KR101250557B1 - Ｐａｕｆ 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 췌장암 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PAUF 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 췌장암 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 PAUF 특이적 앱타머는 높은 친화도 및 특이성을 가지고 PAUF에 결합하며, 체내 투여시 독성 및 면역원성이 거의 없고, 또한 이종 이식 동물 모델을 이용한 실험 결과 등을 볼 때, 우수한 췌장암 치료 효과 뿐 아니라 적절한 치료제가 없는 췌장암 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

Description

ＰＡＵＦ 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 췌장암 치료용 조성물{PAUF-specific aptamer and therapeutic composition for treatment of pancreatic cancer comprising thereof}

본 발명은 PAUF 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 췌장암 치료용 조성물에 관한 것이다.

췌장암은 미국에서 매년 43,000명이 새로이 확진되고 있으며, 비슷한 숫자가 매년 사망하는 것으로 알려져 있는 미국 내에서 암 중 네 번째로 치사율이 높은 암으로 알려져 있다. 특히 췌장암은 종종 암이 상당히 진행된 이후에 발견되고, 진행이 빠르며, 또한 기존의 항암제에 대한 내성이 있는 경우가 많아서 새로운 치료제 및 치료법에 대한 최근의 활발한 시도에도 불구하고, 췌장암은 여전히 가장 치료가 어려운 암 중 하나이며, 5년 생존율이 5% 미만이다.

췌장암이 초기에 발견되는 경우에는 외과 절제술이 사용될 수 있다. 특히 초기에 수술을 받을 경우 생존율은 향상되지만, 췌장암은 대부분 초기 단계에서는 자각 증상이 없어, 많은 췌장암 환자들은 대부분 암이 상당히 진행되거나 이미 전이된 상태에서 진단받는 경우가 많다.

현재까지 외과적인 종양의 절제술은 췌장암 치료를 위한 가장 최선의 치료법으로 알려져 있다. 하지만, 외과적 절제술이 시행된 이후에도, 여전히 전이는 발생할 수가 있으며, 재발의 증거 없이 평균 생존 기간은 절제시술 후 약 21.2개월로 알려져 있다. 특히 췌장암은 상당히 암이 진행된 이후에 진단되는 경우가 많으며, 화학 요법이나 방사선 요법이 효과가 없는 경우 역시 많다.

젬시타빈은 1997년 FDA에서 승인되었으며 췌장암의 치료를 위해 치료 초기에 적용될 수 있는 항암제이다. 젬시타빈은 뉴클레오시드 유사체로, DNA 복제 과정에서 사이티딘(cytidine)을 대체하여 정상적인 복제를 저해함으로써 암 치료효과를 나타낸다.

또 다른 항암제의 타겟은 리보뉴클레오티드 환원효소(ribonucelotide reductase)이다. 리보뉴클레오티드 환원효소의 활성이 억제되면, 세포는 DNA 복제와 보수에 필요한 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 생산하지 못하게 되며, 결국 세포자멸(cell apoptosis)이 유도된다. 표적 요법은 현재까지 실험실 수준에서의 연구결과를 볼 때 매우 유망하지만, 시판중인 제품은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 타이로신 키나제 저해제인 타세바(Tarceva)가 유일하며, 타세바는 젬시타빈과 병용하여 사용될 경우 다소 생존율을 높일 수 있다고 알려져 있다.

하지만, 췌장암은 전이가 빠르게 일어나는 특징을 가지고 있어, 좋지 않은 예후를 보이는 가장 치명적인 암 중 하나로서, 다양한 성장 인자가 췌장암의 성장을 유발하는 것으로 알려져 있지만, 암의 진전되는 정확한 분자생물학적 메카니즘에 대해서는 알려져 있는 바가 없다.

최근에 췌장 선암 상향조절 인자(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor: PAUF)는 췌장암 세포에서 높은 발현양상을 보이는 단백질로, 췌장암의 성장 및 전이에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다(김 등, Cancer Sci., Vol.100, pp828- 836, 2009).

한편, 앱타머(Aptamer)는 목적하는 타겟에 대한 높은 친화력과 특이성을 가지고 결합하는 고유한 3차원 입체 구조를 갖는 단일 가닥(single strand) 핵산이다. 앱타머는 단백질 뿐 아니라 유기분자, 무기분자, 탄수화물, 세포 등에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.

상기 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)으로 알려진 in vitro 선별 과정에 의해 랜덤 시퀀스(randomized sequence) 조합 라이브러리(combinatorial library)에서 선별될 수 있다(US 5,270,163, US 5,580,737, US 5,660,985 등 참조). 이러한 앱타머는 체내에 투여시 면역원성(immunogenicity) 및 독성이 거의 없는 것으로 알려져 있어, 항암제 등의 새로운 약품 형태로 각광받고 있다. 특히 RNA 앱타머는 높은 안정성과 특이성, 면역원성 및 독성이 거의 없다는 특성을 가지고 있어 근래 가장 각광받고 있는 치료제 형태의 하나이다. 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 165 특이적인 앱타머인 마큐젠(Macugen)이 노인성 황반변성(Aged Macular Degeneration: AMD)에 대한 적용증으로 2004년 처음으로 FDA에서 승인된 이후, 현재 많은 종류의 앱타머가 암을 포함한 다양한 적용증에 대해 임상 시험 중에 있다.

이에 본 발명자들은 적절한 치료제가 존재하지 않는 췌장암의 치료제 개발을 위해, 췌장암 세포에서 과다 발현되는 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor)가 췌장암의 전이 및 증식에 밀접한 관련이 있다는 사실을 규명하였으며, 높은 친화도를 가지고 PAUF에 특이적 앱타머를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PAUF에 특이적으로 결합하는 앱타머인 P12FR2를 제공하고, 이를 이용한 췌장암 치료용 조성물 및 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 PAUF에 특이적으로 결합하는 앱타머인 P12FR2를 제공한다.

본 발명은 상기 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2와 생체 적합성(biocompatibility) 고분자 물질이 접합된 앱타머-복합체를 제공한다.

본 발명은 상기 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2 또는 상기 앱타머-복합체를 포함하는 췌장암 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 이전의 연구에서 췌장암 세포주와 췌장암 조직에서 높은 발현양상을 보이는 새로운 분비단백질을 발견하였다. 췌장 선암 상향조절 인자(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor: PAUF)라고 명명된 이 단백질은 췌장암 세포의 증식, 전이 및 침투(invasion)를 도와주는 기능을 하며, 또한 PAUF는 다운스트림(downstream)의 전사인자(transcription factor)를 활성화시켜, 암세포의 증식과 전이에 관여하는 CXCR4 수용체와 같은 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

암세포의 전이와 침투를 조장(助長)하는 PAUF의 기능은 생체외(in vitro) 실험에서 PAUF에 대한 siRNA 및 항 PAUF 항체에 의해 억제될 수 있음이 확인되었는데, 이는 PAUF가 암의 증식 및 전이 등의 진행에 있어 성장인자와 같은 기능을 수행함을 의미한다.

이러한 실험결과로부터 PAUF는 암, 특히 췌장암 치료를 위한 매력적인 타겟이라는 점을 확인할 수 있었고, PAUF에 특이적으로 결합하는 앱타머는 췌장암 치료제로서 매우 유용하다는 점을 확인할 수 있었다. 도 4 및 도 5를 참조한다.

본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor) 특이적 앱타머(Aptamer) P12FR2을 제공한다.

보다 상세하게는 랜덤 시퀀스 조합 라이브러리로부터 PAUF에 특이적으로 결합하는 앱타머를 SELEX 방법을 이용하여 선별하고, 그 중 가장 친화도가 높고 PAUF에 특이적으로 결합하여 췌장암의 증식 및 전이를 억제하는 P12 앱타머를 선별한 후, 이의 서열을 최적화함으로써 최종적으로 P12FR2라 명명된 앱타머를 개발하였다.

본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 RNase에 저항성을 가지도록 변형이 일어난 것을 특징으로 하며, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2’ 탄소 위치에서 -OH 기가 -Me(메틸), -OMe, -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;

뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형;

뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노 포스페이트(borano phosphophate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형; 에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2와 생체 적합성(biocompatibility)을 가지는 거대 고분자 물질이 접합된 앱타머-복합체를 제공한다.

상기 거대 고분자 물질은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 디아실글리세롤(DAG) 임을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공하며, 상기 암은 췌장암, 난소암, 위암 및 대장암으로부터 선택되는 1종 이상의 암을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 상기 앱타머-복합체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하며, 상기 암은 췌장암, 난소암, 위암 및 대장암으로부터 선택되는 1종 이상의 암을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.

예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자에 따라 결정된다.

구체적으로 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 인체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내,정맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥주사, 피하 주사, 피내 주사제, 근육 주사 및 점적 주사이다.

본 발명에 따른 PAUF 특이적 앱타머는 높은 친화도 및 특이성을 가지고 PAUF에 결합하며, 체내 투여시 독성 및 면역원성이 거의 없고, 또한 이종 이식 동물 모델을 이용한 실험 결과 등을 볼 때, 우수한 췌장암 치료 효과 뿐 아니라 적절한 치료제가 없는 췌장암 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 PAUF 특이적 앱타머의 선별과정 및 선별결과를 보여주는 것이고,
(A) SELEX 사이클이 진행됨에 따라 PAUF 특이적 앱타머가 선별되는 과정을 나타내는 도면
(B) 본 발명에서 선별된 P1, P3, P5 및 P12 앱타머의 서열을 나타내는 도면
(C) 18 라운드의 SELEX 선별 과정 후, 선별된 P1, P3, P5 및 P12 압타머의 인간 Fc 및 PAUF-인간 Fc에 대한 결합 특이성을 나타내는 도면
도 2는 본 발명에 따른 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2의 선별과정을 보여주는 것이며,
(A) P12 앱타머의 말단 부분에서 절단이 일어난 변이체를 설명하는 도면
(실선으로 된 박스안은 랜덤 서열을 갖는 부분을 의미하며, 점선으로 된 박스안은 PAUF에 결합하기 위한 P12 앱타머의 필수적인 부분을 나타낸다.)
(B) P12 앱타머의 말단 부분에서의 절단이 일어난 변이체의 PAUF에 대한 결합능을 나타내는 도면
도 3은 P12FR2 압타머와 P12FR2-Rev 앱타머의 서열 및 이차 구조를 보여주는 것이고,
(A) P12FR2 압타머와 P12FR2-Rev 앱타머의 서열을 나타내는 도면
(B) P12FR2 압타머와 P12FR2-Rev 앱타머의 이차 구조를 나타내는 도면
도 4는 P12FR2에 의한 PAUF 유도된 PANC-1 세포 이동의 억제결과를 보여주는 것이며,
(A) P12FR2로 처리된 경우와 다른 대조군을 처리한 경우의 PANC-1 세포 이동을 나타내는 도면
(B) P12FR2로 처리된 경우와 다른 대조군을 처리한 경우의 PANC-1 세포 이동을 수치화하여 나타내는 도면
도 5는 마우스 이종 이식 모델에서 P12FR2에 의한 췌장암의 억제효과를 보여주는 것이다.
(A) P12FR2와 대조군을 처리한 경우의 췌장암이 이식된 마우스 이종 이식 모델에서의 바이오루미네센스 측정 결과를 나타내는 도면
(B) P12FR2와 대조군을 처리한 경우의 췌장암 부피의 변화를 나타내는 도면
(C) P12FR2와 대조군을 처리한 경우의 전체 체중의 변화를 나타내는 도면

이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예 및 시험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] PAUF 특이적 앱타머의 선별

(1) 라이브러리의 제작 및 SELEX 방법

고정 링커 영역 사이에 의해 플랭크(flanked)된 40개의 랜덤 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 1에 따른 DNA 주형(template)을 가지는 랜덤 라이브러리를 (주) 바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 상기 DNA 주형에는 일부 제한 효소 사이트나 in vitro 전사를 위한 T7 promoter 인식부위가 포함되어 있다.

5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC-(N40)-CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3' (서열번호 1)

상기에서 N40은 40개의 뉴클레오티드를 가지는 랜덤 시퀀스이다.

이중 가닥 DNA 라이브러리는 0.25 μM의 5’- 및 3’- 프라이머를 이용하여 10 사이클의 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 제작되었다.

상기 5’- 및 3’- 프라이머의 서열은

5’- GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG -3’(서열번호 2),

5’- GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG -3’(서열번호 3)을 가진다.

RNA 라이브러리는 Epicentre Biotech. 사(위스콘신주, 미국)의 DuraScribe T7 전사 키트를 이용하여 상기 DNA 라이브러리를 in vitro 전사하여 제작되었다.

상기와 같이 제작된 RNA 라이브러리를 이용하여 SELEX 방법을 통해 PAUF 특이적 앱타머를 선별하였다.

각 SELEX 사이클을 수행하기 전에, 30 mM의 트리스 염산(pH 7.5), 150 mM의 NaCl, 1.5 mM의 MgCl₂, 2 mM의 디티오스레이톨(dithiothreitol)과 1% BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 200 ㎕의 바인딩 버퍼(binding buffer)에 200 nM의 인간 IgG의 Fc 단백질과 10 ㎕의 프로테인 G 비드(Protein G Bead)를 첨가하고, RNA와 함께 상온에서 약 30분간 사전 인큐베이션하여 인간 IgG 또는 비드에 결합하는 특성을 가지는 RNA를 제거하였다.

인간 IgG 및 비드에 결합하는 RNA를 제거한 RNA는 새로운 튜브에 옮겨 100 nM의 PAUF-인간 IgG Fc와 상온에서 30 분간 인큐베이션 하였다. PAUF-인간 IgG의 Fc에 결합된 RNA를 비드와 함께 침전시키고, 침전된 펠릿(pellets)을 200 ㎕의 바인딩 버퍼를 이용하여 4회 세척하였다. 이후, RNA를 회수하여, RT-PCR 방법 및 in vitro 전사를 통해 증폭하여 다음 라운드의 SELEX에 사용하였다.

SELEX는 PAUF-인간 IgG Fc 농도를 매 5 사이클마다 1/2로 감소시켜 보다 엄격한 조건 하에서 진행하여, PAUF에 높은 친화력과 특이성을 가지는 앱타머가 선별될 수 있도록 하였다.

RNase에 대한 저항성을 향상시키기 위하여 변형된 염기를 SELEX 방법 내의 전사 단계에서 제공하거나, 또는 최종 선별된 앱타머의 서열에서 변형을 주는 방법으로 변형된 앱타머를 제작할 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2‘ 탄소 위치에서 -OH 기가 -Me(메틸), -OMe, -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노 포스페이트(borano phosphophate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있다(Crooke 등, Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 등 참조).

18 사이클의 SELEX를 수행한 후, 선별된 RNA 풀(pool)을 증폭하여, 증폭된 DNA를 pCDNA3(Invitrogen, 칼즈배드, 캘리포니아)에 클로닝 하였으며, 선별된 20 개의 클론을 수득하였다.

(2) RNA 의 PAUF 에 대한 결합능 측정을 위한 방사능 표지

선별된 RNA의 결합능력 측정을 위해 RNA를 방사능으로 표지하였다. 구체적으로, 1 ㎍의 RNA와 인산 가수 분해 효소(phosphatase) 20 U를 혼합하여 37℃에서 30 분간 인큐베이션 하였다. 이후 페놀/클로로포름을 이용하여 추출하고 에탄올을 이용하여 침전시켜 RNA를 분리·정제하고, ³²P-표지된 γ-ATP와 정제된 RNA의 혼합물을 37℃에서 30 분간 10 U의 T4 폴리뉴클레오디 키나제를 첨가하여 인큐베이션 하였다. 수득된 RNA는 6%의 아크릴아마이드(acrylamide)/7 M 우레아(urea) 젤(gel) 상에서 전기영동(electrophoressis)하였다.

목적하는 RNA 밴드를 젤에서 잘라내어, 아세트산 암모늄 500 mM, EDTA 1 mM, 소듐 도데실 설페이트(sodium dodesyl sulfate: SDS) 0.2%(w/v)의 조성을 갖는 용출 버퍼를 이용하여 용출 시킨 후, 에탄올을 이용하여 침전시키고 원심분리하여 PAUF에 특이적으로 결합하는 RNA를 수득하였다.

상기 방법과 유사한 풀-다운 방법(pull-down assay)을 SELEX 사이클에 적용하여 수행되었다. 간략하게 설명하면 바인딩 버퍼에 50 nM의 RNA(cold : hot = 10 : 1)와 Fc 또는 PAUF-Fc 100 nM를 혼합하여, 상온에서 30분간 방치하였다. 이후 프로테인 G 비드 10 ㎕를 각 용액에 첨가하고, 부드럽게 교반하면서 실온에서 30 분간 인큐베이션 하였다. 수득된 현탁액을 원심분리하여 바인딩되지 않은 RNA를 포함하는 상등액을 폐기한 후, 펠릿화된 비드를 바인딩 버퍼로 3 번 세척하였다.

상기 바인딩된 RNA는 페놀/클로로포름을 이용하여 추출 및 분획(fractionation)하고, 8% 폴리아크릴아마이드/7 M 우레아 젤을 이용하여 전기영동하고 자기방사법(autoradiography) 또는 β-신틸레이션카운터(scintillation counter)를 이용하여 분석하였다.

(3) 앱타머 5’- 말단에서의 바이오티닐레이션

PAUF 특이적 앱타머 또는 대조군 앱타머를 뉴트라비딘(neutravidin) 센서 칩에 고정하기 위해서, 5'- 바이오티닐테이트된 GMP를 이용하여 RNA의 5'- 말단에 바이오틴을 결합시켰다.

반응 혼합물은 2 ㎍의 이중가닥 DNA 주형(P12FR2 또는 P12FR2 - REV)과 T7 프로모터, 5 mM ATP, 5 mM의 2’-F-dCTP, 5 mM 2’-F-dUTP, 2 mM의 GTP, 3mM 5’-바이오티닐- GMP, 20 ㎖의 DuraScribe T7 효소 믹스, 10 mM의 디티오트레이톨 및 DuraScribe T7 반응 버퍼를 포함한다.

전사는 37℃에서 밤새 진행되었으며, 이어서 37℃에서 15 분간 10 분자 단위 (Molecular Biology Units: MBU)의 DNase I를 이용하여 처리하였다. 수득된 RNA는 8%의 아크릴아마이드/7 M 우레아 젤에서 전기영동한 후, 용출 버퍼(0.5 M의 NH₄OAc, 1 mM EDTA, 0.2% SDS)를 이용하여 용출하고, 에탄올과 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 이용하여 침전시켰다.

(4) XPR36 결합 친화력 측정 방법

PAUF-특이적 앱타머 및 컨트롤 앱타머의 PAUF에 대한 친화력은 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR) 기술을 기반으로 하는 ProteOn의 XPR36 단백질 상호 작용 어레이 시스템을 이용하여 측정하였다.

바이오티닐레이션된 PAUF-특이적 앱타머 및 컨트롤 앱타머는 30 ㎕/min의 유체 흐름과 수직방향이 되도록 2개의 서로 다른 채널에서 뉴트라비딘(neutravidin) 센서 칩에 고정되도록 하였다.

고정된 앱타머는 10 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl 및 0.005% Tween 20을 포함하는 pH 7.4, 180 ㎍/㎖의 PBST 런닝 버퍼(PBST running buffer)를 이용하여 용출하였다. 고정화 수준은 양쪽 모두 약 900 공명 단위(Resonance Unit: RU)였다.

다음으로, PAUF와 인간 Fc를 결합한 PAUF-hFc를 런닝 버퍼로 희석하여 0.1, 1 및 10 의 3가지 농도를 가지도록 하여 100 ㎕/분의 속도로 200 ㎕를 수평 방향으로 주입하였다. 이때, PBST가 1 개의 채널에 기준 값을 잡기 위해 함께 주입되었다.

모든 결합 센서그램(sensorgram)은 ProteOn Manager Software를 이용하여 수집, 처리 및 분석되었으며, 레퍼런스 값으로부터 결합 센서그램은 단순한 1:1 랭그미어(Langmuir) 모델을 이용하여 결정되었으며, kd 및 ka 역시 이러한 방법으로 결정되었다.

평형 해리 상수 K _D는 결합상수 및 해리상수로부터 K _D = kd / ka의 관계식을 이용하여 결정되었다.

(5) SELEX 방법을 통해 선별된 PAUF 특이적 RNA 앱타머의 특성 분석

RNase에 내성을 가지는 인간 PAUF 특이적 RAN 앱타머를 선별하기 위해 2-플루오로피리미딘으로 변형된 RNA 라이브러리를 이용한 in vitro SELEX 방법을 수행하였다. SELEX에 이용된 RNA 라이브러리는 양단에 일정한 서열을 가지는 40개의 랜덤 뉴클레오티드 라이브러리의 T7 프로모터를 이용한 in vitro 전사에 의해 생성되었다.

SELEX의 첫 번째 사이클에는 1 × 10²⁴의 다양성(diversity)을 갖는 RNA 라이브러리가 사용되었다. PAUF-인간 IgG Fc 융합 단백질은 RNA 선별을 용이하게 하기 위하여 프로테인 G(Protein G) 코팅된 비드에 결합되어 사용되었다.

PAUF 이외의 IgG Fc 또는 비드에 결합하는 앱타머가 증폭되는 것을 방지하기 위하여, 사전 배양을 통해 IgG Fc 또는 비드를 이용한 사전 인큐베이션 과정에서 그러한 앱타머를 배제하였다. PAUF와 높은 친화도를 가지는 앱타머를 선별하기 위해 SELEX의 라운드가 진행됨에 따라, PAUF 농도를 감소시켜 보다 엄격한 조건 하에서 SELEX를 수행하였다. PAUF 특이적 앱타머의 친화도는 SELEX의 5, 10, 그리고 18 라운드에서 방사성 표지된 RNA 결합 분석(binding assay) 방법을 통해 측정하였다.

이를 위해 RNA는 방사성 표지되어 인간 IgG의 Fc 또는 PAUF-인간 IgG의 Fc가 결합된 프로테인 G 비드에 결합하고, 방사선 표지된 앱타머와 인간 IgG의 Fc 또는 PAUF-인간 IgG의 Fc가 결합된 프로테인 G 비드의 결합은 겔 전기영동 및 자기방사법을 이용하여 확인할 수 있다(그림 1A).

18 라운드의 SELEX가 완료된 후, 선별된 앱타머는 PAUF-인간 IgG Fc에는 높은 친화도를 보이지만, 인간 IgG Fc에는 거의 결합능을 보이고 있지 않아, 높은 특이성을 가지고 PAUF에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 PAUF에 특이성을 가지고 결합 후 선별된 앱타머의 친화도는 SELEX의 매 라운드가 진행됨에 따라 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 RNA 풀이 표적 단백질인 PAUF에 대한 친화도가 높은 리간드가 선택적으로 증폭되어 PAUF에 대한 친화도가 높은 리간드가 풍부, 즉 전체 리간드 중에서 그러한 리간드가 차지하는 비율이 증가하기 때문이다. PAUF-특이적 앱타머가 풍부해진 앱타머 풀은 클로닝 되어 서열을 확인하였다(그림 1B).

이후 각각의 RNA를 이용하여 방사선 표지 RNA 바인딩 어세이를 통해 각 개별 클론의 특성을 in vitro 전사하여 확인하였다. 방사성 표지 RNA 바인딩 어세이를 통해 P5 앱타머가 P1, P3 및 P12 앱타머에 비해 PAUF에 더 높은 친화도를 가짐을 확인할 수 있었다(그림 1C).

하지만, P1, P3 및 P15 앱타머가 PAUF에 높은 친화도를 가짐에도 불구하고, PAUF 유도된 PANC-1 췌장암 세포의 이동은 P12 앱타머에 의해서만 억제된다는 사실이 확인되었다. 따라서 P12 앱타머가 추가 연구를 위한 후보 앱타머로 선정되었다. 먼저 P12 앱타머의 5’-말단 또는 3’-말단에서 10 여개의 뉴클레오티드가 삭제된 절단 변이체를 제작하였고(그림 2A), 이어서 각 변이체의 PAUF에 대한 친화도를 방사능 표지 바인딩 어세이를 통해 측정하였다.

상기 결과로부터 11에서 83번째의 뉴클레오티드(73 base)가 P12 앱타머의 PAUF 결합능에 중요하다는 것을 확인할 수 있었다(그림 2B). 따라서 11에서 83번째의 뉴클레오티를 가지는 변이체를 P12FR2라 명명하고(GGGCGUGCUGGGCCUGUAAAUACACGCAUCGUAUCUCGAUUCGCAUCCCUGACUCAUAACCCAGAGGUCGAUG: 서열번호 4), 그 구조를 분석하였다.

상기 P12FR2는 세 개의 스템 루프(stem loop)와 하나의 짧은 스템(short stem)을 포함하고 있다. 또한 컨트롤로 사용하기 위해 제작된 P12FR2의 상보적 서열을 가지는 P12FR2-REV 앱타머의 경우, 그러한 세 개의 스템 루프 및 짧은 스템을 포함하고 있지 않은 것으로 확인되었다(그림 3A 및 그림 3B).

5’-바이오티닐-GMP를 이용하여 P12FR2 앱타머 또는 P12FR2-REV 앱타머를 바이오티닐레이션시켜, 이를 칩 상에 고정하고, Proteon의 XPR36 시스템을 이용하여 PAUF-인간 Fc 단백질에 대한 친화도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과 P12FR2의 ka 및 kd 값은 각각 3.77 × 10⁴ 및 2.90 × 10^-3이었고, 평형 해리 상수 K _D는 K _D = kd/ka 관계에서 산출될 수 있는데, K _D 값은 약 77 nM이었다. 대조군인 P12FR2-REV의 K _D 값은 약 300 로, 좋지 않은 K _D 값을 나타내었다.

[실시예 2] P12FR2 앱타머에 의한 PAUF 유도된 췌장 세포의 이동 저해

상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 P12 앱타머는 PAUF 유도된 췌장암 세포의 이동을 억제한다. P12FR2에 의한 이러한 효과를 PANC-1 세포를 이용한 상처 치유 분석(wound healing assay)을 통해 확인하였다(그림 4A).

인간 췌장암 세포주인 PANC-1과 CFPAC-1은 ATCC(Manassas, 버지니아)에서 입수하였으며, 췌장암 세포는 10% 태아 소 혈청이 첨가된 Dulbecco’s 변형 Eagle’s 배지(웰진, 대구)에서 5%의 이산화탄소와 37℃에서 가습 인큐베이터에서 보관되었다.

PANC-1 세포의 이동은 1 P12FR2 또는 항-PAUF 항체에 의해 저해되지만, P12FR2-REV에 의해서는 저해되지 않았으며, 이러한 결과는 P12FR2가 PAUF에 결합됨으로써 PAUF에 의해 유도된 췌장암 세포의 이동을 억제한다는 점을 입증하는 증거가 된다.

[ 실시예 3] P12FR2 에 의한 CFPAC -1 이종 이식 동물모델에서의 종양 성장 억제

(1) 루시퍼라아제(Luciferase) 분석

루시퍼라아제의 안정적인 발현을 위하여 CFPAC-1 세포는 리포렉타민(Lipofectamine)을 이용하여 pGL4.51[luc2/CMV/Neo] 반딧불(firefly) 리포터 플라스미드로 형질전환시켰다.

클로닝 여부는 500 ㎍/㎖의 G418에서 선별되었으며, 루시퍼라아제의 활성은 듀얼-루시퍼라제 리포터 분석 시스템(프로메가)과 TD-20/20 루미노미터(Luminometer)를 이용하여 결정하였다.

(2) 누드 마우스 췌장암 이종 이식 모델

이종 이식 모델 동물은 6 주령 BALB/c 누드 암컷 마우스의 옆구리에 췌장암 세포(CFPAC-1) 1 × 10⁶ 개를 피하 주사해서 만들어졌다.

세포 및 쥐의 바이오루미네센스 이미징(imaging)은 캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science)사의 IVIS Lumina 이미징 시스템을 이용하여 수행되었으며, 결과물은 Living Image Acquistion and Analysis Software를 이용하여 분석되었다. 모든 동물의 연구는 국립암센터의 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 실시되었다.

인간 췌장암 세포를 이식한 마우스 이종 이식 모델에서 P12FR2의 종양 성장 억제 효과에 대한 실험을 수행하였다. 췌장암 이종 이식 동물모델은 누드 마우스에 반딧불 루시퍼라제가 발현되도록 유전자 조작된 CFPAC-1 세포를 누드 마우스 옆구리에 피하 주사(암세포 수: 1 × 10⁶)하여 제작하였다.

동물모델은 PBS(그룹 1, 컨트롤), 10 ㎎/kg의 P12FR2(그룹 2) 및 10 ㎎/kg의 P12FR2-REV(그룹 3)의 3개 그룹으로 구분되어, 암세포 접종 3일이 경과한 시점부터 주 2회씩 복강 주사를 통해 약물을 투여하였다.

이때 P12FR2는 생체 내에서의 안정성 및 약물동력학(pharmacokinetics)적 특성을 향상시키기 위하여 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 디아실글리세롤(DAG)과 같은 생체 적합성(biocompatibility)을 가지는 거대 고분자 물질이 접합된 형태로 투여될 수 있다.

세포 주입 후 20 일이 경과한 후, 바이오루미네센스 이미징(bioluminescence imaging)을 모든 동물 모델에 대해 실시하였다.

그림 5의 A에서도 확인할 수 있듯이, 그룹 1(PBS 투여)과 그룹 3(P12FR2-REV 투여)에서는 별 의미 있는 결과가 검출되지 않은 반면, P12FR2가 투여된 그룹 2의 경우는 발광이 현격하게 감소하였음을 확인할 수 있었으며, 이는 이식된 CFPAC-1 암세포의 성장이 줄어들었음을 의미하는 결과를 보여주는 것이다.

또한 2주 간격으로 종양 크기를 측정한 결과, 도 5의 B에서 확인할 수 있듯이 P12FR2가 투여된 그룹 2의 경우는 종양 부피가 60% 이상 감소한 반면, 그룹 1과 그룹 3의 경우는 종양 부피의 변화가 거의 없었다.

특히 P12FR2가 투여된 그룹 2의 경우, 체중 손실이 거의 발생하지 않음을 확인할 수 있는데(그림 5C), 이는 P12FR2가 거의 독성이 없음을 의미하므로, P12FR2가 독성 없이 안전하게 췌장암 치료용도로 사용가능하다는 점을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> PAUF-specific aptamer and therapeutic composition for treatment of pancreatic cancer comprising thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random DNA sequence <400> 1 gggagagcgg aagcgtgctg ggccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnncataac ccagaggtcg atggatcccc cc 92 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggagagcgga agcgtgctgg g 41 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 ggggggatcc atcgacctct gggttatg 28 <210> 4 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P12FR2 aptamer <400> 4 gggcgugcug ggccuguaaa uacacgcauc guaucucgau ucgcaucccu gacucauaac 60 ccagaggucg aug 73

Claims (9)

1. 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 PAUF(Pancreatic Adenocarcinoma Up-regulated Factor) 특이적 앱타머(Aptamer) P12FR2.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 앱타머는 RNase에 저항성을 가지도록 변형이 일어난 것을 특징으로 하는, PAUF 특이적 앱타머 P12FR2.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2’ 탄소 위치에서 -OH 기가 -Me(메틸), -OMe, -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
   뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형;
   뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노 포스페이트(borano phosphophate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형;
   에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것임을 특징으로 하는, PAUF 특이적 앱타머 P12FR2.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2와 생체 적합성(biocompatibility)을 가지는 거대 고분자 물질이 접합된 앱타머-복합체.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 거대 고분자 물질은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 디아실글리세롤(DAG) 임을 특징으로 하는 앱타머-복합체.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 PAUF 특이적 앱타머 P12FR2를 포함하는, 췌장암 치료용 조성물.
7. 삭제
8. 제 4항에 따른 앱타머-복합체를 포함하는 췌장암 치료용 조성물.
9. 삭제

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