이다. 상기 암의 치료 또는 예방은 바람직하게는 암의 증식, 이동 또는 침윤을 억제함으로써 수행된다. 상기 암은 바람직하게는 췌장암, 위암, 난소암 또는 대장암이다.

구체적으로 본 발명의 치료방법은 상기 약제학적 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥주사, 피하 주사, 피내 주사제, 근육 주사 및 점적 주사이다.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명의 인간 단일클론항체가 암 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 췌장암 세포주인 Panc-1 세포주에 상기 단일클론항체를 처리한 후 세포증식을 조사하였다. 그 결과 세포 증식이 상기 항체를 처리한 경우 대조군 항체를 처리한 세포주와 비교하여 감소됨을 확인하였다 (도 3 참조). 즉, 상기 항체에 의해 암세포의 성장 및/또는 생존의 억제가 유도됨이 관찰되었다. 이후, 상기 단일클론항체가 암세포의 이동능에 미치는 영향을 조사하기 위해 췌장암 세포주인 CFPAC-1 세포주와 Panc-1 세포주에 상기 단일클론항체를 처리한 후 이동능 어세이를 수행하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 상기 항체의 처리시 암세포 이동 능력이 감소함을 확인하였다 (도 4 참조). 유사한 방법으로 암세포의 침투능 어세이의 수행시에도 대조군과 비교하여 상기 항체에 의한 암세포 침투 능력의 감소를 관찰하였다 (도 5 참조). 이를 통해 피에이유에프(PAUF) 특이적 항체가 암세포의 성장, 이동, 침투 및/또는 전이를 저해할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 상기 단일클론항체의 생체내 암치료 효과를 조사하기 위해 췌장암 세포주인 CFPAC-1 세포주를 면역결핍생쥐에 이종이식하였다. 상기 항체를 꼬리정맥으로 주사하여 대조군 항체와 비교하여 종양 크기의 감소를 확인하였다 (도 6 참조). 즉, 상기 항체에 의해 생체내에서 종양의 진행이 저하됨이 관찰되었다.

이하, 하기 테이블은 서열목록으로서, 본 발명 4종의 항-PAUF 항체의 경쇄 가변영역, 중쇄 가변영역에 해당하는 아미노산 서열 및 염기서열, 및 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 해당하는 아미노산 서열 리스트를 나타낸다.

8F3 경쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLDWYQQKPGKAPRLLIYSTSTLQRGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFAFGPGTKVDIKR
3A4 경쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호2	DIQMTQSPSSLAVSLGERATIDCRSSQSLLHSSNNKNYLAWFQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCHQYYSTPLTFGGGTKVDIKR
36C9 경쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호3	QLVLTQPPSASGPPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVNWYQHLPGTAPKLLIHTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLQSEDEGDYYCAAWDDSLNGHFVFGTGTKVTV
6C4 경쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호4	DIVMTQSPLSLSASVGDRLTITCRASQSILTYLNWYQQKPGKAPKLLVYAASSLQPGVPSRFSGRGSGTDFTLTISGLQPDDFALYYCQQSYSSPYSFGPGTKVDIKR
8F3 중쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호5	MAQVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSHYMNWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIPRTVSPRTRAMDVWGQGTSVTVSS
3A4 중쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호6	MAQVQLVQSGGGLVQPGGSLRVSCAASGFPFTTYAMTWVRQAPGRGLEWVAVISGSGRTTHYADSVKGRFTISRDASKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSHPRQLAVAGPFQHWGQGTLITVSS
36C9 중쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호7	MAQVQLVESGGGVVLPGGSLRLSCAASGFPFGSYAVSWVRQAPGKGLEWVSAISPRNRYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLEMNSLGAEDTAVYYCAKDRLLRGAIVSALGHWGQGTLVTVSS
6C4 중쇄 가변영역 아미노산 서열	서열번호8	MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDRYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKHDGSEKDYVDSVKGRFIISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRRSYGRSTYYLDSWGQGTQITVSS
8F3 경쇄 아미노산 서열	서열번호9	MGWSYIILFLVATATDVHSSGVGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLDWYQQKPGKAPRLLIYSTSTLQRGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFAFGPGTKVDIKRGGASLVERSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3A4 경쇄 아미노산 서열	서열번호 10	MGWSYIILFLVATATDVHSSGVGSDIQMTQSPSSLAVSLGERATIDCRSSQSLLHSSNNKNYLAWFQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCHQYYSTPLTFGGGTKVDIKRGGASLVERSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
36C9 경쇄 아미노산 서열	서열번호 11	MGWSYIILFLVATATDVHSSGVGSQLVLTQPPSASGPPGQRVTISCSGSRSNIGSNTVNWYQHLPGTAPKLLIHTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAVSGLQSEDEGDYYCAAWDDSLNGHFVFGTGTKVTVXRWRTKVEIKRGGASLVERSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6C4 경쇄 아미노산 서열	서열번호 12	MGWSYIILFLVATATDVHSSGVGSDIVMTQSPLSLSASVGDRLTITCRASQSILTYLNWYQQKPGKAPKLLVYAASSLQPGVPSRFSGRGSGTDFTLTISGLQPDDFALYYCQQSYSSPYSFGPGTKVDIKRGGASLVERSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
8F3 중쇄 아미노산 서열	서열번호 13	MGWSYIILFLVATATDVHSAQPAMAQVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSHYMNWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDIPRTVSPRTRAMDVWGQGTSVTVSSGLGGLASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3A4 중쇄 아미노산 서열	서열번호 14	MGWSYIILFLVATATDVHSAQPAMAQVQLVQSGGGLVQPGGSLRVSCAASGFPFTTYAMTWVRQAPGRGLEWVAVISGSGRTTHYADSVKGRFTISRDASKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSHPRQLAVAGPFQHWGQGTLITVSSGLGGLASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
36C9 중쇄 아미노산 서열	서열번호 15	MGWSYIILFLVATATDVHSAQPAMAQVQLVESGGGVVLPGGSLRLSCAASGFPFGSYAVSWVRQAPGKGLEWVSAISPRNRYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLEMNSLGAEDTAVYYCAKDRLLRGAIVSALGHWGQGTLVTVSSGLGGLASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6C4 중쇄 아미노산 서열	서열번호 16	MGWSYIILFLVATATDVHSAQPAMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDRYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKHDGSEKDYVDSVKGRFIISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRRSYGRSTYYLDSWGQGTQITVSSGLGGLASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

8F3 경쇄 가변영역 염기서열	서열번호 17	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGGTATTTAGATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAGACTCCTGATCTATTCTACTTCCACTTTGCAAAGAGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCGCATTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGT
3A4 경쇄 가변영역 염기서열	서열번호 18	GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCGACTGCAGGTCCAGCCAGAGTCTTTTACACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTTCCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTGGCAGTCTATTACTGTCACCAATATTATAGTACTCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGATATCAAACGT
36C9 경쇄 가변영역 염기서열	서열번호 19	CAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGCCCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGCAGGTCCAACATCGGAAGTAATACTGTTAACTGGTATCAGCACCTCCCAGGAACGGCCCCCAAGCTCCTCATCCATACTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCGTCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGGTGATTATTATTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGCCATTTTGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTC
6C4 경쇄 가변영역 염기서열	서열번호 20	GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGCGACAGACTCACTATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCTTACCTATTTAAATTGGTATCAACAAAAACCAGGGAAAGCCCCGAAGCTCCTAGTCTATGCTGCATCCAGTTTGCAACCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCCGCGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGACGATTTTGCACTTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTAGTCCGTACTCTTTCGGGCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGT
8F3 중쇄 가변영역 염기서열	서열번호 21	ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCAGTAGTCATTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAATTATTTATAGCGGTGGTAGTACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAGTCCAAGAACACTCTGTATCTTCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATATCCCTCGTACGGTGTCCCCACGTACCAGAGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTTCGGTCACCGTCTCCTCA
3A4 중쇄 가변영역 염기서열	서열번호 22	ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCGTTTACCACTTATGCCATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGACTGGAGTGGGTCGCAGTTATAAGTGGTAGTGGAAGAACCACACACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGCTTCCAAGAACACACTGTATCTTCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAACAAGCCACCCCCGACAACTAGCAGTGGCTGGCCCCTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTCTCCTCA
36C9 중쇄 가변영역 염기서열	서열번호 23	ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCTGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGCTTCCCCTTTGGCAGCTATGCCGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTCCTAGGAATCGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTTTATCTGGAAATGAACAGTCTGGGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGATCGCCTACTTAGGGGGGCGATAGTGAGTGCCCTTGGGCACTGGGGCCAGGGAACTCTGGTCACCGTCTCCTCA
6C4 중쇄 가변영역 염기서열	서열번호 24	ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTCCAACCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTACTTTTGATAGATATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCATGATGGAAGTGAGAAAGACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGCGCTCATATGGTCGGAGTACTTACTATTTGGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCAGATCACCGTCTCCTCA

8F3 경쇄 가변영역 CDR1	서열번호 25	RASQSISRYLD
8F3 경쇄 가변영역 CDR2	서열번호 26	STSTLQR
8F3 경쇄 가변영역 CDR3	서열번호 27	QQSYSTPFAF
8F3 중쇄 가변영역 CDR1	서열번호 28	SHYMN
8F3 중쇄 가변영역 CDR2	서열번호 29	IIYSGGSTYYADSVKG
8F3 중쇄 가변영역 CDR3	서열번호 30	DIPRTVSPRTRAMDV
3A4 경쇄 가변영역 CDR1	서열번호 31	RSSQSLLHSSNNKNYLA
3A4 경쇄 가변영역 CDR2	서열번호 32	WASTRESG
3A4 경쇄 가변영역 CDR3	서열번호 33	HQYYSTPLTFG
3A4 중쇄 가변영역 CDR1	서열번호 34	TYAMT
3A4 중쇄 가변영역 CDR2	서열번호 35	VISGSGRTTHYADSVKG
3A4 중쇄 가변영역 CDR3	서열번호 36	TSHPRQLAVAGPFQH
36C9 경쇄 가변영역 CDR1	서열번호 37	SGSRSNIGSNTVN
36C9 경쇄 가변영역 CDR2	서열번호 38	TNNQRPS
36C9 경쇄 가변영역 CDR3	서열번호 39	AAWDDSLNGHFVF
36C9 중쇄 가변영역 CDR1	서열번호 40	SYAVS
36C9 중쇄 가변영역 CDR2	서열번호 41	AISPRNRYIYYADSVKG
36C9 중쇄 가변영역 CDR3	서열번호 42	DRLLRGAIVSALGH
6C4 경쇄 가변영역 CDR1	서열번호 43	RASQSILTYLN
6C4 경쇄 가변영역 CDR2	서열번호 44	AASSLQPG
6C4 경쇄 가변영역 CDR3	서열번호 45	QQSYSSPYSFG
6C4 중쇄 가변영역 CDR1	서열번호 46	DRYWMT
6C4 중쇄 가변영역 CDR2	서열번호 47	NIKHDGSEKDYVDSVKG
6C4 중쇄 가변영역 CDR3	서열번호 48	RRSYGRSTYYLDS

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이유에프 (PAUF) 핵산분자는 암 발병에 대해 매우 특이적이며, 특히 췌장암에 있어 마커 또는 치료 타겟이 된다. 또한, 피에이유에프(PAUF) 단백 질에 특이적으로 결합하는 항-피에이유에프(PAUF)항체 또는 그의 기능적인 단편은 췌장암, 위암을 비롯한 여러 암세포에서 발현하는 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하여 조기에 암 진단이 가능하며, 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 억제하여 암 세포의 성장, 침윤 또는 이동을 억제하고 또한 암세포의 사멸을 유도함으로써 암 치료 및 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

< 실시예 1> 피에이유에프 ( PAUF ) 특이적 단일클론 항체의 스크리닝

피에이유에프(PAUF) 단백질을 플라스틱 튜브에 고정화 한 후 완충액 (2% 탈지우유, PBS)을 이용하여 2시간 동안 완충시킨다. 완충액 제거 후 완충액과 혼합한 인간 항체 디스플레이 파지 라이브러리를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 세척액 (0.1% Tween 20, PBS)로 10회 세척하고, PBS로 10회 더 세척한다. 세척 후 100mM TEA (Triethylamine)를 넣고 상온에서 10분간 반응시켜 파지를 용출시킨다. 용출된 파지에 1M Tris (pH 7.5)를 넣고 상온에서 5분간 반응시켜 중화한다. 용출된 파지의 용액에 E.Coli 배양액을 가하여 감염시킨다. 감염된 E.Coli를 5분간 3,000 xg에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고 2xYT 플레이트에 접종하여 16시간동안 37℃에서 배양한다. 적당량의 2xYT 배지를 가하여 E.Coli 콜로니를 현탁시켜 형성된 콜로니를 회수한다. 회수한 E.Coli를 2xYT 배지에 접종하고 보조파지를 넣어주어 1차 스크리닝 된 파지 라이브러리를 제조한다. 스크리닝 된 파지 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 4회 더 반복한다. 5차 스크리닝 후 클론을 2xYT 플레이 트로부터 임의로 선택하여 2xYT 배지에 배양한다. 배양한 클론에 보조파지를 넣어주어 파지를 형성시킨다. 형성된 파지를 PAUF ELISA법 (실시예 3 참조)을 이용해 피에이유에프(PAUF)에 대한 특이성을 확인한다. 특이성을 보이는 파지를 선별하여 DNA 서열을 분석한다. 이러한 방법을 통하여 서열목록 1~8의 항체 4종 (8F3, 3A4, 36C9, 6C4)을 포함하는 피에이유에프(PAUF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체들을 발굴하였다.

< 실시예 2> 피에이유에프 ( PAUF )에 대한 특이적 인간 단일클론항체의 정제

피에이유에프(PAUF)에 대한 특이적 인간 단일클론항체를 대량 발현할 수 있는 CHO-DG44 세포주를 확립하기 위하여 실시예 1의 방법을 이용하여 발굴한 10종의 단일클론항체의 경쇄부분을 pIgGLD의 BstXI 부위내로, 중쇄 부분을 pIgGHD의 SfiI 부위내로 삽입시켜 IgG형태로 변환하였다. pIgGLD와 pIgGLD는 각기 IgG의 경쇄와 중쇄의 불변부(constant region)에 해당하는 핵산분자를 가지고 있는 항체 생산용 발현 벡터이다. 각 단일클론항체의 IgG 형태의 발현 플라스미드는 리포펙타민 플러스(lipofectamin plus) 약제 (Invitrogen, CA)을 사용하여 제품 설명서에 따라서 DHFR-결핍 CHO 돌연변이체 세포주인 CHO-DG44 내로 안정하게 트랜스펙션되었다. 안정하게 트랜스펙션된 세포는 2주간 G418 G418 550ug/ml(Invitogen, CA) 내에서 선택하였다. 안정한 트랜스펙턴트를 MTX(Sigma, MO) 10nM 농도에서부터 2주씩 단계적으로 농도를 올려서 더욱 적응시켰다. 적응시킨 세포주의 배지 내로 분비된 단일클론항체를 ELISA법을 실시함으로써 발현량을 계산하여 고발현 세포주를 선별하여 단 일클론항체의 대량 정제에 적용하였다.

선별된 세포주를 조직 배양 플라스크에서 SF CHO 배양액(JBI, KR)에 성장시키면서 항체를 발현하도록 하였다. 본 발명의 항체를 순수 정제하기 위해 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 도5에 나타난 4종의 항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4는 모두 하기 조건하에서 정제되었다. CHO 배양액으로 발현, 분비된 인간 단일클론항체는 가장 먼저 항체의 Fc부분을 인지하여 결합할 수 있는 단백질 A 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하도록 하였다. 발현된 항체가 포함된 배양액을 0.45㎛ 멤브레인을 가진 여과기에 1회 통과시킨 후 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH7.0)으로 세척하여 평형화시킨 단백질 A컬럼에 적하한다. 결합되지 않은 단백질들을 씻어내기 위해 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액 (pH7.0)을 단백질 A컬럼에 적하하였다. 그 이후 단일클론항체는 100mM 구연산 나트륨(sodium citrate) 완충액 (pH3)으로 용리시키고, 용리 분취물의 pH는 1M Tris 완충액(pH9.0)으로 7~7.5로 조정한다. 용리 분획되어진 단일클론항체는 합쳐서 단백질 풀을 만들고, 양이온교환 크로마토그래피에 적용시키기 위해 3K MWCO규격의 멤브레인을 가진 스핀컬럼을 사용하여 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH7.0)으로 완충액 교환 및 농축을 하였다. 이 시료는 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액(pH7.0)으로 예비 평형시킨 양이온 교환 크로마토그래피에 적하시키고, 결합되지 않은 물질을 상기 완충액으로 씻어낸 후 20mM 인산 나트륨(sodium phosphate), 1M NaCl (pH7.0) 용액을 적하시켜 목표로 하는 항체를 용출시켰다. 이로써 단일클론항체는 내부에 엔도톡신이 최소화된 상태로 정제되었다. 도 1은 상기 방법으로 정제된 단일클론 항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4의 아크릴아마이드 젤 사진을 나타낸다.

< 실시예 3> 피에이유에프 ( PAUF ) 특이 인간항체의 항원 결합능 측정 ( PAUF ELISA )

피에이유에프(PAUF) 단백질을 플레이트에 고정화한 후 완충액 (2% 탈지우유, PBS)를 이용하여 2시간 동안 완충시킨다. 완충액 제거 후 완충액과 혼합한 인간 항체 디스플레이 파지의 용출액 혹은 정제된 인간 항체를 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 항원과 결합하지 않은 항체를 세척액 (0.1% Tween 20, PBS)으로 5회 세척하여 제거한다. 2차 항체로 파지 용출액의 항원 결합능을 측정하는 경우에는 항 M13-HRP를 인간 항체의 항원 결합능을 측정하는 경우에는 항 인간 IgG (Fc specific)-HRP를 사용한다. 적절한 2차 항체를 완충액을 사용하여 1:5000 농도로 희석하여 상기 플레이트에 넣어준 후 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 세척액 (0.1% Tween 20, PBS)으로 5회 세척 후 TMB와 H₂O₂로 발색하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 피에이유에프(PAUF)에 특이적인 항체를 선별하거나 정제된 항체의 농도별 결합능을 확인한다. 도 2는 정제된 항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4의 농도별 결합능을 측정한 결과이다.

< 실시예 4> 성장 어세이 ( proliferation assay )

췌장암세포를 1ml의 배지 내에 5 x 10⁴ cells 씩 계수하여 24 웰 플레이트에서 배양하고, 상기 단일클론 항체를 3ug/ml 농도로 첨가한 후, 세포를 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하며 2일에 한번씩 항체가 첨가된 배지를 교환해 주었다. 6일 후 세포를 회수하여 0.2% 트리판 블루 (Tryphan Blue) 용액에 염색 후 살아있는 세포의 수를 대조군과 비교하였다. 이 어세이를 통하여 선별된 4종의 단일클론항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4가 췌장암세포주의 성장속도를 저해할 수 있음을 확인하였다 (도 3 참조).

< 실시예 5> 이동 어세이 ( migration assay )

췌장암세포를 분리하여 PBS로 두번 씻어 준 후, 상기 항체들을 농도 별로 섞어서 최종 세포수가 1 x 10⁶ cells/ml이 되도록 맞춰 준다. Neuroprobe 사의 Neuro Probe 48 well 마이크로 챔버(micro chamber)의 하층 챔버에 10% FBS를 넣은 DMEM 배지를 30ul 씩 넣고, 그 위에 8um pore의 중탄산 필터(polycarbonate filter) (25x80mm, Neuroprobe사)를 올려놓는다. 그 위에 상층 챔버를 올린 후 고정 시킨다. 고정된 상층 챔버에 상기 췌장암과 항체의 혼합액을 웰 당 50ul 씩 넣어준 후 37℃ CO₂ 배양기에서 20시간동안 배양한다. 배양이 끝난 후 하층 챔버로 이동한 세포를 100% 메탄올로 고정, 김자 염색액으로 염색하였다. 염색된 세포의 사진을 최소 3개의 선택 면적에서 계수 후 대조군과 비교하였다. 이 어세이를 통하여 선별된 4종의 단일클론항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4가 췌장암세포주의 이동능력을 저해할 수 있음을 확인하였다 (도 4 참조).

< 실시예 6> 침윤 어세이 ( invasion assay )

췌장암세포를 분리하여 PBS로 두 번 씻어 준 후, 상기 항체들을 농도 별로 섞어서 최종 세포수가 1 x 10⁶ cells/ml이 되도록 맞춰 준다. Neuroprobe 사의 Neuro Probe 48 well 마이크로 챔버(micro chamber)의 하층 챔버에 10% FBS를 넣은 DMEM 배지를 30ul 씩 넣고, 그 위에 마트리젤(matrigel)로 코팅한 8um 포어(pore)의 중탄산 필터(polycarbonate filter) (25x80mm, Neuroprobe사)를 올려놓는다. 그 위에 상층 챔버를 올린 후 고정 시킨다. 고정된 상층 챔버에 상기 췌장암과 항체의 혼합액을 웰 당 50ul 씩 넣어준후 37℃ CO₂ 배양기에서 20시간 동안 배양한다. 배양이 끝난 후 하층 챔버로 이동한 세포를 100% 메탄올로 고정, 김자 염색액으로 염색하였다. 염색된 세포의 사진을 최소 3개의 선택 면적에서 계수 후 대조군과 비교하였다. 이 어세이를 통하여 선별된 4종의 단일클론항체 8F3, 3A4, 36C9 및 6C4가 췌장암세포주의 침윤능력을 저해할 수 있음을 확인하였다 (도 5 참조).

< 실시예 7> 생쥐 모델에서 피에이유에프 ( PAUF ) 특이 항체의 암 세포 성장 억제 실험

6~7주령 누드 마우스 Balb/c nu/nu의 피하에 5 x 10⁶ 개의 CFPAC-1 세포를 이식하였다. 이식 10일째부터 상기 단일클론 항체를 매주 2회씩 3주간 5mg/kg의 농도로 꼬리 정맥으로 주사하였다. Caliper를 이용하여 종양 부피(tumor volume)를 매주 2회씩 측정하였다. 실험최종일에 누드 마우스를 CO₂를 이용하여 희생시킨 후 종양을 분리하였으며, 무게를 측정하였다. 분리된 종양을 고정하고 파라핀 블록을 제조하여 토끼에서 제조된 피에이유에프(PAUF)에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 피에이유에프(PAUF) 단백질에 대한 조직면역염색을 수행하였다. 그 결과 피에이유에프(PAUF) 특이적인 단일클론 항체를 주사한 생쥐의 종양에서는 대조 항체를 주사한 생쥐와 비교하여 피에이유에프(PAUF)의 양이 적음을 확인하였다. 이 어세이를 통하여 선별된 2종의 단일클론항체 8F3과 36C9가 생쥐 모델에서 이식된 췌장암 세포주, CFPAC-1의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 6 참조).

< 실시예 8> 항 피에이유에프 항체를 이용한 혈액 내 피에이유에프 측정 및 췌장암 진단 실험

본 발명에 따른 혈액에서 피에이유에프 검출을 통한 췌장암 진단 가능성 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 1-10ug/ml의 농도의 항 피에이유에프 항체인 8F3을 PBS (pH 7.2)에 희석하여 100ul씩 96 웰 플레이트에 분주한 후 웰에 분주된 항체가 플레이트에 잘 고정되도록 밀봉하여 4℃에서 18시간 반응하였다. 웰 플레이트에 부착되지 않고 남아있는 용액을 제거한 후, 1% 소혈청 알부민을 함유한 인산염 완충용액을 웰 당 300ul씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응하였다. 웰에 남은 용액을 제거하고 건조시킨 후 제습제와 함께 밀봉용기에 넣어 4℃ 저온 냉장고에 보관하였다. 코팅된 플레이트의 각 웰에 췌장암 환자 혈청, 정상인, 췌장염 및 타질환 환자의 혈청을 3% 소혈청 알부민을 함유한 인산염 완충용액에 1/2로 희석하여 용액 100ul씩을 각 웰에 분주하여 37℃에서 90분간 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 0.05% Tween 20을 함유한 인산염 완충용액 300ul씩을 각 웰에 분주하여 5회에 걸쳐 세척을 한 후 항 피에이유에프 폴리클로날 항체를 각 웰당 8ug/ml농도로 5% 말혈청과 100mM농도의NaCl을 함유한 인산염 완충용액을 각 웰 당 100ul씩 분주하여 37℃에서 90분 반응하였다. 반응이 끝난 후 남아 있는 용액을 버리고 5% Tween20을 함유한 인산염 완충용액을 사용하여 웰 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하고 하였다. 특이적인 반응을 확인하기 위하여 2차 항체로 고추냉이효소(HRP)가 붙어있는 항 토끼 항체를 1% 소혈청이 포함된 인산염 완충용액에 1/2000으로 희석하여 각 웰 당 100ul씩을 분주한 후 37℃에서 30분 간 반응하였다. 반응이 끝난 후 0.05% Tween20을 함유한 인산염 완충용액을 사용하여 웰 플레이트를 5회에 걸쳐 세척하고, 테트라메틸 벤지딘(tetrametyl benzidine) 100ug/ml, 과산화수소(hydrogen peroxide)0.006% en peroxide)0.006% 및 구연산 인산염 완충용액(pH4.5)을 포함하는 기질 용액을 100씩 첨가하여 30분간 암소에서 발색시켰다. 반응정지액(1N 황산용액) 50ul를 각 웰에 첨가하여 발색반응을 종료 시킨 후, 96 웰 플레이트 판독기(Molecular Devices)로 650nm를 보조(reference)파장으로 하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 기질용액 내 발색제인 테트라메틸 벤지딘은 항체에 결합된 고추냉이효소 접합체에 의해 분해되어 발색반응을 유발하므로 그 발색 정도를 흡광도로 측정함으로써 췌장암환자 혈액에서 피이에이유프의 존재 유무를 검출하였다. 상기 실험에서 사용된 검체들은 하기와 같다.

(1) 정상인 혈청 26개 검체

(2) 췌장암 양성 혈청 13개 검체

(3) 타 암 및 타질환 환자 혈청: 위암 15개, 직장암1개, 유방암 1개, 간암 3개, 간염 5개 검체

실험결과 정상인 및 타질환 환자 총 51검체가 모두 음성으로 판정되 전체 진단 특이도는 100%를 보였으며 췌장암 양성 검체 13개 검체 중 8검체가 양성으로 판정되 61.5%의 민감도를 보였으며 음성으로 보인 검체의 경우도 다른 검체 대비 다소 높은 수치를 나타내었다(도 7). 본 실험 결과는 분석법의 개선에 따라서 보다 높은 민감도 확보가 가능함을 보여 주며, 혈액에서 췌장암 진단이 가능함을 보여 준다.

본 발명에 따른 피에이유에프(PAUF) 단백질 및 이를 암호화하는 피에이유에프 (PAUF) 핵산분자는 암 발병에 대해 매우 특이적이며, 특히 췌장암에 있어 마커 또는 치료 타겟의 용도를 제공한다. 또한, 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하는 항-피에이유에프(PAUF)항체 또는 그의 기능적인 단편은 췌장암, 위암을 비롯한 여러 암세포에서 발현하는 피에이유에프(PAUF) 단백질에 특이적으로 결합하여 조기에 암 진단이 가능하며, 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 억제하여 암 세포의 성장, 침윤 또는 이동을 억제하고 또한 암세포의 사멸을 유도함으로써 암 치료 및 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 정제된 8F3, 3A4, 36C9, 6C4 항체의 아크릴아마이드 젤 사진을 나타낸다.

도 2a-2d는 8F3, 3A4, 36C9, 6C4 항체의 피에이유에프(PAUF) 단백질에 대한 결합에 대한 결합 적정 곡선을 나타낸다.

도 3은 8F3, 3A4, 36C9, 6C4 항체에 의한 췌장암 세포주 (Panc-1)의 성장억제를 보여준다.

도 4a-4d는 8F3, 3A4, 36C9, 6C4 항체에 의한 2종 췌장암 세포주 (Panc-1, CFPAC-1)의 이동능 억제를 보여준다.

도 5a-5d는 8F3, 3A4, 36C9, 6C4 항체에 의한 2종 췌장암 세포주 (Panc-1, CFPAC-1)의 침투능 억제를 보여준다.

도 6a-6b은 8F3, 36C9 항체에 의한 생쥐에서의 CFPAC-1 췌장암 이종이식의 성장에 대한 치료 효과를 보여준다.

도 7은 피에이유에프에 대한 인간화 항체인 8F3과 폴리클론 항체를 이용하여 혈액에서 피에이유에프 측정이 가능함과 췌장암 환자 혈액에서 특이적으로 피에이유에프가 측정됨을 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> PAUF-SPECIFIC HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING THE SAME AND METHOD FOR DETECTING CANCER USING THE SAME <130> PA090369KR <150> KR10-2008-0093106 <151> 2008-09-23 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of L chain variable region of BF3 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Ala Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Tyr Asn Ser Thr 325 330 335 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 340 345 350 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 355 360 365 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 370 375 380 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 385 390 395 400 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 405 410 415 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 420 425 430 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 435 440 445 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 450 455 460 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 465 470 475 480 Ser Pro Gly Lys <210> 15 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of H chain of 36C9 <400> 15 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Val Val Leu Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 35 40 45 Ala Ser Gly Phe Pro Phe Gly Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln 50 55 60 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Pro Arg Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Gly 100 105 110 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Leu Leu Arg 115 120 125 Gly Ala Ile Val Ser Ala Leu Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 130 135 140 Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 145 150 155 160 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 165 170 175 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 180 185 190 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 195 200 205 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 210 215 220 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 225 230 235 240 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 245 250 255 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 275 280 285 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 290 295 300 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 305 310 315 320 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 325 330 335 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 340 345 350 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 355 360 365 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 370 375 380 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 385 390 395 400 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 405 410 415 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 420 425 430 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 435 440 445 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 450 455 460 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 465 470 475 480 Pro Gly Lys <210> 16 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of H chain of 6C4 <400> 16 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 35 40 45 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Tyr Trp Met Thr Trp Val Arg Gln 50 55 60 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys His Asp Gly 65 70 75 80 Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser 85 90 95 Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 100 105 110 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly 115 120 125 Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Ile Thr 130 135 140 Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 145 150 155 160 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 180 185 190 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 195 200 205 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 210 215 220 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 225 230 235 240 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 245 250 255 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 260 265 270 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 275 280 285 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 290 295 300 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 305 310 315 320 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 325 330 335 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 340 345 350 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 355 360 365 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 370 375 380 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 385 390 395 400 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 405 410 415 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 420 425 430 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 435 440 445 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 450 455 460 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 465 470 475 480 Gly Lys <210> 17 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of L chain variable region of 8F3 <400> 17 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aggtatttag attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctagactcct gatctattct acttccactt tgcaaagagg ggtcccatca 180 agattcagtg gcggtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccattcgc attcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324 <210> 18 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of L chain variable region of 3A4 <400> 18 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcgactgca ggtccagcca gagtctttta cacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggttccagc agaaaccagg acagcctcct aaactgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcagcctga ggatgtggca gtctattact gtcaccaata ttatagtact 300 cccctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gatatcaaac gt 342 <210> 19 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of L chain variable region of 36C9 <400> 19 cagctcgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggcccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgttctg gaagcaggtc caacatcgga agtaatactg ttaactggta tcagcacctc 120 ccaggaacgg cccccaagct cctcatccat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccgtcag tgggctccag 240 tctgaggatg agggtgatta ttattgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggccatttt 300 gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc 330 <210> 20 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of L chain variable region of 6C4 <400> 20 gatattgtga tgacccagtc tccactctcc ctgtctgcat ctgtaggcga cagactcact 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattctt acctatttaa attggtatca acaaaaacca 120 gggaaagccc cgaagctcct agtctatgct gcatccagtt tgcaacctgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gccgcggctc tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg tctgcaacct 240 gacgattttg cactttacta ctgtcaacag agttacagta gtccgtactc tttcgggcct 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324 <210> 21 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of H chain variable region of 8F3 <400> 21 atggcccagg tgcagctggt acagtctgga ggaggcttga tccagcctgg ggggtccctg 60 agactctcct gtgcagcctc tgggttcacc gtcagtagtc attacatgaa ctgggtccgc 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcaattattt atagcggtgg tagtacatat 180 tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaagtccaa gaacactctg 240 tatcttcaaa tgaacagtct gagagccgag gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300 atccctcgta cggtgtcccc acgtaccaga gctatggacg tctggggcca agggacttcg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 22 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of H chain variable region of 3A4 <400> 22 atggcccagg tgcagctggt acagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60 agagtctcct gtgcagcctc tggattcccg tttaccactt atgccatgac ttgggtccgc 120 caggctccag ggaggggact ggagtgggtc gcagttataa gtggtagtgg aagaaccaca 180 cactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacgcttc caagaacaca 240 ctgtatcttc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaaa 300 acaagccacc cccgacaact agcagtggct ggccccttcc agcactgggg ccagggcacc 360 ctgatcaccg tctcctca 378 <210> 23 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of H chain variable region of 36C9 <400> 23 atggcccagg tgcagctggt agagtctggg ggaggcgtgg tcctgcctgg ggggtccctg 60 agactctcct gtgcagcctc tggcttcccc tttggcagct atgccgtgag ctgggtccgc 120 caggctccgg ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtcctaggaa tcgttacata 180 tactacgcag actcagtgaa gggccgcttc accatctcca gagacaacgc caagaactca 240 ctttatctgg aaatgaacag tctgggagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaaa 300 gatcgcctac ttaggggggc gatagtgagt gcccttgggc actggggcca gggaactctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 24 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequences of H chain variable region of 6C4 <400> 24 atggcccagg tgcagctggt ggagtcgggg ggaggcttgg tccaaccggg ggggtccctg 60 agactctcct gtgcagcctc tggatttact tttgatagat attggatgac ctgggtccgc 120 caggctccgg ggaaggggct ggagtgggtg gccaacataa agcatgatgg aagtgagaaa 180 gactatgtgg actctgtgaa gggccgattc atcatctcca gagacaacgc caagaagtcg 240 ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300 cggcgctcat atggtcggag tacttactat ttggactcct ggggccaggg aacccagatc 360 accgtctcct ca 372 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR1 of BF3 <400> 25 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR2 of BF3 <400> 26 Ser Thr Ser Thr Leu Gln Arg 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR3 of BF3 <400> 27 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Ala Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR1 of BF3 <400> 28 Ser His Tyr Met Asn 1 5 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR2 of BF3 <400> 29 Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR3 of BF3 <400> 30 Asp Ile Pro Arg Thr Val Ser Pro Arg Thr Arg Ala Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR1 of 3A4 <400> 31 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR2 of 3A4 <400> 32 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 1 5 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR3 of 3A4 <400> 33 His Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR1 of 3A4 <400> 34 Thr Tyr Ala Met Thr 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR2 of 3A4 <400> 35 Val Ile Ser Gly Ser Gly Arg Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR3 of 3A4 <400> 36 Thr Ser His Pro Arg Gln Leu Ala Val Ala Gly Pro Phe Gln His 1 5 10 15 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR1 of 36C9 <400> 37 Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR2 of 36C9 <400> 38 Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR3 of 36C9 <400> 39 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly His Phe Val Phe 1 5 10 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR1 of 36C9 <400> 40 Ser Tyr Ala Val Ser 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR2 of 36C9 <400> 41 Ala Ile Ser Pro Arg Asn Arg Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR3 of 36C9 <400> 42 Asp Arg Leu Leu Arg Gly Ala Ile Val Ser Ala Leu Gly His 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR1 of 6C4 <400> 43 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR2 of 6C4 <400> 44 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Pro Gly 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of L chain variable region CDR3 of 6C4 <400> 45 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Ser Phe Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR1 of 6C4 <400> 46 Asp Arg Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR2 of 6C4 <400> 47 Asn Ile Lys His Asp Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of H chain variable region CDR3 of 6C4 <400> 48 Arg Arg Ser Tyr Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 777 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 cgcttcttcc ttctggatgg gggcccaggg ggcccaggag agtataaagg cgatgtggag 60 ggtgcccggc acaaccagac gcccagtcac aggcgagagc cctgggatgc accggccaga 120 ggccatgctg ctgctgctca cgcttgccct cctggggggc cccacctggg cagggaagat 180 gtatggccct ggaggaggca agtatttcag caccactgaa gactacgacc atgaaatcac 240 agggctgcgg gtgtctgtag gtcttctcct ggtgaaaagt gtccaggtga aacttggaga 300 ctcctgggac gtgaaactgg gagccttagg tgggaatacc caggaagtca ccctgcagcc 360 aggcgaatac atcacaaaag tctttgtcgc cttccaagct ttcctccggg gtatggtcat 420 gtacaccagc aaggaccgct atttctattt tgggaagctt gatggccaga tctcctctgc 480 ctaccccagc caagaggggc aggtgctggt gggcatctat ggccagtatc aactccttgg 540 catcaagagc attggctttg aatggaatta tccactagag gagccgacca ctgagccacc 600 agttaatctc acatactcag caaactcacc cgtgggtcgc tagggtgggg tatggggcca 660 tccgagctga ggccatctgt gtggtggtgg ctgatggtac tggagtaact gagtcgggac 720 gctgaatctg aatccaccaa taaataaagc ttctgcagaa tcaaaaaaaa aaaaaaa 777 <210> 50 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala Gly Lys Met Tyr Gly Pro Gly Gly 35 40 45 Gly Lys Tyr Phe Ser Thr Thr Glu Asp Tyr Asp His Glu Ile Thr Gly 50 55 60 Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Leu Leu Val Lys Ser Val Gln Val Lys 65 70 75 80 Leu Gly Asp Ser Trp Asp Val Lys Leu Gly Ala Leu Gly Gly Asn Thr 85 90 95 Gln Glu Val Thr Leu Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Thr Lys Val Phe Val 100 105 110 Ala Phe Gln Ala Phe Leu Arg Gly Met Val Met Tyr Thr Ser Lys Asp 115 120 125 Arg Tyr Phe Tyr Phe Gly Lys Leu Asp Gly Gln Ile Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Pro Ser Gln Glu Gly Gln Val Leu Val Gly Ile Tyr Gly Gln Tyr Gln 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ile Lys Ser Ile Gly Phe Glu Trp Asn Tyr Pro Leu Glu 165 170 175 Glu Pro Thr Thr Glu Pro Pro Val Asn Leu Thr Tyr Ser Ala Asn Ser 180 185 190 Pro Val Gly Arg 195

Claims

(a) 서열번호 25로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 26으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 27로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; (b) 서열번호 31로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 32로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 33으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; (c) 서열번호 37로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 38로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 39로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 (d) 서열번호 43으로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 44로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 45로 정의되는 경쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
(a) 서열번호 28로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 29로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 30으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; (b) 서열번호 34로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 35로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 36으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; (c) 서열번호 40으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 41로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 42로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 (d) 서열번호 46으로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR1, 서열번호 47로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR2, 및 서열번호 48로 정의되는 중쇄 가변영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 가변영역을 포함하는 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
(a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로부터 선택되는 서열로 정의되는 경쇄 가변영역;

(b) 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로부터 선택되는 서열로 정의되는 중쇄 가변영역; 및

(c) 상기 (a)의 경쇄 가변영역 및 (b)의 중쇄 가변영역에서 선택되는 영역을 포함하는 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
제3항에 있어서, 상기 항체가 암세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제하는 것인 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
제4항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 암인 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
제3항에 있어서, 상기 기능적인 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv로부터 선택되는 것인 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
제3항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체가 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 및 서열번호 12로부터 선택되는 서열로 정의되는 경쇄 아미노산 서열; 또는

서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16로부터 선택되는 서열로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편을 암호화하는 핵산 분자.
제8항에 있어서, 상기 핵산 분자가,

(a) 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로부터 선택되는 서열로 정의되는 경쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열;

(b) 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로부터 선택되는 서열로 정의되는 중쇄 가변영역을 암호화하는 염기서열; 및

(c) 상기 (a)의 염기서열 및 (b)의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
서열번호 50으로 정의되는 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자를 포함하는 암 진단용 마커.
제10항에 있어서, 상기 피에이유에프(PAUF) 핵산분자는 서열번호 49로 정의되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 마커.
제10항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 것인 암 진단용 마커.
피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 진단용 조성물.
제13항에 있어서, 상기 항체는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편을 암호화하는 핵산분자는 제9항의 핵산분자인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제13항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 것인 암 진단용 조성물.
피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 단백질, 펩타이드, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트.
피에이유에프(PAUF) 단백질의 수준, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 수준, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 것인 암을 진단하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 피에이유에프(PAUF) 단백질의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는 피에이유에프(PAUF) 단백질 검출 방법.
다음의 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법:

(a) 피에이유에프(PAUF) 단백질 또는 핵산분자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 피에이유에프(PAUF) 단백질의 수준, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 수준, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 측정값이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상 기 시험물질은 암 치료 또는 예방용 물질로 판정하는 단계.
제21항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 것인 암의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법.
피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 성장 및 전이 억제용 조성물.
피에이유에프(PAUF) 단백질의 발현, 이를 암호화하는 피에이유에프(PAUF) 핵산분자의 발현, 또는 피에이유에프(PAUF) 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제24항에 있어서, 피에이유에프(PAUF)와 특이적으로 결합하는 단백질, 압타머, 펩타이드, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제25항에 있어서, 상기 항체는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제26항에 있어서, 상기 인간 단일클론항체 또는 그의 기능적인 단편을 암호화하는 핵산분자는 제9항의 핵산분자인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제24항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 난소암 및 대장암에서 선택되는 것인 암 치료 또는 예방용 조성물.