KR101589442B1 - 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도 - Google Patents

에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101589442B1
KR101589442B1 KR1020107002791A KR20107002791A KR101589442B1 KR 101589442 B1 KR101589442 B1 KR 101589442B1 KR 1020107002791 A KR1020107002791 A KR 1020107002791A KR 20107002791 A KR20107002791 A KR 20107002791A KR 101589442 B1 KR101589442 B1 KR 101589442B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
cells
sdf
nucleic acid
present
Prior art date
Application number
KR1020107002791A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100050500A (ko
Inventor
웨르너르 퍼르쉬케이
플로리안 야로슈
디르크 율베르그
스벤 클루스만
클라우스 부크너르
크리스티안 매쉬
니꼴 딘세
Original Assignee
녹손 파르마 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 녹손 파르마 아게 filed Critical 녹손 파르마 아게
Publication of KR20100050500A publication Critical patent/KR20100050500A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101589442B1 publication Critical patent/KR101589442B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

본 발명은 SDF-1에 결합하는 핵산 분자에 관한 것으로, 여기에서 상기 핵산분자는 세포의 이주에 영향을 미친다.

Description

에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도 {SDF-1 BINDING NUCLEIC ACIDS AND THE USE THEREOF}
본 발명은 CXC 케모카인 기질 세포-유래 인자-1(Chemokine stromal cell-der ived factor-1; SDF-1)에 결합하는 핵산 분자, 질병의 치료방법, 및 약제 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
1. Abi-Younes, S., A. Sauty, et al. (2000). "The stromal cell-derived factor-1 chemokine is a potent platelet agonist highly expressed in atherosclerotic plaques." Circ Res . 86(2): pp.131-8.
2. Aiuti, A., I.J. Webb, et al. (1997). "The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood." J. Exp . Med . 185(1): pp.111-20.
3. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J. Mol . Biol. 215(3):pp.403-10.
4. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17):pp.3389-402.
5. Ambati, J., A. Anand, et al. (2003). An animal model of age-related macular degeneration in senescent Ccl-2- or Ccr-2-deficient mice. Nat . Med . 9: pp.1390-7.
6. Arya, S. K., C. C. Ginsberg, et al. (1999). "In vitro phenotype of SDF1 gene mutant that delays the onset of human immunodeficiency virus disease in vivo." J. Hum . Virol . 2(3): pp.133-8.
7. Auerbach et al. (2003) Angiogenesis assays: a critical overview. Clin.Chem. 49: pp.32-40.
8. Avniel, S., Z. Arik, et al. (2006). "Involvement of the CXCL12/CXCR4 pathway in the recovery of skin following burns." J. Invest Dermatol . 126(2): pp.468-76.
9. Baggiolini, M. (1998). "Chemokines and leukocyte traffic." Nature 392(6676): pp.565-8.
10. Baggiolini, M., B. Dewald, et al. (1994). "Interleukin-8 and related chemotactic cytokines--CXC and CC chemokines." Adv . Immunol . 55: pp.97-179.
11. Balabanian K, Lagane B, Infantino S, Chow KY, Harriague J, Moepps B, Arenzana-Seisdedos F, Thelen M, Bachelerie F (2005) The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J. Biol . Chem . 280(42): pp.35760-35766
12. Balabanian, K., B. Lagane, et al. (2005). "WHIM syndromes with different genetic anomalies are accounted for by impaired CXCR4 desensitization to CXCL12." Blood 105(6): pp.2449-57.
13. Balabanian, K., J. Couderc, et al. (2003). "Role of the chemokine stromal cell-derived factor 1 in autoantibody production and nephritis in murine lupus." J. Immunol . 170(6): pp.3392-400.
14. Balkwill, F. (2004). "Cancer and the chemokine network." Nat . Rev . Cancer 4(7): pp.540-50.
15. Bazan, J. F., K. B. Bacon, et al. (1997). "A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif." Nature . 385(6617): pp.640-4.
16. Bertolini, F., C. Dell'Agnola, et al. (2002). "CXCR4 neutralization, a novel therapeutic approach for non-Hodgkin's lymphoma." Cancer Res . 62(11): pp.3106-12.
17. Bleul, C. C., J. L. Schultze, et al. (1998). "B lymphocyte chemotaxis regulated in association with microanatomic localization, differentiation state, and B cell receptor engagement." J. Exp . Med . 187(5): pp.753-62.
18. Bleul, C. C., M. Farzan, et al. (1996). "The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry." Nature . 382(6594): pp.829-33.
19. Bleul, C. C., R. C. Fuhlbrigge, et al. (1996). "A highly efficacious lymphocyte chemoattractant, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1)." J. Exp . Med. 184(3): pp.1101-9.
20. Brooks, H. L., Jr., S. Caballero, Jr., et al. (2004). "Vitreous levels of vascular endothelial growth factor and stromal-derived factor 1 in patients with diabetic retinopathy and cystoid macular edema before and after intraocular injection of triamcinolone." Arch . Ophthalmol . 122(12): pp.1801-7.
21. Broxmeyer, H. E., A. Orazi, et al. (1998). "Myeloid progenitor cell proliferation and mobilization effects of BB10010, a genetically engineered variant of human macrophage inflammatory protein-1alpha, in a phase I clinical trial in patients with relapsed/refractory breast cancer." Blood Cells Mol . Dis . 24(1): pp.14-30.
22. Broxmeyer, H. E., L. Benninger, et al. (1995). "Effects of in vivo treatment with PIXY321 (GM-CSF/IL-3 fusion protein) on proliferation kinetics of bone marrow and blood myeloid progenitor cells in patients with sarcoma." Exp. Hematol . 23(4): pp.335-40.
23. Buckley, C. D., N. Amft, et al. (2000). "Persistent induction of the chemokine receptor CXCR4 by TGF-beta 1 on synovial T cells contributes to their accumulation within the rheumatoid synovium." J. Immunol . 165(6): pp.3423-9.
24. Burger, J. A., N. Tsukada, et al. (2000). "Blood-derived nurse-like cells protect chronic lymphocytic leukemia B cells from spontaneous apoptosis through stromal cell-derived factor-1." Blood . 96(8): pp.2655-63.
25. Burns JM, Summers BC, Wang Y, Melikian A, Berahovich R, Miao Z, Penfold ME, Sunshine MJ, Littman DR, Kuo CJ, Wei K, McMaster BE, Wright K, Howard MC, Schall TJ (2006) A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J. Exp . Med . 203(9): pp.2201-2213
26. Burt, R. K., A. Marmont, et al. (2006). "Randomized controlled trials of autologous hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases: the evolution from myeloablative to lymphoablative transplant regimens." Arthritis Rheum . 54(12): pp.3750-60.
27. Butler JM, Guthrie SM, Koc M, Afzal A, Caballero S, Brooks HL, Mames RN, Segal MS, Grant MB, Scott EW (2005) SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy. J. Clin . Invest . 115(1): pp.86-93
28. Butler, J. M., S. M. Guthrie, et al. (2005). "SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy." J. Clin . Invest . 115(1): pp.86-93.
29. Cabioglu, N., A. Sahin, et al. (2005). "Chemokine receptor CXCR4 expression in breast cancer as a potential predictive marker of isolated tumor cells in bone marrow." Clin . Exp . Metastasis . 22(1): pp.39-46.
30. Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ma FY, Ozols E, Rollins BJ, Tesch GH (2007) Monocyte chemoattractant protein-1-induced tissue inflammation is critical for the development of renal injury but not type 2 diabetes in obese db/db mice. Diabetologia . 50(2): pp.471-480
31. Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, OzolsE, Atkins RC, Rollin BJ, Tesch GH (2006) Monocyte chemoattractant protein-1 promotes the development of diabetic renal injury in streptozotocin-treated mice. Kidney Int . 69(1): pp.73-80
32. Corcione, A., L. Ottonello, et al. (2000). "Stromal cell-derived factor-1 as a chemoattractant for follicular center lymphoma B cells." J. Natl . Cancer Inst. 92(8): pp.628-35.
33. Croop, J. M., R. Cooper, et al. (2000). "Large-scale mobilization and isolation of CD34+ cells from normal donors." Bone Marrow Transplant . 26(12): pp.1271-9.
34. Crump, M. P., J. H. Gong, et al. (1997). "Solution structure and basis for functional activity of stromal cell-derived factor-1; dissociation of CXCR4 activation from binding and inhibition of HIV-1." Embo . J. 16(23): pp.6996-7007.
35. Dale, D. C., W. C. Liles, et al. (1998). "Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) on neutrophil kinetics and function in normal human volunteers." Am J. Hematol . 57(1): pp.7-15.
36. Damha, M.J., Ogilvie, K.K.(1993) Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc . 1993
37. D'Apuzzo, M., A. Rolink, et al. (1997). "The chemokine SDF-1, stromal cell-derived factor 1, attracts early stage B cell precursors via the chemokine receptor CXCR4." Eur . J. Immunol . 27(7): pp.1788-93.
38. Dawn B, Tiwari S, Kucia MJ, Zuba-Surma EK, Guo Y, Sanganalmath SK, Abdel-Latif A, Hunt G, Vincent RJ, Taher H, Reed NJ, Ratajczak MZ, Bolli R (2008) Transplantation of bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells attenuates left ventricular dysfunction and remodeling after myocardial infarction. Stem Cells . 26(6): pp.1646-1655
39. De Klerck, B., L. Geboes, et al. (2005). "Pro-inflammatory properties of stromal cell-derived factor-1 (CXCL12) in collagen-induced arthritis." Arthritis Res . Ther . 7(6): pp.R1208-20.
40. Eaton, B. E., L. Gold, et al. (1997). "Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers." Bioorg Med . Chem . 5(6): pp.1087-96.
41. Edelman JL, Lutz D, Castro MR (2005) Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model ofblood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp . Eye . Res . 80(2): pp.249-258
42. Edelman, J. L., D. Lutz, et al. (2005). "Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown." Exp . Eye . Res . 80(2): pp.249-58.
43. Fedyk, E. R., D. H. Ryyan, et al. (1999). "Maturation decreases responsiveness of human bone marrow B lineage cells to stromal-derived factor 1 (SDF-1)." J. Leukoc . Biol . 66(4): pp.667-73.
44. Fedyk, E. R., D. Jones, et al. (2001). "Expression of stromal-derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF and in dermal wound healing." J. Immunol. 166(9): pp.5749-54.
45. Fierro, F. A., S. Brenner, et al. (2008). "Combining SDF-1/CXCR4 antagonism and chemotherapy in relapsed acute myeloid leukemia." Leukemia.
46. Fong, D. S., L. P. Aiello, et al. (2004). "Diabetic retinopathy." Diabetes. Care . 27(10): pp.2540-53.
47. Fransioli J, Bailey B, Gude NA, Cottage CT, Muraski JA, Emmanuel G, Wu W, Alvarez R, Rubio M, Ottolenghi S, Schaefer E, Sussman MA (2008) Evolution of the c-kit-positive cell response to pathological challenge in the myocardium. Stem Cells . 26(5): pp.1315-1324
48. Friedlander M, Dorrell MI, Ritter MR, Marchetti V, Moreno SK, El-Kalay M, Bird AC, Banin E, Aguilar E (2007) Progenitor cells and retinal angiogenesis. Angiogenesis. 10(2): pp.89-101
49. Garrido, S. M., F. R. Appelbaum, et al. (2001). "Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug-induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5)." Exp . Hematol . 29(4): pp.448-57.
50. Gear, A. R., S. Suttitanamongkol, et al. (2001). "Adenosine diphosphate strongly potentiates the ability of the chemokines MDC, TARC, and SDF-1 to stimulate platelet function." Blood . 97(4): pp.937-45.
51. Geminder, H., O. Sagi-Assif, et al. (2001). "A possible role for CXCR4 and its ligand, the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1, in the development of bone marrow metastases in neuroblastoma." J. Immunol . 167(8): pp.4747-57.
52. Glaspy, J. A., E. J. Shpall, et al. (1997). "Peripheral blood progenitor cell mobilization using stem cell factor in combination with filgrastim in breast cancer patients." Blood . 90(8): pp.2939-51.
53. Glaspy, J., M. W. Davis, et al. (1996). "Biology and clinical potential of stem-cell factor." Cancer Chemother . Pharmacol . 38 Suppl: S53-7.
54. Godessart, N. (2005). "Chemokine receptors: attractive targets for drug discovery." Ann N Y Acad . Sci . 1051: pp.647-57.
55. Godot, V., M. Arock, et al. (2007). "H4 histamine receptor mediates optimal migration of mast cell precursors to CXCL12." J. Allergy Clin . Immunol. 120(4): pp.827-34.
56. Gombert, M., M. C. Dieu-Nosjean, et al. (2005). "CCL1-CCR8 interactions: an axis mediating the recruitment of T cells and Langerhans-type dendritic cells to sites of atopic skin inflammation." J. Immunol . 174(8): pp.5082-91.
57. Gonzalo, J. A., C. M. Lloyd, et al. (2000). "Critical involvement of the chemotactic axis CXCR4/stromal cell-derived factor-1 alpha in the inflammatory component of allergic airway disease." J. Immunol . 165(1): pp.499-508.
58. Grassi, F., S. Cristino, et al. (2004). "CXCL12 chemokine up-regulates bone resorption and MMP-9 release by human osteoclasts: CXCL12 levels are increased in synovial and bone tissue of rheumatoid arthritis patients." J. Cell Physiol . 199(2): pp. 244-51.
59. Gratwohl A, Baldomero H, Horisberger B, Schmid C, Passweg J, Urbano-Ispizua A (2002) Current trends in hematopoietic stem cell transplantation in Europe. Blood . 100(7): pp.2374-2386
60. Grunewald, M., I. Avraham, et al. (2006). "VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells." Cell. 124(1): pp.175-89.
61. Gu, J., E. Marker-Hermann, et al. (2002). "A 588-gene microarray analysis of the peripheral blood mononuclear cells of spondyloarthropathy patients." Rheumatology ( Oxford ). 41(7): pp.759-66.
62. Guleng, B., K. Tateishi, et al. (2005). "Blockade of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 axis attenuates in vivo tumor growth by inhibiting angiogenesis in a vascular endothelial growth factor-independent manner." Cancer Res . 65(13): pp.5864-71.
63. Gulino, A. V., D. Moratto, et al. (2004). "Altered leukocyte response to CXCL12 in patients with warts hypogammaglobulinemia, infections, myelokathexis (WHIM) syndrome." Blood . 104(2): pp.444-52.
64. Hartmann, T. N., M. Burger, et al. (2004). "The role of adhesion molecules and chemokine receptor CXCR4 (CD184) in small cell lung cancer." J. Biol. Regul . Homeost Agents . 18(2): pp.126-30.
65. Higgins, R. D., K. Yu, et al. (1999). "Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy." Curr . Eye Res. 18(1): pp.20-7.
66. Hodohara, K., N. Fujii, et al. (2000). "Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) acts together with thrombopoietin to enhance the development of megakaryocytic progenitor cells (CFU-MK)." Blood . 95(3): pp.769-75.
67. Hoshino, M., N. Aoike, et al. (2003). "Increased immunoreactivity of stromal cell-derived factor-1 and angiogenesis in asthma." Eur . Respir . J. 21(5): pp.804-9.
68. Hwang, J. H., H. K. Chung, et al. (2003). "CXC chemokine receptor 4 expression and function in human anaplastic thyroid cancer cells." J. Clin . Endocrinol Metab . 88(1): pp.408-16.
69. Ito T, Suzuki A, Imai E, Okabe M, Hori M (2001) Bone marrow is a reservoir of repopulating mesangial cells during glomerular remodeling. J. Am Soc. Nephrol. 12(12): pp.2625-2635
70. Iwamoto T, Okamoto H, Toyama Y, Momohara S (2008) Molecular aspects of rheumatoid arthritis: chemokines in the joints of patients. FEBS J.
71. Jackson, K. A., S. M. Majka, et al. (2001). "Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells." J. Clin. Invest. 107(11): pp.1395-402.
72. Jiang, W., P. Zhou, et al. (1994). "Molecular cloning of TPAR1, a gene whose expression is repressed by the tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)." Exp. Cell. Res. 215(2): pp.284-93.
73. Jin, L., K. J. Hope, et al. (2006). "Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells." Nat . Med . 12(10): pp.1167-74.
74. Jin, L., Y. Tabe, et al. (2008). "CXCR4 up-regulation by imatinib induces chronic myelogenous leukemia (CML) cell migration to bone marrow stroma and promotes survival of quiescent CML cells." Mol . Cancer Ther . 7(1): pp.48-58.
75. Jo, D. Y., S. Rafii, et al. (2000). "Chemotaxis of primitive hematopoietic cells in response to stromal cell-derived factor-1." J. Clin . Invest. 105(1): pp.101-11.
76. Jose, P. J., D. A. Griffiths-Johnson, et al. (1994). "Eotaxin: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation." J. Exp . Med . 179(3): pp.881-7.
77. Juarez, J. and L. Bendall (2004). "SDF-1 and CXCR4 in normal and malignant hematopoiesis." Histol Histopathol . 19(1): pp.299-309.
78. Kanbe, K., K. Takagishi, et al. (2002). "Stimulation of matrix metalloprotease 3 release from human chondrocytes by the interaction of stromal cell-derived factor 1 and CXC chemokine receptor 4." Arthritis Rheum . 46(1): pp.130-7.
79. Kang, H., G. Watkins, et al. (2005). "Stromal cell derived factor-1: its influence on invasiveness and migration of breast cancer cells in vitro, and its association with prognosis and survival in human breast cancer." Breast Cancer Res . 7(4): pp.R402-10.
80. Kawai, T., U. Choi, et al. (2005). "Enhanced function with decreased internalization of carboxy-terminus truncated CXCR4 responsible for WHIM syndrome." Exp . Hematol . 33(4): pp.460-8.
81. Kim KW, Cho ML, Kim HR, Ju JH, Park MK, Oh HJ, Kim JS, Park SH, Lee SH, Kim HY (2007) Up-regulation of stromal cell-derived factor 1 (CXCL12) production in rheumatoid synovial fibroblasts through interactions with T lymphocytes: role of interleukin-17 and CD40L-CD40 interaction. Arthritis Rheum. 56(4): pp.1076-1086
82. King, A. G., D. Horowitz, et al. (2001). "Rapid mobilization of murine hematopoietic stem cells with enhanced engraftment properties and evaluation of hematopoietic progenitor cell mobilization in rhesus monkeys by a single injection of SB-251353, a specific truncated form of the human CXC chemokine GRObeta." Blood . 97(6): pp.1534-42.
83. Kocher, A. A., M. D. Schuster, et al. (2001). "Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function." Nat. Med . 7(4): pp.430-6.
84. Koshiba, T., R. Hosotani, et al. (2000). "Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor system in pancreatic cancer: a possible role for tumor progression." Clin . Cancer Res . 6(9): pp.3530-5.
85. Krumbholz, M., D. Theil, et al. (2006). "Chemokines in multiple sclerosis: CXCL12 and CXCL13 up-regulation is differentially linked to CNS immune cell recruitment." Brain . 129: pp.200-211.
86. Kryczek, I., A. Lange, et al. (2005). "CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers." Cancer Res . 65(2): pp.465-72.
87. Kucia, M., R. Reca, et al. (2005). "Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis." Stem Cells . 23(7): pp.879-94.
88. Kulkarni O, Pawar RD, Purschke W, Eulberg D, Selve N, Buchner K, Ninichuk V, Segerer S, Vielhauer V, Klussmann S, Anders HJ (2007) Spiegelmer inhibition of CCL2/MCP-1 ameliorates lupus nephritis in MRL-(Fas)lpr mice. J. Am Soc . Nephrol . 18(8): pp.2350-2358
89. Kusser, W. (2000). "Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution." J. Biotechnol . 74(1): pp.27-38.
90. Lagane, B., K. Y. Chow, et al. (2008). "CXCR4 dimerization and {beta}-arrestin-mediated signaling account for the enhanced chemotaxis to CXCL12 in WHIM syndrome." Blood.
91. Lapteva, N., A. G. Yang, et al. (2005). "CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo." Cancer Gene Ther . 12(1): pp.84-9.
92. Li JK, Yu L, Shen Y, Zhou LS, Wang YC, Zhang JH (2008) Inhibition of CXCR4 activity with AMD3100 decreases invasion of human colorectal cancer cells in vitro. World J. Gastroenterol . 14(15): pp.2308-2313
93. Li Y, Atmaca-Sonmez P, Schanie CL, Ildstad ST, Kaplan HJ, Enzmann V (2007) Endogenous bone marrow derived cells express retinal pigment epithelium cell markers and migrateto focal areas of RPE damage. Invest Ophthalmol. Vis . Sci . 48(9): pp.4321-4327
94. Li Y, Reca RG, Atmaca-Sonmez P, Ratajczak MZ, Ildstad ST, Kaplan HJ, Enzmann V (2006) Retinal pigment epithelium damage enhances expression of chemoattractants and migration of bone marrow-derived stem cells. Invest Ophthalmol. Vis . Sci . 47(4): pp.1646-1652
95. Liang Z, Brooks J, Willard M, Liang K, Yoon Y, Kang S, Shim H (2007) CXCR4/CXCL12 axis promotes VEGF-mediated tumor angiogenesis through Akt signaling pathway. Biochem Biophys . Res . Commun . 359(3): pp.716-722
96. Lima e Silva R, Shen J, Hackett SF, Kachi S, Akiyama H, Kiuchi K, Yokoi K, Hatara MC, Lauer T, Aslam S, Gong YY, Xiao WH, Khu NH, Thut C, Campochiaro PA (2007) The SDF-1/CXCR4 ligand/receptor pair is an important contributor to several types of ocular neovascularization. FASEB J. 21(12): pp.3219-3230
97. Ma, Q., D. Jones, et al. (1998). "Impaired B-lymphopoiesis, myelopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1-deficient mice." Proc. Natl . Acad . Sci . U S A 95(16): pp.9448-53.
98. Maekawa, T. and T. Ishii (2000). "Chemokine/receptor dynamics in the regulation of hematopoiesis." Intern . Med . 39(2): pp.90-100.
99. Majka M, Kucia M, Ratajczak MZ (2005) Stem cell biology - a never ending quest for understanding. Acta . Biochim . Pol . 52(2): pp.353-358
100. Majka, M., A. Janowska-Wieczorek, et al. (2000). "Stromal-derived factor 1 and thrombopoietin regulate distinct aspects of human megakaryopoiesis." Blood. 96(13): pp.4142-51.
101. Mames RN, Mattheus A, ButlerJ, Brown G, Jorgensen M, Scott E (2006). New anti SDF-1 antinody prevents retinal neovascularization in primates. ARVO; May 1, 2006; Fort Lauderdale.
102. Marechal, V., F. Arenzana-Seisdedos, et al. (1999). "Opposite effects of SDF-1 on human immunodeficiency virus type 1 replication." J. Virol . 73(5):pp. 3608-15.
103. Matsunaga, T., N. Takemoto, et al. (2003). "Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia." Nat. Med. 9(9): pp. 1158-65.
104. Matthys, P., S. Hatse, et al. (2001). "AMD3100, a potent and specific antagonist of the stromal cell-derived factor-1 chemokine receptor CXCR4, inhibits autoimmune joint inflammation in IFN-gamma receptor-deficient mice." J. Immunol . 167(8): pp.4686-92.
105. McGinnis S, Madden TL (2004). BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32(Web Server issue):W20-5.
106. Meleth, A. D., E. Agron, et al. (2005). "Serum inflammatory markers in diabetic retinopathy." Invest Ophthalmol . Vis . Sci . 46(11): pp.4295-301.
107. Menu, E., K. Asosingh, et al. (2006). "The involvement of stromal derived factor 1alpha in homing and progression of multiple myeloma in the 5TMM model." Haematologica.
108. Miller, M. D. and M. S. Krangel (1992). "Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines." Crit . Rev . Immunol. 12(1-2): pp.17-46.
109. Minges Wols HA, Ippolito JA, Yu Z, Palmer JL, White FA, Le PT, Witte PL (2007) The effects of microenvironment and internal programming on plasma cell survival. Int . Immunol . 19(7): pp.837-846
110. Minges Wols HA, Witte PL(2008) Plasma cell purification from murine bone marrow using a two-step isolation approach. J. Immunol . Methods . 329(1-2): pp.219-224
111. Moser, B., M. Wolf, et al. (2004). "Chemokines: multiple levels of leukocyte migration control." Trends Immunol . 25(2): pp.75-84.
112. Mudry, R. E., J. E. Fortney, et al. (2000). "Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy." Blood . 96(5): pp.1926-32.
113. Muller, A., B. Homey, et al. (2001). "Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis." Nature . 410(6824): pp.50-6.
114. Murdoch, C. (2000). "CXCR4: chemokine receptor extraordinaire." Immunol . Rev. 177: pp.175-84.
115. Murphy, P. M., M. Baggiolini, et al. (2000). "International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors." Pharmacol . Rev. 52(1): pp.145-76.
116. Nagasawa, T. (2000). "A chemokine, SDF-1/PBSF, and its receptor, CXC chemokine receptor 4, as mediators of hematopoiesis." Int . J. Hematol . 72(4): pp.408-11.
117. Nagasawa, T., H. Kikutani, et al. (1994). "Molecular cloning and structure of a pre-B-cell growth-stimulating factor." Proc . Natl . Acad . Sci . U S A. 91(6): pp.2305-9.
118. Nagasawa, T., S. Hirota, et al. (1996). "Defects of B-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1." Nature. 382(6592): pp.635-8.
119. NCI NCI. (2001) Bone Marrow Transplantation and Peripheral Blood Stem Cell Transplantation: Questions and Answers. Fact Sheet, Vol. 2008.
120. Needleman & Wunsch (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol . Biol . 48(3):pp.443-53.
121. Ninichuk, V., S. Clauss, et al. (2008). "Late onset of Ccl2 blockade with the Spiegelmer mNOX-E36-3'PEG prevents glomerulosclerosis and improves glomerular filtration rate in db/db mice." Am J. Pathol . 172(3): pp.628-37.
122. Oppenheim, J. J., C. O. Zachariae, et al. (1991). "Properties of the novel proinflammatory supergene "intercrine" cytokine family." Annu . Rev . Immunol. 9: pp.617-48.
123. Orimo, A., P. B. Gupta, et al. (2005). "Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion." Cell . 121(3): pp.335-48.
124. Otani A, Kinder K, Ewalt K, Otero FJ, Schimmel P, Friedlander M (2002) Bone marrow-derived stem cells target retinal astrocytes and can promote or inhibit retinal angiogenesis. Nat . Med . 8(9): pp.1004-1010
125. Parretta, E., G. Cassese, et al. (2005). "CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow." J. Immunol . 174(12): pp.7654-64.
126. Pearson & Lipman (1988), Improved tools for biological sequence comparison. Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85: p.2444
127. Peled, A., I. Petit, et al. (1999). "Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4." Science . 283(5403): pp.845-8.
128. Perissinotto, E., G. Cavalloni, et al. (2005). "Involvement of chemokine receptor 4/stromal cell-derived factor 1 system during osteosarcoma tumor progression." Clin Cancer Res . 11(2 Pt 1): pp.490-7.
129. Phillips, R. J., M. D. Burdick, et al. (2003). "The stromal derived factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases." Am J. Respir . Crit . Care Med . 167(12): pp.1676-86.
130. Ponath, P. D., S. Qin, et al. (1996). "Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils." J. Clin . Invest . 97(3): pp.604-12.
131. Ponomaryov, T., A. Peled, et al. (2000). "Induction of the chemokine stromal-derived factor-1 following DNA damage improves human stem cell function." J. Clin . Invest . 106(11): pp.1331-9.
132. Pruijt, J. F., R. Willemze, et al. (1999). "Mechanisms underlying hematopoietic stem cell mobilization induced by the CXC chemokine interleukin-8." Curr Opin . Hematol . 6(3): pp.152-8.
133. Radbruch, A., G. Muehlinghaus, et al. (2006)."Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell." Nat . Rev . Immunol. 6(10): pp.741-50.
134. Reddy, K., Z. Zhou, et al. (2008). "Stromal cell-derived factor-1 stimulates vasculogenesis and enhances Ewing's sarcoma tumor growth in the absence of vascular endothelial growth factor." Int . J. Cancer .
135. Riviere, C., F. Subra, et al. (1999). "Phenotypic and functional evidence for the expression of CXCR4 receptor during megakaryocytopoiesis." Blood. 93(5): pp.1511-23.
136. Rosenfeld, C. S., B. Bolwell, etal. (1996). "Comparison of four cytokine regimens for mobilization of peripheral blood stem cells: IL-3 alone and combined with GM-CSF or G-CSF." Bone Marrow Transplant . 17(2): pp.179-83.
137. Rubin, J. B., A. L. Kung, et al. (2003). "A small-molecule antagonist of CXCR4 inhibits intracranial growth of primary brain tumors." Proc . Natl . Acad. Sci . U S A. 100(23): pp.13513-8.
138. Salcedo R, Wasserman K, Young HA, Grimm MC, Howard OM, Anver MR, Kleinman HK, Murphy WJ, Oppenheim JJ (1999) Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells: In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1alpha. Am J. Pathol . 154(4): pp.1125-1135
139. Salcedo, R. and J. J. Oppenheim (2003). "Role of chemokines in angiogenesis: CXCL12/SDF-1 and CXCR4 interaction, a key regulator of endothelial cell responses." Microcirculation . 10(3-4): pp.359-70.
140. Salcedo, R., K. Wasserman, et al. (1999). "Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells: In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1alpha." Am J. Pathol . 154(4): pp.1125-35.
141. Salvucci, O., L. Yao, et al. (2002). "Regulation of endothelial cell branching morphogenesis by endogenous chemokine stromal-derived factor-1." Blood. 99(8): pp.2703-11.
142. Saur, D., B. Seidler, et al. (2005). "CXCR4 expression increases liver and lung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer." Gastroenterology . 129(4): pp.1237-50.
143. Schall, T. J. and K. B. Bacon (1994). "Chemokines, leukocyte trafficking, and inflammation." Curr Opin . Immunol. 6(6): pp.865-73.
144. Schober, A. and A. Zernecke (2007). "Chemokines in vascular remodeling." Thromb. Haemost . 97(5): pp.730-7.
145. Schwarting S, Litwak S, Hao W, Bahr M, Weise J, Neumann H (2008) Hematopoietic Stem Cells Reduce Postischemic Inflammation and Ameliorate Ischemic Brain Injury. Stroke
146. Scotton CJ, Wilson JL, Scott K, Stamp G, Wilbanks GD, Fricker S, Bridger G, Balkwill FR (2002) Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer. Cancer Res . 62(20): pp.5930-5938
147. Scotton, C. J., J. L. Wilson, et al. (2002). "Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer." Cancer Res. 62(20): pp.5930-8.
148. Sengupta, N., S. Caballero, et al. (2005). "Preventing stem cell incorporation into choroidal neovascularization by targeting homing and attachment factors." Invest Ophthalmol . Vis . Sci . 46(1): pp.343-8.
149. Shirozu, M., T. Nakano, et al. (1995). "Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1 (SDF1) gene." Genomics. 28(3): pp.495-500.
150. Smith & Waterman (1981), Adv . Appl . Math . 2: p.482
151. Smith, L. E., E. Wesolowski, et al. (1994). "Oxygen-induced retinopathy in the mouse." Invest Ophthalmol . Vis . Sci . 35(1): pp.101-11.
152. Soriano, A., C. Martinez, et al. (2002). "Plasma stromal cell-derived factor (SDF)-1 levels, SDF1-3'A genotype, and expression of CXCR4 on T lymphocytes: their impact on resistance to human immunodeficiency virus type 1 infection and its progression." J. Infect Dis . 186(7): pp.922-31.
153. Springer, T. A. (1995). "Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration." Annu Rev Physiol . 57: pp.827-72.
154. Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions. Department of Health and Human Services. June 2001. <http://stemcells.nih.gov/info/scireport/2001report>.
155. Sun, Y. X., A. Schneider, et al. (2005). "Skeletal localization and neutralization of the SDF-1(CXCL12)/CXCR4 axis blocks prostate cancer metastasis and growth in osseous sites in vivo." J. Bone . Miner . Res . 20(2): pp.318-29.
156. Tabe, Y., L. Jin, et al. (2007). "Activation of integrin-linked kinase is a critical prosurvival pathway induced in leukemic cells by bone marrow-derived stromal cells." Cancer Res . 67(2): pp.684-94.
157. Tachibana, K., S. Hirota, et al. (1998). "The chemokine receptor CXCR4 is essential for vascularization of the gastrointestinal tract." Nature . 393(6685): pp.591-4.
158. Takenaga, M., H. Tamamura, et al. (2004). "A single treatment with microcapsules containing a CXCR4 antagonist suppresses pulmonary metastasis of murine melanoma." Biochem Biophys Res . Commun . 320(1): pp.226-32.
159. Tamamura, H., M. Fujisawa, et al. (2004). "Identification of a CXCR4 antagonist, a T140 analog, as an anti-rheumatoid arthritis agent." FEBS Lett . 569(1-3): pp.99-104.
160. Tang Y, Yasuhara T, Hara K, Matsukawa N, Maki M, Yu G, Xu L, Hess DC, Borlongan CV (2007) Transplantation of bone marrow-derived stem cells: a promising therapy for stroke. Cell Transplant . 16(2): pp.159-169
161. Tarlinton D, Radbruch A, Hiepe F, Dorner T (2008) Plasma cell differentiation and survival. Curr . Opin . Immunol . 20(2): pp.162-169
162. Tashiro, K., H. Tada, et al. (1993). "Signal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins." Science . 261(5121): pp.600-3.
163. Vadhan-Raj, S., L. J. Murray, et al. (1997). "Stimulation of megakaryocyte and platelet production by a single dose of recombinant human thrombopoietin in patients with cancer." Ann Intern . Med . 126(9): pp.673-81.
164. Venkatesan, N., S. J. Kim, et al. (2003). "Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides." Curr . Med . Chem . 10(19): pp.1973-91.
165. Viardot, A., R. Kronenwett, et al. (1998). "The human immunodeficiency virus (HIV)-type 1 coreceptor CXCR-4 (fusin) is preferentially expressed on the more immature CD34+ hematopoietic stem cells." Ann Hematol . 77(5): pp.193-7.
166. Voermans, C., M. L. Kooi, et al. (2001). "In vitro migratory capacity of CD34+ cells is related to hematopoietic recovery after autologous stem cell transplantation." Blood . 97(3): pp.799-804.
167. Wang J, Shiozawa Y, Wang Y, Jung Y, Pienta KJ, Mehra R, Loberg R, Taichman RS (2008) The role of CXCR7/RDC1 as a chemokine receptor for CXCL12/SDF-1 in prostate cancer. J. Biol . Chem . 283(7): pp.4283-4294
168. Wang, J., E. Guan, et al. (2001). "Role of tyrosine phosphorylation in ligand-independent sequestration of CXCR4 in human primary monocytes-macrophages." J. Biol . Chem . 276(52): pp.49236-43.
169. Wang, N., Q. L. Wu, et al. (2005). "Expression of chemokine receptor CXCR4 in nasopharyngeal carcinoma: pattern of expression and correlation with clinical outcome." J. Transl . Med . 3: p.26.
170. Wijdenes J, Vooijs WC, Clement C, Post J, Morard F, Vita N, Laurent P, Sun RX, Klein B, Dore JM (1996) A plasmocyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J. Haematol . 94(2): pp.318-323
171. Wincott F, DiRenzo A, Shaffer C, Grimm S, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S, Usman N (1995). Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 23(14):2677-84.
172. Xu, J., A. Mora, et al. (2007). "Role of the SDF-1/CXCR4 axis in the pathogenesis of lung injury and fibrosis." Am J. Respir . Cell . Mol . Biol . 37(3): pp.291-9.
173. Yamaguchi, J., K. F. Kusano, et al. (2003). "Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization." Circulation . 107(9): pp.1322-8.
174. Yamaji-Kegan, K., Q. Su, et al. (2006). "Hypoxia-induced mitogenic factor has proangiogenic and proinflammatory effects in the lung via VEGF and VEGF receptor-2." Am J. Physiol . Lung Cell Mol . Physiol . 291(6): pp.L1159-68.
175. Yang J, Zhang B, Lin Y, Yang Y, Liu X, Lu F (2008) Breast cancer metastasis suppressor 1 inhibits SDF-1alpha-induced migration of non-small cell lung cancer by decreasing CXCR4 expression. Cancer Lett
176. Yasumoto, K., K. Koizumi, et al. (2006). "Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer." Cancer Res . 66(4): pp.2181-7.
177. Zagzag D, Esencay M, Mendez O, Yee H, Smirnova I, Huang Y, Chiriboga L, Lukyanov E, Liu M, Newcomb EW (2008) Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1alpha/CXCR4 expression in glioblastomas: one plausible explanation of Scherer's structures. Am J. Pathol. 173(2): pp.545-560
178. Zeelenberg, I. S., L. Ruuls-Van Stalle, et al. (2001). "Retention of CXCR4 in the endoplasmic reticulum blocks dissemination of a T cell hybridoma." J. Clin . Invest . 108(2): pp.269-77.
179. Zeelenberg, I. S., L. Ruuls-Van Stalle, et al. (2003). "The chemokine receptor CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma micrometastases." Cancer Res . 63(13): pp.3833-9.
180. Zhang, X., T. Nakajima, et al. (2005). "Tissue trafficking patterns of effector memory CD4+ T cells in rheumatoid arthritis." Arthritis Rheum . 52(12): pp.3839-49.
181. Zhou, Y., P. H. Larsen, et al. (2002). "CXCR4 is a major chemokine receptor on glioma cells and mediates their survival." J. Biol . Chem . 277(51): pp.49481-7.
182. Zou, Y. R., A. H. Kottmann, et al. (1998). "Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development." Nature. 393(6685): pp.595-9.
케모카인 ( chemokine ). 케모카인은 구조적으로 유사한 헤파린-결합형 8-14 kDa의 소분자 단백질 군이다. 기능적으로, 이들은 전염증성(proinflammatory), 항상성 (homeostatic), 또는 이중(dual) 기능형으로 구분된다 (Moser, Wolf et al. 2004). 염증성 케모카인은 병원체(pathogens), 사이토카인(cytokine) 또는 성장 인자(growth factor)로부터 유도되며, 작용성 백혈구(effector leukocytes)를 감염, 염증, 조직 손상 및 암 발병 부위로 순항시킨다. 이러한 케모카인들은 백혈구(임파구)의 순항, 활성화 및 증식을 조절한다 (Schall 및 Bacon 1994; Springer 1995; Baggiolin 1998). 케모카인들은 선택적으로 호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 비만세포, T세포 및 B 세포의 화학주성을 유도한다. 이러한 화학주성 효과에 더하여, 이들은 세포 모양의 변화, 세포 내의 유리형 칼슘 이온의 농도에서의 일시적인 증가, 탈과립화(degranulation), 인터그린(integrins)의 상향조절(upre gulation); 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘 (prostaglandins), 트롬복산(thromboxans) 등과 같은 생리활성 지질의 생성 또는 호흡성 방출(respiratory burst; 병원성 유기물 또는 종양 세포들의 붕괴를 위한 활성 산소종의 방출)에 선택적으로 영향을 미친다. 그러므로, 추가적인 염증 전구성 매개물의 분비, 감염 혹은 염증 부위로의 백혈구 화학주성(chemotaxis) 및 분출(extravasation)을 자극함으로써, 케모카인들은 염증성 반응의 에스컬레이션 (escalation)을 촉발한다. 따라서, 감염 또는 염증 부위로의 추가적인 전구성 염증 매개물의 분비, 백혈구의 화학주성 및 침투성을 자극시킴으로서, 케모카인은 염증성 반응의 확대를 촉발시킨다. 다른 한편, 항상성(Homeostatic) 케모카인은 골수 및 임파성 조직에서 주로 발현되며 조혈작용(hematopoiesis), 면역성 감시 작용(immune surveillance), 및 적응성 면역 반응 (adaptive immune responses) 과 연관된다 (Goddessart 2005).
케모카인 분류( Class of chemokines ).4개의 보존된 시스테인 잔기(conserved cystein residue) 중 처음 2개의 배열에 기초하여, 케모카인들은 4개의 그룹: (1) 시스테인들이 앞뒤 일렬로 배열된 CC 또는 베타(β)-케모카인, (2) 하나의 추가적인 아미노산 잔기에 의해 분리된 CXC 또는 알파(α)-케모카인, (3) 하나의 디설피드(disulfide) 결합만을 갖는 것으로 알려진 XC 또는 감마(γ)-케모카인(오늘날까지 대표적으로 림포탁틴(lymphotactin)/XCL1만이 알려짐) 및 (4) 오늘날까지 알려진 바에 의하면 오직 클래스 멤버(class member)로서 멤브레인-결합된 프락트알킨(membrane-bound fractalkin)을 갖고, 시스테인 사이에 3개의 아미노산 잔기가 위치함을 특징으로 하는 CX3C-케모카인(Bazan, Bacon et al. 1997)으로 구분할 수 있다. 이 통상적인 케모카인들은 이들의 기능에 기인하여 주어진 것과 관련된 하나의 이름 및 서열 특성에 따른 구조적 이름의 2개의 이름으로 명명된다.
CXC 케모카인 ( CXC chemokines ). CXC 케모카인들, 특히, 아미노 말단에 아미노산 서열 ELR을 갖고 있는 CXC 케모카인들은 호중구에 일차적으로 작용한다. 호중구에 활성을 갖는 CXC 케모카인들의 예로는 IL-8/CXCL8, GRO-알파/CXCL1, GRO-베타/CXCL2, 및 GRO-감마/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA-78/CXCL5, SDF-1/CXCL12 및 GCP-2/CXCL6을 들 수 있다. CC 케모카인들은 단핵세포(monocytes), 대식세포(macroph age), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils)와 같은 더 넓은 범위의 백혈구뿐만 아니라, T 및 B 임파구(lymphocytes)에 작용한다 (Oppenheim, Zachariae et al. 1991; Miller and Krangel 1992; Baggiolini, Dewald et al. 1994; Jose, Griffiths-Johnson et al. 1994; Ponath, Qin et al. 1996). 이들의 예로는 I-309/CCL1; MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-1알파/CCL3 및 MIP-1베타/CCL4, RANTES/CCL5 및 에오탁신(eotaxin)/CCL11을 들 수 있다.
CXC 케모카인 수용체 ( CXC chemokine receptors ). 케모카인들은 7개의 트랜스멤브레인-스패닝(transmembrane-spanning) G 단백질-결합 수용체의 슈퍼패밀리 (superfamily)에 속하는 수용체(GPCRs)를 통해 작용한다 (Murphy, Baggiolini et al. 2000). 일반적으로 말하면, 케모카인과 케모카인 수용체간의 상호작용은 하나의 케모카인이 다수의 케모카인 수용체와 결합할 수 있고, 역으로 단일 케모카인 수용체가 수개의 케모카인과 상호 작용할 수 있다는 점에서 불규칙적인 경향이 있다. CC 케모카인을 위한 알려진 일부 수용체들로는 GRO-알파, GCP-2 및 IL-8와 결합하는 CXCR1; GRO-알파, GRO-베타, GRO-감마, ENA-78 및 IL-8을 포함하는 케모카인과 결합하는 CXCR2; PF4, MIG, IP-10 및 I-TAC을 포함하는 케모카인과 결합하는 CXCR3; SDF-1에 대해서만 반응으로 신호 전달하는 것으로 지금까지 밝혀진 CXCR4; 및 BCA-1에 대한 반응으로 신호 전달하는 것으로 나타난 CXCR5을 포함한다(Godessart 2005). CXCR4외에도, RDC1/CXCR7으로 지칭되어 동정되는 새로운 SDF-1 수용체가 있다 (Balabanian, Lagane et al. 2005, Burns, Summers et al.2006).
SDF -1. SDF-1(기질-세포 유래 인자-1; 동의어, CXCL12; PBSF[전구-B-세포 성장 촉진 인자(pre-B-cell growth-stimulating factor]; TPAR-1[TPA 억제성 유전자 1(repressed gene) 1]; SCYB12; TLSF[흉선 임파성 세포 자극 인자(thymic lymphoma cell stimulating factor]; hIRH[간암세포에서 감소된 인간 인터크린(human intercrine reduced in hepatomas)]은 G-단백질 결합형 수용체 CXCR4와 결합하여 활성화시키는 IL-8-유사 케모카인에 특징적인 ELR 모티프(motif)를 포함하지 않는 맥관형성성(angiogenic) CXC 케모카인이다 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo 및 Oppenheim, 2003). 상기 케모카인은 3개의 군: (1) N-말단 신호 서열(signal sequence)를 갖는 cDNAs를 클로닝(cloning)하는 방법(Tashiro, Tada et al. 1993), (2) 기질 세포주 PA6에 의해 발현시에 초기 B 세포 원종(progenitor)을 자극시키는 능력에 의해(Nagasawa, Kikutani et al. 1994) 또는 (3) 단백질 키나제 C-활성화제(protein kinase C-activator)인 테트라 도데카노일 포볼 아세테이트(tetra dodecanoyl phorbol acetate; TPA)로 처치된 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast)로부터 조립된 cDNA 라이브러리(library)로부터 분리하는 방법(Jiang, Zhou et al 1994)을 통하여 각각 독립적으로 발견되었다.
호환적인 스플라이싱(splicing)의 결과로, C-말단에 4개의 추가적인 잔기를 갖는 SDF-1, SDF-1알파(68 AA) 및 SDF-1베타의 두 개의 형태가 존재한다 (Shirizu, Nakano et al. 1995). 이러한 두 개의 스플라이스 변형체(splice variants)들의 생물학적 중요성은 완전하게 밝혀지지 않았다.
SDF -1 서열( Sequences of SDF -1). 서로 상이한 종으로부터 분리된 SDF-1간의 서열 보존성(sequence conservation)은 현격하다: 인간 SDF-1알파(서열번호 1) 및 설치류 SDF-1알파(서열번호 2)는 실질적으로 동일하다. 18번 위치에서 V가 I로 단 한 개의 보존성 변형이 있을 뿐이다(Shirozu, Nakano et al. 1995).
SDF -1 NMR 구조( NMR Structure of SDF -1).NMR 구조 모델(structure model)이 SDF-1을 위해 존재한다 (PDB 접근법(access), 1SDF)[8-68]. SDF-1은 무질서화된 N-말단 영역을 갖는 단량체로 밝혀 졌다. 기타 케모카인들과는 소수성 핵의 패킹(packing) 및 표면 전하 분배에서 상이성을 갖는 것으로 알려져 있다 (Crump, Gong et al. 1997).
SDF -1의 생리학적 특성( Physiological activities of SDF -1).: SDF-1 수용체인 CXCR4가 백혈구, 성숙된 수상돌기세포, 내피세포, 뇌세포 및 거핵세포 상에서 폭넓게 발현되므로, 상기 SDF-1의 활성은 다형질 발현성(pleiotropic)을 갖는다. 지금까지 동정된 기타 다른 케모카인들과는 달리 상기 케모카인은 가장 폭넓은 범위의 생물학적 기능, 특히 면역체계 외에서 그 기능을 발휘한다.
상기 SDF-1의 가장 유의적인 기능적 효과로는 하기를 들 수 있다:
(1) 망막 맥락막 영역에서의 상피 세포의 신생 맥관 부위로의 귀환 및 부착( Homing and attachment ) : SDF-1은 안조직의 혈관신생과정(neovascularization) 중에 상피세포를 맥락막으로 귀환시키는 과정에 관여되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포들의 정확한 역할은 아직 조사중이나 발표된 가설은 상기 상피세포가 비정상 혈관 형성과 연관되어 있다고 알려져 있다 (Sengupta, Caballero et al. 2005).
(2) 줄기 세포( stem cell ) : SDF-1은 성인 골수에서의 조혈 줄기세포(stem cell) 및 조혈 원종 (hematopoietic progenitor; CD34+) 세포 등과 같은 원종세포를 유지시키기 위해 요구된다. 선택적 CXCR4 길항제의 일종인 AMD3100은 조혈 줄기세포(stem cell) 이식을 위하여 CD34+ 세포를 동원하는 데에 사용가능하다. CD34+ 세포는 기질 세포에 의해 생산되는 SDF-1 경사로 이주한다는 것이 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 시험(in vivo)에서 확인되었다 (Aiuti, Webb et al. 1997).
(3) B세포 전개 및 화학주성 (B cell development and chemotaxis ) : SDF-1은 전구-B세포(pre-B cells)의 증식을 지지하고 골수 B세포 원종의 성장을 촉진한다 (Nagasawa, Kikutani et al. 1994); 이는 전구-B세포(pre-B cells) 및 전-B세포(pro-B cells)의 특수한 이주를 유도하는데 반하여 성숙한 B세포에는 대해서는 유의적인 화학주성인자로서 작용하지 않는다 (D'Apuzzo, Rolink et al. 1997; Bleul, Schultze et al. 1998). 아마도, SDF-1은 2차 임파선 조직 내에서 B세포의 배치에 중요한 역할을 한다.
(4) T세포 화학주성 (T cell chemotaxis ) : SDF-1은 가장 유효한 T세포 화학주성인자중 하나이다; CXCR4는 다수 T세포 아집합(subset)상에 존재한다 (Bleul, Farzan et al. 1996).
(5) 배아 발달( Embryonic development ) : SDF-1 및 이의 수용체인 CXCR4는 배아 발달에 필수적이다. SDF-1 및 CXCR4 녹아웃(knockout) 마우스는 분만시에 사산한다; 감소된 숫자의 B세포 및 골수양 원종(myeloid progenitor) 현상과 더불어, 심혈관 중격 결손(cardiac ventricular septal defects) 또는 비정상적 소뇌 발달(abnormal cerebellar development)을 초래한다 (Nagasawa, Hirota et al. 1996; Ma, Jones et al. 1998; Zou, Kottmann et al. 1998). SDF-1은 또한 배아형성기 동안에 혈관 발달의 정상 개체발생(ontogeny)에 필요하다 (Juarez 및 Bendall 2004).
(6) HIV 감염 : SDF-1은 CXCR4-함유 세포주로의 T-영양성(tropic) HIV-1의 진입을 저해하고, 인간 SDF-1 유전자에서의 다형성이 AIDS의 발병에 영향을 미치기에 SDF-1 발현은 AIDS 병원론상에 중요한 의미를 갖을 수 있다 (Bleul, Farzan et al. 1996).
기타 질환( Other disease ). SDF-1 또는 이의 수용체인 CXCR4의 변화된 발현 수준 또는 상기 분자에 대한 변화된 반응은 다수의 인체 질환, 예를 들어, 망막증 (Brooks, Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); 유방암 (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), 난소암 (Scotton, Wilson et al. 2002), 췌장암 (Koshiba, Hosotani et al. 2000), 갑상선암 (Hwang, Chung et al. 2003), 비인두암 (Wang, Wu et al. 2005); 신경교종 (Zhou, Larsen et al. 2002); 신경모세포증 (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001); B-세포 만성 림프성 백혈병 (Burger, Tsukada et al. 2000); WHIM 증후군 (사마귀, 저감마글로블린혈증, 감염증, 골수성 카텍시스(myelokathexis))(Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005; Kawai, Choi et al. 2005); 면역결핍증(Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soriano, Martinez et al. 2002); 병변적 혈관신생증(Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grunewald, Avraham et al. 2006); 염증(Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001); 다발성 경화증(Krumbholz, Theil et al. 2006); 류마티스성 관절염/골관절염(Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Takagishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004)을 수반한다.
SDF -1 길항작용및 이의 수용체 ( Antagonism of SDF -1 and its receptor ).실험적 동물 모델하에서, SDF-1 길항제 또는 이의 수용체는 췌장(Guleng, Tateishi et al. 2005; Saur, Seidler et al. 2005), 대장(Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003; Guleng, Tateishi et al. 2005), 유방(Muller, Homey et al. 2001; Lapteva, Yang et al. 2005), 폐(Phillips, Burdick et al. 2003), 교아종/수아종(Rubin, Kung et al, 2003), 전립선(Sun, Schneider et al. 2005), 골육종(Perissinotto, Cavalloni et al. 2005), 흑색종(Takenaga, Tamamura et al. 2004), 위(Yasumoto, Koizumi et al. 2006), 다중 골수종(Menu, Asosingh et al. 2006)과 같은 서로 상이한 기원으로부터 인간 암세포의 성장 및/또는 전이성 확산을 억제하기에 유효함이 증명되었다. 추가로, 항-SDF-1 치료법은 동물실험에서 망막성 혈관신생증(Butler, Guthrie et al. 2005), 신우염(Balabanian, Couderc et al. 2003) 및 관절염(Matthys, Hatse et al. 2001; Tamamura, Fujisawa et al. 2004; De Klerck, Geboes et al. 2005)을 예방하는 데에 유효하다. 또한, 선택적 CXCR4 길항제인 AMD3100은 조혈 줄기 세포 이식을 위하여 CD34+ 세포를 동원하는데 사용하였다. CD34+ 세포는 기질세포에 의해 생산되는 SDF-1 경사로 이주한다는 것이 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 시험 (in vivo)에서 확인되었다 (Aiuti, Webb et al. 1997).
SDF -1 및 안과질환( SDF -1 and eye diseases ).SDF-1은 당뇨병성 망막병증(DR; Fong. Aiello et al. 2004) 및 노인성 황반성 퇴화증(age-related macular degeneration, AMD; Ambati, Anand et al. 2003)과 같은 안구 후면의 질병 병리학상 역할을 수행한다. 이러한 질병들 모두는 안구에 손상을 가하여 종국에 맹안을 초래하는 시각상의 점진적 소실을 초래한다. 이러한 손상은 맥락막성 혈관신생증(choroidal neovascularization, CNV)로 알려진 과정으로 안구 후면에서의 부적절한 혈관 성장에 기인하여 발병한다. 상기 CNV 과정 중에, 맥락막으로부터 유래된 신생 혈관은 부루치막(Bruch membrane)의 파괴를 통하여 망막하 색소 상피 (sub-retinal pigment epithelium, sub-RPE) 또는 망막하 공간으로 이주한다. 상기 비정상적 혈관은 망막하에서 출혈(망막간 출혈) 또는 액체를 누출시킬 수 있다. 이는 상처를 남기고 황반을 증가시키고 결국은 시각을 왜곡시키게 된다.
당뇨병성 망막병증 ( Diabetic retinopathy ). 당뇨병성 망막병증(Diabetic retinopathy; DR)은 1형(Type 1) 및 2형(Type 2) 당뇨병을 가진 환자에게 빈번하게 발생하는 당뇨병의 주요한 후유증이다. 미국에서 몇 가지 형태의 당뇨병성 망막병증을 앓고 있는 거의 8백만의 환자와 더불어 약 1천6백만 당뇨환자가 존재한다. 증식성 당뇨병성 망막병증(Proliferative diabetic retinopathy, PDR)을 방치할 시에는 환자 중 약 60%의 환자가 5년 이내에 한 쪽 또는 양쪽의 안구 모두가 실명하게 된다. 미국, 유럽 및 다수의 신생국가에서의 당뇨병 환자의 놀랄만한 증가 추세와 함께 상기 환자 인구는 급격하게 증가한다. 예를 들어, 실명율면에서 통상적 인구보다 당뇨병 환자인 경우에 25배나 높은 발병율을 나타낸다. 게다가, 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy, DR)은 해마다 미국에서 모든 신규 환자의 12% 이상으로 추산되는, 중년층에서의 실명 원인 중에 가장 높은 원인이다. 검색 프로그램은 당뇨병성 환자의 시각을 조사하고 사용가능하는 것과 같은 치료법이 적시에 수행될 수 있도록 적절하게 되어 있다.
당뇨병성 망막증의 직접적인 원인은 정확하게 연구되지는 않았으나, 상기 질환은 요인들: 망막성 혈류량의 자동-조절기능의 손상; 망막성 세포 내의 소르비톨(sorbitol)의 축적; 및 세포외 액상에서 후기당화 최종산물(advanced glycosylation end products)의 축적의 조합으로 그 원인이 있는 것으로 사료된다. 이러한 요인들 모두는 혈류 상에서의 풍부한 당 성분 현상인 고혈당증(hyperglycemia)과 직접 또는 간접적으로 관련된다.
DR의 증상은 AMD의 증상과 유사하다. 환자는 망막 세포를 소실하고 미세동맥류(혈류)가 망막의 기저막에서 발생한다. 추가로, VEGF, IGF-1 및 아마도 SDF-1을 포함하는 기타 혈관-유래 인자들은 새로운 혈관 세포를 모으고 손상되는 혈관의 형성을 조장한다.
노인성 황반변성증( Age - related macular degeneration ). 노인성 황반변성증(AMD)는 환자의 중심 시각을 파괴시킨다. 상기 질병의 초기 단계는 환자에 따라 증상이 변화되기에 비록 인지되지 않을 수도 있다.
때때로, 환자는 한쪽 안구에만 영향을 받는다. 또는 양쪽 안구의 시력을 손상할 수는 있으나 그다지 심각하지 않을 수 있다. 상기 질병은 색상 인지력상의 왜곡 또는 불완전 증상을 초래한다. 가끔 시야 중심에서 흑색 반점을 야기하기도 한다.
상기 질환의 병인(원인)은 구체적으로 밝혀지지 않았다. AMD는 가끔 망막 최외곽층의 노화로 인한 것으로 사료된다. 상기 물리적 변화는 황반증(macula)이라고도 알려져 있으며, 시야 확보를 위해 가장 의존되는 망막의 일부인 망막 중심부에서 발생한다.
습형(wet) AMD 증상이 상기 질환의 건조형 증상(dry form)의 후유증으로 시작된다. 환자의 약 90%가 AMD의 건조형 증상으로 고통받고 이는 황반 조직이 얇아지는 증상 및 그 착색상(pigmentation)의 무질서를 야기한다. 나머지 환자들은 습형을 갖고, 이는 맥락막 혈관신생화 및 황반성 부종 및 망막 또는 망막하 출혈증의 발생과 가끔 관련된다. 이러한 모든 증상은 시각적 명료성상의 급속한 퇴화를 초래할 수 있다.
55세 이상의 인구 중 맹안의 가장 공통적인 원인에 해당하는, 습형 AMD는 65-74세 미국 인구 중 약 4-5%에 해당하며 75세 이상의 인구에는 약 10%을 차지한다. 이 질병을 앓는 80세 이상의 미국 국민은 이미 5백만명에 이르렀고 추가로 5백만명이 2020년까지 발생할 것으로 예상된다.
종양( tumor ).종양(tumor)은 단지 암세포(cancer cell)의 덩어리가 아니다: 면역세포로의 종양의 침습(infiltration)은 암의 특성이다. 많은 인간 암들은 종양 성장, 생존 및 이주 및 혈관형성증(angiogenesis) 뿐만 아니라 이러한 침습의 정도 및 표현형에 영향을 미치는 복잡한 케모카인 네트워크(network)를 갖는다. 대부분의 고형 종양은 다수의 비-악성 기질세포(non-malignant stromal cell)를 포함한다. 사실상, 기질 세포는 가끔은 암세포보다 많은 경우가 있다. 상기 암에서 발견되는 주된 기질세포들은 대식세포, 백혈구, 내피세포 및 섬유아세포이다.
종양내 SDF -1( SDF -1 in tumors ).종양(tumor).서로 상이한 암 형태로부터 유래되는 악성세포들은 서로 상이한 케모카인-수용체 발현 양상을 나타내나, SDF-1 수용체 CXCR4는 마우스 및 인간에서 가장 보편적으로 발견된다: 상피, 간엽 및 조혈 기원의 23이상의 서로 상이한 인간 암으로부터 유래된 종양세포들은 CXCR4를 발현한다(Balkwill 2004). SDF-1은 CXCR4에 대한 알려진 유일한 리간드(ligand)이다. 구조적으로 발현되는, 골수 및 2차 임프성 조직과는 달리, SDF-1은 림프종 및 신경 및 성상교세포 계열의 뇌종양의 주요 발암부위에서 발견된다 (Corcione, Ottonello et al. 2000). 게다가, 유방암 전이 부위(Muller, Homey et al. 2001), 갑상선 암(Hwang, Chung et al. 2003), 신경모세포증 및 혈관성 악성종(Geminder, Sagi-Assif et al. 2001) 뿐만 아니라 난소암(Scotton Wilson et al. 2002) 및 췌장암(Koshiba, Hosotani et al. 2000)에서 고수준으로 존재한다. 반면에, 정상 유방(Muller, Homey et al. 2001), 난소(Scotton, Wilson et al. 2002) 및 전립선 상피(Sun, Schneider et al. 2005)상에서는 CXCR4 발현이 낮거나 존재하지 않는다.
CXCR4 이외에도 새로운 SDF-1 수용체가 동정되었다: RDC1/CXCR7 (Balabanian, Lagane et al. 2005, Burns, Summers et al. 2006). 전립선 암 세포주와 관련된 시험관내(In vitro) 및 생체 내(in vivo) 시험에서 CXCR7/RDC1 발현상의 변화가 생존상의 장점에 더하여 부착성 및 침습성 활성을 증강시키는 현상을 수반하였다. 추가적으로, CXCR7/RDC1 수준은 CXCR4에 의해 조절됨이 관찰되었다 (Wang et al, 2008). 시험관내(In vitro) 및 생체 내(in vivo) 시험에서 SDF-1에 대한 2가지 수용체 즉, CXCR4 및 CXCR7은 수개의 암세포 즉, 유방암(breast cancer), 교모세포종(glioblastomas), 난소암(ovarian cancer), 신경아세포종(neuroblastoma), 폐암(lung cancer), 결장암(colorectal cancer) 및 전립선암(prostate cancer)에 대한 종양 성장, 전이 가능성 및 세포사멸(화학요법제 유도성)에 내성을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. (Burns et al, 2006; Li etal, 2008; Scotton et al, 2002; Yang et al, 2008; Zagzag et al, 2008).
따라서, CXCR4 및 CXCR7 발현은 다수 종양의 일반적 특성이 되는 것 같다.
항암치료상 치료적 선택지로서의 케모카인 -수용체 신호전달의 저해( Inhibition of chemokine - receptor signalling as a therpeutic option in cancer treatment ).
종양 세포상의 케모카인-수용체 신호전달 체계 저해는 성장 저지 또는 세포사멸을 유도하고, 하기 근거자료에 제시된 바와 같이 생체 내 시험에서 침습 및 전이를 저해할 잠재성이 있다: siRNA에 의한 CXCR4 녹다운(knockdown)은 유방 종양 성장을 제거하고 (Lapteva, Yang et al. 2005); CXCR4의 표면 발현을 저해하는 구조(construct)로 감염된 T-림프잡종세포종은 마우스에 정맥내 주사시에 먼 기관으로서 더 이상 전이가 안되게 할 수 있다(Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2001); 결장직장 암세포로 한 실험결과와 유사하게, 폐 및 간 전이는 크게 감소하였다(Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003); 항-CXCR4 항체는 유방암 이종이식편의 임프절내로의 확산을 저해하였다(Muller, Homet et al. 2001); 림프아구 세포(lymphoblastoid cells)에 항-CXCR4 또는 항-SDF-1 항체 처치는(NOD)/SCID 마우스의 종양 성장을 지연하였다(Bertolini, Dell'Agnola et al. 2002); 항-SDF-1 항체는 비-소세포 폐암(NSCLC) 세포의 기관전이 발달을 저해하였다(Philips, Burdick et al. 2003); CXCR4 길항제인 AMD 3100(AnorMED)의 전신 투여는 두개내의 교아종 및 수아종 이종이식편의 성장을 저해하고, 24시간 내에 종양 세포 사멸을 증가시켰다(Rubin, Kung et al. 2003); 항-SDF-1 항체는 암종-수반 섬유아세포와 혼합된 MCF-7 유방암 세포의 성장을 저해했다(Orimo, Gupta et al. 2005); 항체로 CXCR4의 중화는 전립선암 전이 및 골부위에서의 성장을 저해했다(Sun, Schneider et al. 2005); 골육종세포 주사후의 폐 전이의 발달은 펩티드성 CXCR4 길항제 T134 투여로 저해되었다(Perissinotto, Cavalloni et al. 2005).
서로 다른 저자들은 상기 SDF-1/CXCR4 축(axis)을 목표화하는 것이 암 환자를 위한 새로운 치료적 선택법을 제공할 수도 있다는 결론에 이르렀다.
인간 난소성 종양은 저수준의 SDF-1 및 VEGF를 강력하게 발현한다. 모든 단백질은 종양에서의 저산소증(hypoxia)에 의해 촉발된다. 임의의 단독 단백질의 병리학적 농도는 생체 내 실험에서 혈관형성증(angiogenesis)을 유도하기에 부족하나, 병리학적 농도의 SDF-1 및 VEGF와 조합하는 경우는 신생맥관증(neovascularization)을 효과적이고 상승적으로 유도하였다. 따라서, VEGF 단독이 아닌, 이러한 상승적 축을 저해하는 것은 암을 치료하는데 새로운 효과적인 항신생혈관증 전략이 될 수 있다(Kryczek, Lange et al. 2005).
자가 분비성 SDF-1/CXCR4 신호체계 내에서의 유방 암세포주는 공격적인 양상을 나타낸다. 이는 보다 빠른 성장과 함께 침습 및 이동성의 증가를 포함한다. 따라서, 상기 SDF-1/CXCR4 축은 공격적 특성을 예측하기 위한 중요한 정보를 제공할 수 있으며, 인간 유방암에 있어서 중요한 치료학적 목표를 구성할 수 있다(Kang, Watkins et al. 2005).
고 수준의 CXCR4을 발현하는 소-세포 폐암세포(SCLC)의 이주 및 전이는 SDF-1에 의하여 조절된다. CXCR4의 활성화는 종양 미세환경(tumor microenvironment) 내에서 부수적 세포들(기질세포 등) 및 세포외 세포간질 분자로의 부착을 촉진시킨다. 이러한 부착성 상호작용은 화학요법 상에서 SCLC세포의 증가된 내성을 유발한다. 이와 같이, SDF-1/CXCR4 축의 저해제는 SCLC세포의 화학적-감수성(chemosensitivity)을 증가시킬 수 있어 SCLC 환자에 대한 새로운 치료학적 길을 이끌어 준다(Hartmann, Burger et al. 2004).
케모카인 -수용체 신호 및 줄기 세포 소통( Chemokine - receptor signalling and stem cell trafficking ). 상기 SDF-1/CXCR4 축은 신체 내의 다양한 형태의 줄기 세포(stem cell) 소통에 대한 추축성 조절자로서 부상하고 있다. 모든 악성물이 간/원종세포 분획으로부터 유래되지 않으므로, 암 줄기 세포는 또한 그 표면상에서 CXCR4를 발현하고 결과적으로, 상기 SDF-1/CXCR4 축은 SDF-1을 발현하는 기관(예를 들어, 임프절, 폐, 간, 뼈) 으로의 소통/전이를 지향함과 관여한다. 결론적으로, SDF-1/CXCR4 축을 조절하기 위한 전략은 정상 줄기 세포의 상기 조직으로의 전달을 위한 재생의학 및 암 줄기 세포(stem cell)의 전이를 저해하기 위한 임상적 종양학 상에 중요한 임상적 적용을 갖는다 (Kucia, Reca et al. 2005).
줄기 세포 동원( Stem Cell Mobilization ). 백혈구 세포(white blood cell)로 지칭되는 백혈구(Leukocytes)는 호중구(neutrophils), 대식세포(macrophages), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils)/비만 세포(mast cells), B 세포(cells) 및 T 세포를 포함한다. 백혈구는 집락 증식 인자(colony stimulating factors; CSFs) 및 조혈 조직(hematopoietic tissues)에서의 줄기 세포(stem cells) 및 전구 세포(progenitor cells)상의 다양한 사이토카인(cytokines)의 작용에 의하여 조혈계를 통하여 연속적으로 치환된다. 이러한 인자들 중 가장 널리 알려진 인자는 백혈구 및 원세포(말초 혈관 줄기 세포 동원)의 생산을 가극함으로서 화학요법제의 부작용을 억제하는 용도로 승인된 과립구 집락 증식 인자( granulocyte colony stimulating factor; 약자, G-CSF)이다. 줄기 세포 및 전구 세포 증식을 특정하는 마커(marker)로 사용되는 몇 개의 세포 표면 항원(cell surface antigens)들이 있다. 이러한 마커들은 새롭고 보다 특이적인 마커들이 발견될 때마다 또한 변화되기 쉽다. 조혈 줄기 세포(Hematopoietic stem cells)는 현재는 CD34+, c-kit+, Sca- 1+ , CD45+, lin-, 및 CD38- (CD 38 도 계열 마커 (lineage marker)이므로 lin-으로 됨)으로 특정된다. 또한 골수는 조혈작용을 갖지 않는 몇 개의 기타 상이한 줄기 세포형의 숙주이나, 다른 세포 형들 및 조직에는 조혈성을 유발한다: 중간엽 줄기 세포 (Mesenchymal stem cells)는 CD34+, Sca-1+, lin-, BMPR+ 및/또는 STRO-1+로 특정되고, 골수 유래의 조직-예정 줄기 세포 (tissue-committed stem cells):는 현재 CXCR4+, CD34+, CD45- 으로 특정된다. 골수 유래의 조직-예정 줄기 세포 모집단은 (Majka et al. 2005): 골격 줄기 세포(skeletal stem cells):는 Myf5+, MyoD+, 심장 줄기 세포(cardiac stem cells):는 NKx2.5+, GATA4+, 간 줄기 세포(liver stem cells):는 CK19+, α-fetoprotein+, 신경 줄기 세포(neural stem cells):는 nestin+, GATA4+로 특정된다.
기타 다른 인자들은 인간 및 동물 객체 모두에서의 백혈구 및 전구 세포를 증가시키는 것으로 보고되었다. 이러한 시약으로는 과립구-대식세포 집락 증식 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; 약자-GM-CSF), 인터루킨(Interleukin)-1 (약자- IL-1), 인터루킨-3 (약자- IL-3), 인터루킨-8 (약자- IL-8), PIXY-321 (약자- GM-CSF/IL-3 융합 단백질), 대식세포 연증성 단백질 (약자-MIP), GROβ (CXCL2) 및 GROβT(CXCL2Δ4), 줄기 세포 인자, 혈소판 형성인자(thrombopoietin) 및 성장 관련 온코진(growth related oncogene) 단독 또는 이들의 조합을 포함한다(Broxmeyer, Benninger et al. 1995; Glaspy, Davis et al. 1996; Rosenfeld, Bolwell et al. 1996; Glaspy, Shpall et al. 1997; Vadhan-Raj, Murray et al. 1997; Broxmeyer, Orazi et al. 1998; Dale, Liles et al. 1998; Pruijt, Willemze et al. 1999; King, Horowitz et al. 2001).
내인성 성장 인자(endogenous growth factors)가 약학적으로 유효성을 갖으나, 약제로서 적용되는 단백질 및 펩티드의 잘 알려진 장점은 지금까지 유효한 추가적인 제제로 사용되는 상기 성장 인자의 장점, 즉, 백혈구 및 줄기 세포의 전구 세포를 각각 증가시키는 점, 바람직하게는 객체의 말초혈관 내에서 혈중 농도를 증가시키는 등의 장점을 추가할 필요성이 대두 된다. 결과적으로, 본원에서 해결해야 할 하나의 문제점은 백혈구 및 줄기 세포의 전구 세포를 각각 증가, 보다 상세하게는, 객체의 말초혈관 내에서 혈중 농도를 증가시키는 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 본원에서 추가적으로 해결해야 할 문제점은 백혈구 및 줄기 세포의 낮은 수준의 전구 세포 수준으로 기인하거나 수반되는 질병의 치료를 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
줄기 세포는 동원된 동일 환자의 손상된 조직을 직접 치유하거나 또는 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA) 일치 공여자로부터 동원되거나 수집하여, 작용할 조직에 정맥 내 투여하거나 직접 투여하여 손상된 조직을 직접 치유하기 위하여 동원된다. 또한 후자는 환자 스스로 동원된 줄기 세포로 수행가능하다. 줄기 세포의 투여 전에, 시험관 내 연구에서 증식 및/또는 분화시킬 수 있다.
알러지성 기도 질환 및 접촉성 알러지( Allergic airway disease and contact allergies). SDF-1는 성숙 및 전구 비만 세포에 대하여 특히, 예를 들어, 비만 세포 표면에 대한 Fc-epsilon과 결합함으로서 IgE 신호전달과정을 통하여 히스타민이 분비될 때에 화학주성 약제(chemotactic agent)로 작용함이 밝혀 졌다 (Godot, Arock et al. 2007). 알러지성 기도 질환의 마우스 모델에서, 상술한 바와 같이 백혈구상에 발현되는 CXCR4의 항원-매개성 중화현상은 기도성 과민반응을 감소시킨다. 이러한 항체는 또한 폐 호산구증다증(lung eosinophilia), 특히 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage fluid) 및 간질조직에서 폐 호산구증다증(lung eosinophilia)을 절반 정도로 감소시키며, 이는 CXCR4-매개 신호가 폐 염증에 기여함을 의미한다. SDF-1α 중화 작용은 폐 알러지성 염증 및 기도 과반응증(airway hyper-responsiveness) 모두에서 유사하게 감소되었다 (Gonzalo, Lloyd et al. 2000). 또한, SDF-1이 혈관신생증에 기여한다는 점도 확인되었다. 이러한 결과는 혈관신생증 및 SDF-발현을 연구하기 위한 기관지 생검 분석시험을 통한 천식시험(Hoshin et al)에서 증명되었다. 이러한 생검 조직편을 이용한 면역세포화학시험은 천식 객체가 대조군 객체보다 보다 발달한 혈관분포상태 및 보다 다수의 SDF- 양성 세포를 나타내었다 (Hoshino, Aoike et al. 2003).
게다가, 임상 및 실험적 결과에서 피부-침투성 백혈구는 아토피 피부염(atopic dermatitis)의 개시 및 지속성에 중요한 역할을 하며, SDF-1이 T-임파구 및 수지상 세포(dendritic cells), 특히, 랑거한스-형 수지상 세포(Langerhans-type dentritic cells)의 순항에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Gombert, Dieu-Nosjean et al. 2005).
건선 ( Psoriasis ). 건선은 자가-면역 구성요소에 해당하는 염증성 피부 질환이다. 이 건선은 주요한 역할을 수행하는 T 세포와 함께 작용된 피부에 대한 강력한 백혈구 침습으로 특징화된다. 주 등(Zhou et al)은 건선화된 피부 영역에서 기타 물질과 같이 증가된 SDF-1 mRNA 발현율을 나타내었다 (Zhou, Krueger et al. 2003).
관절 염( Joint inflammation ). 관절염에서의 SDF-1-CXCL4-축과의 관련성이 문헌에서 밝혀졌다. 문헌(Matthys et al)은 강력한 CXCR4의 강력하고 특이적인 길항제인 AMD3100이 IFN-감마 수용체-결핍 마우스 시험에서 자가면역성 관절염을 저해함을 개시하고 있다(Matthys, Hatse et al. 2001). 또한 SDF-1의 발현이 활액 생검시험 및 척추관절증(spondyloarthropathy), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선형 관절염(psoriatric arthritis) 및 퇴행성 관절염 (degenerative joint disease; 골관절염)을 앓고 있는 객체로부터 얻은 RT-PCR시험으로부터 관찰되었다. 그러나, 과발현은 모든 경우에 발견되지 않았다 (Gu, Marker-Hermann et al. 2002). 유사한 결과가 RT-PCR을 이용한 시험법에서 CXCR4에서도 발견되었다.
류마티스성 관절염( Rheumatoid arthrits ). 최근 들어, SDF-1 수준이 골관절염 환자와 비교하여 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활액낭에서 보다 증가함이 확인되었다 (Kim, Cho et al. 2007). 저자들은 또한 세포 배양실험에서, 활막섬유 모세포(fibroblast-like synoviocytes)에서의 SDF-1 발현이 T 세포와 함께 공동-배양함으로서 상위 조절됨도 개시하였다. 이러한 효과는 상기 배양 배지에 T-세포 사이토카인인 IL-17을 첨가하여도 나타났다.
관절 조직 생검 시험을 통한 면역생화학적 시험법에서 SDF-1이 건선형 관절염 환자의 관절 활액에서 발현됨이 밝혀졌다. 약제(infliximab)를 투여한 총 9명의 환자에게서 신속하고 유의적인 임상적 개선효과를 나타냈다. 이는 기타 성장 인자들과 같이 활액성 SDF-1 수준상의 감소현상을 나타냈다 (Gu, Marker-Hermann et al. 2002).
백혈구 침습은 알러지성 질환, 알러지 반응 및 자가면역 질환 상의 염증에서 특징적인 현상이라는 증거가 있는 반면에, 지금까지 이러한 질환에 효과적인 치료법이 개발된 바가 없다. 현재까지 이러한 질환의 경로, 및 바람직하게는 백혈구 침습(leukocyte infiltration)에 영향을 미치는 추가적인 치료제 개발이 요구되고 있다. 결과적으로, 본원에서 해결해야 할 하나의 문제점은 조직으로의 백혈구 침습을 저해 또는 감소시키기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 본원에서 추가적으로 해결해야 할 문제점은 조직으로의 백혈구 침습 또는 조직으로의 증가된 상기 백혈구 수준으로 기인하거나 또는 수반되는 질환을 치료하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
SDF-1 및 이의 수용체의 신호전달은 신체 내에서의 세포들의 이주, 바람직하게는 한 조직에서 다른 조직으로의 이주, 보다 바람직하게는, 조직으로부터 말초혈관 및/또는 말초혈관으로부터 조직으로의 이주에 영향을 미쳐 다수의 질환 (dise ases) 및 장애(disorders)을 초래한다. 특이적 간섭, 바람직하게는 SDF-1 및 SDF-1 수용체 또는 수용체간의 상호작용의 저해는 다수 질환 및 장애들의 개선에 영향을 미친다. 상술한 견지에서, 본원에서 추가적으로 해결해야 할 문제점은 신체 내에서의 세포들의 이주, 바람직하게는 한 조직에서 다른 조직으로의 이주, 보다 바람직하게는, 조직으로부터 말초 혈관 및/또는 말초혈관으로부터 조직으로의 이주(여기에서 이러한 이주는 다수의 질환 및 장애를 초래하거나 수반함)에 영향을 미치기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본원에서 추가적으로 해결해야 할 문제점은 신체 내에서의 세포들의 이주, 바람직하게는 한 조직에서 다른 조직으로의 이주, 보다 바람직하게는, 조직으로부터 말초 혈관 및/또는 말초혈관으로부터 조직으로의 이주(여기에서 이러한 이주는 다수의 질환 및 장애를 초래하거나 수반함) 으로 기인하거나 또는 수반하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 하기 독립 청구항의 주제에 의하여 해결된다. 바람직한 구현예들은 종속항들로 구현될 수 있을 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명의 해결 과제는 본 발명의 첫 번째 측면으로서, SDF-1에 결합하는 핵산 분자(상기 핵산 분자가 세포의 이주에 영향을 줌)를 제공함으로서 해결되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 본 발명의 상기 세포들은 SDF-수용체를 발현하는 세포(여기에서 상기 SDF-1 수용체는 바람직하게는, CXCR4 및 CXCR7로부터 선택되는 것이다)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 본 발명의 상기 세포들의 이주는 전구 세포(progenitor cells), 줄기 세포(stem cells), 암 세포(cancer cells), 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포의 객체의 말초혈관으로 동원(mobilizations)(여기에서 바람직하게는 B 세포(cells) 및/또는 T 세포가 기억성(memory) B 세포(cells) 및/또는 T 세포인 것임)을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 본 발명의 상기 전구 세포(progenitor cells) 및/또는 줄기 세포(stem cells)는 CD34+ 전구 세포를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 2차 및 3차 구현예로서, 본 발명의 상기 전구 세포 및/또는 줄기 세포의 동원(mobilization)은 조혈 조직(hematopoietic tissue)에서 발생되는 것이다.
본 발명의 첫번째 측면의 제 5차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 본 발명의 상기 조혈 조직은 골수 조직(myeloid tissue) 및 림프 조직(lymphoid tissue)중 어느 하나(여기에서, 바람직하게는 상기 골수 조직은 골수에 위치한 것이고, 바람직하게는, 상기 림프 조직은 염증 조직에서의 소화관(digestive tract), 기도 관(respiratory tract), 임파 절(lymph nodes), 비장 (spleen), 흉선(thymus) 및/또는 림프 소포(lymphoid follicles)의 점막에 위치한 것임)이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 핵산 분자(nucleic acid molecule)는 백혈구(leukocytes)의 이주를 저해하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 본 발명의 상기 백혈구(leukocytes)는 T-임파구(lymphocytes), B-임파구, 단핵세포(monocytes), 대식세포(macrophages), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils), 수지상 세포(dendritic cells) 및/또는 비만 세포(mast cells)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 본 발명의 상기 백혈구가 이주(migration)시, 조직상에 축적, 여기에서 바람직하게는, 상기 백혈구의 축적은 조직상에 염증을 초래하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 본 발명의 상기 조직(tissue)은 피부, 점막, 이에 제한되지는 않으나, 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 뼈 및 임파계(lymphatic system)로부터 선택된 기관, 바람직하게는, 피부 및/또는 기도 점막을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 9차 구현예 중 어느 하나로서, 본 발명의 상기 핵산 분자(nucleic acid molecule)는 A형(type A) 핵산 분자, B형(type B) 핵산 분자, C형(type C) 핵산 분자, 및 서열번호(SEQ.ID) 142, 143 및 144 중 어느 하나의 핵산 서열(nucleic acid sequence)을 갖는 핵산 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 10차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 A형(type A) 핵산 분자는 하기 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence)을 포함하는 것이다:
5’ AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC 3’ (서열번호 19)
여기에서 XA 는 존재하지 않거나 또는 A이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 11차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 A형(type A) 핵산 분자는 하기 군을 포함하는 군으로부터 선택된 핵심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다:
5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (서열번호 20),
5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’ (서열번호 21), 및
5’AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (서열번호 22), 바람직하게는, 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (서열번호 22)을 포함하는 핵심 뉴클레오티드 서열.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 11차 내지 제 12차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 1차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 11차 내지 제 12차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 2차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 13차 내지 제 14차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 스트레치를 포함하고 상기 제 1차 및 제 2차 스트레치는 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 혼성화(hybridization)시에 이중-가닥 구조(double-stranded structure)를 생성하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 13차 내지 제 15차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 이중-가닥 구조(double-stranded structure)는 4 내지 6개 염기 쌍(base pairs), 바람직하게는 5개 염기 쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 13차 내지 제 16차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X1X2NNBV’ (서열번호 44)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’BNBNX3X43’ (서열번호 45)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
상기에서 X1 은 존재하지 않거나 또는 R이고, X2 는 S이고, X3 는 S이고 X4 는 존재하지 않거나 또는 Y이거나;
또는
X1 은 존재하지 않고, X2 는 존재하지 않거나 S이고, X3 는 존재하지 않거나 또는 S이고 X4 는 존재하지 않는다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 13차 내지 제 17차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’RSHRYR’ (서열번호 23)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’YRYDSY’(서열번호 24)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’ GCUGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’ CGCAGC 3’을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 19차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 13차 내지 제 17차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X2BBBS3’ (서열번호 42)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’SBBVX33’ (서열번호 43)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
여기에서 X2는 존재하지 않거나 또는 S이고 X3 는 존재하지 않거나 또는 S이며;
바람직하게는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’CUGUG3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CGCAG3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이거나;
또는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’GCGUG3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CGCGC3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 20차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 11차 내지 제 19차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 서열번호 5 내지 18, 25 내지 41, 133, 137, 139 내지 141 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 21차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 10차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 B형(type B) 핵산 분자는 하기 핵심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다:
5’ GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (서열번호 57).
본 발명의 첫 번째 측면의 제 22차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 21차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 B형(type B) 핵산 분자는 GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (서열번호 58)의 핵심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다:
본 발명의 첫 번째 측면의 제 23차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 21차 내지 제 22차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’방향으로 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 21차 내지 제 22차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 2차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 25차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 23차 내지 제 24차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 스트레치를 포함하고 상기 제 1차 및 제 2차 스트레치는 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 혼성화(hybridization)시에 이중-가닥 구조(double-stranded structure)를 생성하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 26차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 21차 내지 제 25차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 이중-가닥 구조(double-stranded structure)는 4 내지 6개 염기 쌍(base pairs), 바람직하게는 5개 염기 쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 27차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 23차 내지 제 26차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X1X2SVNS3’ (서열번호 77)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’BVBSX3X43’ (서열번호 78)을 포함하며, 여기에서
X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X2 는 G이고, X3 는 C이고 X4 는 존재하지 않거나 또는 U이거나;
또는
X1 는 존재하지 않고, X2 는 존재하지 않거나 또는 G이고, X3 는 존재하지 않거나 또는 C이고 X4 는 존재하지 않은 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 23차 내지 제 27차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X1GCRWG3’ (서열번호 59)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’KRYSCX43’(서열번호 60)을 포함하는 것이며,
여기에서 X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X4 는 존재하지 않거나 또는 U이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 29차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 23차 내지 제 28차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X1GCGUG3’ (서열번호 75)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’UACGCX43’ (서열번호 76)을 포함하며,
여기에서 X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X4 는 존재하지 않거나 또는 U이며,
바람직하게는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’AGCGUG3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’UACGCU3’을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 23차 내지 제 27차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’X2SSBS3’ (서열번호 73)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’BVSSX33’ (서열번호 74)을 포함하며,
여기에서 X2 는 존재하지 않거나 또는 G이고, X3 는 존재하지 않거나 또는 C이며,
바람직하게는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’GCGUG3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’UACGC3’을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 31차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 21차 내지 제 30차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 서열번호 46 내지 56, 61 내지 72, 및 132 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 32차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 10차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 C형 (type C) 핵산 분자는 GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG (서열번호 90)의 핵심 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기에서 XA 는 존재하지 않거나 또는 A이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 33차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 32차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 C형 (type C) 핵산 분자는
5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (서열번호 91),
5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (서열번호 92), 및
5’GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (서열번호 93)을 포함하는 군으로부터 선택된 핵심 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는, 상기 핵심 뉴클레오티드 서열은 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (서열번호 93)을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 32차 내지 제 33차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’방향으로, 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 35차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 32차 내지 제 33차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 5’->3’ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 2차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 36차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 35차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 스트레치를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 1차의 적어도 일부 및 제 2차 스트레치의 적어도 일부가 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 혼성화(hybridization)시에 이중-가닥 구조(double-stranded structure)를 생성하는 것이다
본 발명의 첫 번째 측면의 제 37차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 36차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 제 1차 스트레치의 길이 및 제 2차 스트레치의 길이가 개별적으로 및 독립적으로 0 내지 17 개 뉴클레오티드, 바람직하게는 4 내지 10 개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 4 내지 6 뉴클레오티드인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 36차 내지 제 37차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 이중 가닥 구조는 4 내지 10 개 염기쌍, 바람직하게는 4 내지 6 개 염기쌍, 보다 바람직하게는 5 개 염기쌍을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 39차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 38차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 이중가닥 구조는 4 내지 10 개 연속적 염기쌍(consecutive base pairs), 바람직하게는 4 내지 6 개 연속적 염기쌍, 보다 바람직하게는 5 개 연속적 염기쌍을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 40차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’RKSBUSNVGR’ (서열번호 120)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’YYNRCASSMY’ (서열번호 121)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
바람직하게는 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’RKSBUGSVGR3’ (서열번호 122)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’YCNRCASSMY3’ (서열번호 123)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 41차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’XSSSSV3’ (서열번호 124) 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’BSSSXS3’ (서열번호 125)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 Xs 는 존재하지 않거나 또는 S인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 42차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 및 제 41차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’SSSSR3’(서열번호 130)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’YSBSS3’ (서열번호 131)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
바람직하게는, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’SGGSR3’ (서열번호 126) 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’YSCCS3’ (서열번호 127)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 43차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차, 제 41차 및 제 42차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’GCSGG 3’(서열번호 128)의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CCKGC’ (서열번호 129)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
바람직하게는, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’GCCGG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CCGGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CUGAUUCUCACG’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 45차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’UGAGAUAGG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’ CUGAUUCUCA’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 46차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 34차 내지 제 39차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치는 5’GAGAUAGG’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치는 5’CUGAUUCUC’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 47차 구현예로서, 또한 첫번째 측면의 제 32차 내지 제 46차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 서열번호 79 내지 89, 94 내지 119, 및 134 내지 136중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것이다 .
본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차 구현예로서, 또한 첫번째 측면의 제 10차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 서열번호 142 내지 144중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 49차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 48차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 SDF-1의 길항제인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 50차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 48차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 SDF-1 수용체 계(receptor system)의 길항제(antagonist)이고, 여기에서 바람직하게는 SDF-1 수용체 계(receptor system)의 SDF-1 수용체는 CXCR4 및 CXCR7으로부터 선택된 하나인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 51차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 50차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 SDF-1는 인간 SDF-1 이고/이거나 상기 SDF-1 수용체 계(receptor system)의 SDF-1 수용체가 인간 SDF-1 수용체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 52차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 51차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 SDF-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 53차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 52차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산은 변형체(modification)를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 53차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 변형체(modification)는 HES 기(moiety) 및 PEG 기(moiety)을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 55차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 54차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 변형체(modification)는 직쇄(straight) 또는 가지상(branched) PEG 기로 구성된 PEG 기이며, 여기에서 상기 PEG 기의 분자량은 바람직하게는 약 2 내지 180 kD 범위, 보다 바람직하게는 약 60 to 140 kD 범위, 및 가장 바람직하게는 약 40 kD인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 제 54차 구현예의 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 변형체(modification)는 HES 기(moiety)이며, 여기에서 상기 HES 기의 분자량은 바람직하게는 약 10 내지 130 kD 범위, 보다 바람직하게는 약 30 내지 130 kD 범위 및 가장 바람직하게는 약 100 kD인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 57차 구현예로서, 또한 첫 번째 측면의 하나의 구현예 및 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 56차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 발명의 상기 핵산의 뉴클레오티드는 L-뉴클레오티드 (L-nucleotides), 바람직하게는 서열번호 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92, 및 93 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는 뉴클레오티드인 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 두 번째 측면으로서, 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 핵산 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물에 의해 해결되며, 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이.
본 발명의 근본적인 해결과제는 세 번째 측면으로서, 약제(medicament) 제조를 위한 첫 번째 측면에 따른 핵산의 용도에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 약제는 전구세포(progenitor cell) 및/또는 줄기 세포의 말초 혈관으로의 동원(mobilization), 및/또는 질환 또는 장애, 바람직하게는, 상처 치료(wound healing); 화상(burn); 손상된 기관 조직(damaged organ tissue) 및/또는 손상된 맥관구조(vasculature)에 기인하거나 수반하는 장애(여기에서 상기 장애는 망막 및 맥락막 손상(retinal and choroidal damage), 뇌졸중(stroke), 심근성 손상(myocardial damage), 심근 경색증(myocardial infarct), 장기 이식 및 외상성 후 허혈증(ishemia); 및 조혈성 장애(hematopoietic disorders)(여기에서 상기 장애는 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 백혈병(leukaemia), 약물-유도 빈혈증(drug-induced anemia) 및 백혈구 감소증(leukopenia) 및 백혈구 감소증에 의한 박테리아 감염증(bacterial infection)으로부터 선택된 것임)의 치료에 사용된다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 약제는 객체에서 암세포(cancer cells)의 말초혈관으로의 동원을 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 2차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 암세포(cancer cells)는 백혈병 세포(leukemic cells), 림프종 세포 (lymphoma cell), 암 줄기 세포 (cancer stem cell), 전이 잠재적(metastatic potential) 암세포 및 암 전이물(cancer metastases)로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 2차 내지 제 3차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 약제는 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제와 조합하여 사용하는 것이다(여기에서 상기 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 객체에서 암세포(cancer cells)의 말초혈관으로의 동원하기에 적합한 것이고, 바람직하게는, 상기 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 암세포 동원제(cancer cell mobilizing agents)로부터 선택된 것이다).
본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 2차 내지 제 4차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 약제는 제 3의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제와 조합하여 사용하는 것이다(여기에서 상기 제 3의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 말초혈관에서 암세포를 손상시키고(damages), 파괴시키고 (destroys) 및/또는 표지화시키고(labels), 상기 표지(label)는 신체 방어의 활성화(activation)를 초래함).
본 발명의 세 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 2차 내지 제 5차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 객체는 연속적으로 또는 동시적으로 화학요법 및/또는 방사선요법을 수행되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 5차 내지 제 6차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 약제는 암, 바람직하게는, 고형 암(solid tumors) 및 혈액 종양(hematological cancers), 보다 바람직하게는, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 및 골수종(myeloma)의 치료(treatment) 및/또는 예방(prevention)에 사용되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 약제는 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포의 객체의 말초혈관으로 동원(mobilizations)(여기에서 바람직하게는 B 세포(cells) 및/또는 T 세포가 기억성(memory) B 세포(cells) 및/또는 T 세포인 것임)을 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 8차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제와 조합하여 사용하는 것이다(여기에서 상기 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 기억성 T 세포의 객체의 말초혈관으로 동원(mobilizations)되고, 상기 제 2의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 바람직하게는, 세포 동원제들(cell mobilizing agents)로부터 선택된 것임).
본 발명의 세 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 8차 내지 제 9차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 약제는 제 3의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제와 조합하여 사용하는 것이다(여기에서 상기 제 3의 약학적으로 활성을 갖는 활성화제는 말초혈관에서 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포를 손상시키고(damages), 파괴시키고 (destroys) 및/또는 표지화시키고(labels), 상기 표지(label)는 신체 방어의 활성화(activation)를 초래함).
본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 8차 내지 제 10차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 객체는 연속적으로 또는 동시적으로 화학요법 및/또는 방사선요법을 수행되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 8차 내지 제 11차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 약제는 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases)(여기에서, 상기 전신성 자가면역 질환은 바람직하게는, 알러지(allergy), 온난(warm) 및 저온(cold) 자가면역 용혈성 빈혈증(autoimmune hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증상(systemic inflammatory response syndrome), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), I형 당뇨병 (diabetes type I), 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 다발연골염(polychondritis), 다분비선 자가면역 증후군(polyglandular autoimmune syndrome), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)및 그 증상(manifestations), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 임파계(lymphatic system) 혈관 또는 기타 기관에서의 류마티스 질환(rheumatic disease)로부터 선택된 질환임); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract) (여기에서, 상기 위장관 자가면역 질환은 바람직하게는, 크론씨 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 셀리악병(celiac disease), 글루텐 불내성(gluten intolerance), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 췌장염(pancreatitis), 호산성 식도염(eosinophilic esophagitis)으로부터 선택된 질환임);피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin)(여기에서 상기 피부 자가면역 질환은 바람직하게는, 건선(psoriasis), 심마진(urticaria), 피부근염(dermatomyositis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceus), 수포성 유사 천포창(bullous pemphigoid), 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis) 또는 두링씨 질환(Duhring's disease), 경화성 태선(lichen sclerosis)으로부터 선택된 질환임); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature)(여기에서 맥관 자가면역 질환은 혈관병증(vasculit ides), 바람직하게는, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관병증(vascul itis), 혈관누수증(vascular leakage), 류마티스성 다발근육통(polymyalgiarheum atica), 동맥경화증(atherosclerosis), 척－스트라우스 증후군 (Churg-Strauss sy ndrome), 따까야 수동맥염 (Takayasu arteritis), 굿패스쳐증후군(Goodpasture sy ndrome), 바람직하게는 대부분 신장에 영향을 미치는 질환, 보다 구체적으로는, 사구체(glomeruli), 및/또는 또한 대부분 폐에 영향을 미치는 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa), 베체트씨 병(Behset's disease)으로부터 선택된 질환임); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system)(여기에서 상기 신경계 자가면역 질환은 바람직하게는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 신경성 인지 기능장애(neurocognitive dysfunction), 강직인간 증후군 (stiff-man syndrome), 길란-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 램버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome)으로부터 선택된 질환임); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases)(여기에서 상기 근육성 골격 자가면역 질환은 강직성 척추염(ankylosing spodylitis), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스성 다발성근육통 (polymyalgia rheumatica), 다발성근염 (polymyositis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 열 (rheumatic fever), 다발연골염(polychondritis), 섬유근육통 (fibromyalgia), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 라임병 (Lyme disease), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 척추 관절병증 (spondyloarthropathy), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease)으로부터 선택된 질환임); 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)(여기에서 상기 기타 면역 질환은 바람직하게는 코간 증후군 (Cogan syndrome), 자가면역 부신염 (autoimmune adrenalitis), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 국소성 염증 (local inflammations), 원형 탈모증 (alopecia areata), 급성염증 질환 (acute inflammatory diseases), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 미만선 경피증(diffuse scleroderma), 크레스트 증훈군(CREST syndrome) 및/또는 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma)과 같은 경피증, 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroiditis), 그레이브씨 질환(Graves disease), 자가면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 특발성 폐 섬유증(idiopatic pulmonar fibrosis), 자가면역성 불임증 (autoimmune infertility), 면역성 복합 장애(immune complex disordes) 및 복막염 (peritonitis)으로부터 선택된 질환임); 및 이식 기관의 이식 거부증(transplant rejection of a transplanted organ)(여기에서 상기 조직은 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬(islets of Langerhans), 골수, 혈관, 췌장으로부터 선택된 조직임); 및/또는 골수 이식후 이식편대숙주반응 (Graft-versus-Host-Disease)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 상기 약제는 백혈구 이주를 저해하기 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 13차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬, 골수, 혈관, 췌장과 같은 이식 기관의 이식 거부증을 예방 및/또는 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 13차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases)(여기에서, 상기 전신성 자가면역 질환은 바람직하게는, 알러지(allergy), 온난(warm) 및 저온(cold) 자가면역 용혈성 빈혈증(autoimmune hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증상(systemic inflammatory response syndrome), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), I형 당뇨병 (diabetes type I), 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 다발연골염 (polychondritis), 다분비선 자가면역 증후군(polyglandular autoimmune syn drome), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)및 그 증상(manif estations), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 임파계(lymphatic system) 혈관 또는 기타 기관에서의 류마티스 질환(rheumatic disease) 로부터 선택된 질환임); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract) (여기에서, 상기 위장관 자가면역 질환은 바람직하게는, 크론씨 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 셀리악병(celiac disease), 글루텐 불내성(gluten intolerance), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 췌장염(pancrea titis), 호산성 식도염(eosinophilic esophagitis)으로부터 선택된 질환임); 피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin)(여기에서 상기 피부 자가면역 질환은 바람직하게는, 건선(psoriasis), 심마진(urticaria), 피부근염(dermatomy ositis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceus), 수포성 유사 천포창(bullous pemphigoid), 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis) 또는 두링씨 질환(Duhring's disease), 경화성 태선(lichen sclerosis)으로부터 선택된 질환임); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature)(여기에서 맥관 자가면역 질환은 혈관병증(vasculitides), 바람직하게는, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관병증(vasculitis), 혈관누수증(vascular leakage), 류마티스성 다발근육통(polymyalgia rheumatica), 동맥경화증(atherosclerosis), 척－스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 따까야 수동맥염 (Takayasu arteritis), 굿패스쳐증후군(Goodpasture syndrome), 바람직하게는 대부분 신장에 영향을 미치는 질환, 보다 구체적으로는, 사구체(glomeruli), 및/또는 또한 대부분 폐에 영향을 미치는 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa), 베체트씨 병(Behset's disease)으로부터 선택된 질환임); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system)(여기에서 상기 신경계 자가면역 질환은 바람직하게는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 신경성 인지 기능장애(neurocognitive dysfun ction), 강직인간 증후군 (stiff-man syndrome), 길란-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 램버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome)으로부터 선택된 질환임); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases)(여기에서 상기 근육성 골격 자가면역 질환은 강직성 척추염(ankylosing spodylitis), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스성 다발성근육통 (polymyalgia rheumatica), 다발성근염 (polymyositis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 열 (rheumatic fever), 다발연골염(polychondritis), 섬유근육통 (fibromyalgia), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 라임병 (Lyme disease), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 척추 관절병증 (spondyloarthropathy), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease)으로부터 선택된 질환임); 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)(여기에서 상기 기타 면역 질환은 바람직하게는 코간 증후군 (Cogan syndrome), 자가면역 부신염 (autoimmune adrenalitis), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 국소성 염증 (local inflammations), 원형 탈모증 (alopecia areata), 급성염증 질환 (acute inflammatory diseases), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 미만선 경피증(diffuse scleroderma), 크레스트 증훈군(CREST syndrome) 및/또는 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma)과 같은 경피증, 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroiditis), 그레이브씨 질환(Graves disease), 자가면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 특발성 폐 섬유증(idiopatic pulmonar fibrosis), 자가면역성 불임증 (autoimmune infertility), 면역성 복합 장애(immune complex disordes) 및 복막염 (peritonitis)으로부터 선택된 질환임)에서 발생 되거나 수반되는 염증의 치료 및/또는 예방에 사용되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 13차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 피부 및/또는 기도 점막의 알러지 반응(allergic reactions), 바람직하게는, 건초열(hay fever), 천식 (asthma), 기도 과-반응증(airway hyper-responsiveness) 및/또는 피부염(dermatitis)을 예방 및/또는 치료하기 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 또한 세 번째 측면의 제 16차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 피부염(dermatitis)은 접촉성피부염(contact dermatitis) 및/또는 아토피성 피부염(atopic dermatitis)인 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 네 번째 측면으로서, a) 객체에게 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 객체의 말초 혈관으로 동원하기에 효과적인 양의 본 발명의 첫 번째 측면 및 이의 임의의 구현예에 따른 핵산을 상기 객체에 투여하는 제 1 단계; b) 상기 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 상기 객체로부터 수확하는 제 2단계를 포함하는 제 1차 객체로부터 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 수득하기 위한 방법에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 전구 세포 및/또는 줄기 세포의 수확은 성분채집술 (apheresis), 백혈구 성분채집술 (leukapheresis), 세포분리법(cell sorting) 및/또는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 수행되는 것이다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 또한 네 번째 측면의 하나의 구현예 및 상기 네 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 제 1차 객체 또는 제 2차 객체는 연속적으로 또는 동시적으로 화학요법 및/또는 방사선요법을 수행되는 것이다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 또한 네 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 제 1차 객체 또는 제 2차 객체의 화학요법 및/또는 방사선요법 후에 상기 제 1차 객체 또는 제 2차 객체로부터 수확된 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 상기 제 1차 객체 또는 제 2차 객체의 말초 혈관에 투여하는 것이다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 또한 네 번째 측면의 하나의 구현예 및 상기 네 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 수확된 전구 세포 및/또는 줄기 세포는 증식되고(expanded) 상기 증식된 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 상기 제 1차 객체 또는 제 2차 객체에 투여하는 것이다(여기에서 바람직하게는 상기 증식된 전구 세포 및/또는 줄기 세포는 정맥주사법 (intraveneous) 또는 국소 주사법(local injection)으로 투여되는 것이다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 또한 네 번째 측면의 하나의 구현예 및 상기 네 번째 측면의 제 1차 내지 제 4차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 방법(method)는 암(cancer), 바람직하게는 고형 암(solid tumours) 및 혈액종양 (hematological malignancies)의 치료를 위해 사용되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 다섯 번째 측면으로서, 상기 첫 번째 측면 및 이의 임의의 구현예들에 따른 방법상에 사용하기 위한 첫 번째 측면 및 이의 임의의 구현예들에 따른 핵산 분자에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 여섯 번째 측면으로서, a) 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포를 객체의 말초혈관에 동원하기에 효과적인 양의 상기 첫 번째 측면 및 이의 임의의 구현예들에 따른 핵산 분자를 객체에 투여하는 제 1단계; b) 상기 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포를 상기 객체로부터 수확하는 제 2단계를 포함하는(여기에서 바람직하게는 고갈되거나(depleted) 또는 수확된(harvested) T 세포는 기억성 T 세포임) 단계를 포함하는, 객체로부터 상기 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포를 고갈시키는 방법에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma cells), B 세포(cells) 및/또는 T 세포의 수확은 성분채집술 (apheresis), 백혈구 성분채집술 (leukapheresis), 세포분리법(cell sorting) 및/또는 유세포 분석법(flow cytometry), 바람직하게는 상기 세포에 적합한 표면 마커(surface marker)를 갖는 유세포 분석법으로 수행되는 것이다.
상기 네 번째 측면의 하나의 구현예 및 네 번째 측면의 제 1차 내지 제 5차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 6차 구현예; 및 또한 상기 여섯 번째 측면의 하나의 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 2차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 방법(methods)은 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases)(여기에서, 상기 전신성 자가면역 질환은 바람직하게는, 알러지(allergy), 온난(warm) 및 저온(cold) 자가면역 용혈성 빈혈증(autoimmune hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증상(systemic inflammatory response syndrome), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), I형 당뇨병 (diabetes type I), 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 다발연골염(polychondritis), 다분비선 자가면역 증후군(polyglandular autoimmune syndrome), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)및 그 증상(manifestations), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 임파계(lymphatic system) 혈관 또는 기타 기관에서의 류마티스 질환(rheumatic disease)로부터 선택된 질환임); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract) (여기에서, 상기 위장관 자가면역 질환은 바람직하게는, 크론씨 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 셀리악병(celiac disease), 글루텐 불내성(gluten intolerance), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 췌장염(pancreatitis), 호산성 식도염(eosinophilic esophagitis)으로부터 선택된 질환임); 피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin)(여기에서 상기 피부 자가면역 질환은 바람직하게는, 건선(psoriasis), 심마진(urticaria), 피부근염(dermatomyositis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceus), 수포성 유사 천포창(bullous pemphigoid), 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis) 또는 두링씨 질환(Duhring's disease), 경화성 태선(lichen sclerosis)으로부터 선택된 질환임); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature)(여기에서 맥관 자가면역 질환은 혈관병증(vasculitides), 바람직하게는, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관병증(vasculitis), 혈관누수증(vascular leakage), 류마티스성 다발근육통(polymyalgia rheumatica), 동맥경화증(atherosclerosis), 척－스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 따까야 수동맥염 (Takayasu arteritis), 굿패스쳐증후군(Goodpasture syndrome), 바람직하게는 대부분 신장에 영향을 미치는 질환, 보다 구체적으로는, 사구체(glomeruli), 및/또는 또한 대부분 폐에 영향을 미치는 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa), 베체트씨 병(Behset's disease)으로부터 선택된 질환임); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system)(여기에서 상기 신경계 자가면역 질환은 바람직하게는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 신경성 인지 기능장애(neurocognitive dysfunction), 강직인간 증후군 (stiff-man syndrome), 길란-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 램버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome)으로부터 선택된 질환임); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases)(여기에서 상기 근육성 골격 자가면역 질환은 강직성 척추염(ankylosing spodylitis), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스성 다발성근육통 (polymyalgia rheumatica), 다발성근염 (polymyositis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 열 (rheumatic fever), 다발연골염(polychondritis), 섬유근육통 (fibromyalgia), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 라임병 (Lyme disease), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 척추 관절병증 (spondyloarthropathy), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease)으로부터 선택된 질환임); 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)(여기에서 상기 기타 면역 질환은 바람직하게는 코간 증후군 (Cogan syndrome), 자가면역 부신염 (autoimmune adrenalitis), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 국소성 염증 (local inflammations), 원형 탈모증 (alopecia areata), 급성염증 질환 (acute inflammatory diseases), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 미만선 경피증(diffuse scleroderma), 크레스트 증훈군(CREST syndrome) 및/또는 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma)과 같은 경피증, 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroiditis), 그레이브씨 질환(Graves disease), 자가면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 특발성 폐 섬유증(idiopatic pulmonar fibrosis), 자가면역성 불임증 (autoimmune infertility), 면역성 복합 장애(immune complex disordes) 및 복막염 (peritonitis)으로부터 선택된 질환임); 및 이식 기관의 이식 거부증(transplant rejection of a transplanted organ)(여기에서 상기 조직은 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬(islets of Langerhans), 골수, 혈관, 췌장으로부터 선택된 조직임); 및/또는 골수 이식후 이식편대숙주반응 (Graft-versus-Host-Disease)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 일곱 번째 측면으로서, 상기 여섯 번째 측면 및 이의 임의의 구현예들에 따른 방법상에 사용하기 위한 상기 첫번째 측면 및 이의 임의의 구현예들에 따른 핵산 분자에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 여덟 번째 측면으로서, 약제를 제조하기 위한 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 정의된 핵산의 용도(use)(여기에서 상기 약제는 신병증(nephropathy), 바람직하게는 당뇨병성 신병증의 치료 및/또는 예방을 위한 것임)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 아홉 번째 측면으로서, 약제를 제조하기 위한 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 정의된 핵산의 용도(use)(여기에서 상기 약제는 고혈압(hypertension), 바람직하게는 폐 고혈압 (pulmonary hypertension)의 치료 및/또는 예방을 위한 것임)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열 번째 측면으로서, 약제를 제조하기 위한 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 정의된 핵산의 용도(use)(여기에서 상기 약제는 섬유화증(fibrosis), 바람직하게는 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis)의 치료 및/또는 예방을 위한 것임)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 열 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 약제는 상처 치유 과정(wound healing process) 내에서의 섬유화증(fibrosis)의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열한 번째 측면으로서, 약제를 제조하기 위한 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 정의된 핵산의 용도(use)(여기에서 상기 약제는 신생혈관형성증(angiogenesis) 및/또는 신생맥관형성증 (neovascularization)와 관련된 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 것임)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 약제는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 저해제에 의한 조합 치료법(combination therapy)에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 또한 상기 열한 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 저해제에 의한 치료법(therapy)에 미약하게 반응하는 객체에 사용되는 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 약제는 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 저해제에 의한 치료법(therapy)에 반응하지 않는 객체에 사용되는 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 질병 및/또는 장애는 맥락막 신생맥관형성증 (choroidal neovascularization)과 관련되고/되거나 수반하는 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 또한 상기 열한 번째 측면 및 상기 열한 번째 측면의 제 1차 내지 제 4차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 질환 및/또는 장애는 망막질환들(retinal diseases), 바람직하게는, 노인성황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 망막정맥 폐쇄 (retinal vein occlusion), 황반부종 (macular edema) 및 망막부종 (retinal edema)을 포함하는 군으로부터 선택된 망막질환으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 열한 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 또한 상기 열한 번째 측면 및 상기 열한 번째 측면의 제 1차 내지 제 3차 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 상기 질환은 암(cancer), 바람직하게는, 고형암(solid tumours) 및 전이물 (metastases)로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 18차 구현예로서, 상기 약제는 객체에서의 전구세포 및/또는 줄기 세포를 고갈시키는, 바람직하게는 말초혈관에서 고갈시키는 치료 처방 계획(treatment regimen)을 수행하거나 또는 수행예정인 객체에게 투여되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 19차 구현예로서, 또한 상기 세 번째 측면 및 상기 세 번째 측면의 제 18차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 화학요법 및/또는 방사선요법을 수행하거나 또는 수행예정인 객체에 투여되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 20차 구현예로서, 상기 약제는 객체에서 면역 시스템(immune system)의 회복(restoration) 또는 개선(improvement)을 위한 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열두 번째 측면으로서, 약제를 제조하기 위한 SDF-1 및 SDF-1 수용체간의 신호전달(signalling)을 저해하는 분자(molecule)에 의해 해결되는 것이다(여기에서 상기 약제는 신병증(nephropathy), 바람직하게는 당뇨병성 신병증의 치료 및/또는 예방을 위한 것임).
본 발명의 열두 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 분자(molecule)는 SDF-1 결합 분자(binding molecule) 및 SDF-1 수용체 결합 분자(receptor binding molecule)이고 목표-결합 핵산 유사 압타머(target-binding nucleic acids like aptamers) 및 스피에겔머(Spiegelmers), 항체 및 저분자 물질(small molecules)을 포함하는 것이다.
본 발명의 열두 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 또한 상기 열두 번째 측면 및 상기 열두 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 분자는 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예에 정의된 바와 같은 핵산 분자(nucleic acid molecule)인 것이다.
본 발명의 열두 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 분자는 SDF-1 또는 SDF-1 수용체의 발현을 저해하는 분자이고 siRNA 분자(molecules), 리보자임(ribozymes), 안티센스 분자 (antisense molecules) 및 전사 인자의 저해제 (inhibitors of transcription factors)를 포함하는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열세 번째 측면으로서, 백혈구의 이주를 저해하는 방법에 사용하기 위한, 상기 첫 번째 측면의 제 5차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나에 따른 핵산 분자(molecule)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열네 번째 측면으로서, 골수 유래 줄기 세포의 동원에 사용, 또는 약제, 바람직하게는, 골수 유래 줄기 세포의 동원을 위한 약제의 제조를 위한 사용을 위하여 혈액-뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과하지 않는 SDF-1 결합 분자(binding molecule)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 열네 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 상기 약제는 중추신경계(central nervous system) 손상의 개선 및/또는 뇌졸중(stroke) 이후의 조직 재생(tissue repair)의 촉진을 위해 사용되는 것이다.
본 발명의 열네 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 또한 상기 열네 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예로서, 상기 SDF-1 결합 분자는 압타머(aptamers), 스피에겔머(Spiegelmers), 항체 (antibodies) 및 저분자 물질 ( small molecules)을 포함하는 군으로부터 선택된 목표-결합 핵산(target-binding nucleic acids)을 포함하는 것이다.
본 발명의 열네 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 또한 상기 열네 번째 측면 및 상기 열네 번째 측면의 제 1차 내지 제 2차 구현예 중의 어느 하나의 구현예로서, 상기 분자는 상기 첫 번째 측면의 제 9차 내지 제 57차 구현예 중 어느 한 구현예에 정의된 핵산 분자(nucleic acid molecule)인 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열다섯 번째 측면으로서, 전술한 청구항 중 임의의 항에 정의된 바와 같은 질환의 치료에 사용하기 위한, 상기 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 57차 구현예 중 어느 하나에 따른 핵산 분자 (nucleic acid molecule)에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 근본적인 해결과제는 열여섯 번째 측면으로서, 약제의 제조를 위한, 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예들에 정의된 바와 같은 핵산의 용도 (use)에 의해 해결되는 것이다 (여기에서 상기 약제는 WHIM 증후군의 치료 및/또는 예방을 위한 것임).
본 발명의 근본적인 해결과제는 열일곱 번째 측면으로서, 약제의 제조를 위한, 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예들에 정의된 바와 같은 핵산의 용도 (use)에 의해 해결되는 것이다 (여기에서 상기 약제는 암의 성장 및 전이물, 및 신생종 (neoplasia)의 성장의 치료 및/또는 예방을 위한 것임).
본 발명의 근본적인 해결과제는 열여덟 번째 측면으로서, 약제의 제조를 위한, 상기 첫 번째 측면의 제 10차 내지 제 57차 구현예들에 정의된 바와 같은 핵산의 용도 (use)에 의해 해결되는 것이다 (여기에서 상기 약제는 화학요법, 바람직하게는 암치료를 위한 화학요법을 수행 전에 객체에 투여하는 것임).
어떠한 이론에도 얽매이지 않고자하는 바램으로서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자들이 SDF-1의 SDF-1 수용체와의 결합을 저해하여, 세포의 이주, 바람직하게는, 말초혈관으로부터 하나 이상의 조직(들) 및 조직으로부터 말초혈관으로의 세포 이주에 직접 또는 간접으로 영향을 미치는 것으로 판단된다.
그러나, 어떠한 이론에도 얽매이지 않고자하는 바램으로서, 본 발명자들은 또한 SDF-1의 SDF-1 수용체와의 결합을 저해하는 본 발명에 따른 상기 핵산 분자들이, 전구세포, 줄기 세포, 암세포, 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포의 이주, 바람직하게는, SDF-1 및 SDF-1 수용체간의 상호작용을 저해하기 위하여 조직으로부터 말초혈관으로의 동원에 의하여 이주를 초래하는 것으로 판단된다.
게다가 또 한번, 어떠한 이론에도 얽매이지 않고자 하는 바램으로서, 본 발명자들은 또한 SDF-1의 SDF-1 수용체와의 결합을 저해하는 본 발명에 따른 상기 핵산 분자들이 T-임파구(lymphocytes), B-임파구, 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils), 호염기구(basophi ls) 와 같은 백혈구 및 또는 수지상세포(dendritic) 및 비만세포(mast cells), 바람직하게는, 조직 유사 피부(tissues like skin) 또는 점막(mucosa) 상에서의 이주를 방지하고 바람직하게는, 상기 피부 및 점막의 자가면역 질환 및 알러지 질환을 경감시키는 데 도움을 주는 것으로 판단된다.
게다가 또 한번, 어떠한 이론에도 얽매이지 않고자 하는 바램으로서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 SDF-1 저해제 유사 핵산의 용도가 신병증(nephropathy), 바람직하게는 당뇨병성 신병증; 고혈압, 바람직하게는 폐 고혈압; 섬유화증, 바람직하게는, 폐섬유화증 (pulmonary fibrosis)의 치료, 및 신생맥관형성증 (neovascularization), 바람직하게는, 맥락막 혈관형성증 (choroidal nevascularization)과 관련된 질환 및/또는 장애의 치료에 사용가능한 것임을 입증할 수 있었다.
본 발명에 다른 상기 핵산분자 또는 조성물, 바람직하게는, 상기 핵산을 함유한 약학 조성물을 이용하여 치료 또는 예방될 수 있는 다양한 질환(diseases), 상태(conditions) 및 장애(disorders)에 있어서, 상기 질환(diseases), 상태(conditions) 및 장애(disorders)는 본원에 개시된, 특히, 본원의 서론 부분에 개시 및 설시된 내용을 포함하는 것으로 인식되어야 할 것이다. 지금까지. 개개의 경로는 상기 개개 질환(diseases), 상태(conditions) 및 장애(disorders)를 위한 예방 및 치료를 위하여 상기 핵산의 적합성을 교시하는 본 개시내용의 불가분의 일체를 형성한다.
NOX-A12-JE40와 같은 SDF-1 결합 핵산 분자의 정맥 내 투여 후에, 세포가 혈관에 투입되고 상기 SDF-1 결합 핵산 분자인 NOX-A12-JE40의 효과가 세포 계수법 (hemocytometer)를 이용하여 전혈 검사법(whole blood cell count)을 수행한 후에 나타났다 (실시예 10 참조). 조혈성 줄기세포/조혈성 전구세포가 동원된 백혈구의 소분획으로만 표시되나, 혈관으로 분비되는 기타 세포 형들이 있다. 이 중에서 이에 제한되지는 않으나, 조직-예정 줄기세포/전구세포(tissue-commited stem/pro genitor cells), 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells), 장기-생존 혈장 세포(long-lived plasma), B-세포뿐만 아니라 단핵세포(monocytes) 및 호중구 과립백혈구 (neutrophil granulocytes) 들이 있다.
이러한 상기 결과에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산 분자에 의한 SDF-1의 SDF-1 수용체로의 신호 전달 저해는 세포 이주에의 영향을 초래함을 밝혀 냈다. 바람직하게는 상기 세포는 SDF-1 수용체를 발현하는 것이다.
결론적으로, 바람직하게는, 본원에서 사용된 용어 이주(migration)은 하나의 조직(tissue)으로부터 기타 조직, 조직으로부터 말초 혈관, 및/또는 말초혈관으로부터 조직으로의 이주(migration) 및/또는 이동(movement)을 지칭한다. 세포 이주는 실시예 5에 개시된 바와 같은, TAX-어세이(assay; 시험관내 이주) 및 실시예 10에 개시된 바와 같은 세포 계수법(hemocytometer) 및 FACS 분석법 (생체내 실험)상에서 시험될 수 있다. 추가적으로, 조직의 면역조직화학법(immunehistochemistry)이 수행가능하고, 이후 상기 이주된 세포들은 세포-특이적 마커(cell-specfic surface markers)에 대한 항체로 탐지가능하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 “SDF-1 수용체(receptor)”는 복수 또는 단수적으로 사용되는가 여부와 상관없이, SDF-1 결합물(binds)와 결합하는 임의의 수용체(receptor)를 지칭한다. 현재, 본 발명의 바람직한 SDF-1 결합 수용체(SDF-1 binding receptors)인 CXCR 4 (Godessart 2005) 및 CXCR7 (Burns, Summers, et al. 2006)로 알려진 2개의 수용체가 존재하는 것으로 알려져 있다.
혈관 세포 발달( Blood cell development ). 혈관 세포의 발달 및 성숙은 복잡한 과정이다. 성숙한 혈관 세포는 또한 전구 세포(progenitor cells)라고 지칭되는 조혈성 전구세포(hematopoietic precursor cells) 및 골수를 포함하는 특이적 조혈성 조직에 존재하는 줄기 세포(stem cells)로부터 유래 된다. 이러한 환경 내에서, 조혈세포 (hematopoietic cells)는 순환에 진입 전에 증식 및 분화한다. 케모카인 수용체(chemokine receptor) CXCR4 및 이의 천연 리간드(ligand)인 SDF-1은 이 과정에 중요한 것으로 사료된다 (Maekawa and Ishii 2000; Nagasawa 2000). 이는 CXCR4 또는 SDF-1 녹-아웃(knock-out) 마우스가 조혈 결함(hematopoietic defects)을 나타낸다는 보고로 입증되었다 (Ma, Jones et al. 1998; Tachibana, Hirota et al. 1998; Zou, Kottmann et al. 1998). 또한 CD34+ 전구세포는 CXCR4을 발현하며 화학주성(chemoattraction) 및 착상(engraftment)을 위하여 골수 기질세포(bone marrow stromal)에 의해 생성되는 SDF-1을 필요로 함이 알려져 있고 (Peled, Petit et al. 1999) 시험관내 시험(in vitro)에서, SDF-1가 CD34+ 세포 (Aiuti, Webb et al. 1997; Viardot, Kronenwett et al. 1998) 및 전구/줄기 세포(Jo, Rafii et al. 2000)에 화학적 주성을 갖는 것도 알려져 있다. 또한, SDF-1는 CXCR4 수용체를 통해 T-임파구 및 단핵세포를 포함하는 몇몇의 기타 다수의 예정된 전구 세포 및 성숙된 혈관 세포(Bleul, Fuhlbrigge et al. 1996), 프로(pro)- 및 프리(pre)-B 임파구(lymphocytes) (Fedyk, Ryyan et al. 1999) 및 거대핵세포(megakaryocytes) (Riviere, Subra et al. 1999; Abi-Younes, Sauty et al. 2000; Hodohara, Fujii et al. 2000; Majka, Janowska-Wieczorek et al. 2000; Gear, Suttitanamongkol et al. 2001)를 위한 신호전달을 하는 중요한 화학주성(chemoattractant)을 갖는 것이다. 다양한 세포 형(cell types) 및 SDF-1의 관련성 및 SDF-1 수용체와의 이러한 상관관계로 기인하여, 상기 다양한 세포 형들(cell types)은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자들에 의해 실제로 지정될 수 있다.
따라서, 요약하면, SDF-1은 세포가 줄기세포, 즉, 특정 자극에 대응하여 특정한 형태의 집락(colonies)의 형성으로 귀결되는 CD34+, 및/또는 전구세포들인 CD34+ 또는 CD34- 또는 다소 보다 분화된 세포일 수 있나 여부에 따라 SDF-1 수용체, 바람직하게는 CXCR4 수용체를 함유한 세포의 위치선정 및 분화를 조절할 수 있는 것으로 밝혀 졌다.
최근에, 자가(autologous) 및 동종 (allograft) 모세포이식을 위해 사용된 말초 혈관 전구 세포의 풀(pool)에서 동원된 CD34+ 세포수에 대하여 상당한 관심이 집중되어 오고 있다. CD34+ 개수는 화학요법이후 조속한 회복 기간에 주요 책임을 갖는 것으로 생각되는 구성요소이고 상기 세포는 장기간 착상(engraftment) 및 조혈작용 (hematopoiesis)의 회복에 가장 책임이 있는 것으로 보인다 (Croop, Cooper et al. 2000). CD34+ 세포 재-착상 (re-engraft)의 기전은 CXCR4 발현 세포에 대한 SDF-1의 화학 주성 효과에 기인 할 수 있다(Ponomaryov, Peled et al. 2000; Voermans, Kooi et al. 2001). 좀더 최근에, 성인 조혈 줄기 세포는 마우스의 손상된 심근조직을 회복시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Jackson, Majka et al. 2001; Kocher, Schuster et al. 2001).
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어 “전구세포(progenitor cells)“ 는 특정한 자극에 대하여 분화된 조혈성(hematopoietic) 또는 골수성세포(myeloid cells)를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다. 전구세포의 존재는 상기 세포의 시료중 예를 들어, CFU-GM (집락-형성 단위 과립구-대식세포(colony-forming units granulocyte-macrophage)을 의미함); CFU-GEMM (집락-형성 단위(colony-forming units)을 의미, 다능성(multipotential)); BFU-E (파열-형성 단위(burst-forming units), 적혈구계(erythroid)); HPP-CFC (고 증식성 강력 집락-형성 세포(high proliferative potential colony-forming cells)을 의미); 또는 공지 프로토콜(protocols)을 사용하여 수득가능한 기타 가능한 형태의 분화된 집락(colonies)을 포함하는 다양한 형태의 집락-형성 단위(colony-forming units)를 형성할 수 있는 능력에 의하여 분석될 수 있다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어 줄기 세포(stem cells)는 전구세포(progenitor cells)의 덜 분화된 형태이다. 전형적으로, 상기 세포들은 CD34에 대하여 종종 양성(positive)이다. 몇몇 줄기 세포들은 이러한 마커들을 포함하지 않으나 CD34+ 세포들은 형광 활성화 세포 분류법(약어 FACS)으로 동정 가능하여 이들의 존재는 이 기법을 사용하여 시료 내에서 동정가능하다.
일반적으로, CD34+ 세포들은 혈중에 낮은 수준으로 존재하나 골수에는 다수가 존재한다. 내피세포(endothelial cells) 및 비만세포(mast cells)와 같은 기타 형태의 세포들이 또한 이 마커를 나타낼 수 있으나, CD34는 줄기 세포 존재의 표식으로 간주 된다.
어떠한 이론에도 얽매이지 않고자 하는 바램으로서, 본 발명자들은 줄기세포 및/또는 전구세포 이외에 암세포, 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T-세포가 본 발명에 따른 핵산으로 SDF-1 및 이의 SDF-1 수용체 간에 신호전달에 저해 효과에 의하여 영향을 받는 것으로 확인되었다. B-세포 및 T-세포는 바람직하게는 기억성 (memory) B 및 기억성(memory) T-세포이다. SDF-1 및 이의 SDF-1 수용체 간에 신호전달 저해는 말초혈관으로의 동원(mobilization)을 포함하는 이주(migration)를 초래한다.
줄기세포, 전구세포, 암세포, 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T-세포의 동원은 바람직하게는 조혈 조직(hematopoietic tissues)에서 발생하며, 여기에서 상기 조혈 조직은 골수조직(myeloid tissue) 및 림프 조직(lymphoid tissue)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 골수조직은 골수에 소재한다. 림프 조직은 소화기 관 및 기도 관, 림프 절(lymph nodes), 비장 및/또는 흉선( thymus)의 점막에 존재한다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어 암세포는 신생성 세포(neoplastic cells)이고 바람직하게는 백혈병세포(leukemic cells), 골수종 세포(myleoma cells), 임파종 세포(lymphoma cells), 암 줄기 세포(cancer stem cells), 전이 잠재성을 갖는 암세포(cancer cells) 및 암 전이물 (cancer metastases)로부터 선택되는 것이다. 전형적으로 상기 신생성 세포는 공통적으로 유전적(genetic) 또는 후생학적(epigenetic) 비정상, 및 클론형성증 (clonality)의 징표를 갖는다. 예를 들어 임파종 (lymphoma) 및 백혈병 (leukemia)과 같은 몇 종의 신생물 형태에 있어서, 클론형성증(clonality)은 현재 신생적(neoplastic)이라는 세포적 증식 (cellular proliferation)을 확인할 입증이 필요한 (충분하지는 않으나) 것으로 간주 되었다.
말기적으로 분화된 B-세포 (혈장 세포)에 의하여 생산되는 활성 항체를 갖는 급성 면역 반응(acute immune response) 후에, 이러한 세포들의 대부분은 질병의 해결 및/또는 외부 항원(예를 들어 바이러스 단백질)의 제거와 함께 죽는다. 그러나 T-세포의 도움으로 혈장블라스트(plasmablasts)로 전환될 수 있는 소수의 기억성 B 세포가 있다. 이러한 혈장블라스트는 수년동안 장기-생존 “기억성(memory)" 혈장 세포로서 화학 주성 자극에 대하여 생존하는 적소(niche)로 이주시킬 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 적소는 골수 및 예를 들어 염증화 조직과 같은 주변부 모두가 될 수 있다. 이러한 장기-생존 혈장 세포는 감염 또는 접종 수년 후에도 가끔 유지하는 보호성 항체 혈장 역가(protective antibody plasma titers)의 유지를 담당하는 것 같다 (Tarlinton et al, 2008).
전구 세포 및/또는 줄기세포의 동원은 바람직하게는 조혈 조직 (hematopoietic tissues)에서 발생하며, 여기에서 상기 조혈 조직은 골수조직(myeloid tissue) 및 림프 조직(lymphoid tissue)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 골수조직은 골수에 소재한다. 림프 조직은 소화기 관 및 기도 관, 림프 절(lymph nodes), 비장, 흉선(thymus) 및/또는 염증성 조직의 리포이드성 모낭(lyphoid follicles)의 점막에 존재한다. 바람직하게는, 이전에 개시된 바와 같은 상기 세포의 동원은 이전에 개시된 바와 같은 상기 세포의 말초 혈관으로의 이주(migration)를 포함한다.
상기한 바와 같이, SDF-1은 성숙 및 전구 비만세포에 대하여, 특히, 예를 들어, 비만 세포 표면상에 Fc-엡실론(epsilon) 수용체(receptor)로의 결합을 통한 IgE 신호전달에 의하여 성숙된 비만세포로부터 히스타민이 분비시에, 화학 주성 시약(chemotactic agent)으로 작용하는 것으로 밝혀 졌다 (Godot, Arock et al. 2007). 고초열, 천식, 피부염, 특히 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염과 같은 기도상의 피부 및 점막의 알러지성 반응과 유사한 질환은 종종 백혈구의 작용된 조직으로의 축적 및 조직에서의 축적과 관련된다. SDF-1의 발현이 활액 생검시험 및 척추관절증(spondyloarthropathy), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatric arthritis), 퇴행성 관절염(degenerative joint disease; 골관절염) 등과 같은 관절성 염증으로 질환을 앓은 객체에서 또한 RT-PCR에 의하여 발견된다. 따라서 본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산에 의한 SDF-1의 간섭은 관절성 염증으로 질환을 앓은 환자에게 긍정적인 효과를 나타낼 수도 있다.
SDF-1 및 SDF-1 수용체간의 상술한 관련성의 의미 및 견지에 의하여, 상기 SDF-1 결합 및 본 발명에 따른 핵산 분자를 저해하는 SDF-1 및 SDF-1 수용체간의 상호 작용은 상기 질환을 경감시키는 데 도움이 될 수 있고, 여기에서 본 발명에 따른 핵산 분자에 다른 SDF-1의 저해는 백혈구 이주의 감소 및/또는 저해를 초래하고 여기에서 상기 백혈구는 바람직하게는 T-임파구(lymphocytes), B-임파구(lymphocytes), 단핵세포(monocytes), 대식세포(macrophages), 거대세포(mega karyocytes), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils), 호염기구(basophils), 수지상 세포(dendritic cells) 및/또는 비만 세포(mast cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
백혈구의 이주는 조직상에 축적을 초래하고, 여기에서 바람직하게는, 상기 백혈구의 축적은 상기 조직에서의 염증을 초래하고, 여기에서 상기 조직은 피부 및/또는 점막, 바람직하게는, 기도상의 점막, 및 이에 제한되지는 않으나, 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈 및/또는 임파계로부터 선택된 몇몇 기관을 포함한다.
SDF-1에 대한 길항제는 바람직하게는, 하기 실시예들에 개시된 바와 같은 세포-기반 어세이법(cell-based assay) 또는 생체 내 시험 모델 (in vivo model)에서 SDF-1에 결합하고 SDF-1 기능을 저해하는 분자이다.
게다가, 본 발명은 SDF-1에 특이적으로 결합하고 고친화성(high affinity)을 갖는 핵산을 생산가능하다는 놀라운 발견에 기반으로 하였다. 이러한 핵산(nucleic acids)은 바람직하게는, 본원에서 또한 본 발명에 따른 핵산 분자(nucleic acid molecules according to the present invention), 본 발명에 따른 핵산(the nucleic acids according to the present invention) 또는 발명적 핵산(the inventive nucleic acids) 또는 발명적 핵산 분자(inventive nucleic acid molecules)로 지칭되는 것이다.
SDF-1은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 기본 펩티드(basic peptide)이다. SDF-1의 pI 계산치는 9.70이다. 본원에서 사용되는 용어 “SDF-1”은 이에 제한되지는 않으나, 포유동물(mammalian) SDF-1을 포함하는, 임의의 SDF-1을 의미한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 SDF-1은 마우스(mouse), 랫트(rat), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 원숭이(monkey) 및 인간(human) SDF-1을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 SDF-1은 인간 SDF-1(서열번호 1)인 것이다.
SDF-1에 대한 높은 친화성으로 결합하는 핵산을 동정할 수 있다는 발견은 압타머(aptamers), 즉, 기본 단백질에 배향하는 목표 분자에 결합하는 D-핵산(nucleic acid)은, 이러한 종류의 목표가 그 비가 높으나 비-특이적인 신호-대 잡음 비(signal-to-noise ratio)를 발생한다는 점에서 일반적으로 그 생성이 매우 어렵다는 점을 보고한 이튼 등의 보고(Easton, Gold et al. 1997)를 감안하면 놀라운 발견이다. 이 높은 신호-대-잡음 비는 SDF-1과 같은 기본 목표들을 위한 핵산에 의해 나타내는 높은 비-특이적 친화성(high non-specific affinity)에 기인한다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 의한 핵산의 특징은 상기 핵산이 단독 또는 임의의 조합으로 사용되는 본 발명의 어떠한 측면으로 실현될 수 있다.
어떠한 이론에도 얽매이지 않고자 하는 바램으로서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산과 결합하는 SDF-1의 관찰된 특이성은 어느 정도의 구조적 특성, 특히 도 1 내지 도 8 및 실시예 1에서 참고로 설명되는 바와 같은, 하기에 상술될 “핵심 서열(core sequence)”이라고 본원에서 지칭되는 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나에서 기인될 것이라고 가정하였다. 그러나, 상기 도면들 내지 실시예 1는 본 발명에 따른 핵산의 개개 또는 모두가 필수적으로 실현화되지는 않은 상기 구조적 특성 일부를 설명한 것으로 이해되어야 할 것이다.
특허청구범위 및 실시예 1에서 보다 상술하는 바와 같이, 다양한 인간 SDF-결합 핵산 분자는 각각 상기 박스 및 몇몇 구조적 특징들 및 요소들에 기초하여 분류될 수 있다. 그러므로 본원에서 정의되는 다양한 분류들은 형(type), 보다 상세하게는, A형(Type A), B형(Type B), 및 C형(Type C)으로 지칭된다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 단일 핵산 분자(single nucleic acid molecule)이다. 보다 구체적인 구현예로서, 상기 단일 핵산 분자는 단일 핵산 분자의 다중(multitude)로 제시된다. 바람직하게는, 상기 용어 핵산(nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)는 반대로 지시되지 않는다면, 본원에서는 상호변환 가능하게 사용된다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는, 서로 상호가 공유적으로, 보다 바람직하게는 포스포디에테르 결합(phosphodiester link) 또는 결합(linkage)을 통해 결합되는 뉴클레오티드로 구성된 것으로 당업계에서 인지되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 핵산들은 또한 본원에 개시된 특정 서열들과 실질적으로 상동성(homologous)을 갖는 핵산들도 포함할 것이다. 본원에서 정의되는 용어 “실질적으로 상동성(substantially homologous)”은 최소한 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 핵산에 존재하는 상동성을 갖는 뉴클레오티드의 실제적인 백분율은 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 개수에 의존할 것이다. 상기 백분율 변형체(percent modification)는 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 개수에 기초한 것일 수 있다.
상기 상동성은 당업자에게 널리 알려진 바와 같이 결정될 수 있다. 보다 상세하게는, 서열 비교 알고리즘(sequence comparison algorithm)은 비교용 서열(reference sequence)과 관련된 시험용 서열(test sequence)에 대한 백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 계산하는 것이다. 상기 시험용 서열은 바람직하게는, 또 다른 핵산 분자에 대하여 상동성인지, 만약 그렇다면, 어느 정도까지 인지 여부를 시험되거나 시험될 서열 또는 핵산 분자이며, 상기 또 다른 핵산 분자는 또한 비교용 서열(reference sequence)이라고도 지칭된다. 하나의 구현예로서, 상기 비교용 서열은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 분자, 보다 바람직하게는 서열번호 5 내지 144 중의 어느 하나에 따른 서열을 갖는 핵산 분자이다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 스미스 및 워터맨 (Smith 및 Waterman, 1981)의 국부적 상동성 알고리즘법(local homology algorithm)에 의해, 니들맨 및 운츠 (Needleman 및 Wunsch, 1970)의 상동성 정렬 알고리즘법(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립맨 (Pearson 및 Lipman, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행법 (computerized implementations)(위스콘 제네틱 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 시각적 조사(visual inspection)에 의해서 수행될 수 있다.
백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 예로서는 기본 국소 정렬 조사 도구 분석법(basic local alignment search tool; 이하 “BLAST"이라 명명함)에 사용되는 알고리즘, 예를 들어, 알쯔슐 등의 문헌(Altschul et al. 1990 및 Altschul et al, 1997)에 개시된 알고리즘이다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for biotechnology Information; 이하 “NCBI”이라 명명함)을 통하여 공중에서 입수 가능하다. NCBI에서 입수가능한 스포트웨어, 예들 들어, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 이용하여 서열 동일성(sequence identity)을 결정하는데 사용되는 디폴트 함수(default parameters)는 맥기니스 등의 문헌(McGinnis et al, 2004)에 개시되어 있다.
본원에 기재된 용어 “발명적 핵산(inventive nucleic acid)” 또는 본 발명에 따른 핵산(nucleic acid according to the present invention)”은 본원에 개시된 핵산 또는 이들의 일부를 포함하는 핵산들, 바람직하게는 상기 핵산 또는 상기 핵산의 일부들이 SDF-1의 결합과 관련되는 정도까지를 또한 포함하는 것이다. 상기 핵산은 예를 들어, 절단(truncation)과 같은 본원에서 개시된 것으로부터 유래될 수 있다. 절단은 본원에서 개시된 상기 핵산의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단과 연관될 수 있다. 또한, 절단은 핵산의 뉴클레오티드 내 서열(inner sequence)과 관련될 수 있다, 즉, 5‘ 및 3’ 말단 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)와 각각 관련될 수 있다. 게다가, 절단은 본원에서 개시된 핵산 서열로부터 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실(deletion)을 포함할 것이다. 절단은 발명적 핵산(들)의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 여기에서 상기 스트레치는 최소한 하나의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 결합은 당업자들에게 통상적인 실험법, 또는 본원에 개시된, 바람직하게는 실시예 부분에 개시된 방법을 사용 또는 적용함으로서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 D-핵산 또는 L-핵산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 발명적 핵산은 L-핵산이다. 추가적으로, 상기 핵산의 하나 내지 여러 부분은 D-핵산형으로 존재 가능하며, 또는 상기 핵산의 하나 이상 내지 여러 부분은 L-핵산형이다. 상기 핵산의 “일부(part)”라는 용어는 최소한 1개 이상의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 것이다. 이러한 핵산들은 일반적으로, 각각 “D- 및 L-핵산”으로 지칭된다. 따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산들은 L-뉴클레오티드로 구성되고 최소 하나 이상의 D-뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 D-뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 이들의 일부를 한정하는 스트레치와는 별개의 다른 부분에 부착되는 것이며, 이 일부들은 핵산의 다른 부분과의 상호작용이 연관된 접촉의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 D-뉴클레오티드는 각각 본 발명의 임의의 핵산 및 임의의 스트레치의 말단에 부착되는 것이다. 보다 바람직한 구현예로서, 상기의 D뉴클레오티드는 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)로 작용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 PEG 또는 HES와 같은 변형체(modifications)를 부착할 수도 있다.
본원에서 그들의 핵산 서열로 온전히 그대로 개시된 개개 및 임의의 핵산(들)은 특정 뉴클레오티드 서열(들)에 한정되는 것도 또한 본 발명의 범위내이다. 환원하면, 용어 “포함하는(comprising)” 또는 “포함하다 (comprise(s))”는 이러한 구현예에서 ‘함유하는(containing)’ 또는 ‘구성하는 (consisting of)’의 의미로서 해석되어야 할 것이다.
또한, 본 발명에 따른 핵산은 비교적 긴 핵산(longer nucleic acid)의 일부분이며, 상기 비교적 긴 핵산은 최소한 본 발명의 한 부분이 본 발명에 따른 핵산 또는 그 일부분인 여러 부분을 포함한다는 것도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 D-핵산 또는 L-핵산 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에서는 이들의 임의 조합이 사용될 수 있을 것이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 단독 또는 상호 조합으로 전체로서 또는 특별한 조합으로서, 결합(binding), 바람직하게는 SDF-1과의 결합과는 다른 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용(interaction), 예를 들어, 고정화(immobilization), 가교결합(cross-linking), 검출(detection) 또는 증폭(amplif ication)등과 같은 작용을 허용하는 것이고, 여기에서 상기 다른 분자들은 바람직하게는 SDF-1와 상이한 것이다. 본 발명의 추가의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 몇 개의 본 발명의 핵산을, 독립적 또는 조합된 부위로서 포함한다. 이와 같은 본 발명의 여러 가지 핵산을 포함하는 핵산은 비교적 긴 핵산의 용어로서 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 L-핵산들은 L-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 L-뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본원에서 사용되는 D-핵산들은 D-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 D-뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본원에서 사용되는 용어 “핵산(nucleic acid)” 및 “핵산 분자(nucleic acid molecule)”는 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 호환가능한 방식으로 사용된다.
또한, 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 본원에서 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열은 5’ → 3’ 방향이다.
본 발명의 발명적 핵산이 D-뉴클레오티드, L뉴클레오티드 또는 상기 두 형태 뉴클레오티드의 조합, 예를 들어 하나 이상의 L-뉴클레오티드 및 하나 이상의 D-뉴클레오티드로 구성되는 무작위 조합(random combination) 또는 하나 이상의 L-뉴클레오티드 및 하나 이상의 D-뉴클레오티드로 구성되는 스트레치의 한정된 서열을 포함하는가 여부에 상관없이, 상기 핵산은 데스옥시리보뉴클레오티드(desoxy ribonucleotide(s)), 리보뉴클레오티드(ribonucleotide(s)) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
L-핵산과 같은 본 발명의 발명적 핵산을 고안하는 것은 여러 가지 장점을 갖는다. L-핵산은 자연 발생적 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나 D-핵산은 수용액상, 및 특히 핵산 분해 효소(nucleases)의 광범위한 분포에 기인하는 생체 조직(biological systems) 또는 생체 표본(biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연 발생적 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L-핵산에 대한 분해 능력이 없다. 이와 같은 이유로 L-핵산의 생물학적 반감기(biological halflife)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L-핵산의 분해능 결핍으로 인해, 핵산 분해 효소의 분해산물이 발생되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 SDF-1 존재와 관련한 질환 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L-핵산으로 한정되지 않는 것이다. 특이적으로 왓슨와 크릭의 염기 결합과는 다른 기전을 통한 목표 분자와 결합을 하는 L-핵산 또는 L-뉴클레오티드로 일부 또는 온전히 구성되는 압타머(aptamer), 특히 상기 목표물질(target molecule)과 압타머와의 결합과 관련되는 압타머의 일부분을 갖는 압타머를 또한 스피에겔머(spiegelmer)이라고 지칭된다.
상기 핵 뉴클레오티드 서열을 플래크(flanking)하는 뉴클레오티드의 1차 및 2차 스트레치는 원칙적으로 상호 혼성화될 수 있음도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 혼성화가 발생시에, 이중 가닥형(double-stranded) 구조가 생성된다. 이러한 혼성화가 특히. 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 발생되거나 발생되지 않을 수 있음도 당업계에 인지가능할 것이다. 또한 이러한 혼성화시에, 적어도 염기쌍에 대한 규칙에 기초하여, 이러한 혼성화 및 이중 가닥 구조가 형성될 수 있는 경우에 2개의 스트레치의 전장 길이 전체에 걸쳐 반드시 발생하지는 않는다. 본원에서 바람직하게는 개시한 바대로, 이중-가닥 구조는 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 염기쌍이 염기 쌍, 바람직하게는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따른 염기 쌍을 이루어지는, 분자 일부 또는 2개 이상의 분리된 가닥(seperated strands)에 의하여 생성된 구조인 것이다. 후그스텐(Hoogsten) 염기 쌍과 같은 기타 염기 쌍은 이러한 이중-가닥 구조로 또는 이 구조를 형성할 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다.
또한, 본 발명에 따른 핵산으로 또한 지칭되는 발명적 핵산은 그 핵산이 D-핵산, L-핵산 또는 D-, L-핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명의 발명적 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조(defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 삼차 구조(tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명의 발명적 핵산은 서로 상보적인 또는 서로 일부가 상보적인 이중 가닥이 서로 혼성화된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함될 수도 있다. 이러한 특성은 특히 핵산이 L-형이 아닌 자연 발생의 D-형으로 존재한다면 유리할 것으로 생각되므로 핵산에 안정성을 부여한다.
본 발명의 발명적 핵산은 변형가능하다. 이러한 변형은 상기 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 변형의 예는 그 중에서도, 하기 문헌들, 즉, 벤카테산 외(Venkatesan, Kim et al, 2003) 및 커서(Kusser 2000)에 의해 서술되어 있다. 이러한 변형은 핵산을 구성하는 개별적인 뉴클레오티드의 2번 위치에서의 수소 원자, 불소 원자 혹은 O-CH3 그룹 또는 NH2 그룹이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 LNA 뉴클레오티드로 구성된 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원에서 사용되는 “다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)”은 두 개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다. 상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드 (ligand)로 작용하는 기능적 부위(functional unit)를 형성한다. 이 두 개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산을 두 개의 가닥으로 분할시키는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫 번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산(overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성 방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할(cleavage) 및 합성(synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 2개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 2개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부분 사이에 어느 정도의 상보적 구역(complementarity)이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 혼성화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 구현예에서, 온전히 닫힌, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산을 위한 원형 구조가 보여 진다, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산이 닫혀있으며, 바람직하게는 공유결합을 통해 닫혀있으며, 보다 더 바람직하게는 그와 같은 공유결합은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 서열을 5‘ 말단 및 3’ 말단 사이에 만들어진다는 점도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산이 매우 좋은 Kd치 (Kd value) 범위를 갖는다는 것을 발견했다.
결합 상수(binding constant)의 측정은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 소위, 비아코아 장치(biacore device; Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)로 불리는 표면 플라즈몬 공명 기기(surface plasmon resonance measurement)의 사용으로 가능하다. 또한, 본원에서 사용되는 친화도(affinity)는 하기 실시예에 기재된 “풀-다운 측정법(pull-down assay)”의 사용으로 측정될 수 있다. 본 발명의 경우에 있어서 SDF-1인 목표 분자에 따른 핵산간의 결합 강도(intensity of the binding)를 표시하기 적합한 측정치는 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 “Kd치(Kd value)”이다.
본 발명에 따른 핵산은 특정한 Kd치에 의해 특징화 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 Kd치는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 Kd치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 결합(nonspecific binding)으로 특정된다고 간주 된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 Kd치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 μM 정도의 Kd치는 Kd치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 Kd치 하한선은 약 10 pM(picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 SDF-1과 결합하는 개별적인 핵산의 Kd치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두 번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 상위 값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 하위 값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 목표 분자에 여전히 결합할 수 있는 어떠한 제공된 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 바람직한 길이가 있다는 것은 당업계에 자명한 사실이다. 일반적으로, 길이는 15 내지 120 뉴클레오티드 사이이다. 본 발명에 따르는 핵산을 위한 길이가 15 내지 120 사이의 어떠한 정수가 가능하다는 것은 당업자에게 자명한 사실이다. 본 발명에 따르는 핵산의 길이를 위한 보다 더 바람직한 범위는 약 20 내지 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 20 내지 50 뉴클레오티드 및 약 20 내지 40 뉴클레오티드이다.
본원에서 개시된 본 발명의 핵산은 바람직하게는 높은 분자량 기 및/또는 동물 신체, 바람직하게는 인체 내에서 그들 중에 체류 시간을 통한 핵산 특성을 변형시키는 기를 포함함도 본 발명의 범주 내이다. 상기 변형의 특정 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 PEG화 반응(PEGylation) 및 HES화 반응(HESylation)이다. 본원에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))의 약어이고, HES는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)의 약자로 사용된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 PEG기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 HES기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 상기 변형체뿐만 아니라 상기 변형법을 이용하여 핵산을 변형하는 제조방법은 유럽특허출원 EP 1 306 382호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
바람직하게는, 높은 분자량 부위를 함유하거나 구성하고 있는 상기 변형체의 분자량은 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 PEG의 경우에는, 약 2,000 내지 200,000 Da이며, 바람직하게는 40,000 내지 120,000 Da이며, 구체적으로 매우 높은 분자량 기인 HES의 경우에는 바람직하게는 약 3,000 내지 180,000 Da, 보다 더 바람직하게는 60,000 내지 140,000 Da이다, HES 변형의 제조방법은 독일특허출원 제 DE 1 2004 006 249.8호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
특허출원 WO2005074993 및 PCT/EP02/11950에 서술된 바와 같이 PEG 및 HES 중 어느 하나도 쇄상 및 가지상 중 어느 하나로도 사용될 수 있다는 것도 본 발명의 범주 내이다. 그와 같은 변형은, 원칙적으로, 본 발명의 핵산 분자의 어떠한 위치에서 만들어질 수 있다. 바람직하게, 그와 같은 변형은 5'-말단 뉴클레오티드, 3‘-말단 뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자의 5’뉴클레오티드와 3‘뉴클레오티드 사이의 어떠한 뉴클레오티드 중 어느 하나에 만들어진다.
변형체 및 바람직하게는 PEG 및/또는 HES기는 본 발명의 핵산 분자에 직접적 또는 링커(linker) 중 하나에 부착될 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 핵산 분자가 하나 또는 그 이상의 변형체, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 PEG 및/또는 HES기를 포함함은 본 발명의 범주 내이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 독립적인 링커 분자(linker molecule)는 본 발명에 따르는 핵산에 하나 이상의 PEG기 또는 HES기를 부착한다. 본 발명과 관련되어 사용된 링커는 그 자체로 쇄상 또는 가지상이 될 수 있다. 이와 같은 링커는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 더 나아가 특허출원 WP2005074993 및 PCT/EP02/11950에 서술되어 있다.
어떠한 이론에 국한되지 않은 범위 내에서, 중합체(polymer)와 같은 고분자량 기, 더욱 상세하게는, 본원에 개시된, 바람직하게는 생리학적으로 수용이 가능한 중합체를 갖는 본 발명에 따른 핵산을 변형시킴에 따라 배출 역학(excretion kinetic)은 변화될 것이다. 더욱 상세하게는, 이러한 변형된 발명적 핵산의 증가된 분자량 및 핵산, 특히 L형인 경우에 대사과정의 대상이 되지 않는 핵산으로 기인하는 경우에 동물세포, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 배출은 감소 된다. 상기 배출은 신장을 통해 전형적으로 일어나므로, 본원 발명자들은 상기 변형된 핵산의 사구체의 여과속도가 이와 같은 높은 분자량의 변형을 거치지 않아 결과적으로 생체 내의 체류시간이 증가 되는 이러한 고분자량의 변형체를 갖지 않은 핵산과 비교시에 현저하게 감소 된다. 이와 연관지어, 본 발명에 따른 핵산의 특성이 상기와 같은 높은 분자량 변형에도 불구하고 불리한 영향을 받지 않음은 매우 두드러진 사실이다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산은 정상인 경우는 약학 활성 성분으로부터 기대할 수 없는 예를 들어 지체된 방출을 제공하기 위해 지체된 방출속도(sustained release)를 제공하는 약학적 제형이 필수적이지는 않다는 것과 같은 놀라운 특성을 갖는다. 오히려 높은 분자량 부위를 함유하고 있는 변형된 본 발명에 따른 핵산은 서방형(sustained release formulation)으로서 즉시 사용가능하다. 지금까지, 본원에 기재된 핵산의 변형체(들) 및 이리하여 변형된 핵산 분자 및 이를 포함하는 어떠한 조성물은 명확한, 바람직하게는 조절된 약물동력(pharmacokinetics) 및 그들의 생물분소(biodistribution). 이는 또한 조직으로의 순환(circulation) 및 분산(distribution)의 잔류시간(residence time)을 포함한다. 이와 같은 변형체는 특허출원 PCT/EP02/11950에 서술되어 있다.
그러나, 본원에서 개시된 핵산은 임의의 변형 및 특히 예를 들어, PEG화 반응 또는 HES화 반응과 같은 비 고 분자량성 변형체를 포함하고 있지 않음도 본 발명의 범주 내이다. 이러한 구현예는, 투여 후에 체내로부터 핵산의 빠른 제거율이 특히 바람직하다. 이와 같은 빠른 제거율은 본 발명의 따른 핵산 또는 이를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 실험 이미징(imaging) 또는 특이적 치료적 투약 요건(specific therapeutic dosing requirements)의 경우에서 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산으로 본원에서 또한 발명적 핵산으로 지칭되는, 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제들은 약제의 생성 또는 제조에 이용될 수 있다. 상기 약제는 적어도 하나 이상의 발명적 핵산을 포함하는데, 임의적으로 추가의 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 본 발명 핵산은 바람직하게는 핵산 그 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예로서, 상기 약제는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 글루코스 수용액, 바람직하게는 5% 포도당 염 조절 수용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 등을 들 수 있다. 상기 담체들은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다. 당업자에게 있어, 본 발명의 임의의 구현예, 사용 및 측면들 또는 약제는 또한 본 발명의 약학 조성물에게도 적용가능하고 그 반대(vice versa)도 인지 가능할 것이다.
치료 및/또는 예방을 위한 적응증(indication), 질환(disease) 및 장애(disorders)의 본 발명과 관련되거나 또는 관련되어 제조된 핵산, 약학조성물 및 약제는 직접적 또는 간접적 중 하나와 각개의 병원성 기전과 관련된 SDF-1로부터 발생한다.
물론, 상기 본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산은 인간 또는 설치류 SDF-1과 상호작용을 하므로, 당업자는 본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산은 인간 및 동물의 본원에서 개시된 바와 같은 임의의 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위하여 용이하게 사용가능하다.
본 발명의 네 번째 측면의 하나의 구현예로서, 상기 진단용 수단은 혈관형성증(angiogenesis), 신생맥관증(neovascularization), 염증(inflammation) 및 전이증(metastasis)을 진단하고자 하는 것이다.
하기에 다양한 질환, 장애 및 상태와 관련하여 본 발명에 따른 핵산 분자의 사용을 위한 방향을 제공하므로, 타당한 본 발명에 따른 핵산 분자의 청구된 치료학적 (therapeutic), 예방적인 (preventive) 및 진단적인 (diagnostic) 적용가능성을 제공한다. 임의의 불필요한 반복을 회피하기 위하여 관련된 방법과 같은 SDF-1 SDF-1 수용체 축 (receptor axis)의 관련성에 기인하여, 상기 축(axis)은 청구된 치료학적 (therapeutic), 예방적인 (preventive) 및 진단적인 (diagnostic) 효과가 달성되도록 본 발명에 따른 핵산 분자에 의하여 위치지정이 될 수 있음도 인지되어야 할 것이다. 게다가, 환자들의 질환(diseases), 장애(disorders) 및 상태(conditions)의 자세한 사항, 및 이와 관련되어 개시된 치료 처방방법의 모든 구체적인 사항은 본원의 바람직한 구현예들로 구현될 수 있을 것이다.
혈관 보다 구체적으로는, 말초 혈관에서 줄기 및/또는 전구 세포수를 항진시키는 것은 백혈구 감소증의 결과와 같은 골수에 역작용을 나타내는 프로토콜(protocol)의 효과를 경감시키기 위하여 치료에 도움을 줄 수 있다.
이미 화학요법제 및 방사선 요법의 부작용은 알려진 바 있다. 또한 본 발명의 핵산은 골수 이식 성공률을 증진시키고, 상처 치료 및 화상 치료를 증진시키고 손상된 기관 조직의 회복에 도움을 준다. 또한 이들은 백혈병에서 발병하는 박테리아 감염증을 치료한다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산 분자는 어떠한 상기 목적을 위하여 사용 가능하고 어떠한 상기 질환 및 상태의 개개 치료 및 예방에 사용가능하다.
조직 재생을 위한 줄기세포 동원 ( Stem cell mobilization for regeneration of tissues ). 예를 들어 맥관구조 이상 또는 외상에 기이한 조직 손상의 경우에서, 조직재생(tissue regeneration)이 요구되나 가끔 달성되지 않는다. 골수, 바람직하게는 자가 줄기세포(autologous stem cells)로부터 얻은 줄기 세포는 다양한 동물 질병 모델에서 유익한 효과를 나타내어 왔고 몇몇 경우에 인간에서 그 유용성이 입증되었다.
망막 복원 및 망막 색소 상피 ( Repair of the retina and the retinal pigment epithelium ). 골수-유래 줄기세포는 망막혈관 및 퇴행성 질환의 마우스 시험모델에서 조사되어 왔다. 이러한 줄기 세포는 유리체강내 (intravitreally) 또는 망막하내(subretinally)로 주사시 손상 부위로 고착되고, 정상 맥관구조를 안정화시키고 저산소 상태에서 신생맥관형성증(neovascularization)을 촉진시키는 것으로 밝혀 졌다 (Friedlander et al, 2007; Otani et al, 2002). 기타 과학자들은 G-CSF로 동원된 골수-유래 줄기 세포가 손상 부위에서 망막색소 상피를 목표화함을 밝혀냈다. 전신 투여 이외에, 줄기세포를 수확하고 안구내 주사가 필요없는 것으로 밝혀졌다. 반대로, 손상(injury)/상해(damage) 부위로의 이끌림이 예를 들어, SDF-1과 같은 케모카인에 의하여 일시적 국소화 과발현 (transient localised over-expression)에 의하여 달성되었다 (Li et al, 2007; Li et al, 2006).
심근 복원( Cardiac repair ). 축적된 근거자료에서 심근은 복원 (repair) 및 재생 (regenerative) 과정에 참여하는 줄기 및/또는 전구 세포의 순항 (recruitment)에 의하여 성장 또는 손상에 반응함이 밝혀졌다. 심근경색증(cardiac infarction) 마우스 모델에서, 프란시올리 등(Fransioli et al.)은 줄기세포인 c-kit+ 세포(cells)가 복원 과정에 기여할 것 같은, 경색부위에서의 심근경색후 1-2주간 축적됨을 보고하였다 (Fransioli et al, 2008). 돈 등(Dawn et al.)은 뼈 골수 세포-유래의 매우 작은 배아-유사(embryonic-like) 줄기세포인 Sca-1+/Lin-/CD45- (약어; VSELs)의 탁월한 치료학적 유용성에 대하여 보고한 바가 있다. 심근 경색증(약어; MI)의 마우스 모델시험에서, 상대적으로 소수의 CD45- VSELs의 이식은 좌심실 기능을 개선시키고 심근경색증후의 심근세포 비대증(myocyte hypertrophy)을 경감시키기에 충분하였다 (Dawn et al, 2008).
허혈성 뇌졸중후 염증 복원 및 경감 ( Repair and amelioration of inflammation after ischemic stroke ). 슈바르팅 등(Schwarting et al.)은 허혈성 뇌 손상 마우스 모델에서 녹색 형광 펩티드-표식된 (green fluorescent peptide-marked) Lin(-)-조혈성(hematopoietic) 줄기 세포 주입이 경색 크기(infarct size), 세포사멸성 세포사(apoptotic cell death), 경색후 염증 (post-ischemic inflammation) 및 사이토카인 유전자 전사 (cytokine gene transcription)에 미치는 영향을 조사하였다. 24시간 주사 후, 상기 세포는 비장 및 추후에 소교세포성(microglial)을 나타내나 중성 마커 단백질(neural marker proteins)은 아닌 허혈성 뇌 유조직(ischemic brain parenchyma)에서 발견된다. 조직 손상 분석에서 Lin(-)-조혈성 줄기 세포(hematopoietic stem cell) 처치 동물의 경색-주변 부위에서 유의적으로 적은 경색 부피 및 적은 세포사멸성 세포사를 나타내었다. 뇌의 허혈성 반구에서의 면역 세포 침윤 분석시험에서 처치된 마우스에서 진입한 T 세포 및 대식세포수의 감소를 나타냄을 확인하였다 (Schwarting et al, 2008). 이미톨라 등(Imitola et al.)은 신경 줄기 세포가 SDF-1α/CXCR4 경로를 통하여 중추신경계(약어; CNS) 손상 부위로의 이끌림이 보고되었다.
이러한 발견들을 견지하여, 골수로부터 분리된 충분한 수의 줄기 세포의 동원은 복원 과정을 유도하는 데에 이로울 것이다 (Tang et al, 2007). SDF-1 또는 이의 수용체인 CXCR4의 차단(Blocking)은 다수의 줄기세포를 골수로부터 동원하므로 상기 분야에서 가능성 있는 접근법이다. 상기 동원용 시약(mobilizing agent)의 올바른 용량, 투여 계획 및 잠재적인 국소화 (localization)는 일상적 실험을 수행하는 숙련된 자에 의하여 결정될 수 있을 것이다. 여기에서, 바람직하게는, 상기 줄기 세포는 동원되나 여전히 조직 손상 부위로 순항되도록 화학 주성적 신호에 반응할 수 있도록 의도되는 것이다.
본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산 분자들은 SDF-1 및 SDF-1 수용체간의 신호전달 과정을 저해하기 때문에 이러한 SDF-1 결합 핵산 분자들은 전구세포 및/또는 줄기 세포의 말초 혈관으로의 동원, 및/또는 질환 및/또는 장애, 바람직하게는, 상처 치유; 화상; 손상된 기관 조직 및/또는 손상된 맥관 구조에 기인하거나 수반되는 장애(disorders)를 포함하는 군으로 선택된 질환 및/또는 장애 [여기에서 상기 장애(disorders)는 망막 및 맥락막 손상(retinal and choroidal damage), 뇌졸중(stroke), 심근성 손상(myocardial damage), 심근 경색증(myocardial infarct), 장기 이식 및 외상성 후 허혈증(ishemia); 및 조혈성 장애(hematopoietic disorders)를 포함하는 군으로부터 선택된 것이며 (여기에서 상기 조혈성 장애는 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 백혈병(leukaemia), 약물-유도 빈혈증(drug-induced anemia) 및 백혈구 감소증(leukopenia) 및 백혈구 감소증에 의한 박테리아 감염증(bacterial infection)으로부터 선택된 것임)]의 치료에 사용될 수 있는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
상기 전구세포 및/또는 줄기 세포를 동원하기 위하여, 상기 약제는 제 2차 약학적 활성화 제(pharmaceutically active agent)와 조합하여 사용 가능하고, 여기에서 상기 제 2차 약학적 활성화 제의 기능은 상기 전구세포 및/또는 줄기 세포를 동원하는 것이다. 세포 동원 제(Cell mobilizing agents)는 이에 제한되지는 않으나, 과립구-대식세포 집락 자극인자(granulocyte-macrophage colony stimul ating factor; 약어; GM-CSF), 인터루킨(Interleukin)-8 (약어; IL-8), 대식세포 염증성 단백질(macrophage inflammatory protein; 약어; MIP), 성장관련 온코진 (growth related oncogene), AMD3001과 같은 CXCR4 차단제(blocking agents) (Aiuti, Webb et al. 1997) 및 과립구 집락-자극인자(granulocyte colony-stimulating factor; 약어; G-CSF)으로부터 선택된 것이다.
CNS 손상의 경우, 골수 유래 줄기세포의 동원을 위한 거대분자(macromolecule) SDF-1 저해제(inhibitor)의 사용은 특히 유용할 것이다. 상기 세포가 SDF-1 농도 경사(gradients)에 민감하여도, 신체 내에서 충분하게 고농도가 유지되는 한은 말초 혈관에서 거대분자 SDF-1 저해제에 의하여 차폐된다. 그러나, 상기 거대분자 SDF-1 저해제는 혈액뇌장벽(blood brain barrier)을 통과할 수 없으므로, CNS 저산소증 또는 손상 부위에서 SDF-1 과-발현(over-expression)으로부터 유래된 SDF-1 농도 경사는 CNS에서 유지되고 상술한 바와 같은 제공될 수 있는 일부의 동원된 세포를 손상부위로 이끌 수 있을 것이다. 바람직한 구현예로서, 상기 거대분자 SDF-1 저해제는 본 발명에 따른 핵산 분자(nucleic acid molecule)이다.
SDF -1 차단 및 화학요법제와의 조합 ( Combination of SDF -1 blockade and chemotherapy). 약 20%의 B-계열(lineage) 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemias)은 전통적인 치료법으로는 치료되지 않는다. 기질 세포와 공동-배양하는 생체외(ex-vivo) 백혈구을 이용한 전임상 실험에서, 골수 구성요소들과 백혈병 세포(leukemic blasts)의 상호작용이 화학요법제에 대한 백혈병 세포를 보호한다는 근거를 제공하였다 (Mudry, Fortney et al. 2000; Garrido, Appelbaum et al. 2001; Tabe, Jin et al. 2007). 또한 마우스 실험 모델에서 세포 부착에 중요한 세포 표면 분자의 저해를 수행하여 (악성)조혈세포의 귀환은 화학요법의 유효성을 개선 시키고 백혈병 줄기세포의 제거를 초래함이 밝혀졌다 (Matsunaga, Takemoto et al. 2003; Jin, Hope et al. 2006). SDF-1은 골수 세포 적소(bone marrow niches)에서 줄기 세포의 귀환 및 저장에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려 진 바 있다. SDF-1 수용체인 CXCR4의 조혈세포에 대한 차단은 골수로부터 말초혈관으로의 급성 골수성 백혈병 세포의 방출을 초래하고, 이들은 화학요법제(예를 들어 시타라빈(cytarabine) 약제)(Fierro, Brenner et al. 2008) 또는 종양 세포사(예를 들어 생물학적 제제 단독 또는 항체 의존성 세포-매개성 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성)를 이끄는 기타 제제에 의해 목표화가 가능함이 축적된 전임상 및 하나의 보고된 임상 실험결과가 알려져 있다. 추가적으로, 진 등(Jin et al.)은 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia)에 대한 티로신 키나제 저해제(tyrosine kinase inhibitors; 예를 들어 이마티닙(imatinib))의 처치가 백혈병 세포에 대한 CXCR4의 상위조절(upregulation)을 초래함을 관찰하였다. 이러한 결과는 증가된 골수 귀환(bone marrow homing) 및 유도된 G0-G1 사이클 블록(cycle block)로 귀결되고 이는 추가의 화학요법제 접근법에 대하여 세포가 반응이 없고 무감각하게 된다 (Jin, Tabe et al. 2008). 이러한 견지에서, 본 발명은 화학요법제와 백혈병의 골수로의 귀환을 감소시키고 이전에 골수로 귀환된 무반응성 백혈병 세포를 동원시키기 위하여, 이에 제한되지는 않으나, NOX-A12-JE40을 포함한, 본 발명에 따른 CXCR4 또는 SDF-1 저해제 유사 SDF-1 결합 핵산 분자와의 조합 투여법(combination therapy)을 제시한다. 소실된 적소 신호(niche signals)에 기인하여, 상기 세포는 세포 사이클(cycle)을 통하여 진행가능하고 따라서 화학요법제에 대하여 보다 민감하다. 화학요법제 및 이와 연관된 개개 약제는 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 리투시맙(Rituximab), 이브리투모맙 티우세탄(Ibrit umomab tiuxetan), 토시투모맙(Tositumomab)과 같은 항체(antibodies); 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메클로탄민(mechlorethamine); 시클로포스마미드(cyclophos phamide), 클로람부실(chlorambucil) 뿐만 아니라 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 알킬화제(alkylating agents); 퓨린아자티오프린(p urineazathioprine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine)과 같은 항-대사체(anti-meta bolites); 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids) 및 탁산(taxanes)과 같은 식물 알칼로이드(plant alkaloids) 및 테르페노이드(terpenoids); 포도필로톡신(podo phyllotoxi); 에포틸론(epothilone); 및 캠토테신(camptothecins)과 같은 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitors)를 들 수 있다 .
따라서, 본원에서 개시된 바와 같은 상기 약제(medicament)는 객체에서 암세포(cancer cells)의 말초혈관으로의 동원(mobilization)에 사용가능하고, 여기에서 상기 암세포는 이에 제한되지는 않으나, 백혈병 세포 (leukemic cells), 골수성 세포 (myleoma cells), 임파종 세포(lymphoma cells), 암 줄기 세포 (cancer stem cells) 전이 잠재성(metastatic potential)을 갖는 암세포 및 암 전이물 (cancer metastases)로부터 선택된 것이다.
본 발명에 따른 상기 약제는 상기 암세포를 객체의 말초 혈관에 동원하기 위하여 사용가능한 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화 제(pharmaceutically active agent)와 조합하여 사용가능하다. 상기 제 2차 약학적 활성화 제는 전술한 바와 같은 세포 동원 제(cell mobilizing agents)를 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 약제는 상기 암세포를 객체의 말초 혈관에 동원하기 위하여 사용가능한 제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화 제(pharmaceutically active agent)와 조합하여 사용 가능하고 여기에서 상기 제 3차 약학적 활성화 제는 암세포를 손상시키거나(damage), 파괴하고(destroys) 및/또는 표지화시킨다(labels). 이러한 암세포 파괴용 약제는 바람직하게는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 리투시맙(Rituximab), 이브리투모맙 티우세탄 (Ibritu momabtiuxetan), 토시투모맙(Tositumomab)과 같은 항체(antibodies); 옥살리플라틴(oxaliplatin), 메클로탄민(mechlorethamine); 시클로포스마미드(cyclophosp hamide), 클로람부실(chlorambucil) 뿐만 아니라 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 알킬화제(alkylating agents); 퓨린아자티오프린(pur ineazathioprine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine)과 같은 항-대사체(anti-meta bolites); 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids) 및 탁산(taxanes)과 같은 식물 알칼로이드(plant alkaloids) 및 테르페노이드(terpenoids); 포도필로톡신(podophy llotoxi); 에포틸론(epothilone); 및 캠토테신(camptothecins)과 같은 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitors)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화 제(pharmaceutically active agent)는 화학요법제의 기능을 갖거나 제공가능하다.
암세포를 표지화하는 약제는 약제 표지화된 암세포에 배향하는 신체 방어력의 활성화를 초래하고, 여기에서 상기 암세포를 표지화하는 약제는 이에 제한되지는 않으나 단일클론항체의 군으로부터 선택된다. 이들은 목표화된 특이 항원에 의하여 작동되므로 약제가 자체로 부착한 종양세포에 대한 숙주의 면역 반응을 증강시킨다. 실제적인 예로는 트라츄주맙(trastuzumab; 상표명; 헤르셉틴(Herceptin)), 세툭시맙(cetuximab) 및 리툭시맙(rituximab; 상표명; 리툭산(Rituxan) 또는 맙테라(Mabthera))를 들 수 있다.
본 발명에 따른 약제의 조합 치료법은 상기 제 2차 및/또는 제 3차 약제와 수행가능하다.
암세포 동원을 위한 약제로 처치된 객체는 연속적으로 또는 동시적으로 방사선 요법을 수행가능하다. 본원발명의 구현예로서 상기 방사선 요법은 상기 제 3차 약제 또는 상기 제 3차 약학적 활성화제로 호환적인 치료요법으로 사용가능하다.
본 발명에 따른 상기 약제는 상기 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제와의 조합 또는 비조합; 상기 제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화제와의 조합 또는 비조합; 및 상기 방사선 요법과의 조합 또는 비조합으로 암(cancer), 바람직하게는, 고형암(solid tumors) 및 혈액 성 악성종양(hematological malignancy), 보다 바람직하게는, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 및 골수종(myeloma)의 치료(treatment) 및/또는 예방(prevention)에 사용가능하고, 여기에서 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 약제는 제 3차 약제 또는 방사선 요법과의 조합으로 사용하는 것이다.
자가면역질환에서의 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및 기억성 T 세포 동원 (Long-lived plasma cells , B cell and memory T cell mobilization in autoimmune disease )
B 세포, 및/또는 기억성 T 세포는 신체로부터 골수 및 아마도 림프 절과 같은 기타 장소로 돌아오고/오거나 기질 세포의 SDF-1 발현에 의하여 생성된 SDF-1 농도경사에 의하여 그 장소에 보유된다 (Parretta, Cassese et al. 2005; Zhang, Nakajima et al. 2005; Radbruch, Muehlinghaus et al. 2006). 상기 적소(niches)에서, 이러한 세포는 비활동성 상태이며 이는 자가 면역질환의 치료에 통상적으로 사용되는 질환 개선제(diseases modifying drugs) (예를 들어, 세포정지약물(cytostatic drugs) 또는 메토트렉세이트(methotrexate))에 민감성이 없다. 만일 이들이 상기 적소를 떠나면, 이들은 영속적 자가면역 질환을 초래할 가능성이 있는 동족성 항원(cognate antigen)을 조우한다면, 이들의 쉽게 분열되고 새로운 면역 반응 수행을 시작할 수 있다. SDF-1 결합 핵산 또는 CXCR4 차단제에 의한 골수 및 기타 적소(niche)에서의 SDF-1 농도경사에 의한 간섭은 B 세포 및/또는 T 세포의 동원을 초래하고 성분헌혈(apheresis) 또는 적절한 약제에 의한 목표화(targeting)를 통한 혈액으로부터의 고갈을 허용한다.
종국적으로 분화된 B 세포 (혈장 세포)에 의한 활성형 항체 생성에 대한 급성 면역 반응 후에, 이러한 세포들의 대부분은 염증의 해결 또는 외부 항원(예를 들어 바이러스 단백질)의 제거와 함께 죽는다. 그러나 T-세포의 도움으로 혈장블라스트(plasmablasts)로 전환될 수 있는 소수의 기억성 B 세포가 있다. 이러한 혈장블라스트는 수년 동안 장기-생존 “기억성(memory)" 혈장 세포로서 화학 주성 자극에 대하여 생존하는 적소(niche)로 이주시킬 수 있는 능력을 갖는다. 상기 전이(transition) 동안, 상기 세포들은 CXCR5 및 CCR7 이 발현을 소실하고 개개 리간드로 더 이상 이주시키지 못한다. 그러나, 상기 CXCR4의 발현은 유지된다. 따라서, 상기 세포들은 SDF-1과 별개 또는 상보적일 수 있는 장기간 생존 신호와 조우할 수 있는, SDF-1 발현 부위로 이동할 것이다 (Minges Wols et al, 2007). 이러한 적소는 골수 및 예를 들어 염증화 조직과 같은 주변부 모두가 될 수 있다. 이러한 장기-생존 혈장 세포는 감염 또는 접종 수년 후에도 가끔 유지하는 보호성 항체 혈장 역가(protective antibody plasma titers)의 유지를 담당하는 것 같다 (Tarlinton et al, 2008). 혈장 세포는 질환 개선제(diseases modifying drugs)가 쉽게 분열시키지 않으므로 기타 B- 및 T-세포와 같이 치료되지 않을 것 같다. 게다가, 혈장 세포가 CD20을 운반하지 않으므로 이들은 항-CD20 항체에 의해 목표화될 수 없다. 혈장 세포 및 장기-생존 혈장 세포에 의하여 분비되는 자가항체에 의하여 유지되는 자가면역 질환에서, 이러한 세포들을 제거하는데 유용할 것이며 이러한 면역체계는 자가 조직(self tissue)을 공격하는 것을 정지할 것이다. 혈장세포로부터 환자 혈액을 고갈시키는 방법은 친화성 매트릭스(affinity matrix; 예를 들어 컬럼 또는 비드(beads))상에 항 CD 138 (syndecan-1) 항체를 이용한 성분헌혈(apheresis)로 수행가능하다 (Minges Wols & Witte, 2008; Wijdenes et al, 1996). 순환하는 혈장 세포뿐만 아니라 거주성 장기-생존 혈장 세포(resident long-lived plasma cells)를 제거하기 위하여, 후자를 이들의 적소에서 동원하기 이로울 것이다. 이는 SDF-1 농도경사를 파괴하고 SDF-1의 말초 혈관으로 이동하는 이러한 세포들을 동원시키는 본 발명의 SDF-1 결합 핵산 분자의 전신적 투여법에 의하여 달성된다.
따라서, 본 발명에 따른 상기 약제는 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포의 객체 말초혈관으로의 동원에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약제는 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포의 객체 말초혈관으로의 동원에 사용될 수 있는 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제와의 조합으로 사용가능하다. 상기 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제는 이에 제한되지는 않으나, 상술한 바와 같은 세포 동원제(cell mobilizing agent)를 포함한다.
상기 세포들은 본 발명에 다른 약제 단독 또는 상술한 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제와의 조합에 의하여 동원되나, 이들은 성분헌혈(apheresis), 세포분류법(cell sorting) 및/또는 유세포 분석기(flow cytometry)(예를 들어, 적절한 장기-생존 혈장 세포, B-세포 또는 T-세포 표면 마커를 가진 형광-활성화 세포 분류법-Fluorescence-activated cell sorting [FACS] 및/또는 자기-활성화 세포 분류법-Magnetic-activated cell sorting [MACS])에 의하여 혈액으로부터 제거가능하다.
게다가, 본 발명에 따른 약제는 제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화제 와 조합되어 사용가능하다 (여기에서 제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화제는 말초혈관에서 장기-생존 혈장 세포, B-세포 또는 T-세포를 손상시키고(damages), 파괴시키고 (destroys) 및/또는 표지화시키다(labels)). 이러한 장기-생존 혈장 세포, B-세포 또는 T-세포를 손상시키고(damages), 파괴시키고 (destroys) 및/또는 표지화시키는 약제는 이에 제한되지는 않으나, 질환 개선제(diseases modifying drugs) (예를 들어, 세포정지약물(cytostatic drugs) 또는 메토트렉세이트 (methotrexate))들로부터 선택되는 것이다. 장기-생존 혈장 세포, B-세포 또는 T-세포를 표지화시키는 이러한 약제의 예들은 표지된 장기-생존 혈장 세포, B-세포 또는 T-세포들에 배향된 신체 방어의 활성화를 초래하며, 이들은 이에 제한되지는 않으나, 리툭시맙(rituximab), IL-6 수용체 결합 항체(receptor binding anti bodies) 또는 신데칸(syndecan)-1 결합 항체(binding antibodies)로부터 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 약제의 조합치료법은 제 2차 및/또는 제 3차 약제로 수행가능하다.
장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T-세포를 동원하기 위하여 본 발명에 따른 약제로 본 발명에 따라 처치된 객체는 방사선 요법은 연속적으로 또는 동시적으로 수행가능하며, 이는 종국적으로 자신을 공격하는 환자의 면역체계의 분열되는 세포를 손상시키거나 파괴한다. 방사선 요법은 제 3차 약제로 호환적인 치료에 사용가능하다. 본 발명에 따른 상기 약제는 상기 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제와의 조합 또는 비조합; 상기 제 3차 약제 또는 제 3차 약학적 활성화제와의 조합 또는 비조합; 및 상기 방사선 요법과의 조합 또는 비조합으로 자가면역질환(autoimmune diseases)의 치료 및/또는 예방, 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T-세포의 단독 동원 또는 보다 복잡한 치료적 개념(therapeutic concept) 내에서의 이에 제한되지는 않으나, 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases)(여기에서, 상기 전신성 자가면역 질환은 바람직하게는, 알러지(allergy), 온난(warm) 및 저온(cold) 자가면역 용혈성 빈혈증(autoimmune hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증상(systemic inflammatory response syndrome), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), I형 당뇨병 (diabetes type I), 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 다발연골염 (polychondritis), 다분비선 자가면역 증후군(polyglandular autoimmune syndrome), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)및 그 증상 (manifestations), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 임파계(lymphatic system) 혈관 또는 기타 기관에서의 류마티스 질환(rheumatic disease)로부터 선택된 질환임); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract) (여기에서, 상기 위장관 자가면역 질환은 바람직하게는, 크론씨 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 셀리악병(celiac disease), 글루텐 불내성(gluten intolerance), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 췌장염 (pancreatitis), 호산성 식도염(eosinophilic esophagitis)으로부터 선택된 질환임); 피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin)(여기에서 상기 피부 자가면역 질환은 바람직하게는, 건선(psoriasis), 심마진(urticaria), 피부근염(dermatomyositis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창 (pemphigus foliaceus), 수포성 유사 천포창(bullous pemphigoid), 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis) 또는 두링씨 질환(Duhring's disease), 경화성 태선(lichen sclerosis)으로부터 선택된 질환임); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature)(여기에서 맥관 자가면역 질환은 혈관병증(vasculitides), 바람직하게는, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관병증(vasculitis), 혈관누수증(vascular leakage), 류마티스성 다발근육통(polymyalgia rheumatica), 동맥경화증(atherosclerosis), 척－스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 따까야 수동맥염 (Takayasu arteritis), 굿패스쳐증후군(Goodpasture syndrome), 바람직하게는 대부분 신장에 영향을 미치는 질환, 보다 구체적으로는, 사구체(glomeruli), 및/또는 또한 대부분 폐에 영향을 미치는 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa), 베체트씨 병(Beh's disease)으로부터 선택된 질환임); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system)(여기에서 상기 신경계 자가면역 질환은 바람직하게는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 신경성 인지 기능장애(neurocognitive dysfunction), 강직인간 증후군 (stiff-man syndro me), 길란-바레 증후군 (Guillain-Barrsyndrome), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 램버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome)으로부터 선택된 질환임); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases)(여기에서 상기 근육성 골격 자가면역 질환은 강직성 척추염(ankylosing spodylitis), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스성 다발성근육통 (polymyalgia rheumatica), 다발성근염 (polymyositis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 열 (rheumatic fever), 다발연골염(polychondritis), 섬유근육통 (fibromyalgia), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 라임병 (Lyme disease), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 척추 관절병증 (spon dyloarthropathy), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease)으로부터 선택된 질환임); 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)(여기에서 상기 기타 면역 질환은 바람직하게는 코간 증후군 (Cogan syndrome), 자가면역 부신염 (autoimmune adrenalitis), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 국소성 염증 (local inflammations), 원형 탈모증 (alopecia areata), 급성염증 질환 (acute inflammatory diseases), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 미만선 경피증(diffuse scleroderma), 크레스트 증훈군(CREST syndrome) 및/또는 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma)과 같은 경피증, 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroiditis), 그레이브씨 질환(Graves disease), 자가면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 특발성 폐 섬유증(idiopatic pulmonar fibrosis), 자가면역성 불임증 (autoimmune infertility), 면역성 복합 장애(immune complex disordes) 및 복막염 (peritonitis)을 포함하는 다양한 질환의 치료 및/또는 예방에 사용가능하다.
게다가, 상기 제 2차 약제 또는 제 2차 약학적 활성화제와의 조합 또는 비조합으로 수행한 본 발명에 따른 약제의 사용은 골수 이식후 이식편대숙주반응 (Graft-versus-Host-Disease) 및 바람직하게는 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬(islets of Langerhans), 골수, 혈관, 췌장으로부터 선택된 다른 이식 기관의 이식 거부증(transplant rejection of a transplanted organ)의 치료 및/또는 예방에 사용가능하다.
알러지성 기도 모델 실험에서, 백혈구상의 CXCR4 목표화 항체는 기도 과-반응증(airway hyper-responsiveness) 및 폐호산구 증가증(lung eosinophilia)을 감소시키며, 이는 CXCR4-매개 신호전달이 폐염증에 기여함을 입증하는 것이다 (Gonzalo, Lloyd et al. 2000). 또한, SDF-1이 신생혈관형성 (angiogenesis)에 기여한다는 근거자료도 있다. 임상 및 실험적 결과는 피부-침윤 백혈구가 아토피성 피부염의 유지에 주요한 역학을 하며, SDF-1 가 T-임파구, 및 수지상 세포의 순항에 중요한 인자임이 밝혀졌다 (Gombert, Dieu-Nosjean et al. 2005). 백혈구 및 특히 T 세포는 SDF-1 수용체인 CXCR4를 발현하고, SDF-1 농도경사에 대하여 화학주성적으로 반응하므로, 본 발명에 따른 SDF-1 결합 및 중화 핵산에 의한 이러한 SDF-1 농도경사의 파괴가 박테리아 또는 바이러스 기원에 기인하거나 또는 기인하지 않는 지나친 염증, 폐 및/또는 피부 염증, 바람직하게는 건선으로 인한 염증에 도움을 주기에 적합하다.
류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis)은 팔 및 다리의 소관절에서 대개 개시되는 잠재적인 전신성 자가면역 질환이다. 그 특징은 백혈구, 특히 대식세포, T 세포 및 B 세포에 의한 막 및 둘러싼 조직에서의 침윤에 의하여 특징화되는 활액성 막의 염증을 나타낸다. 이러한 과정 및 프로테아제(proteases) 및 전염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)의 분비는 활액 막의 비후 및 소위 판누스(pannus)라 지칭되는 스폰지 형태 조직의 성장을 초래한다. 이는 관절 주위에서 증식하고 및 뼈 및 연골로 공격적으로 침입하여, 결국 이들의 비가역적 파괴를 초래한다. 이 판누스는 자신의 혈액 공급을 위해 신생혈관구조(neovasculature)의 형성을 촉진한다. 이와모토 등(Iwamoto et al.)은 다수의 케모카인들이 류마티스성 관절염 환자의 활액 조직 및 활액 낭에서 상승하고 이중의 하나가 SDF-1임을 최근에 발견하였다 (Iwamoto et al, 2008). 또한 SDF-1의 상위-조절(up-regulation)은 이전의 시험관내 시험에서 류마티스성 관절염 환자로부터 채취한 활액 낭(synovial fluid)을 배양된 섬유아 세포-유사 활막세포 (fibroblast-like synoviocytes)로의 첨가시험으로 확인 되었다. 이 액체 또는 IL-17의 첨가는 활막세포에 의하여 SDF-1 mRNA 발현을 유도하였다. SDF-1 발현 유도는 항-IL-17 항체의 첨가로 차단될 수 있다 (Kim et al, 2007). 염증화된 관절의 이러한 배경하에서, SDF-1은 3가지 양태로 작용을 할 수 있다. 첫 번째로 백혈구에 대한 화학주성제(chemoattractant)로서의 기능, 두 번째로 신생혈관혈성증에 요구되는 내피 전구세포 (endothelial progenitor cells)의 화학 주성제로서의 역할, 또는 세 번째로 신생혈관구조(neovasculature)의 성장을 초래하는 VEGF와 같은 하위 성장 인자(downstream growth factor) 발현의 개시자(trigger)로서의 역할이다.
이러한 시험에 기초하여, 본 발명자들은 백혈구의 이주, 바람직하게는 말초혈관으로부터 조직으로의 이주를 저해하기 위해 사용되는 약제가 하기한 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방을 허용할 것으로 예상된다.
백혈구의 이주는 이식된 기관의 타가 항체(non-self antigens)에 의하여 개시될 수 있으며, 여기에서 상기 이식 기관은 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬(islets of Langerhans), 골수, 혈관, 췌장으로부터 선택되는 것이다. 따라서, 백혈구 이주를 저해하는 약제는 본원에서 개시된 이식 거부증(transplant rejection)의 예방 및/또는 치료에 사용가능하다.
게다가, 상기 백혈구의 이주는 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases)(여기에서, 상기 전신성 자가면역 질환은 바람직하게는, 알러지(allergy), 온난(warm) 및 저온(cold) 자가면역 용혈성 빈혈증(autoimmune hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증상(systemic inflammatory response syndrome), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), I형 당뇨병 (diabetes type I), 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 다발연골염(polychondritis), 다분비선 자가면역 증후군(polyglandular autoimmune syndrome), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)및 그 증상(manifestations), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 임파계(lymphatic system) 혈관 또는 기타 기관에서의 류마티스 질환(rheumatic disease)로부터 선택된 질환임); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract) (여기에서, 상기 위장관 자가면역 질환은 바람직하게는, 크론씨 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 셀리악병(celiac disease), 글루텐 불내성(gluten intolerance), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 췌장염(pancreatitis), 호산성 식도염(eosinophilic esophagitis)으로부터 선택된 질환임); 피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin)(여기에서 상기 피부 자가면역 질환은 바람직하게는, 건선(psoriasis), 심마진(urticaria), 피부근염(dermatomyositis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceus), 수포성 유사 천포창(bullous pemphigoid), 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis) 또는 두링씨 질환(Duhring's disease), 경화성 태선(lichen sclerosis)으로부터 선택된 질환임); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature)(여기에서 맥관 자가면역 질환은 혈관병증(vasculitides), 바람직하게는, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관병증(vasculitis), 혈관누수증(vascular leakage), 류마티스성 다발근육통(polymyalgia rheumatica), 동맥경화증(atherosclerosis), 척－스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 따까야 수동맥염 (Takayasu arteritis), 굿패스쳐증후군(Goodpasture syndrome), 바람직하게는 대부분 신장에 영향을 미치는 질환, 보다 구체적으로는, 사구체(glomeruli), 및/또는 또한 대부분 폐에 영향을 미치는 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성 동맥염 (polyarteritis nodosa), 베체트씨 병(Beh's disease)으로부터 선택된 질환임); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system)(여기에서 상기 신경계 자가면역 질환은 바람직하게는, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 신경성 인지 기능장애(neurocognitive dysfunction), 강직인간 증후군 (stiff-man syndrome), 길란-바레 증후군 (Guillain-Barrsyndrome), 중증근무력증 (myasthenia gravis), 램버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome)으로부터 선택된 질환임); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases)(여기에서 상기 근육성 골격 자가면역 질환은 강직성 척추염(ankylosing spodylitis), 유육종증 (sarcoidosis), 류마티스성 다발성근육통 (polymyalgia rheumatica), 다발성근염 (polymyositis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 류마티스성 열 (rheumatic fever), 다발연골염(polychondritis), 섬유근육통 (fibromyalgia), 연소성 류마티스성 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 라임병 (Lyme disease), 반응성 관절염 (reactive arthritis), 척추 관절병증 (spondyloa rthropathy), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease)으로부터 선택된 질환임); 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)(여기에서 상기 기타 면역 질환은 바람직하게는 코간 증후군 (Cogan syndrome), 자가면역 부신염 (autoimmune adrenalitis), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 국소성 염증 (local inflammations), 원형 탈모증 (alopecia areata), 급성염증 질환 (acute infla mmatory diseases), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen’s syndrome), 미만선 경피증(diffuse scleroderma), 크레스트 증훈군(CREST syndrome) 및/또는 반상(Morphea)/선상(linear) 경피증(scleroderma)과 같은 경피증, 자가면역성 포도막염 (autoimmune uveitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroiditis), 그레이브씨 질환(Graves disease), 자가면역성 간염 (autoimmune hepatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 항인지질 증후군 (anti -phospholipid syndrome), 특발성 폐 섬유증(idiopatic pulmonar fibrosis), 자가면역성 불임증 (autoimmune infertility), 면역성 복합 장애(immune complex disordes) 및 복막염 (peritonitis)이 발생 되거나 수반되는 염증에 의해 개시될 수 있다.
따라서, 백혈구 이주 저해 또는 감소를 초래하는 약제는 본원에서 개시된 바와 같은 자가면역 질환을 발생하거나 수반하는 염증의 예방 및/또는 치료에 사용가능하다.
알러지성 기도 질환의 마우스 모델 시험에서 보는 바와 같이, 백혈구 이주의 저해를 초래하는 상기 약제는 피부 및/또는 기도 점막의 알러지 반응, 바람직하게는, 건초열, 천식, 기도 과-반응증 및/또는 피부염, 바람직하게는 접촉성 피부염 및/또는 아토피성 피부염의 치료 및/또는 예방에 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산에 의한 전구 세포 및/또는 줄기 세포의 동원은 객체로부터 이러한 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 유효량의 상기 핵산은 객체에 투여되어, 전구 세포 및/또는 줄기 세포의 객체의 말초혈관으로의 동원을 초래한다. 상기 세포들은 객체의 말초혈관으로부터 본원에 개시된 바와 같은, 성분헌혈(apheresis), 백혈구 성분채집술 (leukapheresis), 세포분류법 (cell sorting) 및/또는 유세포 분석기(flow cytometry)에 의하여 수확가능하다.
상기 객체로부터 상기 전구 세포 및/또는 줄기세포를 수확한 후에, 상기 객체, 바람직하게는, 제 1차 객체(first subject)는 연속적으로 또는 동시적으로 화학요법 또는 방사선요법을 수행가능하다.
일반적으로 화학요법 및 방사선 요법은 빨리 분열하는 세포에 영향을 미친다. 이들은 암세포가 대부분의 건강한 세포들보다 빨리 분열하기에 암을 치료하는데 사용된다. 그러나, 골수 세포도 또한 빈번하게 분열되므로, 고-용량의 치료법은 환자의 골수를 심각하게 손상을 주거나 파괴시킬 수 있다. 건강한 골수없이, 환자는 산소를 운반하고, 감염과 투쟁하고, 출혈을 방지하는 데 필요한 혈액 세포를 더 이상 생산할 수 없게 된다. 말초 혈관 줄기 세포 이식(Peripheral blood stem cell transplantation)은 처치에 의해 파괴된 줄기세포를 대체한다. 건강하고 이식된 줄기 세포는 환자가 필요로 하는 혈액 세포를 생산하는 골수의 능력을 회복시킬 수 있다.
말초 혈관 줄기 세포 이식은 백혈병 및 임파종의 치료에 가장 통상적으로 사용된다. 이는 백혈병 및 임파종이 완화 상태 시 (암의 신호 및 증상이 소멸 됨)에 가장 효과적이다. 말초 혈관 줄기 세포 이식은 또한 신경모세포종 (neuroblastoma; 미성숙 신경 세포에서 발생 되며 대부분 유아 및 소아에서 발생하는 암) 및 다발성 골수종 (multiple myeloma)과 같은 다른 암의 치료에도 사용된다. 연구자들은 다양한 형태의 암의 치료를 위한 임상 실험(연구 조사)을 통하여 말초혈관 줄기 세포 이식을 평가하였다 (NCI, 2001).
도(Fig.) 47 내지 도 49에 제시된 바와 같이, 백혈병 및 고형암과 같은 다양한 암, 림프세포증식성질환(lymphoproliferative disorders), 및 자가면역 질환, 조혈계 장애(hematopoietic disorders)와 같은 비-악성 장애(non-malignant disorders)는 동종(allogenic) 및/또는 자가(autologous) 조혈모세포이식 (hemato poietic stem cell transplantation, 약어; HSCT)으로 치유될 수 있다 (Gratwohl, Baldomero et al. 2002).
만일, 화학요법 또는 방사선 요법이 바람직하게는, 제 1차 객체에서 연속적으로 수행된다면 (여기에서 상기 화학요법 또는 방사선 요법은 바람직하게는, 종양세포(tumor cells)를 손상시키거나 또는 파괴시키기 위해 수행되거나 투여됨), 바람직하게는 상기 제 1차 객체의 수확된 전구 세포 및/또는 줄기 세포는 바람직하게는 제 1차 객체의 말초혈관에 역으로 투여될 수 있다. 호환적으로, 제 2차 객체는 저수준의 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 갖거나 또는 예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법에 의하여 이미 이전에 파괴된 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 갖는 제 1차 객체에게 수확된 전구 세포 및/또는 줄기 세포를 제공할 수 있다.
상기 방법은 암, 바람직하게는 고형 암(solid tumours), 혈액 종양(hematological tumours) 또는 악성종양(malignancies)의 치료에 사용가능하다.
이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 홍반성낭창(lupus erythematosus), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis)을 포함하는 자가면역성 질환, 특히 심각한 질환인 경우에, 선택적인 치료법의 하나로서, 골수박멸성(myeloablative) 치료법 또는 보다 선택적인 임파박멸성 (lymphoablative) 치료법을 수행하여 상기 조혈계를 이전의 상태로 돌려 놓은 방법이 있다 (Burt, Marmont et al. 2006). 상기 조혈계를 이식하는데 필요한 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells) 및 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cells)는 이에 제한되지는 않으나, SDF-1 결합 스피에겔머 (Spiegelmer NOX-A12-JE40), 또는 SDF-1 또는 이의 개개 수용체인 CXCR4의 기타 차단 전략을 포함하는, 본 발명에 따른 상기 핵산 분자에 의하여 유효적으로 동원된다.
호환적으로, 조혈 줄기세포/조혈 전구세포는 혈액으로부터 수확되고 화학요법 및/또는 방사선 요법에 의한 자가반응성 임파구 (autoreactive lymphocytes)를 포함하는 조혈계의 박멸 이후에 환자의 면역계를 재구성하는데 사용된다. 원칙적으로 이는 자가면역 질환을 치료하는 근치적 치료법 (curative therapy)을 구성한다.
본 발명에 따른 핵산에 의한 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포의 동원은 객체로부터 이러한 세포들을 고갈시키는 방법을 제공한다. 그렇게 함으로서, 효과적인 양의 본 발명에 따른 핵산을 객체에 투여하여, 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포를 객체의 말초 혈관으로의 동원을 초래한다. 바람직하게는, 상기 수확된 T 세포는 기억성(memory) T 세포이다. 이러한 세포들은 객체 또는 객체의 말초혈관으로부터 각각 본원에 개시된 바와 같은, 성분헌혈(apheresis), 백혈구 성분채집술 (leukapheresis), 세포분류법(cell sorting) 및/또는 유세포 분석기(flow cytometry)에 의하여 제거가능하다. 바람직하게는, 상기 제거(removal)은 상기 세포에 대하여 적절한 표면 마커(surface markers)에 의한 유세포 분석기로 수행되는 것이다.
전구세포 및/또는 줄기 세포 및 장기-생존 혈장 세포, B-세포 및/또는 T 세포를 각각 수확하는 방법은 본원에서 개시된 바와 같은 전신성 자가면역 질환(systemic auto-immune diseases); 위장관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the gastrointestinal tract); 피부 자가면역 질환(autoimmune diseases of the skin); 맥관 자가면역 질환(autoimmune diseases of the vasculature); 신경계 자가면역 질환(autoimmune diseases of the nervous system); 근육성 골격 자가면역 질환 (muscular skeletal autoimmune diseases); 및 기타 자가 면역 질환(other autoimmune diseases)의 치료 및/또는 예방에 사용가능하다.
당뇨병성 신병증(Diabetic nephropathy, 약어; DN)은 최종-단계의 신장 질환의 주요한 원인이다. 비록 안지오텐신 저해제(angiotensin inhibitors)가 다수의 케이스(cases)에서 질환 진행을 방지할 수 있음에도 불구하고, 이에 반응하지 않는 환자들에 대한 별다른 치료법은 없다. 당뇨병성 신병증(DN)에서 사구체 타래 (glomerular tuft)는 속도는 느리나, 사구체 비후증 (glomerular hypertrophy), 세포외 혈관 간세포 매트릭스(extracellular mesangial matrix)의 결절성(nodular) 및 미만성(diffuse) 축적, 및 족세포(podocyte) 손상으로 특징화되는 진행적인 구조적 재조립을 수행한다. 후자는 당뇨병성 신병증(DN)의 초기단계의 미세알부민뇨증(microalbuminuria) 진행 내지 후기 단계의 명백한 단백뇨증(proteinuria) 및 사구체경화증(glomerulosclerosis)이 원인이 된다. 당뇨병성 신병증(DN)의 발병 및 진행은 당화합 최종생성물(advanced glycosylation endproducts)의 축적, 혈관 내피세포 기능이상(endothelial dysfunction), 및 성장 인자 및 전염증성 매개물(proinflammatory mediators)의 증가된 국소적 발현을 포함하는 다수의 병리기전과 관련된다. 기타 신장 질환의 형태와 같이, 특정 케모카인들은 당뇨병성 신병증(DN)에서 순항 및 활성화하는 면역 세포에 의하여 염증을 증진시키므로 일반적으로, 케모카인은 인자(factor)의 후자군에 속한다. 예를 들어, 단핵세포 화학주성 단백질(monocyte chemoattractant protein)인 MCP-1/CCL2의 목표화된 제거 또는 치료학적 차단은 1형 또는 2형 당뇨병 (T1D/T2D) 마우스의 사구체로의 대식세포의 순항을 차단함으로서 사구체경화증을 예방한다 (Chow et al, 2007; Chow et al, 2006; Kulkarni et al, 2007).
당뇨병성 신병증(DN)에서의 SDF-1 기능에 대해서는 알려진 바가 없다. DN은 족세포 증식 또는 자가면역증 증상이 전혀 없으므로 전술한 연구는 당뇨병성 신병증(DN)에서의 SDF-1 주요한 기능적 역할을 예측할 수는 없다. 그러나, 본 발명자들은 사구체 구조의 사구체경화증 및 상처 치유의 형태학적 변이로의 진행적 재조립이 SDF-1 신호 전달(signaling)과 관련되는 것으로 판단되는 근거를 갖고 있다. 기타 질환 상태로부터 얻은 수득 가능한 데이터에 기초하여, 예를 들어, 조직 일체성의 유지 및 재생을 유지함으로서 SDF-1이 DN으로부터 주도적으로 방지가능한지 여부; 또는 예를 들어, 사구체경화증을 증진시킴으로서 DN을 SDF-1가 주도적으로 악화시키는지 여부에 대해서는 명확하지 않는 것으로 밝혀졌다. 당뇨병성 신병증(DN) 마우스 실험모델에서 본 발명에 다른 핵산 분자의 대표적인 분자인 SDF-1-결합 핵산인 NOX-A12-JE40 (서별번호 132)을 이용한 본 발명자들의 데이터는 후자, 즉, 새로운 사구체경화증 및 실시예 12에서 DN에 대한 잠재적 치료 목표(potential therapeutic target)로서 SDF-1의 병리기전을 동정하는 사실임을 지지함을 밝혀 냈다. 따라서, NOX-A12-JE40 (서열번호 132)은 당뇨병성 신병증의 치료 또는 예방을 위한 치료법으로서 유용할 수 있다. 또한 상기 작용기전은 잠재적으로 골수-유래 전구세포 및/또는 줄기 세포의 동원에 의하여 매개될 수 있다 (Ito et al, 2001). 그러므로 본원에서 개시된 SDF-1 핵산은 약제의 제조에 사용가능하다(여기에서 상기 약제는 신병증 및 바람직하게는 당뇨병성 신병증의 치료 및/또는 예방을 위한 것임).
폐 동맥성 고혈압( Pulmonary arterial hypertension ).
폐 고혈압(PULMONARY HYPERTENSION-약어; PH)은 상승된 동맥압으로 특징되며, 진행성 우측 심부전 및 종국에 사망에 이르는 그 병인이 잘 밝혀지지 않은 심각한 질환이다. PH는 적어도 일부는 내피세포 및 평활근 세포 기능이상 및 증식에 기인하는 적은 폐동맥 혈압의 파열성 비후로 기인된다. 맥관구조의 증가된 혈관 내피세포 증식 및 근육화(muscularization)는 폐 혈관성 재조립의 병리학적 특징이며, 이는 상기 과정이 신생혈관생성 인자(angiogenic factors), 염증성 매개자(inflammatory mediators) 및 혈관수축제(vasoconstrictors)의 저산소증-유도 생성을 수반한다. 야마지-케간 등(Yamaji-Kegan et al.)은 생체 외 마우스 폐 조직 배양 연구에서 CXCL12/SDF-1이 상위조절되고 과발현된 저산소증-유도 분열 촉진 인자 (hypoxia-induced mitogenic factor-약어; HIMF)에 의한 순환 세포의 폐내 순항과 관련될 수 있는 것으로 밝혀 졌다 (Yamaji-Kegan, Su et al. 2006). 일반적으로 혈관 재조립(vascular remodeling) 및 폐 동맥 고혈압에서의 SDF-1의 영향도 또한 개시되었다 (Schober and Zernecke 2007). 따라서, 본원에서 개시된 바와 같은 SDF-결합 핵산에 의한 SDF-1의 차단은 고혈압, 바람직하게는 폐 고혈압, 보다 구체적으로는 폐 동맥성 고혈압 (pulmonary arterial hypertension)의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
특발성 폐 섬유화증( Idiopathic pulmonary fibrosis )
특발성 폐 섬유화증 환자로부터 얻은 폐 조직은 정상 폐보다 SDF-1 및 CXCR4 모두를 발현하는 보다 많은 수의 세포를 나타낸다. 블레오마이신-유도성 페섬유화증 (bleomycin-induced pulmonary fibrosis) 마우스 실험 모델에서, 수 등(Xu et al.)은 CXCR4 길항제 (TN14003)이 투여가 유의적으로 폐 섬유화증을 감소시킴을 나타내는 데이터를 보여 줬다 (Xu, Mora et al. 2007). 따라서, 본원에서 개시된 바와 같은 SDF-결합 핵산에 의한 SDF-1의 차단은 특발성 폐 섬유화증의 치료 및/또는 예방을 위해 사용가능하다.
상처 치유에서의 섬유화증( Fribrosis in wound healing )
화상 손상 후, 래트(rat), 돼지(pig) 및 인간(human)의 피부는 SDF-1을 과발현하는 것으로 밝혀졌다. 손상 후 단기간 동안 이로우나 상피화(epithelializa tion)를 촉진하는 것보다 백혈구(예를 들어 호중구)의 끌림 및 섬유화증을 촉진하는 것으로 보인다. (Avniel, Arik et al. 2006). 본원에 개시된 바와 같은 SDF-1 결합 핵산에 의한 CXCR4 또는 SDF-1 의 저해에 의하여, 경미한 섬유화증을 갖는 상처 치유가 될 수 있다.
상술한 바와 같이, SDF-1은 안구조직에서의 신생맥관형성 (neovascular ization) 동안 상피세포의 맥락막으로의 귀환과 관련되는 것으로 밝혀 졌고, 여기에서 상기 세포들의 구체적인 역할은 아직 조사중이다 (Sengupta, Caballero et al. 2005). 그러나, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같은 SDF-1 결합 핵산에 의한 SDF-1의 차단이 신생맥관형성 (neovascularization)의 감소를 초래하는 2개의 독립적인 동물 실험 모델에서 확인할 수 있었다.
상기 “레이져-유도 맥락막 신생맥관형성증(laser-induced choroidal neovas cularization)” 동물 모델은 인간 망막 및 맥락막 및 신생맥관형성증에 대한 시험용 약물들의 효과를 예측하는데 사용되었다. 이는 습형(wet) 또는 “증식성(pro liferative)” 노인성황반변성증 (age-related macular degeneration, 약어 AMD), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 및 망막정맥 폐쇄증 (BRVO; retinal vein occlusion)과 같은 질환에서 발생 된다. CXCR4은 레이져-유도 (laser-induced) CNV 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (Lima e Silva et al., FASEB J. 21: , 2007). CD45 및 F4/80 발현 세포는 같은 위치하에 있고 이는 BM-유래 대식세포임을 제시한다. CXCR4 저해제는 레이져-유도 (laser-induced) CNV를 감소시켰다. 그러나, 만일 CXCR4 세포가 SDF1을 또한 발현한다면 조사되지 않았다. 본원의 실시예 11에서 성공적으로 밝힌 바와 같이, 본 발명에 따른 대표적인 핵산 분자인 상기 SDF-1 결합 핵산인 NOX-A12-JE40 (서열번호 132)은 CNV 동물 실험 모델에서 신생맥관형성증을 차단하였다.
산소-유도 망막병증(oxygen-induced retinopathy) 마우스 실험모델은 당뇨병성 망막증(DR), 특히 증식성 DR, 및 AMD에서 관찰되는 바와 같이, 망막의 저산소증-유도 신생혈관형성(hypoxia-induced neovascularizationa)을 모방하기 위한 모델이다 (Smith, Wesolowski et al. 1994). 또한 상기 모델은 병원 인큐베이터에 들어 가 있는 미숙아가 인큐베이터에 있는 동안 및 정상산소 조건(normoxic conditions)으로 귀환 후에 정상 망막 혈관 성장을 초래하는 인큐베이터에서의 너무 높은 산소 노출로 인하여 실명하게 되므로 미숙아의 망막병증(retinopathy of prematurity)으로도 지칭된다. 실시예 14에 개시된 마우스 실험 모델에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 대표적인 핵산 분자인 상기 SDF-1 결합 핵산인 NOX-A12-JE40 (서열번호 132)은 타래(tuft) 형성을 저해함으로서 본원에서 개시된 바와 같이 17일째(P17)에 관찰되는 바와 같이 전체적인 망막병증 점수(retinopathy score)를 향상시킨다.
게다가 표준 신생혈관형성 기관 배양 어세이(standard angiogenesis organ culture assay) 및 환상 대동맥 발생분석법(aortic ring sprouting assay)을 수행한 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 대표적인 핵산 분자인 상기 SDF-1 결합 핵산인 NOX-A12-JE40 (서열번호 132)은 SDF-1 유도 발아(sprouting)를 차단한다.
따라서, 본원에 개시된 상기 SDF-1 결합 핵산은 약제의 제조 (상기 약제는 신생형성형성증(angiogenesis) 및/또는 신생맥관형성증 (neovascularization)과 관련된 질환 및/또는 장애, 바람직하게는 맥락막 신생맥관형성증의 치료를 위한 것임)에 사용가능하다. 신생맥관형성증을 위한 동물시험모델은 본원에 개시된 바와 같은, 상기 SDF-1 결합 핵산은 망막성 질환(retinal diseases), 바람직하게는, 노인성 황반 변성증(age-related macular degeneration), 당뇨병성 신병증(diabetic retinopathy), 망막정맥 폐쇄증 (BRVO; retinal vein occlusion), 황반성 부종(macular edema) 및 망막성 부종 ( retinal edema)을 포함하는 군으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 약제로서 사용가능하다.
신생맥관형성증(Neovascularization)은 바람직하게는 본원에서 적혈구 관류(red blood cell perfusion)로 기능적 미세혈관 네트워크 (functional microvascular networks)의 형성으로 정의된다. 신생맥관형성증(Neovasculariz ation)은 신생혈관형성증(angiogenesis)이 주로 기존 혈관으로부터의 모세관성 버드(capillary buds) 및 모세관성 싹 (capillary sprouts)의 돌출(protrusion) 및 성장으로 특징화 된다는 점에서 구분된다.
망막성 혈관 부종 저해( Inhibition of retinal vascular edema )
노인성 황반 변성증(AMD), 당뇨병성 망막변증 및 망막정맥 폐쇄증 (BRVO; retinal vein occlusion)에서, 황반성 부종 형성이 종종 관찰된다. 일반적으로, 국소 맥관구조의 증가된 투과성은 부종 형성의 원인이다. 가끔 혈관성 구조물 또는 미성숙하고 누수성 신생혈관구조의 형성을 변화시키는 염증성 과정의 결과가 된다.
이러한 황반성 부종 형성은 영양소 및 기타 신호전달 물질의 공급이 손상되었으므로 시력의 급속한 퇴화를 초래할 수 있다.
SDF-1은 부종 형성을 초래할 수 있는 몇몇 인자를 부여한다. 세포부착 단백질(tight-junction protein)인 오클로딘(occludin)의 발현을 저해함으로서 (Butler et al, 2005), 혈관 벽이 무너질 수도 있다. 게다가, 이는 전염증성 환경(pro-inflammatory environment)을 창제할 수 있는 백혈구 침입을 촉발시키고 VEGF의 발현을 자극할 수도 있다 (Liang et al, 2007; Salcedo et al, 1999), 그 존재가 누수성 혈관 형성을 초래하는 것으로 최초로 알려진 “혈관 투과성 인자(vascular permeability factor)”로 알려진 것이다.
SDF-1이 건강한 안구에서 저농도로만 발현되는 바와 같이, 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같은 SDF-1 결합 핵산에 의한 SDF-1의 저해가 임의의 생리학적 효과를 초래하는지 여부는 명백하지 않다 (Lima e Silva et al, 2007).
하나의 SDF-1-결합 핵산이 VEGF-유도성 망막 혈관 투과성을 유도하는 토끼 실험 모델에서 실험이 수행되었다. 형광분석법(fluorometry)으로 관찰된 투과성은 유리체강내 VEGF-주사의 직접적인 단기-작용 효과에 기인한 것이 아닌, 보다 느리게 촉발되고 반응하는, 케스케이드(cascades)에 기인한 것이다(Edelman et al, 2005). 상기 SDF-1-결합 핵산은 유의적으로 농도의존적으로 망막 혈관 투과성을 감소시켰다.
VEGF -저해 실패와 혈관형성 상보 또는 이후의 저해 ( Inhibition of vasculogenesis complementary to or after failure of VEGF - inhibition )
최근에, 레디 등(Reddy et al.)은 SDF-1이 소량 존재하는 VEGF로 종양 혈관 성장을 촉진시킬 수 있음을 보고했다. 이는 신생-맥관구조를 촉진하기 위한 두 번째 VEGF-독립적 경로인 것 같다 (Reddy, Zhou et al. 2008). 따라서 본 발명에 개시된 바와 같은 SDF-1 결합 핵산에 의한 간섭은 항-신생혈관형성 처치법(anti-angiogenesis treatment)으로 이로울 수도 있다. 이는 특히 항-VEGF 치료 비-반응성 환자, 항-VEGF 치료 난치성 환자(anti-VEGF therapy refractory patients), 또는 신생혈관형성증(angiogenesis), 보다 상세하게는, 증식성 망막 질환 (prolif erative retinal diseases)과 관련된 모든 적응증(indications)을 위한 항-VEGF 약제와의 조합 치료법에 이로울 수 있다 (여기에서 상기 증식성 망막 질환은 AMD, DR, 및 망막정맥 폐쇄증, 및 암, 바람직하게는 고형암 및 전이물로부터 선택된 질환임).
이에 제한되지는 않으나, VEGF의 기능을 저해하는 약물로는 베바시주맙 (Bevacizumab; Avastin), 페갑타닙(Pegaptanib; Macugen) 및 라니비주맙 (Ranibizumab; Lucentis)을 들 수 있다.
지금까지, 본원에 개시된 SDF-1 핵산 분자들은 약제의 제조에 사용가능하다(여기에서 상기 약제는 VEGF를 저해하는 약제와의 조합 치료 및/또는 VEGF를 저해하는 약제로 처치하는 치료법에 미약(weekly)하거나 반응하지 않는 객체에서의 사용을 위한 것임). 본원의 임의의 측면 및 구현예에서의 임의의 치료법에 대한 반응과 연관되어 본원에서 사용한“미약한(weekly)”이라는 용어는 문맥 내에서 질병의 차도가 달성되지 않는 것을 의미한다.
WHIM 증후군( syndrome )
WHIM 증후군은 CXCR4 수용체의 절단 형(truncated form)으로 종종 특징화되는 면역 결핍증 (immune deficiency)이다. 이는 수용체 리간드 SDF-1 (CXCL-12)에 대한 증강된 민감성을 초래하고 보다 강력한 화학주성을 갖는다. 따라서, 정상적인 줄기 세포 유통(stem cell trafficking)을 달성하기 위해서는, 본 발명에 따른 SDF-1 결합 핵산 분자와 같은 SDF-1 차단제(blocking agent) 또는 CXCR4 수용체 차단제(receptor blocker)를 이용하여 신체 내 생물학적 활성형 SDF-1 농도를 감소시키는 것이 이로울 것이다 (Lagane, Chow et al. 2008).
신체, 바람직하게는, 혈액으로부터 전구세포 및/또는 줄기 세포, 장기-생존 혈장 세포, 기억성 B 세포 및/또는 T 세포와 같은 세포를 분리 및/또는 고갈시키는 것은 하는 성분헌혈법(apheresis), 세포분류법(cell sorting) 및/또는 유세포 분석법(flow cytometry)으로 수행가능하다.
성분헌혈법(apheresis)은 객체의 혈액을 구성성분의 하나의 특정성분 또는 군을 분리하여 순환계에 남은 잔여물을 돌려 보내는 장치를 통과시키는 기술이다. 제거시켜야 할 물질 및/또는 세포 종류에 따라, 줄기 세포 수확법(stem cell harvesting), 흡수 공정법(absorption procedures) 및 친화성 크로마토그래피법(affinity chromatography)를 포함하는 성분헌혈법에서 서로 다른 공정을 적용할 수 있다.
백혈구 성분채집술 (leukapheresis)은 혈액 시료로부터 백혈구를 분리하는 실험실적 공정이다. 이는 암(백혈병) 환자의 고 수준의 백혈구 수치를 감소시키거나 수혈을 위해 백혈구를 제거함으로써 달성될 수 있다.
세포분류법(cell sorting)은 전형적인 예로서, 유세포 분석법(flow cytometry), 바람직하게는, 형광-활성형 세포 분류법(FACS) 및 자기-활성형 세포 분류법(FACS)으로 표시되는 바와 같이, 혼합된 세포군으로부터 2개 이상의 세포군으로 분리하는 공정이다.
유세포 분석법(flow cytometry)은 액상 스트림(stream)에서 현탁된 서로 상이한 세포군과 같은 미세 입자를 계산하고, 검사하고 분류하는 기술을 의미한다. 이 기술은 광학적 및/또는 전자적 탐지 장치를 통하여 흐르는 단일 세포의 물리적 및/또는 화학적 특성을 동시적으로 분석하는 다중매개변수분석(multiparametric analysis) 방법을 허용한다. 형광-활성형 세포 분류법(FACS)은 특이적 형태의 유세포 분석법이다. 이는 개개 세포의 특정 광 산란(light scattering) 및 형광특성(fluorescent characteristics)을 기초로 하여 한번에 하나의 세포씩 생물학적 세포들의 이질적 혼합물을 2개 이상의 콘테이너(container)로 분류하는 방법을 제공한다. 입자/세포의 형광염색은 상기 입자/세포에 결합하는 형광성 염료와 함께 상기 입자/세포를 배양함으로써 수행된다. 이는 특정한 관심을 갖는 세포의 물리적인 분리뿐만 아니라 개개 세포로부터 형광성 신호의 신속하고, 객관적이고 정량적인 기록을 제공할 수 있는 유용한 과학적 도구이다. 두문자어(acronym)인 FACS는 특정인(Becton Dickinson) 소유의 상표명이다. 자기-활성형 세포분류법(MACS)은 특정회사(Miltenyi Biotec)에 의해 등록된 상표명으로서 다양한 세포군들을 이들의 표면 항원(CD 분자)에 따라 분리하는 방법이다. 그리하면, 분리할 세포 혼합물은 특정 표면 항원에 대한 항체로 피복된 자기 비드(magnetic beads)와 함께 배양된다. 이는 세포가 자기 비드에 부착된 이러한 항원들을 발현하게 유도한다. 그런 후에, 상기 용액을 강력한 자기장하에 위치한 컬럼 상으로 이동시킨다. 이 단계에서, 다른 세포들(항원을 발현하지 않는)이 흘려 내려가나, 상기 비드에 부착된(항원을 발현하는) 세포들은 컬럼상에 체류한다. 이 방법으로, 상기 세포들은 특정 항원(들)에 대하여 양성적으로 또는 음성적으로 제거가능하다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 약제는 추가적인 약학적 활성화제를 포함하는 것이다. 이러한 추가적인 약학적 활성 화합물(pharmaceutically active compounds)은 당업계에 공지된 것일 수 있으며, 바람직하게는, 케모카인(che mokine) 또는 사이토카인 길항제(cytokine antagonists), 코르티코스테로이드(co rticosteroids) 및 그 유사체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다. 주어진 다양한 적응증은 본 발명에 따른 핵산에 의해 본 발명에 따라 지정가능하고 상기 추가적인 약학적 활성화제(들)은 원칙적으로 상기 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 적합한 임의의 것일 수 있음도 당업자에게 이해될 것이다. 본 발명에 따른 핵산, 특히 존재하거나 또는 약제로서 사용된다면, 바람직하게는, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), PIXY-321 (GM-CSF/IL-3 융합 단백질(fusion protein)), 대식세포 염증성 단백질; macrophage inflammatory protein; MIP), 줄기 세포 인자 (stem cell factor), 혈소판형성인자(thrombopoietin) 및 성장 관련 온코진(growth related oncogene)의 단독 또는 조합으로 조합되는 것이다.
호환적으로 또는 추가적으로, 상기 추가적인 약학적 활성화제는 본 발명에 따른 핵산이다. 호환적으로 상기 핵산은 SDF-1과 상이한 목표 분자와 결합하거나 본 발명에 따른 핵산 중 하나와 상이한 기능을 나타내는 하나 이상의 핵산을 포함하는 것이다.
당업자들에게 인지되는 바와 같이, 발명적 핵산(inventive nucleic acids)은 SDF-1 길항제가 상기 길항제가 필요한 환자에게 투여될 수 있고 상기 길항제가 상기 질환 또는 상기 장애의 병인을 제거하기에 적합하거나 적어도 상기 질환 또는 상기 장애의 상태를 경감시키는 어떠한 질환에도 실제적으로 사용가능하다. 이러한 상태는 이에 제한되지는 않으나, 병적 신생혈관형성증(neovascularization), 염증 및 전이증을 포함한다. 이러한 및 기타 질환 또는 장애와 연관되어 본 발명에 따른 핵산의 적용은 어떠한 불필요한 반복을 피하기 위해서 참고로만 인용된, 본원 명세서의 도입부에 상술된 바대로 SDF-1의 관련성으로부터 초래된 것이다.
본 발명의 약제의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 본원에 개시된 임의의 질환, 특히 본 발명의 약제가 사용되는 기타 다른 치료법과 조합하여 사용되는 것이다.
“조합 치료법(combination therapy)”(또는 “공동-치료법 (co-therapy)”)은 본 발명의 약제 투여 및 이러한 치료제를 공동-작용 (co-action)함으로서 유리한 효과를 제공하기 위한 특정 치료 처방 (specific treatment regimen)의 부분으로서 최소한 2차 작용제를 포함, 즉, 본 발명의 약제 및 상기 2차 작용제와의 조합 투여를 포함한다. 상기 조합의 유리한 효과는, 이에 제한되지는 않으나, 치료제들의 조합으로 초래되는 약물동력학적(pharmacokinetic) 또는 약물역학적(pharma codynamic) 공동-작용을 포함한다. 이러한 치료제들의 조합 투여는 전형적으로 한정된 일정 기간(선택된 조합에 따라 보통 분, 시간, 일 또는 주 단위)이상 수행된다.
일반적이지는 않으나, “조합 치료(combination therapy)”는 본 발명의 조합을 우발적 및 자발적으로 초래하는 분리된 단독요법 처방의 일부분으로서 2개 이상의 이러한 치료제 조합 투여를 포함하는 의도일 수 있다.
“조합 치료”는 상기 치료제 투여를 연속적인 순서, 즉 상기 이러한 치료제들의 투여뿐만 아니라 개개 치료제를 상이한 시각에 투여하거나 또는 2개 이상의 치료제들을 실질적 동시 투여방법(substantially simultaneously manner)을 포함할 의도이다. 이러한 실질적 동시 투여 방법은 예를 들어, 고정된 비를 갖는 개개 치료제를 함유한 단일 캡슐 또는 개개 치료제의 다중, 단일 캡슐을 투여객체에 투여함으로써 달성가능하다.
각 치료제의 연속적 또는 실질적 동시 투여방법은 이에 제한되지는 않으나, 국소투여 경로(topocal routes), 경구투여 경로(oral routes), 정맥내투여경로 (intraveneous routes), 근육내 투여 경로(intramuscular routes) 및 점막 조직을 통한 직접 흡수(direct absorption) 경로를 포함하는, 임의의 모든 적절한 경로로 영향을 미칠 수 있다. 상기 치료제들은 동일한 경로 또는 서로 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 첫 번째 치료제는 주사를 통해 투여되면서, 조합의 또 다른 치료 작용제는 국소적으로 투여될 수도 있다.
호환적으로, 예를 들어, 모든 치료제들은 국소적으로 투여될 수도 있거나 또는 모든 치료제들을 주사로 투여할 수도 있다. 투여되는 치료제의 순서는 별도로 지적하지 않은 한은 엄밀하게 중요하지 않다. 또한 “조합 치료”는 다른 생물학적 활성 성분들과 추가적인 상기한 치료제와의 조합 투여를 포함할 수도 있다. 상기 조합 치료가 추가적으로 비-약물 치료법(non-drug treatment)을 포함하는 경우는 상기 비-약물 치료법은 상기 치료제 미 비-약물 치료법의 조합상의 공동-작용이 유리한 효과를 유지할 수 있는 한 임의의 적절한 시간동안에도 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 사례에서, 상기 비-약물 치료법이 치료제의 투여로부터 일시적, 아마도 수일 또는 수주일 동안 제거될 때에도 상기 유리한 효과는 달성될 수 있다.
상기와 같이 일반적인 정의로 실시된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로 당업자에게 알려진 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 투여경로는 전신 투여법이며, 보다 바람직하게는 비경구적 투여법, 가장 바람직하게는 주사법이다. 호환적으로, 상기 약제는 국소 투여가 가능하다. 기타 투여 경로로는 근육 투여법, 복강 투여법, 피하 투여법, 경구 투여 또는 바람직하게는 효능을 유지하면서도 최소한 침투성을 갖는 투여 경로가 주어지는 선호도를 갖는 비강 투여법(intranasal), 기관내 투여(intratracheal) 또는 경폐 투여법(pulmonary)들이다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥내 주사 또는 주입으로 사용된다. 추가적으로, 비경구 투여를 위한 하나의 접근법으로 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 일정한 투여용량을 유지하게 보장하는 지연성 방출 시스템 또는 서방성 방출 시스템의 적용 방법도 포함한다.
더 나아가, 본 발명의 바람직한 약제는 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 적절한 비강 매개물, 흡입기의 국소적 사용을 통해 경비 투여 형태, 또는 경피 투여 피부용 패취(transdermal skin patches) 형태와 같은 형태를 이용한 경피 경로(transdermanl route)를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템(transdermal delivery system)의 형태로 투여되기 위해서는, 상기 용량 투여(dosage administration)는 물론, 용량 처방(dosage regimen) 내내 간헐적 보다는 연속적 투여용량일 것이다. 기타 바람직한 국소 제제로는 전형적으로 활성 성분 농도가 0.01% 내지 15%(w/w 또는 w/v)인, 크림제(creams), 연고제(ointments), 로션제(lotions), 분무제(sprays) 및 겔제(gels)를 포함한다.
상기 개체로의 직접 투여법(direct administration)에 추가하여, 본 발명의 바람직한 약제는 객체의 혈액 세포를 보충하는데 사용하는 세포 배양물을 제조하기 위하여 생체 외 처치법 프로토콜(ex vivo treatment protocols)에 사용가능하다. 생체 외 처치법은 말초 혈관 또는 골수로부터 수확되거나 또는 일치되는 공여자로부터 수득한 동종이식물(allografts)로부터 얻은 자가 세포상에서 수행가능하다. 본 발명의 바람직직한 약제 또는 대식세포 염증성 단백질 (MIP)와 같은 기타 약제와의 조합의 농도는 당업계의 숙련자의 범위 내이다.
본 발명의 방법에 이롭게 반응하는 객체(Subjects)는 의학적 및 수의학적 객체, 일반적으로 인간 및 인간 환자를 포함한다. 본 발명의 방법 및 수단이 유용한 기타 다른 객체로는 고양이, 개, 대동물, 닭 및 그 유사동물과 같은 조류를 포함한다. 일반적으로, 전구 세포 및/또는 줄기 세포의 상승으로 혜택이 필요하거나 줄기 세포 이식을 위해 전구 세포 및/또는 줄기 세포가 요구되는 모든 객체는 본 발명의 방법의 투여에 적합하다.
본 발명의 방법 및 수단에 의하여 개선되거나 또는 도움을 받을 수 있는 전형적인 상태(conditions)는 상기 장애는 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 백혈병(leukaemia), 약물-유도 빈혈증(drug-induced anemia) 및 화학요법 또는 방사선 요법에 의한 조혈성 결손과 같은 조혈성 장애를 포함한다. 본 발명의 방법 및 수단은 또한 보다 효과적인 상처 치유 및 박테리아 감염증의 치료뿐만 아이라 이식성공율 및 하기 면역억제 치료법(immunosuppressive treatments)을 증진시키는 데 유용하다. 본 발명의 방법은 추가적으로, 면역손상(immunocompromised)되거나 면역체계가 고장난 객체를 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 방법에 의하여 개선되거나 또는 도움을 받을 수 있는 전형적인 상태는 리트로바이러스(retrovirus)로 감염된 객체 및 보다 상세하게는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로 감염된 객체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 객체에서의 전구세포 및/또는 줄기 세포의 상승이 이로울 것이거나 연속적인 줄기 세포 이식을 위하여 전구세포 및/또는 줄기 세포의 수확이 이로울 광범위한 상태를 목표로 한다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 또한 본 발명의 핵산은 골수 줄기 세포를 동원하여 심근을 재생하기 위해 투여되는 것이다.
본 발명의 약제는 일반적으로, 이에 한정되지는 않으나, 약학적으로 허용된 매질에 용해 또는 분산된 본 발명의 핵산을 포함하는, 치료학적으로 유효량의 활성 작용제를 포함할 것이다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균성 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 저해제 및 그 유사체를 포함한다. 이러한 약학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 보조 활성 성분(supplementary active ingredient)도 또한 본 발명의 약제 내에 혼입될 수도 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 및 바람직하게는 약학적으로 허용된 담체(vehicle)를 함유한다. 상기 담체는 당업계에 공지 및/또는 사용되는 임의의 담체 또는 임의의 결합제(binder)일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 결합제 또는 담체는 본원에 개시된 약제의 제조와 관련되어 실시한 임의의 결합제 또는 담체이다. 추가적인 구현예로서, 상기 약학 조성물은 추가적인 약학 활성 성분을 포함하는 것이다.
약제 및 약학 조성물의 제조는 본원 개시 내용으로 보아 당업계에 종사하는 자에게 널리 알려진 것일 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 액제 또는 현탁제와 같은 주사가능 형태; 주사 전에 현탁제 또는 액제 내의 용액을 위해 적절한 고형 형태; 경구투여를 위한 정제 또는 기타 고형물; 시간 방출형 캡슐제; 또는 안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등을 포함하는 현재 통상적으로 사용되는 형태로 제조될 수 있다. 외과의사, 내과의사 또는 보건직이 수술분야에서 특정 부위를 치료하기 위해 사용하는, 예를 들어 염수-기초 세척제(saline-based washes)와 같은 멸균된 제형의 사용도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치(microdevice), 미세입자 (microparticle) 또는 스폰지(sponge)를 통해 운반될 수도 있다.
제형에 있어서, 약제는 용량 제형과 양립될 수 있는 방법으로 투여될 수 있으며, 상기 함량은 약학적으로 효과적인 것이다. 상기 제형은 상술한 주사제 형태와 같은, 다양한 투여용량 형태로 용이하게 투여될 수 있으나 약물 방출형 캡슐 및 그 유사체도 또한 사용될 수 있다.
본원에서, 투여되는 활성 성분의 양 및 조성물의 부피는 치료할 개인 또는 객체 대상에 의존한다. 투여에 요구되는 활성 화합물의 특정한 함량은 치료자의 판단에 의존되며, 개개인마다 고유하다.
활성 화합물을 분산하기 위해 요구되는 약제의 최소 부피가 전형적으로 이용된다. 투여를 위한 적절한 용법 또한 다양하지만, 화합물을 일차적으로 투여함으로써 정형화되고 그 결과를 모니터하여 추가적인 간격으로 추가적으로 조절된 용량으로 투여가능하다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예를 들어, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구투여를 위해, 상기 활성 약물 조성, 즉, 본 발명의 핵산 분자 및/ 또는 본원에서 일명, 치료제(therapeutic agent) 또는 활성 화합물(active compounds)로 지칭되는 임의의 추가적인 약학적 활성 작용제는 에탄올, 글리세롤, 물 및 그 유사체와 같은 경구, 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 운반체(inert carrier)와 조합될 수 있다. 게다가, 요구되거나 또는 필요시에, 적당한 결합제(binder), 윤활제(lubricant), 붕해제(disintegrating agents), 및 착색제(coloring agents)를 또한 상기 혼합물 내로 혼입시킬 수 있다. 적당한 결합제로는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(magnesium aluminium silicate), 전분 반죽(starch paste), 젤라틴, 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리딘, 포도당 또는 베타-락토스(beta-lactose)와 같은 천연 당류, 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸트(tragacanth) 또는 알긴산 나트륨(sodium alginate)와 같은 천연 및 합성 껌, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여 형태에서 사용되는 윤활제로는 나트륨 올레산염(sodium oleate), 나트륨 스테아르산염(sodium stearate), 마그네슘 스테아르산염(magnesium stearate), 나트륨 안식향산염(sodium benzoate), 나트륨 아세테이트(sodium acetate), 염화 나트륨(sodium chloride), 실리카(silica), 활석(talcum), 스테아르산(stearic acid), 이의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함한다. 붕해제로는 제한없이, 전분, 메틸 셀루로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 껌 전분(xanthan gum starches), 아가(agar), 알긴산(alginic acid) 또는 이의 나트륨염, 또는 비등성 혼합물 등을 포함한다. 희석제로는, 예를 들면, 유당, 덱스토로스(dextrose), 수크로스(sucrose), 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/ 또는 글리신(glycine)을 포함한다.
본 발명의 약제는 이와 같은 지효성 및 서방성 정제 또는 캡슐, 환약, 분말, 과립제, 엘렉시르(elixirs), 팅크제(tinctures), 현탁제, 시럽제 및 유화 액제(emulsion)와 같은 경구 투여 형태로 투여될 수도 있다. 좌약(suppositories)은 지방성 유화액제 또는 현탁액제에서 유리하게 제조된다.
상기 약학조성물 또는 약제는 살균될 수 있거나 또는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 추가적으로, 그들은 또한 기타 치료적으로 유용한 성분들을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적 혼합법, 과립화법, 또는 코팅법에 따라 전형적으로 활성 성분의 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 1% 내지 50%을 함유하여 제조된다.
액체, 특히 주사용 조성물은, 예를 들어, 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 상기 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어, 물, 식염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 혼합될 수 있으며, 이로써 주사용 용액 또는 현탁액을 생성한다. 추가적으로, 주사 전 액체 용해에 적절한 고형 형태는 제조될 수 있다.
고형 조성물을 위해서, 부형제(excipients)는 약제 등급의 만니톨, 유당, 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 포도당, 자당, 마그네슘 탄산염 등을 포함한다. 상기에서 정의된 활성 화합물(active compounds)은 좌약, 예를 들어 운반체로서, 예를 들어 프로필렌 글리콜(propylene glycol)과 같은 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycols)을 사용하여 제조될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 좌약은 지방성 유화제 또는 현탁액에서 유리하게 제조된다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 예를 들어 소형 단층 소포 (small unilamellar vesicles), 대형 단층 소포(large unilamellar vesicles) 및 다층 소포(multilamellar vesicles)과 같은 리포좀 전달 시스템(liposome delivery system)의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀(liposome)은 콜레스테롤, 스테아릴아민(stearylamine) 또는 포스페티딜콜린 (phosphatidylcholines)을 포함하는 다양한 인지질(phospholipids)로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 지질 성분의 필름이 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화한 지질층을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 상술하고 있는 핵산 분자는 당업계에 널리 알려진 제조방법을 이용하여 구성되는, 친유성 화합물 또는 비-면역성(non-immuogenic), 고분자량 화합물로 복합체(complex) 형태로 제공될 수 있다. 추가적으로, 리포좀은 세포 독성을 내부적으로 매개하는 세포 독성제(cytotoxic agent)를 목표 또는 운반하기 위하여 그 표면상에 상기 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 수반 복합체의 예는 미국 특허번호 제 6,011,020호에서 제공된다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 표적 가능한 약물 운반체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 상기 중합체로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrro lidone), 피란 공중합체(pyran copolymer), 폴리히드록시프로필-메트아크릴아미드-페놀(polyhydroxypropyl-methacrylamide-phenol), 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀(polyhydroxyethylaspanamidephenol), 또는 팔미토일기(palmitoyl residue)로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신 (polyethylene oxide polylysine)을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 약물 방물 조절에 유용한 생분해성 중합체 (biodegradable polymer)류, 예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리엡실론 카프로 락톤(polyepsilon capro lactone), 폴리히드록시 부티르산 (polyhydroxy butyric acid), 폴리오로토에스테르(polyorthoesters), 폴리아세탈(polyacetals), 폴리히드로피란(polydihydropyrans), 폴리시아노아크릴레이트 (polycyanoacrylates) 및 가교화 또는 양친매성 하이드로젤 블록 공중합체(block copolymer)와 결합될 수 있다.
요구된다면, 상기 투여될 약학조성물 및 약제는, 각각 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 미량의 비독성 보조 물질(non-toxic auxiliary substance) 및 나트륨 아세테이트(sodium acetate) 및 트리에탄올아민 올레이트(triethanolamine oleate)와 같은 기타 물질을 미량 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각을 이용하는 용량 처방(dosage regimen)은 환자의 유형, 종, 나이, 무게, 성 및 건강 상태; 치료될 상태 정도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 적용되는 특정 압타머 및 이들의 염을 포함한 다양한 요인에 따라 선정된다. 당업계에 숙련된 의사 또는 수의사는 병적 상태의 진행을 저해, 대항(counter) 또는 저지(arrest)하기 위해 요구되는 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 효과적인 혈장 수준은 본원에 개시된 모든 질병의 치료에 있어서 바람직하게는 500 fM 내지 500 ㎛ 의 범위이다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각은 바람직하게는 매일, 매 둘째 또는 셋째 날, 매주, 매 둘째 주당 단회 투여용법, 또는 매달 또는 매 셋째 달 당일 투여용법으로 투여될 수 있다.
본원에서 개시된 약제가 본원에 개시된 약학조성물을 구성한다는 것도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 유효량의 하나 이상의 핵산을 치료가 요구되는 객체에 투여함을 포함하는, 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예로서, 상기 객체는 질병으로부터 고통받거나 이와 같은 질병으로 진행될 위험성이 있으며, 여기에서 상기 질병은 본원에서 개시된 임의의 질병, 특히 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 임의의 핵산의 사용과 연관된 임의의 질병이다.
본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 정의되는 치료는 추가적 또는 선택적 예방 및/또는 추적치료 (follow-up)을 포함한다.
본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 역으로 지시되지 않는 한, 정의되는 용어 질환 및 장애는 교환가능한 방법으로 사용될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 정의되는 용어 “포함하다(comprise)”는 바람직하게는 이와 같은 정의에 의해 따르거나 서술되는 주제를 한정하고자 함이 아니다. 그러나, 호환적인 구현예로서, 정의되는 용어 “포함하다(comprises)”는 함유하다 (containing)는 의미로 이해될 것이며, 그러므로 그와 같은 정의로 따르거나 서술되는 주제를 한정되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 상기 핵산 분자 및 본원에서 사용된 바와 같은 목표 분자 (target molecules; SDF-1)의 다양한 서열번호(SEQ.ID.Nos.), 화학적 본질, 이의 실질적인 서열 및 내부 참고번호(internal reference number)는 하기 표에 요약된다.
상기 핵산들은 압타머, 즉, 비오틴화된 (biotinylated) 인간 D-SDF-1(서열번호 4)로 표지된 D-핵산 수준(D-RNA), 또는 스피에겔머, 즉, SDF-1의 자연형 배위를 갖는 L-핵산(L-RNA)인 L-SDF-1(인간 SDF-1알파, 서열번호 1)의 수준으로 특정됨을 주목하여야 할 것이다. 상기 상이한 핵산들은 1개의 내부 참고 명칭을 공유하나 D-RNA(압타머) 분자 및 L-RNA (스피에겔머)에는 각각 1개의 서열번호만이 공유된 다.
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
1 L-펩티드 KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLK WIQEYLEKALNK 인간/원숭이/고양이 SDF - 1알파 ,
인간/원숭이/고양이 SDF -1
2 L- 펩티드 KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLK WIQEYLEKALNKRFKM 인간/원숭이/고양이 SDF-1β
3 L- 펩티드 KPVSLSYRCPCRFFESHIARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLK WIQEYLEKALNK 설치류 SDF-1 알파, 설치류 SDF -1
4 D- 펩티드 KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFK-Biotin 비오틴화 hu D-SDF-1
5 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001
6 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192- G10
7 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCGCAGC 192-F10
8 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-B11
9 L-RNA (스피에겔머) GCUGUAAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-C9
10 L-RNA (스피에겔머) GCUGUAAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-E10
11 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-C10
12 L-RNA (스피에겔머) GCAGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-D11
13 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACUGC 192-G11
14 L-RNA (스피에겔머) GCUAUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCAUAGC 192-H11
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
15 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCUGCGAAAGCGACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192- D10
16 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCACAGC 192-E9
17 L-RNA (스피에겔머) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-H9
18 L-RNA (스피에겔머) AGCGUGAAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAACCACGCU 191-A6
19 L-RNA (스피에겔머) AAAGYRACAHGUMAAXAUGAAAGGUARC; XA = A 또는 부재 A 형 공식-1
20 L-RNA (스피에겔머) AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC A 형 공식 -2
21 L-RNA (스피에겔머) AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC A 형 공식 -3
22 L-RNA (스피에겔머) AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC A 형 공식 -4
23 L-RNA (스피에겔머) RSHRYR A 형 공식 -5-5′
24 L-RNA (스피에겔머) YRYDSY A 형 공식 -5-3′
25 L-RNA (스피에겔머) CUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAG 192-A10-002
26 L-RNA (스피에겔머) UGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCA 192-A10-003
27 L-RNA (스피에겔머) GUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGC 192-A10-004
28 L-RNA (스피에겔머) UGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCG 192-A10-005
29 L-RNA (스피에겔머) GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
30 L-RNA (스피에겔머) AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
31 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
32 L-RNA (스피에겔머) GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
33 L-RNA (스피에겔머) GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
34 L- RNA ( 스피에겔머 ) CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
35 L-RNA (스피에겔머) GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
36 L-RNA (스피에겔머) GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
37 L-RNA (스피에겔머) CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
38 L-RNA (스피에겔머) GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
39 L-RNA (스피에겔머) GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
40 L-RNA (스피에겔머) GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
41 L-RNA (스피에겔머) CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
42 L-RNA (스피에겔머) X2BBBS; X2 = S 또는 부재 A 형 공식 -6-5
43 L-RNA (스피에겔머) SBBVX3; X3 = S 또는 부재 A 형 공식 -6-3
44 L-RNA (스피에겔머)) X1X2NNBV; X1 = R 또는 부재, X2 = S 또는 부재 A 형 공식 -7-5
45 L-RNA (스피에겔머) BNBNX3X4; X3 = R 또는 부재, X4 = Y 또는 부재 A 형 공식 -7-3
46 L-RNA (스피에겔머) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-C2-001
47 L-RNA (스피에겔머) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-G2-001
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
48 L- RNA ( 스피에겔머 ) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGCU 193-F2-001
49 L-RNA (스피에겔머) GCGAGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-G1-002
50 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-D2-002
51 L-RNA (스피에겔머) GCAUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCCC 193-A1-002
52 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGGACGC 193-D3-002
53 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-B3-002
54 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-H3-002
55 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGUUCCUAGUCAGGUAUGC 193-E3-002
56 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUUAGGUACGC 193-D1-002
57 L- RNA ( 스피에겔머 ) GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG B 형 공식-1
58 L-RNA (스피에겔머) GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG B 형 공식 -2
59 L-RNA (스피에겔머) X1GCRWG; X1 = A 또는 부재 B 형 공식 -3-5′
60 L-RNA (스피에겔머) KRYSCX4; X4 = U 또는 부재 B 형 공식 -3-3′
61 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-C2-002
62 L-RNA (스피에겔머) CGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACG 193-C2-003
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
63 L- RNA ( 스피에겔머 ) GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUAC 193- C2 -004
64 L-RNA (스피에겔머) UGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUA 193-C2-005
65 L-RNA (스피에겔머) GGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGU 193-C2-006
66 L-RNA (스피에겔머) GUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGG 193-C2-007
67 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193- G2 -012
68 L-RNA (스피에겔머) GCGCGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGCGCGC 193-G2-013
69 L-RNA (스피에겔머) GCGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCGC 193-G2-014
70 L-RNA (스피에겔머) GGGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCCC 193-G2-015
71 L-RNA (스피에겔머) GGCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGCC 193-G2-016
72 L-RNA (스피에겔머) GCCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGGC 193-G2-017
73 L-RNA (스피에겔머) X2SSBS; X2 = G 또는 부재 B 형 공식-4-5′
74 L-RNA (스피에겔머) BVSSX3; X3 = C 또는 부재 B 형 공식 -4-3′
75 L-RNA (스피에겔머) X1GCGUG; X1 = A 또는 부재 B 형 공식 -5-5′
76 L-RNA (스피에겔머) UACGCX4; X4 = U 또는 부재 B 형 공식 -5-3′
77 L-RNA (스피에겔머) X1X2SVNS; X1 = A 또는 부재, X2 = G 또는 부재 B 형 공식 -6-5′
78 L-RNA (스피에겔머) BVBSX3X4; X3 = C 또는 부재, X4 = U 또는 부재 B 형 공식 -6-3′
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
79 L- RNA ( 스피에겔머 ) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
80 L-RNA (스피에겔머) AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
81 L-RNA (스피에겔머) GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
82 L-RNA (스피에겔머) CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCACG 190-A3-001
83 L-RNA (스피에겔머) AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
84 L-RNA (스피에겔머) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGCAC 197-H3
85 L-RNA (스피에겔머) GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGCAC 197-B1
86 L-RNA (스피에겔머) GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-E3
87 L-RNA (스피에겔머) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-H2
88 L-RNA (스피에겔머) GUGCUGCCGGGGUUAGGGCUAA-AGUCGGCCGACAGCAC 197-D1
89 L-RNA (스피에겔머) GUGCUGUGGGGGUCAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-D2
90 L-RNA (스피에겔머) GGUYAGGGCUHRXAAGUCGG; XA = A 또는 부재 C 형 공식-1
91 L-RNA (스피에겔머) GGUYAGGGCUHRAAGUCGG C 형 공식 -2
92 L-RNA (스피에겔머) GGUYAGGGCUHRAGUCGG C 형 공식 -3
93 L-RNA (스피에겔머) GGUUAGGGCUHGAAGUCGG C 형 공식 -4
94 L-RNA (스피에겔머) UGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCA 190-A3-003
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
95 L- RNA ( 스피에겔머 ) GAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUC 190-A3-004
96 L-RNA (스피에겔머) GGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCU 190-A3-007
97 L-RNA (스피에겔머) GCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGC 191-D5-002
98 L-RNA (스피에겔머) CGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACG 191-D5-003
99 L-RNA (스피에겔머) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACCG 191-D5-004
100 L-RNA (스피에겔머) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCCG 191-D5-005
101 L-RNA (스피에겔머) CGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCG 191-D5-006
102 L-RNA (스피에겔머) CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007
103 L-RNA (스피에겔머) GGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCC 191-D5-010
104 L-RNA (스피에겔머) CCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGG 191-D5-017
105 L-RNA (스피에겔머) CCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGG 191-D5-029
106 L-RNA (스피에겔머) GGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCC 191-D5-024
107 L-RNA (스피에겔머) CCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGG 191-D5-017-29a
108 L-RNA (스피에겔머) GCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGC 191-D5-017-29b
109 L-RNA (스피에겔머) CCCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGGG 191-D5-019-29a
110 L-RNA (스피에겔머) CGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCG 191-D5-024-29a
111 L-RNA (스피에겔머) GGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCC 191-D5-024-29b
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
112 L- RNA ( 스피에겔머 ) UGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCA 197-B2-001
113 L-RNA (스피에겔머) GCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGC 197-B2-002
114 L-RNA (스피에겔머) CUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAG 197-B2-003
115 L-RNA (스피에겔머) UGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCA 197-B2-004
116 L-RNA (스피에겔머) GCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGC 197-B2-005
117 L-RNA (스피에겔머) GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006
118 L-RNA (스피에겔머) GGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCC 197-B2-006-31a
119 L-RNA (스피에겔머) CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b
120 L-RNA (스피에겔머) RKSBUSNVGR C 형 공식-5-5′
121 L-RNA (스피에겔머) YYNRCASSMY C 형 공식 -5-3′
122 L-RNA (스피에겔머) RKSBUGSVGR C 형 공식 -6-5′
123 L-RNA (스피에겔머) YCNRCASSMY C 형 공식 -6-3′
124 L-RNA (스피에겔머) XSSSSV; Xs = S 또는 부재 C 형 공식 -7-5′
125 L-RNA (스피에겔머) BSSSXS; Xs = S 또는 부재 C 형 공식 -7-3′
126 L-RNA (스피에겔머) SGGSV C 형 공식 -8-5′
127 L-RNA (스피에겔머) YSCCS C 형 공식 -8-3′
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
128 L- RNA ( 스피에겔머 ) GCSGG C 형 공식 -9-5′
129 L-RNA (스피에겔머) CCKGC C 형 공식 -9-3′
130 L-RNA (스피에겔머) SSSSR C 형 공식 -10-5′
131 L-RNA (스피에겔머) YSBSS C 형 공식 -10-3
132 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-G2-012-5′-PEG, NOX-A12-JE40
133 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008-5′-PEG
134 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007-5′-PEG
135 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006-5′-PEG
136 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b-5′PEG
137 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001-5′-PEG
192-A10-001-5′-PEG40
138 L-RNA (스피에겔머) UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU 대조군 스피에겔머
139 L-RNA (스피에겔머) 5′30　kDa-PEG-GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001-5′-PEG30
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
140 L- RNA ( 스피에겔머 ) 5′-100　 kDa - HES - GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001-5′- HES100
141 L-RNA (스피에겔머) 5′-130　kDa-HES-GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001-5′- HES130
142 L-RNA (스피에겔머) CGUGGUCCGUUGUGUCAGGUCUAUUCGCCCCGGUGCAGGGCAUCCGCG 194-A2-001
143 L-RNA (스피에겔머) GCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAGGUGAG 196-B12-003
144 L-RNA (스피에겔머) CAACAGCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAG 196-B12-004
145 D- RNA ( 압타머 ) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-A10-001
146 D- RNA ( 압타머 ) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192- G10
147 D-RNA (압타머)) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCGCAGC 192-F10
148 D-RNA (압타머) GCUGUGAAAGUAACACGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-B11
149 D-RNA (압타머) GCUGUAAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-C9
150 D-RNA (압타머) GCUGUAAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACUACAGC 192-E10
151 D-RNA (압타머) GCUGUGAAAGUAACAAGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-C10
152 D-RNA (압타머) GCAGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACAGC 192-D11
153 D-RNA (압타머) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCACUGC 192-G11
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
154 D- RNA ( 압타머 ) GCUAUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAACCAUAGC 192- H11
155 D-RNA (압타머) GCUGCGAAAGCGACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-D10
156 D-RNA (압타머) GCUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCACAGC 192-E9
157 D-RNA (압타머) GCUGUGAAAGUAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAGC 192-H9
158 D-RNA (압타머) AGCGUGAAAGUAACACGUAAAAUGAAAGGUAACCACGCU 191-A6
159 D-RNA (압타머) CUGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCAG 192-A10-002
160 D-RNA (압타머) UGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCA 192-A10-003
161 D-RNA (압타머) GUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGC 192-A10-004
162 D-RNA (압타머) UGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCG 192-A10-005
163 D-RNA (압타머) GAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCC 192-A10-006
164 D-RNA (압타머) AAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGC 192-A10-007
165 D-RNA (압타머) GCGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-008
166 D-RNA (압타머) GCGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCGC 192-A10-015
167 D-RNA (압타머) GCGGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCCGC 192-A10-014
168 D- RNA ( 압타머 ) CGUGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGCG 192-A10-016
169 D-RNA (압타머) GCGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGUGC 192-A10-017
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
170 D- RNA ( 압타머 ) GUGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCGC 192-A10-018
171 D-RNA (압타머) CGCGAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCCGUG 192-A10-019
172 D-RNA (압타머) GGGCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGCCC 192-A10-020
173 D-RNA (압타머) GGCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGCC 192-A10-021
174 D-RNA (압타머) GCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGC 192-A10-022
175 D-RNA (압타머) CCCCAAAGCAACAUGUCAAUGAAAGGUAGCGGGG 192-A10-023
176 D-RNA (압타머) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-C2-001
177 D-RNA (압타머) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGCU 193-G2-001
178 D-RNA (압타머) AGCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGCU 193-F2-001
179 D-RNA (압타머) GCGAGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-G1-002
180 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCGC 193-D2-002
181 D-RNA (압타머) GCAUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUGCCC 193-A1-002
182 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAUGGCUGAUCCUAGUCAGGGACGC 193-D3-002
183 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-B3-002
184 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAAAGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-H3-002
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
185 D- RNA ( 압타머 ) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGUUCCUAGUCAGGUAUGC 193- E3 -002
186 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUUAGGUACGC 193-D1-002
187 D-RNA (압타머) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193-C2-002
188 D-RNA (압타머) CGUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACG 193-C2-003
189 D-RNA (압타머) GUGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUAC 193-C2-004
190 D-RNA (압타머) UGGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGUA 193-C2-005
191 D-RNA (압타머) GGUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGGU 193-C2-006
192 D-RNA (압타머) GUGUGAUCUAGAUGUAGUGGCUGAUCCUAGUCAGG 193-C2-007
193 D- RNA ( 압타머 ) GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC 193- G2 -012
194 D-RNA (압타머) GCGCGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGCGCGC 193-G2-013
195 D-RNA (압타머) GCGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCGC 193-G2-014
196 D-RNA (압타머) GGGCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGCCC 193-G2-015
197 D-RNA (압타머) GGCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGCC 193-G2-016
198 D-RNA (압타머) GCCCGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGGGGC 193-G2-017
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
199 D- RNA ( 압타머 ) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-B2
200 D-RNA (압타머) AGCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGCU 191-D5-001
201 D-RNA (압타머) GUGUUGCGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCAGCAGCAC 197-H1
202 D-RNA (압타머) CGUGCGCUUGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCACG 190-A3-001
203 D-RNA (압타머) AGCGUGAAGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCUGACACGCU 191-A5
204 D-RNA (압타머) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCGAAGUCGGCCCGCAGCAC 197-H3
205 D-RNA (압타머) GUGUUCCCGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCGGCAGCAC 197-B1
206 D-RNA (압타머) GUGUUGCAGGGGUUAGGGCUUGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-E3
207 D-RNA (압타머) GUGCUGCGGGGGUUAGGGCUCAAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-H2
208 D-RNA (압타머) GUGCUGCCGGGGUUAGGGCUAA-AGUCGGCCGACAGCAC 197-D1
209 D-RNA (압타머) GUGCUGUGGGGGUCAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCAC 197-D2
210 D-RNA (압타머) UGAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUCA 190-A3-003
211 D-RNA (압타머) GAGAUAGGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCUC 190-A3-004
212 D-RNA (압타머) GGGGUUAGGGCUUAAAGUCGGCUGAUUCU 190-A3-007
213 D-RNA (압타머) GCGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACGC 191-D5-002
214 D-RNA (압타머) CGUGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACACG 191-D5-003
서열번호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
215 D- RNA ( 압타머 ) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGACCG 191- D5 -004
216 D-RNA (압타머) CGGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCCG 191-D5-005
217 D-RNA (압타머) CGGCGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCGCCG 191-D5-006
218 D-RNA (압타머) CGGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCCG 191-D5-007
219 D-RNA (압타머) GGGAGGUUAGGGCUAGAAGUCGGUCCC 191-D5-010
220 D-RNA (압타머) CCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGG 191-D5-017
221 D-RNA (압타머) CCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGG 191-D5-029
222 D-RNA (압타머) GGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCC 191-D5-024
223 D-RNA (압타머) CCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGG 191-D5-017-29a
224 D-RNA (압타머) GCCGCGGUUAGGGCUAGAAGUCGGGCGGC 191-D5-017-29b
225 D-RNA (압타머) CCCCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGGGG 191-D5-019-29a
226 D-RNA (압타머) CGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCG 191-D5-024-29a
227 D-RNA (압타머) GGGCGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCGCCC 191-D5-024-29b
228 D-RNA (압타머) UGCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGCA 197-B2-001
서 열번 호 RNA /펩티드 서열 내부참고번호
229 D- RNA ( 압타머 ) GCUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAGC 197-B2-002
230 D-RNA (압타머) CUGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCAG 197-B2-003
231 D-RNA (압타머) UGCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGCA 197-B2-004
232 D-RNA (압타머) GCGGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCUGC 197-B2-005
233 D-RNA (압타머) GCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGC 197-B2-006
234 D-RNA (압타머) GGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCC 197-B2-006-31a
235 D-RNA (압타머) CGCCGGGGUUAGGGCUAGAAGUCGGCCGGCG 197-B2-006-31b
236 D-RNA (압타머) CGUGGUCCGUUGUGUCAGGUCUAUUCGCCCCGGUGCAGGGCAUCCGCG 194-A2-001
236 D-RNA (압타머) GCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAGGUGAG 196-B12-003
238 D-RNA (압타머) CAACAGCAGUGUGACGCGGACGUGAUAGGACAGAGCUGAUCCCGCUCAG 196-B12-004
239 L-RNA (스피에겔머) 5′-PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU PEG화 대조군 스피에겔머
240 L-RNA (스피에겔머) 5′30　kDa-PEG-GCGUGGUGUGAUCUAGAUGUAUUGGCUGAUCCUAGUCAGGUACGC NOX-A12-NO30
241 L-RNA (스피에겔머) 5′40　kDa-PEG-CGCAUGGACUGAUCCUAGUCGGUUAUGUAGAUCUAGUGUGGUGCG revNOX-A12-JE40
도 1은 인간 SDF-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프(motiff) (“A 형(Type A)”)를 나타내는 인간 SDF-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 나타낸 것이며;
도 2는 RNA 리간드 192-A10-001(서열 모티프 “A형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 3은 RNA 리간드 192-A10-001(서열 모티프 “A형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 4는 인간 SDF-1 및 RNA 리간드 유도체 192-A10-001에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 ("B 형(Type B)")를 나타내는 인간 SDF-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 나타낸 것이며;
도 5는 RNA 리간드들인 193-C2-001 및 193-G2-001 (서열 모티프 “B형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체들을 나타낸 것이며;
도 6은 RNA 리간드들 193-C2-001 및 193-G2-001 (서열 모티프 “B형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체들을 나타낸 것이며;
도 7은 인간 SDF-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 (“C 형(Type C)”)를 나타내는 인간 SDF-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 나타낸 것이며;
도 8은 RNA 리간드 190-A3-001 (서열 모티프 “C형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 9는 RNA 리간드 190-D5-001 (서열 모티프 “C형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 10은 RNA 리간드 190-D5-001 (서열 모티프 “C형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 11은 RNA 리간드 197-B2 (서열 모티프 “C형”의 인간 SDF-1 RNA 리간드)의 유도체를 나타낸 것이며;
도 12는 인간 SDF-1에 결합하는 추가적인 RNA 리간드들을 나타낸 것이며;
도 13은 인간 SDF-1 농도에 대한 형광 신호로 표시된 바와 같이, 다양한 SDF-1 농도에 대한 Jurkat 인간 T 세포 백혈구의 이동 3시간 후에 인간 SDF-1에 대한 용량-반응 곡선이 얻어지는 측면에서, Jurkat 인간 T 세포 백혈구의 인간 SDF-1-유도성 화학주성을 나타낸 것이며;
도 14는 비오틴화 인간 D-SDF-1 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시된 바와 같이, 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 SDF-1 결합 압타머 192-A10-001의 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 15는 화학주성 어세이 상에서 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 192-A10-001의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머 192-A10-001의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머 192-A10-001와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 16은 1 nM 및 5 nM 비-표지된 압타머들인 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 및 192-H9-001에 대한 표지된 압타머 192-A10-001(비-표지된 압타머에 의해 치환되는 기준으로서 사용됨)의 결합능으로 표시된 바와 같이, 37℃에서 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 SDF-1 결합하는 압타머들인 192-A10-001, 192-F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 및 192-H9-001의 경쟁적 결합능 분석결과를 나타낸 것이며;
도 17은 비오틴화 인간 D-SDF-1 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시된 바와 같이, 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 SDF-1 결합 압타머 192-A10-008의 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 18은 시간에 대한 반응(RU)으로 표시된 바와 같이, 아민 결합 공정 통해 Pioneer F1 센서 칩에 고정화된 인간 SDF-1에 결합하는 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 192-A10-008의 KD치를 나타내는 Biacore 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며, 추가적으로 스피에겔머 192-A10-008 및 192-A10-001의 KD치, 온- 및 오프-비율 (on and off-rates)이 기록되어 있으며;
도 19는 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머 192-A10-008의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머 192-A10-008의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머 192-A10-008와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 20은 시간에 대한 반응(RU)으로 표시된 바와 같이, 아민 결합 공정 통해 Pioneer F1 센서 칩에 고정화된 인간 SDF-1에 결합하는 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 193-G2-001의 KD치를 나타내는 Biacore 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며, 추가적으로 스피에겔머 193-G2-001 및 193-C2-001의 KD치, 온- 및 오프-비율이 기록되어 있으며;
도 21은 비오틴화 인간 D-SDF-1 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시된 바와 같이, 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 항-SDF-1 압타머 193-G2-012의 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 22는 500 nM, 50 nM 및 10 nM 비-표지된 압타머들인 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 및 191-D5-007 에 대한 표지된 압타머들인 190-A3-001 또는 191-D5-001(비-표지된 압타머에 의해 치환되는 기준으로서 사용됨)의 결합능으로 표시된 바와 같이, 37℃에서 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 SDF-1 결합하는 압타머들인 190-A3-001, 190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 및 191-D5-007의 경쟁적 결합능 분석결과를 나타낸 것이며;
도 23은 비오틴화 인간 D-SDF-1 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시된 바와 같이, 비오틴화 인간 D-SDF-1에 대한 인간 SDF-1 결합하는 압타머들인 190-A3-004 및 191-D5-007의 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 24는 시간에 대한 반응(RU)으로 표시된 바와 같이, 아민 결합 공정 통해 Pioneer F1 센서 칩에 고정화된 인간 SDF-1에 결합하는 스피에겔머 191-D5-007의 KD치를 나타내는 Biacore 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며, 추가적으로 스피에겔머 191-D5-001, 191-D5-007, 190-A3-003 및 197-B2 의 KD치, 온- 및 오프-비율이 기록되어 있으며;
도 25는 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머 190-A3-004의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머 190-A3-004의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머 190-A3-004와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 26은 화학주성 어세이 상에서 SDF-1와 결합하는 스피에겔머들인 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG 및 191-A10-008-5'-PEG 의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머들인 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG 및 191-A10-008-5'-PEG 의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머들인 193-G2-012-5'-PEG, 197-B2-006-5'-PEG, 191-D5-007-5'-PEG 및 191-A10-008-5'-PEG 와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 27은 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머들인 197-B2-006-5'-PEG 및 197-B2-006-31b-5'-PEG의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머들인 197-B2-006-5'-PEG 및 197-B2-006-31b-5'-PEG의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머들인 197-B2-006-5'-PEG 및 197-B2-006-31b-5'-PEG와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 28은 시간에 대한 반응(RU)으로 표시된 바와 같이, 아민 결합 공정 통해 Pioneer F1 센서 칩에 고정화된 인간 SDF-1에 결합하는 스피에겔머들인 193-G2-012-5'-PEG, 191-A10-008-5'-PEG 및 191-A10-001-5'-PEG의 KD치를 나타내는 Biacore 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 29는 시간에 대한 반응(RU)으로 표시된 바와 같이, 아민 결합 공정 통해 Pioneer F1 센서 칩에 고정화된 인간 SDF-1에 결합하는 스피에겔머들인 197-B2-006-5'-PEG, 197-B2-006-31b-5'-PEG 및 191-D5-007-5'-PEG의 KD치를 나타내는 Biacore 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 30은 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머들인 192-A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 및 192-A10-001-5'-HES100의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머들인 192-A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 및 192-A10-001-5'-HES100의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머들인 192-A10-001, 192-A10-001-5'-HES130 및 192-A10-001-5'-HES100와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 31은 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머들인 192-A10-001,192-A10-001-5'-PEG30 및 192-A10-001-5'-PEG40의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머들인 192-A10-001, 192-A10-001-5'-PEG30 및 192-A10-001-5'-PEG40의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머들인 192-A10-001,192-A10-001-5'-PEG30 및 192-A10-001-5'-PEG40와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 32는 화학주성 어세이 상에서 대조군-스피에겔머의 비유효성을 나타낸 것이며; 대조군 스피에겔머의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 대조군 스피에겔머와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 인간 또는 설치류(murine) SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 33은 형광신호로 표시된 바와 같이, 다양한 SDF-1 농도에 대한 Jurkat 인간 T 세포 백혈구의 이동 3시간 후에 SDF-1에 대한 용량-반응 곡선이 얻어지는 측면에서, Jurkat 인간 T 세포 백혈구의 설치류 SDF-1-유도성 화학주성을 나타낸 것이며;
도 34는 화학주성 어세이 상에서 SDF-1 결합하는 스피에겔머들인 192-A10-001 및 191-D5-007-5'PEG의 유효성을 나타낸 것이며; 스피에겔머들인 192-A10-001 및 191-D5-007-5'PEG의 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 바와 같이, 세포들은 다양한 용량의 스피에겔머들 192-A10-001 및 191-D5-007-5'PEG와 37℃에서 전배양한 0.3 nM 설치류 SDF-1으로의 이동이 허용되는 단계를 나타낸 것이며;
도 35는 스피에겔머 192-A10-001의 농도에 대한 특이적으로 결합한 [125J]-SDF-1α의 플롯화(plot)된 바와 같이, CXCR4-수용체 결합능 분석 상에서 다양한 용량의 스피에겔머 192-A10-001와 37℃에서 전배양한 인간 [125J]-SDF-1α을 사용하여 SDF-결합하는 스피에겔머 192-A10-001의 유효성을 나타낸 것이며;
도 36은 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 192-A10-001에 의해 1 nM 인간 SDF-1α와 CXCR4-발현하는 세포의 MAP-키나아제(kinase) 자극의 저해를 나타낸 것이며;
도 37은 랫트 대동맥으로부터 분리된 환상(ring)은 콜라겐 세포간질(collagen matrix)에 묻힌 후, SDF-1와 스피에겔머를 포함 및 비포함하여 6일 동안 배양하는 환상 대동맥 발생 분석법 (aortic ring sprouting assay) 상에서 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG 및 PEG화된 대조군 스피에겔머에 의해 SDF-1 유도된 발생의 저해를 나타낸 것(a: 대조군, b: 10 nM SDF-1, c: 10 nM SDF-1+1 μM 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG, d: 10 nM SDF-1+1 μM PEG화된 대조군 스피에겔머)이며;
도 38은 발생수치(sprouting indices)가 각 조건당 5 환상(ring)에 대한 평균± 표준편차 (mean± SD) 값으로 나타나는, 대동맥 발생 분석법 (aortic ring sprouting assay) 상에서 인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG 및 PEG화된 대조군 스피에겔머에 의해 SDF-1 유도된 발생의 저해를 나타낸 것(*: 대조군에 비해 SDF-1의 값은 유의적 차이있음 (Mann-Whitney-test; p=0.009); **: SDF의 값에 비해 SDF-1+인간 SDF-1 결합하는 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG의 값은 유의적 차이있음 (Mann-Whitney-test; p=0.028)이며;
도 39는 실시예 10에 따른 줄기 세포 방출 데이터(stem cell liberation data)를 얻는데 적용하는 동물 치료 및 방법을 도식화하여 나타낸 것이며;
도 40은 NOX-A12-JE40, NOX-A12-NO30, revNOX-A12-JE40 (대조군 스피에겔머), AMD3100, G-CSF (뉴포겐; Neupogen) 또는 담체군 (5% 포도당)을 정맥 내 주사 후 1 내지 48시간 후에 방출되는 혈장 μl 당 ;CD117+ 및 Ly-6 A/E+ 세포 (조혈 줄기 세포 / 조혈 전구 세포)의 절대적인 수를 나타내며 (상기 그래프는 평균치 및 표준 편차를 표시함);
도 41은 투여 계획(legend)에 나타난 바와 같이, NOX-A12-유도체 및 AMD3100로 6시간, 48 h for G-CSF (뉴포겐) 및 담체 주사로 48시간 후에 C57BL/6 마우스 혈액 당 집락 혈성 단위(colony forming units)을 나타내며 (상기 도표는 각각 3중 실험한 5마리의 평균치 및 표준 편차를 표시함) ;
도 42는 마우스에서 레이져-유도된 맥락막 신생혈관형성증 실험결과를 나타내며(여기에서 NOX-A12-JE40는 동일 동물 (좌측 도표)의 담체-처치 안구 (링거 액; Ringer solution)에서의 신생혈관형성 넓이와 직접 비교시 NOX-A12-JE40 처치 안구에서의 신생혈관형성 넓이와 감소하였음을 나타낸 것이며(레이져 손상후 NOX-A12-JE40 및 담체 처치 마우스(vehicle-treated mouse) 안구에서의 개개 부위의 신생혈관형성 넓이 중심값은 우측 도표에 나타냄) ;
도 43은 담체(vehicle), NOX-A12-JE40, revNOX-A12-JE40 (대조 스피에겔머)로 반복 처치된 일측 신절제되거나 (uninephrectomy), 되지 않은 건강한 마우스 및 당뇨병성 마우스에서의 실험 결과를 나타낸 것이며 (상기 NOX-A12-JE40는 사구체경화증 지수 (glomerulosclerosis scores)를 개선함);
도 44는 유리체강내 VEGF 투여로 망막 혈관 누수(retinal vascular leakage)를 유도하고 상이한 농도의 SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40, 담체 또는 Kenacort retart로 처치된 망막 혈관 누수 동물 실험 모델에서의 실험 결과를 나타내며 (이 실험 모델에서 망막 혈관구조의 투과성은 유리체강내 VEGF 투여 48시간 후에 형광광도 측정법(fluorescein photometry)으로 측정함);
도 45는 당뇨병성 망막병증 또는 AMD에서 관찰되는 바와 같이, 망막의 저산소증-유도 신생혈관형성증의 모방을 위한 실험 모델인 산소-유도 망막병증(oxygen-induced retinopathy)의 마우스 실험 모델에서의 개개 마우스의 망막병증 점수 (retinopathy scores)를 나타낸 것이며 (담체 처치 안구 (vehicle treated eye) [x-축] 대(vs) 스피에겔머 NOX-A12-JE40 처치 안구 [y-축]);
도 46은 당뇨병성 망막병증 또는 AMD에서 관찰되는 바와 같이, 망막의 저산소증-유도 신생혈관형성증의 모방을 위한 실험 모델인 산소-유도 망막병증(oxygen-induced retinopathy)의 마우스 실험 모델에서 측정되는 바와 같이, 각각 개별적인 망막병증의 측정된 매개변수 (parameter) 및 망막병증 점수 (retinopathy scores)에 대한 스피에겔머 NOX-A12-JE40 처치 안구 및 담체 처치 안구 간의 통계학적 차이 (p 값)을 나타낸 것이며(상기 p-값은 특정 시험법(Wilcoxon signed-ranks test)을 이용하여 측정됨);
도 47은 13.4(올리고 부분(oligo part)과 관련되어 계산된) SDF-1 결합 핵산 NOX-A12-JE40의 정맥 내 투여 후 백혈구 세포 측정 결과를 나타낸 것이며 (여기에서 NOX-A12_JE40는 역으로 풍부한 수의 백혈구를 동원하나 담체 (5% 포도당) 투여군은 고정적이므로 담체 (5% 포도당) 투여후 1회 측정만 수행함);
도 48은 1990-2000년 사이의 유럽에서 발생한 동종 조혈 줄기 세포 이식 (약어 HSCT) 및 환자수에 대한 전체적인 표시를 나타낸 것이며 (Gratwohl, Baldomero 등 2002);
도 49는 1990-2000년 사이의 유럽에서 발생한 동종 조혈 줄기세포 이식 (약어 HSCT) 및 환자수에 대한 전체적인 표시를 나타낸 것이다 (Gratwohl, Baldomero 등 2002).
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 인간 SDF -1과 결합하는 핵산
목표(target)로서 비오틴화(biotinylated) 인간 D-SDF-1을 이용하여, 인간 SDF-1과 결합하는 몇가지 핵산은 도 1 내지 도 12에 묘사된 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 상기 핵산은 압타머(aptamer), 즉, 비오틴화 인간 D-SDF-1와 D-핵산 수준(level), 또는 스피에겔머(Spiegelmer) 수준, 즉, SDF-1의 자연 배위(L-SDF-1)와 L-핵산의 압타머 상에서 특징화되었다.
상기 압타머들은 비오틴화 인간 D-SDF-1으로 수행되는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull down) 어세이법을 이용하여 비오틴화 인간 D-SDF-1으로 분석되었다(실시예 4). 상기 스피에겔머들은 SDF-1의 자연 배위를 이용하여 Biacore 2000 기기(instrument)를 이용한 표면 플라즈몬 공명기기(surface plasmon resonance measurement)(실시예 6) 및 시험관내(in vitro) 세포배양 화학주성 에세이법(실시예 5)으로 측정되었다.
결국, 핵산은 서로 상이한 서열 모티프(sequence motiff)를 나타내며, 주요 3개 형(types)은 도 1, 2 및 3 (A형), 도 4, 5 및 6 (B형), 도 7, 8, 9, 10 및 11 (C형)에서 정의되었다. 뉴클레오티드 서열 모티프(nucleotide sequence motif)를 정의하기 위하여, 모호한 핵산을 IUPAC 생략 표기법(IUPAC abbreviations)을 이용하여 하기와 같이 정의하였다:
S-강(strong)-G 또는 C;
W-약(weak)-A 또는 U;
R-퓨린(purine)-G 또는 A;
Y-피리미딘(pyrimidine)-C 또는 U;
K-케토(keto)-G 또는 U;
B-A가 아닌(not A)-C 또는 U 또는 G;
D-C가 아닌(not C)-A 또는 G 또는 U;
H-G가 아닌(not G)-A 또는 C 또는 U;
V-U가 아닌(not U)-A 또는 C 또는 G;
N-모두(all)-A 또는 G 또는 C 또는 U.
역으로 지시되지 않는다면, 임의의 핵산 서열 또는 스트레치(streches) 및 박스(boxes)의 서열은 각각 5’→3’ 방향으로 정의된다.
1.1 A형 SDF -1 결합 핵산 ( Type A SDF -1 binding nucleic acids )
도 1에 도시된 바와 같이, A형의 SDF-1 결합 핵산의 모든 서열은 서로 혼성화(hybridize)할 수 있는 5’- 및 3’-말단 스트레치(terminal stretches)에 의해 플랭크된(flanked) 한 핵심(core) 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다.
상기 핵산은 이들의 결합 양상에 대하여 순위를 매기기 위하여 비오틴화 인간 D-SDF-1으로 수행하는 직접 및 경쟁적 풀-다운(pull-down) 결합 어세이법을 이용하여 압타머 수준(level)으로 특징화되었다 (실시예 4). 선택된 서열들은 스피에겔머로 합성 (실시예 3)되었으며 SDF-1의 자연 배위(L-SDF)를 이용하여 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법(실시예 5) 및 Biacore 2000 기기를 이용한 표면 플라즈몬 공명 기기(surface plasmon resonance measurement)(실시예 6) 로 측정하였다.
SDF-1에 대한 결합 친화력에 영향을 미치는 A형의 SDF-1 결합 핵산간에 정의된 박스들(= 밑줄 및 이탤릭체로 표시) 또는 스트레치들의 서열이 상이할 수 있다. A형 SDF-1 결합 핵산으로 요약된 서로 상이한 SDF-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 핵심 뉴클레오티드 서열 및 하기에 개시되는 이들의 뉴클레오티드 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 SDF-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:
A형 SDF-1 결합 핵산의 모든 동정된 서열들의 핵심 뉴클레오티드 서열은 서열 AAAG Y RACA H GU M AA X A UGAAAGGUARC (A형 공식 1)을 공유하며, 상기 XA은 존재하지 않거나 또는 ‘A’일 수 있다. 만일 ‘A’가 존재하지 않으면, 상기 핵심 뉴클레오티드 서열은 A형 공식 2인 AAAG Y RACA H GU M AAUGAAAGGUA R C 으로 요약될 수 있다. 핵심 뉴클레오티드 서열 내에서 추가적인 뉴클레오티드‘A’를 운반하면서 여전히 SDF-1에 결합하는 A형 SDF-1 결합 핵산 191-A6 (핵심 뉴클레오티드 서열: AAAG U AACA C GU A AA A UGAAAGGUA A C )은 호환적인 핵심 뉴클레오티드 서열 ( AAAG Y RACA H GU M AA A UGAAAGGUA R C , A형 공식 3)로 결론지어진다. A형 SDF-1 결합 핵산의 모든 기타 핵산들을 위한 구현예로서, A형 SDF-1 결합 핵산인 192-A10-001은 인간 SDF-1에 대한 결합 친화력으로 특징화된다. 평형 결합 상수 KD 치는 풀-다운 결합 어세이법 (KD=1.5 nM, 도 14) 및 표면 플라즈몬 공명 기기 (KD=1.0 nM, 도 18)을 이용하여 규명되었다. 192-A10-001에 대한 0.12 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다 (도 15). 결론적으로, 도 1에 개시된 모든 A형 SDF-1 결합 핵산은 192-A10-001 에 대한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다 (도 16; 도 16에는 모든 A형 SDF-1 결합 핵산이 측정된 것은 아니다). A형 SDF-1 결합 핵산 192-B11 및 192-C10은 상기 경쟁적 실험상에서 192-A10-001와 동일한 결합 친화력을 나타내었다. A형 SDF-1 결합 핵산 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 및 191-A6에서는 더 약한 결합 친화력이 측정되었다. A형 SDF-1 결합 핵산 192-D10, 192-E9 및 192-H9는 192-A10-001보다 더 약한 결합 친화력을 갖는 것으로 나타났다 (도 16).
상기에 기재된 바와 같이, A형 SDF-1 결합 핵산 192-B11 및 192-C10은 192-A10-001와 SDF-1에 대한 동일한 결합 친화력을 나타낸다. 그러나, 핵심 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열상에서 일부 상이성을 나타낸다. 그러므로 거의 동일한 높은 친화력을 갖고 SDF-1에 결합하는 세 분자의 공통 서열(consensus sequence)은 뉴클레오티드 서열 AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC (A형 공식 4)으로 요약될 수 있으며, 상기 192-A10-001(뉴클레오티드 서열: AAAGCAACAUGUCAAUGAA AGGUAGC )의 핵심 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열은 A형 SDF-1 결합 핵산의 최적 결합 친화력을 갖는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
A형 SDF-1 결합 핵산의 5’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 다섯 또는 여섯 개는 A형 SDF-1 결합 핵산의 3’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 각각 다섯 또는 여섯 뉴클레오티드와 혼성화(hybridize)되어 말단 나선형(terminal helix)을 형성할 수 있다. 상기 뉴클레오티드들은 일부 위치에서 가변성이 있음에도 불구하고, 상이한 뉴클레오티드는 각 5’- 및 3’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 다섯 또는 여섯 개의 혼성화를 허용한다. 도 1에 도시된 바와 같이, A형 SDF-1 결합 핵산의 상기 5’-말단 및 3’-말단 스트레치는 5’-말단 스트레치(‘RSHRYR’, A형 공식 5-5’) 및 3’-말단 스트레치(‘YRYDSY’, A형 공식 5-3’)의 일반식(generic formula)으로 요약될 수 있다. A형 SDF-1 결합 핵산의 절단형 유도체(truncated derivatives)는 본래의 분자 192-A10-001 및 192-A10-008에 대한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다(도 2 및 3). 상기 실험들은 192-A10-001의 여섯 말단 뉴클레오티드(5’말단: GCUGUG; 3’말단: CGCAGC)가 유도체 192-A10-002의 다섯 뉴클레오티드(5’말단: CUGUG; 3’말단: CGCAG)로의 감소가 결합 친화력의 감소 없이도 수행될 수 있음을 나타낸다. 반면에, 넷 말단 뉴클레오티드(5’말단: UGUG; 3’말단: CGCA; 192-A10-003) 또는 그 이하(192-A10-004/-005/-006/-007)의 절단은 SDF-1에 대한 감소된 결합 친화력을 나타내었다(도 2). 도 2 및 3에 도시된 바와 같이, A형 SDF-1 결합 핵산 192-A10-001의 상기 유도체의 다섯 및 넷 뉴클레오티드의 길이를 갖는 규명된 5’-말단 및 3’-말단 스트레치들은 상기 5’-말단 스트레치 (‘X2BBBS’, A형 공식 6-5’) 및 3’-말단 스트레치(‘SBBVX3’, A형 공식 6-3’)의 일반식(generic formula)으로 서술될 수 있으며, 상기 X2은 존재하지 않거나 ‘S’ 이고, X3은 존재하지 않거나‘S’일 수 있다.
상기 5’- 및 3’-말단 스트레치의 뉴클레오티드 서열은 A형 SDF-1 결합 핵산의 결합 친화력에 영향을 미친다. 이는 핵산 192-F10 및 192-E10 뿐만 아니라, 192-A10-001의 유도체에 의해서도 나타난다(도 3). 192-F10 및 192-E10의 핵심 뉴클레오티드 서열은 192-B11 및 192-C10와 동일하나, 5’-말단 스트레치의 3’-말단 및 3’-말단 스트레치의 5’-말단 상에서 일부 상이함을 포함하고 이로써 감소된 결합 친화력을 나타낸다.
A형 SDF-1 결합 핵산인 192-A10-002의 5’- 및 3’-말단 뉴클레오티드 ‘CUGUG’ 및 ‘CGCAG’의 ‘GCGCG’ 및 ‘CGCGC’ (192-A10-015)으로의 치환은 감소된 결합 친화력을 초래하는 반면에, ‘GCGUG’ 및 ‘CGCGC’로의 치환은 192-A10-002와 동일한 결합 친화력을 초래하였다(도 3, 도 18, 도 15, 도 19). 추가적으로, 네 개의 5’- 및 3’-말단 뉴클레오티드를 함유한 A형 SDF-1 결합 핵산 192-A10-001의 아홉 개의 유도체들 (192-A10-014/-015/-016/-017/-018/-019/-020/-021/-022/-023)은 각각 192-A10-001 또는 그의 유도체 192-A10-008 (둘은 SDF-1에 대해 동일한 결합 친화력을 가짐.)에 대한 결합 친화력을 압타머로서 실험하였다. 모든 클론(clones)은 각각 192-A10-001(말단 나선형을 형성하는 여섯 뉴클레오티드) 또는 다섯 말단 뉴클레오티드 갖는 192-A10-008에 비하여 SDF-1에 대하여 약하거나, 보다 약하거나 또는 보다 더 약한 결합 친화력을 나타냈다(도 3). 결론적으로, 5’- 및 3’-말단 스트레치의 뉴클레오티드 숫자 및 서열은 SDF-1에 대한 효과적인 결합을 위해 필수적이다. A형 SDF-1 결합 핵산들인 192-A10-002 및 192-A10-008 에 나타난 바와 같이, 상기 5’- 및 3’-말단 스트레치의 바람직한 조합은 ‘CUGUG’ 및 ‘CGCAG’(A형 SDF-1 결합 핵산인 192-A10-002의 5’- 및 3’-말단 스트레치) 및 ‘GCGUG’ 및 ‘CGCGC’(A형 SDF-1 결합 핵산인 192-A10-008의 5’- 및 3’-말단 스트레치) 이다.
그러나, 실험된 모든 A형 SDF-1 결합 핵산의 5’- 및 3’-말단 스트레치를 조합함으로써, A형 SDF-1 결합 핵산의 5’-말단 스트레치의 일반식은 ‘X1X2NNBV’(A형 공식 7-5’)이고 A형 SDF-1 결합 핵산의 3’-말단 스트레치의 일반식은 ‘BNBNX3X4’이며,
상기 X1은 ‘R’ 또는 존재하지 않거나, X2은 ‘S’, X3은 ‘S’이고, X4은 ’Y’ 또는 존재하지 않거나; 또는
X1은 존재하지 않거나, X2은 ‘S’ 또는 존재하지 않거나, X3은 ‘S’또는 존재하지 않고, X4은 존재하지 않는다.
1.2 B형 SDF -1 결합 핵산
도 4에 도시된 바와 같이, B형의 SDF-1 결합 핵산의 모든 서열은 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’-말단 스트레치에 의해 플랭크된(flanked) 하나의 핵심(core) 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다. 그러나, 이와 같은 혼성화는 상기 분자 내에 반드시 필수적으로 주어지지 않는다.
상기 핵산은 이들의 결합 양상에 대하여 서열화하기 위해 비오틴화 인간 D-SDF-1와 수행하는 직접 및 경쟁적 풀-다운(pull-down) 결합 어세이법을 이용하여 압타머 수준으로 특징화되었다(실시예 4). 선택된 서열들은 스피에겔머로 합성(실시예 3)되었으며 SDF-1의 자연 배위(L-SDF)를 이용하여 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법(실시예 5) 및 Biacore 2000 기기를 이용한 표면 플라즈몬 공명기기(surface plasmon resonance measurement)(실시예 6)으로 측정하였다.
여기에서 정의된 박스들 또는 스트레치들의 서열은 SDF-1에 대한 결합 친화력에 영향을 미치는 B형의 SDF-1 결합 핵산 간에 상이할 수 있다. B형 SDF-1 결합 핵산으로 요약된 서로 상이한 SDF-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 핵심 뉴클레오티드 서열 및 하기에 개시되는 이들의 뉴클레오티드 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 SDF-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:
B형 SDF-1 결합 핵산의 모든 동정된 서열들의 핵심 뉴클레오티드 서열은 서열인 GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG (B형 공식 1)을 공유한다. 핵심 뉴클레오티드 서열의 한 위치가 상이한 B형 SDF-1 결합 핵산들인 193-G2-001, 193-C2-001 및 193-F2-001은 A형 SDF-1 결합 핵산 192-A10-001(풀-다운 결합 어세이법에서 규명된 1.5 nM의 KD치(도 14), 표면 플라즈몬 공명 기기에서 규명된 1.0 nM의 KD치(도 18), 0.12 nM의 IC50 값(도 15))에 대한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다. 시험된 각 세 개의 B형 SDF-1 결합 핵산은 A형 SDF-1 결합 핵산 192-A10-001와 비교하였을때, 인간 SDF-1에 대해 보다 우세한 결합력을 나타냈으며, 193-G2-001의 결합 친화력은 193-C2-001 및 193-F2-001만큼 좋다(도 4). 상기 데이터는 B형 SDF-1 결합 핵산인 193-G2-001, 193-C2-001 및 193-F2-001의 핵심 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열상에서의 상이성은 SDF-1에 대한 결합 친화력에 대한 영향이 없음을 의미한다. 전형적인 B형 SDF-1 결합 핵산인 193-G2-001은 인간 SDF-1에 대한 결합 친화력으로 특징화된다. 평형 결합 상수 KD 치는 풀-다운 결합 어세이법(KD=0.3 nM) 및 표면 플라즈몬 공명 기기(KD=0.5 nM, 도 20)를 이용하여 규명되었다. 193-G2-001에 대한 0.08 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관 내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다. 이와 대조적으로, 핵심 뉴클레오티드 서열의 서열상에서 서로 상이한 B형 SDF-1 결합 핵산들인 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 및 193-D1-002은 좋지 않은 결합력을 나타내었다(도 4). 그 결과로서, SDF-1에 대한 향상된 결합 친화력을 갖고 있는 B형 SDF-1 결합 핵산은 서열 GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG 의 핵심 뉴클레오티드 서열을 공유한다 (B형 공식 2).
B형 SDF-1 결합 핵산의 5’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 넷, 다섯 또는 여섯 개 뉴클레오티드들은 B형 SDF-1 결합 핵산의 3’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 각각 넷, 다섯 또는 여섯 개 뉴클레오티드와 혼성화(hybridize)되어 말단 나선형(terminal helix)을 형성할 수 있다. 상기 뉴클레오티드들은 일부 위치에서 가변성이 있음에도 불구하고, 서로 상이한 뉴클레오티드는 각 5’- 및 3’-말단 스트레치의 여섯 뉴클레오티드 중 네, 다섯 또는 여섯 뉴클레오티드들의 혼성화를 각각 허용한다. 도 4에 도시된 바와 같이, B형 SDF-1 결합 핵산의 상기 5’-말단 및 3’-말단 스트레치는 5’-말단 스트레치(B형 공식 3-5’; ‘X1GCRWG’, 상기 X1은 ‘A’ 또는 존재하지 않음) 및 3’-말단 스트레치(B형 공식 3-3’; ‘KRYSCX4’,′상기 X4은 ‘U’또는 존재하지 않음)의 일반식(generic formula)으로 요약될 수 있다. B형 SDF-1 결합 핵산들인 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 및 193-D3-002은 193-C2-001, 193-G2-001 및 193-F2-001와 동일한 핵심 뉴클레오티드 서열(B형 공식 2)을 공유함에도 불구하고 SDF-1에 대한 약한 결합 친화력을 갖고 있다(도 4). B형 SDF-1 결합 핵산들인 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 및 193-D3-002의 불리한 결합력은 5’- 및 3’-말단 스트레치의 뉴클레오티드의 개수 및 서열에 기인할 수 있다.
B형 SDF-1 결합 핵산인 193-G2-001 및 193-C2-001의 절단형 유도체(truncated derivatives)는 각각 193-G2-001 및 193-G2-012에 대한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 각각 분석되었다(도 5 및 6). 상기 실험들은 B형 SDF-1 결합 핵산인 193-G2-001 및 193-C2-001의 여섯 말단 뉴클레오티드(5’말단: AGCGUG; 3’말단: UACGCU)의 다섯 뉴클레오티드(5’말단: GCGUG; 3’말단: UACGC)로의 감소가 유사한 결합 친화력을 갖는 분자(193-C2-002 및 193-G2-012)를 초래함을 나타내었다. 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant) KD치는 풀-다운 결합 어세이법을 이용하여 규명되었다(KD=0.3 nM, 도 21). 네 개(5’말단: CGUG; 3’말단: UACG; 193-C2-003) 또는 그 이하 개수의 뉴클레오티드 (193-C2-004/193-C2-005/193-C2-006/193-C2-007)로의 절단은 풀-다운 결합 어세이법 실험 상에서 SDF-1에 대한 감소된 결합 친화력을 나타내었다(도 5). 5’- 및 3’-말단에서의 다섯 말단 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 각각 B형 SDF-1 결합 핵산의 결합 친화력에 영향을 미친다. 5’- 및 3’-말단 뉴클레오티드 인‘GCGUG’ 및 ‘UACGC’ (193-C2-002, 193-G2-12)의 ‘GCGCG’ 및 ‘CGCGC’ (193-G2-013)으로의 대체는 감소된 결합 친화력을 유발한다. 추가적으로, 네 염기-대합(base-pairing) 뉴클레오티드 (193-G2-014/ -015/ -016/ -017)의 길이를 갖는 말단 나선형을 갖는 B형 SDF-1 결합 핵산 193-G2-001의 서로 상이한 네 개의 유도체들을 대상으로 실험하였다. 이들 모두 SDF-1에 대해 감소된 결합 친화력을 나타내었다(도 6). 따라서, 5’- 및 3’-말단 뉴클레오티드의 길이 및 서열은, SDF-1에 대한 효과적인 결합을 위해 필수적이다. 도 5 및 6에 도시된 바와 같이, B형 SDF-1 결합 핵산인 193-C2-003 및 193-G2-012의 유도체의 다섯 개 및 네 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 5’- 및 3’-말단 스트레치는, 5’-말단 스트레치 (‘X2SSBS’, B형 공식 4-5’)의 일반식으로 개시되며, 상기 X2은 존재하지 않거나 또는 ‘G’이며, 3’-말단 스트레치 (‘BVSSX3’, B형 공식 4-3’)의 일반식으로 개시되며, 상기 X3은 존재하지 않거나 또는 ‘C’이다. B형 SDF-1 결합 핵산인 193-G2-001 및 193-C2-001 및 이들의 유도체인 193-G2-012 및 193-C2-002에 나타난 바와 같이, 상기 5’- 및 3’-말단 스트레치의 바람직한 조합은 ‘X1GCGUG’(5’-말단 스트레치; B형 공식 5-5’) 및 ‘UACGCX4’ (3’-말단 스트레치; B형 공식 5-3’)이며, 상기 X1은 ‘A’ 또는 존재하지 않고, X4은 ‘U’ 또는 존재하지 않는다.
그러나, 실험된 모든 B형 SDF-1 결합 핵산들의 5’- 및 3’-말단 스트레치를 조합함으로써, B형 SDF-1 결합 핵산의 5’-말단 스트레치의 일반식은 ‘X1X2SVNS’(B형 공식 6-5’)이며, 3’-말단 스트레치 B형 SDF-1 결합 핵산의 일반식은 '‘BVBSX3X4’(B형 공식 6-3’)이며, 상기 X1은 ‘A’ 또는 존재하지 않고, X2은 ‘G’, X3은 ‘C’ 이고 X4은 ‘U’ 또는 존재하지 않고;
또는 X1은 존재하지 않고, X2은 ‘G’ 또는 존재하지 않고, X3은 ‘C’ 또는 존재하지 않고 X4은 존재하지 않는다.
1.3 C형 SDF -1 결합핵산
도 7에 도시된 바와 같이, C형의 SDF-1 결합 핵산의 모든 서열은 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’-말단 스트레치에 의해 플랭크된(flanked) 한 핵심(core) 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다. 그러나, 이와 같은 혼성화는 상기 분자 내에 필수적으로 주어지지 않는다.
상기 핵산은 비오틴화 인간 D-SDF-1와 수행하는 직접 및 경쟁적 풀-다운(pull-down) 결합 어세이법을 이용하여 이들의 결합 능력에 의해 서열화하기 위해 압타머 수준으로 특징화된다(실시예 4). 선택된 서열들은 스피에겔머로서 합성(실시예 3)되었으며, SDF-1의 자연 배위(L-SDF)를 이용하여 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법(실시예 5) 및 Biacore 2000 기기를 이용한 표면 플라즈몬 공명기기(surface plasmon resonance measurement)(실시예 6)로 측정하였다.
정의된 박스들 또는 스트레치들의 서열들은 SDF-1에 대한 결합 친화력에 영향을 미치는 C형의 SDF-1 결합 핵산들 간에 상이할 수 있다. C형 SDF-1 결합 핵산으로 요약된 서로 상이한 SDF-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 핵심 뉴클레오티드 서열 및 하기에 개시되는 이들의 뉴클레오티드 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 SDF-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적인 것이다:
C형 SDF-1 결합 핵산의 모든 동정된 서열들의 핵심 뉴클레오티드 서열은 서열 GGU Y AGGGCU HRX A AGUCGG (C형 공식 1; Type C Formulae-1)을 공유하며, 상기 XA은 존재하지 않거나 또는 ‘A’일 수 있다. C형 SDF-1 결합 핵산인 197-D1을 제외하고는, C형 SDF-1 결합 핵산의 동정된 모든 서열들의 핵심 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 GGU Y AGGGCU HRA AGUCGG C형 공식 2)을 공유한다. 핵심 뉴클레오티드 서열 내에서 한 개의 뉴클레오티드‘A’를 소실하고 있으면서 SDF-1에 결합하고 있는 C형 SDF-1 결합 핵산 197-D1 (핵심 뉴클레오티드 서열: GGUUAGGGCUA A - AGUCGG )은 호환적인 핵심 뉴클레오티드 서열 ( GGU Y AGGGCU HR - AGUCGG , C형 공식 3)로 종결되게 한다. 당초에, 도 5에 도시된 바와 같은, 모든 C형 SDF-1 결합 핵산은, A형 SDF-1 결합 핵산 192-A10-001에 대해 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다 (풀-다운 어세이법 및 표면 플라즈몬 공명 기기에 의해 규명된 KD=1.5 nM; IC50=0.12 nM). C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-001, 197-B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 및 197-E3은 경쟁적 실험상에서 192-A10-001보다 약한 결합 친화력을 나타내었다. 191-A5, 197-B1, 197-D1, 197-H2 및 197-D2은 보다 약한 결합 친화력을 나타내었다(도 7). 이들 분자 또는 그 유도체들은 추가적인 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법, 플라즈몬 공명 기기 및 시험관 내 화학주성 어세이법에 의해 추가적으로 특징화되었다. 인간 SDF-1에 대한 결합 친화력으로 C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-001을 특징화된 반면에, 평형 결합 상수 KD치는 표면 플라즈몬 공명 기기(KD=0.8 nM, 도 24)에 의해 규명되었다. 191-D5-001을 위한 0.2 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다. 인간 SDF-1에 대한 C형 SDF-1 결합 핵산인 197-B2의 결합 친화력은 표면 플라즈몬 공명 기기(KD=0.9 nM)에 의해 규명되었으며, 0.2 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다. 이러한 데이터는 C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-001 및 197-B2이 SDF-1에 대해 유사한 결합 친화력을 갖고 있음을 나타낸다(도 7 및 11).
C형 SDF-1 결합 핵산인 190-A3-001(48 nt)은 17개 뉴클레오티드의 5’-말단 스트레치 및 12개 뉴클레오티드의 3’-말단 스트레치를 포함하고 있으며, 여기에서 한편으로는 5’-말단 스트레치의 5’-말단에 있는 4개 뉴클레오티드 및 3’-말단 스트레치의 3’-말단에 있는 4개 뉴클레오티드는 서로 혼성화(hybridize)하여 말단 나선형을 형성할 수 있다. 추가적으로, 5’-말단 스트레치 상의 뉴클레오티드 ‘UGAGA’는 3’-말단 스트레치 상의 뉴클레오티드 ‘UCUCA’에 혼성화되어 말단 나선형을 형성할 수 있다. 190-A3-001 분자(여기에서 5’- 및 3’-말단 스트레치의 8/9개 뉴클레오티드 중 6개 뉴클레오티드는 서로 간에 혼성화될 수 있음) 의 5’-말단 스트레치의 여덟 뉴클레오티드(‘GAGAUAGG ’) 및 3’-말단 스트레치의 아홉 뉴클레오티드(‘CUGAUUCUC’)로의 감소는 SDF-1에 대한 결합 친화력에 아무런 영향도 미치지 못한다 (190-A3-004; 도 8 및 도 22). 90-A3-004의 평형 결합 상수(equilibrium binding constant) KD치는 풀-다운 어세이법(KD=4.6 nM, 도 23) 및 표면 플라즈몬 공명 기기(KD=4.7 nM)을 이용하여 규명되었다. 190-A3-004에 대한 0.1 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다(도 25). 그러나 5’-말단 스트레치 상에서 두 뉴클레오티드로의 절단은 매우 강한 결합 친화력의 감소를 유발한다(190-A3-007; 도 8 및 도 22).
C형 SDF-1 결합 핵산 191-D5-001, 197-B2 및 197-H1 (핵심 뉴클레오티드 서열: GGUUAGGGCUAGAAGUCGG ), 197-H3/191-A5 (핵심 뉴클레오티드 서열: GGUUAGGGCU C GAAGUCGG ) 및 197-E3/197-B1 (핵심 뉴클레오티드 서열: GGUUAGGGCU U GAAGUCGG )는 거의 동일한 핵심 뉴클레오티드 서열(C형 공식 4; 뉴클레오티드 서열: GGUUAGGGCU H GAAGUCGG ) 을 공유한다. 191-D5-001, 197-B2 및 197-H1은 유사한 5‘- 및 3’-말단 스트레치를 공유하지 않는다(197-H3및 197-E3는 197-B2와 동일한 5‘- 및 3’-말단 스트레치를 갖고 있음). 그러나, 5‘-말단 스트레치의 열 개중 열 개(197-B2, 197-E3, 197-H3) 또는 열 개중 아홉 개(191-D5-001, 197-H1)의 뉴클레오티드는 3’-말단 스트레치의 열 개(191-D5-001, 197-H1) 뉴클레오티드 중 각각의 열(197-B2, 197-E3, 197-H3) 또는 아홉 개와 혼성화될 수 있다(도 7). 그러므로, 상기에 기재된 C형 SDF-1 결합 핵산들인 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 및 197-H3, 또한 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 및 197-D2의 5’-말단 스트레치는 공통적인 일반적 뉴클레오티드 서열 ‘RKSBUSNVGR’(C형 공식 5-5’)을 포함한다. 상기에 기재된 C형 SDF-1 결합 핵산들인 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 및 197-H3, 또한 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 및 197-D2의 3’-말단 스트레치는 공통적으로 일반적 뉴클레오티드 서열 ‘YYNRCASSMY’(C형 공식 5-3’)을 포함하며, 여기에서 상기 C형 SDF-1 결합 핵산들인 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 및 197-H3의 5’및 3’-말단 스트레치가 바람직하다. 상기 C형 SDF-1 결합 핵산들인 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 및 197-H3의 바람직한 5’- 및 3’-말단 스트레치는 일반식 ‘RKSBUGSVGR’(C형 공식 6-5’; 5’-말단 스트레치) 및 ‘YCNRCASSMY’(C형 공식 6-3’; 3’-말단 스트레치)으로 요약될 수 있다.
C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-001의 절단형 유도체(truncated derivatives)은 합성되고 원래 분자인 191-D5-001에 대한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다(도 9, 10 및 도 22). 처음에는 도 9에 도시된 바와 같이, 5’- 및 3’-말단 스트레치의 열 뉴클레오티드(191-D5-001)의 길이는 각각 일곱 뉴클레오티드(191-D5-004)로 축소되었으며, 상기 5’-말단 스트레치 및 3’-말단 스트레치의 각각 열 개중 아홉 개 뉴클레오티드(191-D5-001) 또는 일곱 개중 여섯 개 뉴클레오티드(191-D5-004)는 각각 서로 간에 혼성화 될 수 있다. 상기 5’- 및 3’-말단 스트레치의 일곱 개 뉴클레오티드로의 감소(반면에, 일곱 뉴클레오티드 중의 여섯은 서로 간에 혼성화될 수 있음)는 각각 SDF-1에 대한 감소된 결합 친화력을 초래하였다(191-D5-004). C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-004의 말단 스트레치는 변형되었으며, 상기 191-D5-004의 3’-말단 스트레치 내의 짝지워지지 않는 뉴클레오티드 ‘A’를 ‘C’로 대체하였다(191-D5-005). 상기 변형(modification)은 결합력의 향상을 유발하였다. 상기 유도체, C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-005는 SDF-1에 대하여 191-D5-001와 유사한 결합력을 나타냈다. 더 나아가, 5’- 및 3’-말단 스트레치의 각각 다섯 개 뉴클레오티드로의 절단은 전체 스물아홉 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 분자로 이끌었다(191-D5-007). 191-D5-001와 C형 SDF-1 결합 핵산들인 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 및 197-D2간의 유사성에 기인하거나 191-D5-007의 데이터에 기인하여, 5’-말단 스트레치에 대한 뉴클레오티드 서열 ‘CGGGA’ 와 3’-말단 스트레치에 대한 뉴클레오티드 서열 ‘UCCCG’이 성공적으로 실험 수행되었던, 상기 5’- 및 3’-말단 스트레치는 원칙적으로 다섯 뉴클레오티드로 절단될 수 있음을 짐작할 수 있다(C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-007 010). C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-007은 놀랍게도 SDF-1에 대해 191-D5-001 보다 더 우세하게 결합한다(경쟁적 결합 어세이법을 이용하여 압타머 수준 상에서 규명됨). 191-D5-007의 평형 결합 상수 KD치는 풀-다운 결합 어세이법(KD=2.2 nM, 도 23) 및 표면 플라즈몬 공명 기기(KD=0.8 nM, 도 24)를 이용하여 규명되었다. 191-D5-007에 대한 0.1 nM의 IC50 값(50% 저해 농도)은 시험관내 세포배양 화학주성 어세이법을 이용하여 측정되었다. 더 나아가, 양방향의 말단 스트레치도 네 뉴클레오티드로 절단되었다(191-D5-010, 도 9).
4개의 뉴클레오티드들의 5’-말단 및 3’-말단 스트레치를 갖는 C형 SDF-1 결합 핵산들의 추가적인 유도체들인 191-D5-001 (191-D5-017/-024/-029)은 191-D5-007에 대하여 경쟁적 결합 어세이법 상에서 SDF-1에 대한 감소된 결합 친화성을 또한 나타냈다 (도 10). 각각 5개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 호환적인 5’-말단 및 3’-말단 스트레치들도 추가적으로 시험하였다(191-D5-107-29a, 191-D5-017-19b, 191-D5-109-29a, 191-D5-024-19a, 191-D5-024-29b). 상기 유도체의 5‘-말단 스트레치의 일반식은 ‘XsSSSV’(C형 공식 7-5’) 및 3’-말단 스트레치의 일반식은 ‘BSSSXs’(C형 공식 7-3’)이며, 상기 XS은 존재하지 않거나 또는 ‘S’이다. 시험된 다섯 변형체(variants) 중 두 개는 191-D5-007와 SDF-1에 대한 동일한 결합 친화력을 나타내었다(191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b; 도 10). SDF-1에 대한 최적의 결합 친화력을 나타내며, 다섯 뉴클레오티드(191-D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b)의 각각 5’-말단 및 3’-말단 스트레치에 포함하는 191-D5-001-유도체들의 5’-말단 및 3’-말단 스트레치의 서열은 일반식으로 요약될 수 있다(5’-말단 스트레치: ‘SGGSR’, C형 공식 8-5’; 3’-말단 스트레치: ‘YSCCS’, C형 공식 8-3’).
C형 SDF-1 결합 핵산인 197-B2의 절단 유도체들은 원래 분자인 197-B2 및 191-D5-007에 대해 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법 상에서 분석되었다(도 11). 191-D5-007에 대해 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법을 이용함으로써, 197-B2는 191-D5-007와 SDF-1에 대한 동일한 결합 친화력을 나타냄을 확인하였다. 상기 5’- 말단 및 3’-말단 스트레치들은 열 개 뉴클레오티드 (197-B2)를 5개 뉴클레오티드(197-B2-005)로 감소시켜도 결합 친화도상의 손실이 없으며 여기에서 5’-말단 스트레치 및 3’-말단 스트레치의 뉴클레오티드들은 상호 혼성화가 가능하다. 197-B2-005의 5’-말단(‘GCGGG ’) 및 3’-말단(‘CCUGC ’) 스트레치가 197-B2-006의 ‘GCCGG ’(5’-말단 스트레치) 및 ‘CCGGC ’(3’-말단 스트레치)으로 대체되면, SDF-1에 대한 결합 친화력은 온전히 지속된다. 197-B2 및 191-D5-001 (및 그들의 유도체들)은 동일한 핵심 뉴클레오티드 서열( GGUUAGGGCUAGAAGUCGG )을 공유하므로, 각각 네 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 5’- 및 3’-말단 스트레치를 갖는 191-D5의 다양한 유도체들이 실험 수행함으로써, 5’- 및 3’-말단 스트레치의 추가적인 절단은 생략되었다. 더 나아간 두 유도체들은 각각 5’- 및 3’-말단(5’- 및 3’-말단 스트레치)에 여섯 개의 뉴클레오티드를 포함하도록 설계되었다. 양 분자(197-B2-006-31a 및 197-B2-006-31b)의 SDF-1에 대한 결합 친화력은 191-D5-007 및 197-B2-006에 나타난 바와 같이 동일하다(도 11). SDF-1에 대해 최적의 결합 친화력을 나타내며 각각 다섯 개의 뉴클레오티드를 갖는 5’-말단 및 3’-말단 스트레치를 포함하는 197-B2 유도체들의 5’-말단 및 3’-말단 스트레치의 서열은 일반식(5’-말단 스트레치: ‘GCSGG’, C형 공식 9-5’; 3’-말단 스트레치: ‘CCKGC’, C형 공식 9-3’)으로 요약될 수 있다.
C형 SDF-1 결합 핵산인 191-D5-001(5’-말단 스트레치: ‘SGGSR’, C형 공식 8-5’; 3’-말단 스트레치: ‘YSCCS’, C형 공식 8-3’) 및 197-B2(5’-말단 스트레치: ‘GCSGG’, C형 공식 9-5’; 3’-말단 스트레치: ‘CCKGC’, C형 공식 9-3’)의 절단 유도체들의 바람직한 5’- 및 3’-스트레치들을 조합함으로써, 상기 5’-말단 및 3’-말단 스트레치의 공통된 바람직한 일반식은 ‘SSSSR’(5’-말단 스트레치, C형 공식 10-5’) 및 ‘YSBSS'(3’-말단 스트레치: C형 공식 10-3’)임을 확인하였다.
1.4 더 나아간 SDF -1 결합 핵산
추가적으로, ‘A형’, ‘B형’, 및 ‘C형’의 SDF-1 결합 모티프(motif)을 공유하지 않은 더 나아간 세 개의 SDF-1 결합 핵산이 동정되었다. 이들은 풀-다운 결합 에세이법을 이용하여 압타머로서 분석되었다(도 12).
도 1 내지 12에 나타난 임의의 서열들은 이들의 절단된 형태 및 연장된 형태를 포함하여 본 발명에 따른 핵산들이나, 비록 각각 절단되고 신장된 핵산 분자 형태라도 상기 학산 분자들이 목표에 결합할 수 있는 능력을 갖는다는 전제하에 이들도 포함한다는 것으로 이해되어야 할 것이다.
실시예 2: 40 kda - PEG 및 SDF -결합 스피에겔머의 기타 변형체( modification )
생체 내(in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간(plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 제 3장(chapter 3)에 개시된 바와 같이 스피에겔머들인 193-G2-012, 192-A10-008, 191-D5-007, 197-B2-006 및 197-B2-006-31b을 5’-말단에서 40 kDa 폴리에틸렌글리콜(PEG) 기와 공유 결합시켰다(PEG화된-클론 (PEGylated-clones): 193-G2-012-5’-PEG, 192-A10-008-5’PEG, 191-D5-007-5’PEG, 197-B2-006-5’PEG 및 197-B2-006-31b-5’PEG).
PEG화된 스피에겔머 분자는 세포 배양 시험관 내 실험(in vitro) TAX-어세이법(제 5장) 및 비아코어를 사용하여 플라즈몬 공명 기기(제 6장)에 의해 분석되었다. 모든 40 kDa-PEG-변형된 스피에겔머(40kDa-PEG-modified Spiegelmers)들은 SDF-1 유도된 화학주성(chemotaxis)을 저해하며 낮은 나노 분자량 범위 상에서 SDF-1에 결합할 수 있다(도 26, 27, 28 및 29).
추가적으로, SDF-1 결합 스피에겔머인 192-A10-001은 40kDa-PEG, 30kDa-PEG, 100kDa-HES 또는 130kDa-HES을 이용하여 변형되었다(PEG화된 클론: 192-A10-001-5’PEG40, 192-A10-001-5’PEG30, 192-A10-001-5’HES100, 192-A10-001-5’HES130; 제 3장의 결합(coupling) 방법 참조). 도 30 및 도 31에 도시화된 바와 같이, PEG-기 또는 HES-기 모두가 SDF-1 유도된 화학주성을 저해하는 스피에겔머 효력에 어떠한 영향도 미치지 못한다.
실시예 3. 압타머 및 스피에겔머의 합성 및 유도체화
3.1 소규모 합성법
압타머 및 스피에겔머들은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학법(Damha 및 Ogilvie, 1993)을 이용한 ABI 394 합성기로 고체-상 합성법(solid-phase synthesis)으로 생산하였다. D- 및 L- 입체 배위를 갖는 rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, 및 rU-포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 압타머 및 스피에겔머들은 겔 전기영동법(Gel electrophoresis)로 정제하였다.
3.2 대규모 합성법 및 변형
상기 스피에겔머들은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학법(Damha 및 Ogilvie, 1993)을 이용한 100 합성기(Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg)로 고체-상 합성법(solid-phase synthesis)으로 생산하였다. L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU- 포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 5’-아미노-변형기 (amino-modifier)는 회사(American International Chemicals Inc. Framingham, MA, USA)에서 구입하였다. 상기 스피에겔머의 합성은 L-riboG, L-riboC, L-riboA, L-riboU 각각 변형된 CPG 공극 크기 1000 Å (Link Technology, Glasgow, UK)로 출발하였다. 결합 공정을 위하여 (사이클 당 15 분), 0.3 M 아세토니트릴 중 벤질티오테트라졸 (benzylthiotetrazole; CMS-Chemicals, Abingdon, UK) 및 3.5 당량의 개개 아세토니트릴 중 0.2 M 포스포라미다이트 용액을 사용하였다. 산화-캡핑 사이클 (oxidation-capping cycle)이 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 추가적인 표준 용매 및 시약들은 회사(Biosolve, Valkenswaard, NL)에서 구입하였다. 스피에겔머는 DMT-ON 합성되고; 탈보호화한 후에, Source 15RPC 배양액(Amersham)을 이용한 예비(preparative) RP-HPLC(Wincott F. 등. 1995)을 통해 정제되었다. 5’DMT-그룹은 80% 초산으로 제거되었다(실온에서 90분). 연속적으로, 수용성 2 M NaOAc 용액을 가하고 상기 스피에겔머는 5 K 재생 셀룰로오스 막(Millipore, Bedford, MA)을 이용한 탄젠셜-유동 여과법(tangential-flow filtration)으로 탈염되었다.
3.3 PEG 화 반응( PEGylation )
생체 내 실험(in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간(plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 상기 스피에겔머를 40 kDa 폴리에틸렌글리콜 (PEG)기의 5’-말단에 공유 결합시켰다.
PEG화 반응을 위하여(PEG화 반응 방법의 구체적인 기술은 유럽특허 출원 제 1 306 382호를 참고), 상기 정제한 5’-아미노 변형된 스피에겔머(5’-amino modified Spiegelmer)는 물(2.5 ml), DMF(5 ml) 및 완충액 A(5 ml; 구연산ㆍ1 수화물 [7 g], 붕산 [3.54 g], 인산 [2.26 ml] 및 1M NaOH [343 ml]를 혼합하고 물을 가하여 1 L의 최종 용량을 만들고; 1 M 염산으로 pH=8.4로 적정하였다)의 혼합물에 용해시켰다.
상기 스피에겔머 용액의 pH는 1 M NaOH으로 8.4로 적정하였다. 그리고, 40 kDa PEG-NHS 에스테르(Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)를 최대 수율이 75-85%에 도달하도록 0.25 당량의 6 부분(portions)으로 매 30분씩 37℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH는 PEG-NHS 에스테르 첨가 중에 1 M NaOH로 8-8.5를 유지토록 하였다.
상기 반응 혼합물을 4 ml 우레아(urea) 용액(8 M), 4 ml 완충액 B(수중 0.1 M 트리에틸암모니움 아세테이트)와 혼합하고, 15분간 95℃로 가열하였다. 그리고 상기 PEG화된 스피에겔머를 아세토니트릴 경사법(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)을 이용하여 Source 15RPC 배양액(Amersham)으로 RP-HPLC로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C로, PEG화 스피에겔머는 10-15% 완충액 C로 용출시켰다. 95% 이상의 순도(HPLC로 측정)를 갖는 목적 분획물은 회수시켜 3 M NaOAC 40 ml와 혼합하였다. 상기 PEG화된 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법 (tangential-flow filtration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore,Bedford, MA)을 이용)으로 탈염하였다.
3.4 HES 화 ( HESylation )
생체 내 실험(in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간(plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 상기 스피에겔머를 130 kDa 이상의 다양한 분자량 및 0.5 이상의 치환 정도(substitution degree)를 갖는 하이드록시 에틸 전분(HES)에 공유 결합시켰다. 접합의 바람직한 부위는 스피에겔머의 5’-말단이다.
HES화 반응을 위하여(핵산의 HES화 반응 방법의 구체적인 기술은 독일특허 출원 제 101 12 825 A1, 및 D/L-핵산에 대해서는 PCT WO 02/080979A2를 참고), 정제한 5’-아미노 변형된 스피에겔머(5’-amino modified Spiegelmer)는 소듐 비카르보네이트(0.3 M, 1 ml)에 용해되었으며, pH는 8.5로 적정하였다.
상기 스피에겔머에 관하여, 5배 과량의 유리 HES 산(3.3 mmol, Supramol, Rosbach, Germany) 및 디(N-석시니미딜)카르보네이트 (di-N-succinimidyl) carbonate; 3.3 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide; 1 ml)에 첨가하여 HES의 활성화된 N-하이드록시석시미드 에스테르(N-hydroxysuccimide ester)의 용액을 수득하였다. 모든 반응물을 용해하기 위해, 상기 혼합물은 60℃에서 간단히 교반하고, 25℃로 냉각하고, 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 스피에겔머 용액을 활성화된 HES 용액에 첨가하였으며, 상기 반응 혼합물은 25℃ 및 pH 8.5에 교반하였다. 반응은 분석용(analytical) IEX-HPLC으로 모니터링 되었다. 전형적으로 상기 접합반응은 1시간 이내에 75%에 도달하였다.
Source 15Q 배양액(GE, Freiburg, Germany)을 통한 IEX-HPLC 정제법을 위해, 상기 반응 혼합물을 10배 용량의 완충액 A(1 mM EDTA, 25 mM Tris, 물/아세토니트릴 9:1 상에서 10 mM NaClO4, pH 4)에 혼합하였다. 과량 HES은 5% 완충액 A(1 mM EDTA, 25 mM Tris, 물/아세토니트릴 9:1 상에서 500 mM NaClO4, pH 4)에서 용출되었으며, 상기 HES-스피에겔머 접합물은 20-30% 완충액 B로 용출된다. 95% 이상의 순도(HPLC로 측정)를 갖는 목적 분획물은 회수시켜 3 M NaOAc 40 ml와 혼합하였다. 상기 PEG화된 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법(tangential-flow filtration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore,Bedford, MA)을 이용)으로 탈염하였다.
실시예 4: 결합 상수의 측정(풀-다운 결합 어세이법 )
4.1 직접 풀-다운 결합 어세이법( Direct pull - down binding assay )
비오틴화된 인간 D-SDF-1에 대한 압타머의 친화도는 풀-다운 어세이 포메트(pull-down assay format)을 이용하여 37℃에서 측정하였다. 압타머들은 [γ-32P]-표지 ATP(Hartmann Analytic, Braunschweig, 독일)을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; Invitrogen, Karlsruhe, 독일)에 의해 5’포스페이트 표지화되었다. 표지 압타머의 특이적 방사능은 200,000800,000 cpm/pmol이었다. 압타머들은 선택용 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4; 137 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 0.1% [w/vol] Tween-20) 중에서 다양한 농도의 비오틴화 인간 D-SDF-1과 저농도에서 평형에 도달하도록 4-12시간동안 37℃에서 10, 20, 30 또는 40 pM 농도에서 변성(denaturation) 및 재생(renaturation)후에 배양되었다. 선택용 완충액은 사용된 플라스틱 용기 또는 고정화 매트릭스(matrix) 표면으로의 결합 파트너들의 흡수를 억제하기 위하여 10 ㎍/ml 인간 혈청 알부민(human serum albumin; Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일) 및 10 ㎍/ml 효모 RNA (Ambion, Austin, 미국)를 첨가하였다. 비오틴화 인간 D-SDF-1의 농도 범위는 8 pM 내지 100 nM으로 조정하고; 총 반응 부피는 1 ml였다. 펩타이드 및 펩타이드-압타머 복합체는 6㎕ 총 부피에서 선택용 완충액으로 예비-평형화(pre-equilibrated) 및 재현탁된 1.5㎕ 스트렙타비딘 울트라링크 플러스 입자(Streptavidin Ultralink Plus particles; Pierce Biotechnology, Rockford, 미국)상에 고정화시켰다. 상기 입자들을 열 혼합기(thermomixer)에서 각각의 온도로 30분간 현탁 상태로 유지하였다. 고정화된 방사능은 상등액을 분리하고 적절한 세척을 마친 후에 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 정량화하였다. 상기 결합의 백분율은 비오틴화 인간 D-SDF-1 농도에 따라 구도되었고 해리상수(dissociation constants)는 1:1 화학양론으로 추정되는 소프트웨어 알고리즘(software algorithms)을 이용하여 계산되었다(GRAFIT; Erithacus Software; Surrey 영국).
4.2 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법( Competitive pull - down binding assay )
서로 상이한 D-SDF-1 결합 압타머들을 서로 비교하기 위하여, 경쟁적 서열화 어세이법(competitive ranking assay)이 수행되었다. 상기 목적을 위하여 입수 가능한 가장 근접한 압타머를 방사선으로 표지하고(상기 참조) 표준물질로 제공하였다. 변성 및 재생과정 후에, 경쟁 없이 고정화 후에 펩티드에 5-10% 결합하고 뉴트라비딘 아가로스(NeutrAvidin agarose; Pierce사) 또는 스트렙타비딘 울트라링크 플러스(Streptavidin Ultralink Plus; Pierce사)로 세척하는 조건하에서 1 ml 선택용 완충액으로 37℃에서 배양하였다. 과량의 변성 및 재생된 비-표지된(non-labeled) D-RNA 압타머 변이체(aptamer variants)들을 표지된 표준 물질 압타머와 함께 평형 결합반응(parallel binding reactions)을 수행하도록 여러 농도(예를 들어 2, 10, 및 50 nM)로 첨가하였다. 시험될 상기 압타머들은 목표 결합을 위해 상기 표준 물질 압타머들과 경쟁하였고, 결국, 이들의 결합 특성에 따라서 상기 결합 신호를 감소시켰다. 본 어세이법에서 가장 활성이 강한 압타머는 추후의 압타머 변이체의 비교분석시험을 위해 새로운 표준물질로 제공될 수 있을 것이다.
실시예 5. SDF -1 결합 스피에겔머에 의해 SDF -1 유도된 화학주성 저해의 분석
Jurkat 인간 T 세포 백혈구 세포(DSMZ, Braunschweig)은 37℃ 및 5% CO2에서 10% 우 혈청 알부민, 100 unit/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 함유한 글루타막스(Glutamix; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)와 RPMI 1640 배양액에 배양하였다. 실험 하루 전 날, 세포는 일반 배지에서 0.3x106/ml 의 농도로 새로운 플라스크에 배양하였다.
실험을 수행하기 위하여, 세포들은 원심분리(300 g, 5 분), 재현탁, 카운팅 및 15 ml HBH(1 mg/ml 우 혈청 알부민 및 20 mM HEPES을 함유한 Hanks balanced salt solution; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)으로 1회 세척되었다. 그런 후, 상기 세포들은 사용된 필터 플레이트(filter plate)의 유형에 따라 3x106/ml 또는 1.33x106/ml에 재현탁 되었다. 세포들은 필터 플레이트의 다공성 멤브레인(porous membrane)을 통해 SDF-1 및 다양한 양의 스피에겔머를 함유한 용액을 향해 여러 시간동안 이동하도록 허용하였다. 트란스웰 플레이트(Transwell plates) 및 다공성 폴리카르보네이트 멤브레인(porous polycarbonate membrane)의 삽입물(5 μm 공극 크기) 또는 멀티스크린(MultiScreen) MIC 플레이트(Millipore, MAMIC5S10)를 사용하였다.
5.1 트란스웰 플레이트( Transwell plates )의 프로토콜( Protocol )
자극 용액(Stimulation solution; SDF-1+다양한 농도의 스피에겔머)은 상기 트란스웰 플레이트의 하부 구획(lower compartment)에서 600 ㎕HBH에서 제조되어 20-30분 동안 배양되었다. 모든 조건들은 최소한 두 번 이상 만들었다. 자극 용액을 함유한 웰에 삽입물을 옮긴 후, 상기 삽입물(3x105 세포/웰)에 3x106/ml 세포 현탁액 100 ㎕을 첨가하였다. 그런 후, 상기 세포들은 37℃에서 3시간 동안 이동하도록 허용되었다.
그 후에, 상기 삽입물을 제거하고 60 ㎕ 레사주린(resazurin; Sigma, Deisenhofen, Germany) 워킹 용액(working solution; PBS 내의 440 ㎛; Biochrom, Berlin, Germany)은 상기 웰(게다가 교정(calibration) 웰)에 첨가되었다. 상기 플레이트는 2.5 내지 3시간 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 후에, 각 웰의 200 ㎕는 블랙 96 웰 플레이트로 옮겼다. 형광 신호는 Fluostar Optima 멀티디텍션 플레이트 리더(BMG, Offenburg, Germany) 이용하여 544 nm(여기 파장) 및 590 nm(방출 파장)에서 측정하였다.
5.2 밀리포어 멀티스크린 플레이트( Millipore MultiScreen plates )의 프로토콜
자극 용액(SDF-1+다양한 농도의 스피에겔머)은 10배 용액으로서 0.2 ml 낮은 프로파일(low profile) 96-튜브 플레이트에서 제조되었다. 멀티스크린 플레이트의 하부 구획 내로 135 ㎕ HBH 피펫팅(pippeting) 및 자극 용액 15 ㎕를 첨가하였다. 모든 조건은 세 배수(triplets)로 제조되었다. 20 내지 30분 후에 자극 용액을 함유한 플레이트 내로 필터 플레이트가 삽입되었으며, 1.33x106/ml 세포 현탁액 75 ㎕를 필터 플레이트의 웰(1x105 세포/웰)에 첨가하였다. 그런 후, 상기 세포들은 37℃에서 3시간 동안 이동하도록 허용되었다.
그 후에, 상기 삽입물을 제거하고 20 ㎕ 레사주린(resazurin; Sigma, Deisenhofen, Germany) 워킹 용액(working solution; PBS 내의 440 ㎛ ; Biochrom, Berlin, Germany)은 하부 웰에 첨가되었다. 그런 후, 상기 플레이트는 2.5 내지 3시간 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 후에, 각 웰의 100 ㎕는 블랙(black) 96 웰 플레이트로 옮겼다. 형광 신호의 측정은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다.
5.3 평가( Evaluation )
평가를 위해서, 형광 값은 배경 형광 값(background fluorescence; 세포가 없는 웰)으로 수정되었다. 그런 후, SDF-1와 함께 처리 및 처리되지 않은 실험적 조건 간의 차이점이 계산되었다. 스피에겔머가 처리되지 않은 시료(SDF-1 단독)의 값을 백분율(100%)로 고정하여 스피에겔머와 함께 처리된 시료의 수치를 퍼센트로 계산되었다. 농도-반응 곡선을 위해 계산된 퍼센트 값은 스피에겔머 농도에 대해 표시(plot)되었으며, IC50 값(스피에겔머 존재하지 않을 때 50%의 활성을 나타내는 스피에겔머 농도)은 상기 곡선으로부터 규명되었다.
5.4 결과
5.4.1 인간 SDF -1에 의한 Jurkat 세포의 농도 의존적 자극
인간 SDF-1은 약 0.3 nM의 농도에서 반-최대 자극(half-maximal stimulation)을 갖고 농도 의존적으로 Jurkat 세포의 이동을 자극하였다(도 14).
5.4.2 SDF -1 결합 스피에겔머에 의해 인간 SDF -1 유도된 화학주성의 농도 의존적 저해
세포들이 인간 SDF-1 및 SDF-1 결합 스피에겔머들의 증가되는 농도를 함유하는 용액을 향해 이동이 허용될 때, 농도-의존적인 저해가 관찰되었다. 실험된 스피에겔머들의 개개 IC50 값은 실시예 1에 기재되어 있다. SDF-1 결합 스피에겔머 대신에 비특이적 대조군 스피에겔머(unspecific control speigelmer)를 사용하였을 때, 1 μM 농도까지도 저해 효과는 관찰되지 않았다(도 32).
5.4.3 SDF -1 결합 스피에겔머에 의해 마우스 SDF -1 유도된 화학주성의 농도 의존적 저해
SDF-1은 모든 종에 걸쳐 보존된다: 마우스로부터 수득한 SDF-1은 인간 SDF-1α와는 한 개 아미노산(18번 위치의 발린(valine) 대신 이소류신(isoleucin))만 상이하다. 설치류 SDF-1은 Jurkat 세포의 화학 주성을 자극할 수 있으며(도 33), 상기 반응은 인간 SDF-1의 경우와 같이, 동일한 효능으로 스피에겔머 192-A10-001 및 191-D5-007-5'-PEG에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다(도 34).
실시예 6. 표면 플라즈몬 공명 기기에 의한 결합 분석
비아코아 2000 기기(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)는 인간 SDF-1α에 대한 스피에겔머의 결합력을 분석하는데 사용하였다. 아민기에 의하여 SDF-1α의 결합반응이 완성될 때에, 상기 단백질을 간섭하는 아민기들을 제거하기 위하여 1-2시간동안 물에서 투석을 수행하였다(Millipore VSWP 혼합 셀룰로오스 에스테르; 공극 크기, 0.025 ). CM4 센서 칩(sensor chips; Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)을 5 ㎕/분 유속으로 0.4 M NHS 및 0.1 M EDC의 1:1 희석액을 35-㎕ 주사함으로서 단백질 결합반응 전에 활성화시킨다. 그런 후, 케모카인(Chemokines)을 기기 반응이 1000 내지 2000 RU (상대적 단위) 범위 내에 도달시까지 2 ㎕/분 유속으로 0.1-1.5 ㎍/ml의 농도로 주사하였다. 미반응된 NHS 에스테르는 5 ㎕/분 유속으로 35 ㎕ 의 에탄올아민 염산 용액(pH 8.5) 주사함으로서 비활성화시켰다. 상기 센서 칩을 결합 완충액(binding buffer)으로 2배로 채우고 기저선이 안정될 때까지 약 1 내지 2시간동안 10 ㎕/분으로 평형화시켰다. 모든 단백질을 위하여, 역학적 파라미터(kinetic parameters) 및 해리 상수(dissociation constants)를 선택용 완충액(Tris-HCl, 20 mM; NaCl, 137 mM; KCl, 5 mM; CaCl2,1 mM; MgCl2,1 mM; Tween20, 0.1%[w/v]; pH7.4) 중 다양한 농도 즉, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 및 0 nM 농도로 연속적으로 스피에겔머를 주사함으로서 측정하였다. 모든 실험에서, 상기 분석법은 37℃에서 10 ㎕/분 유속으로, 180초의 결합 시간 및 360초의 해리 시간으로 한정하는 킨젝트 코멘드(Kinject command)를 이용하여 수행되었다. 해리 상수(KD)의 데이터 분석 및 계산은 Langmuir 1:1 화학양론적 적정 알고리즘(stochiometric fitting algorithm)을 이용한 소프트웨어(BIAevaluation 3.0 software; BIACOREAB, Uppsala, 스웨덴)으로 수행하였다.
실시예 7. SDF -1 결합 스피에겔머에 의한 CXCR4 발현 세포들에 대한 [ 125 J]- SDF -1 결합의 저해
7.1 방법
인간 CXCR4-수용체(NM_003467.2)을 위한 cDNA 클론 코딩은 오리진 테크놀러지(OriGene Technologies; Rockville, MD)에서 구입하였으며 pCR3.1 벡터(Invitrogen, Karlsruhe, 독일) 내에 클로닝되었다. 상기 벡터는 CHO-K1 세포(DSMZ, Braunschweig, 독일) 내로 Lipofectamin 2000(Invitrogen)을 이용하여 트랜스펙트(transfect)되었으며, 발현이 안정화된 세포주들은 제네티신(geneticin)의 첨가로 인해 선별되었다. 상기 수용체의 발현은 RT-PCR으로 입증되었다.
결합 어세이법을 위해, CXCR4-발현 세포들은 1 x 105 세포/웰의 농도로 폴리라이신(polylysine)-코팅된 24-웰 플레이트에 주입되었으며, 50 unit/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신 및 0.5 mg/ml 제네티신을 함유하는 CHO-Ultra 배양배지(Cambrex, Verviers, 벨기에) 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양되었다.
결합력 실험을 위해서, 상기 배지는 제거되고 세포들은 20 mM HEPES, 1 mg/ml 우혈청알부민(bovine serum albumin), 1 mg/ml 바시트라신(bacitracin)을 추가적으로 함유하는 행크스 균형 염 용액(Hanks balanced salt solution; HBB)에 한번 세척하였다. 그런 후, 상기 세포들은 50 pM [125J]-SDF-1(PerkinElmer, Rodgau, 독일) 및 다양한 농도의 스피에겔머를 첨가하여 실온에서 1시간동안 0.2 ml HBB 내에 배양되었다.
비특이적 결합은 비표지된 인간 SDF-1(R&D Systems, Wiesbaden, 독일)을 최종농도 0.5 μM가 되도록 여러 웰에 첨가함으로써 측정되었다.
상기 배양 기간 후, 상등액을 제거하고 웰을 빙냉-HBB으로 세 번 세척하였다. 그런 다음, 세포들은 0.1 ml의 0.1 M NaOH으로 용해되었다. 상기 용해물은 진틸레이션 바이엘(szintillation vial) 내로 옮긴 후, 4 ml Unisafe 1 용액 진틸레이션 칵테일(Zinsser, Franfurt, 독일)을 첨가하여 Beckman LS6500 진틸레이션 카운터(szintillation counter)를 이용하여 계측하였다.
고 농도(500 pM)의 스피에겔머의 존재하에서 전체 결합력의 값보다 비특이적 결합력 값이 다소 높게 나타남으로써, 상기 최대 결합력(“max”) 및 500 pM 스피에겔머 존재하의 결합력 간의 차이를 이용하여 IC50 값의 계산에 사용하였다.
7.2 결과
스피에겔머 농도에 대한 결합된 [125J]-SDF-1을 표시함으로써, 약 60 pM의 IC50 값을 갖는 스피에겔머 192-A10-001에 의해 SDF-1의 결합력이 저해됨을 확인할 수 있었다(도 35).
실시예 8. SDF -1 결합 스피에겔머에 의해 SDF -1 유도된 MAP - 키나아제 ( kinase ) 활성의 저해
8.1 방법
CXCR4-발현 CHO 세포들은 0.5x106 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에 주입되었으며, 50 unit/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신 및 0.5 mg/ml 제네티신을 함유하는 CHO-Ultra 배양배지(Cambrex, Verviers, 벨기에) 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 약 3시간 동안 배양되었다. 세포 부착 이후 배지는 제거되어 50 unit/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 Ham's F12 배양 배지로 대체하였다. 상기 세포들은 그후, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양되었다. 자극 세 시간 전에 배지는 다시 한번 새로운 Ham's F12 배양 배지로 대체되었다. 세포들은 인간 1 nM SDF-1 및 다양한 농도의 스피에겔머로 5 또는 10분 동안 자극되었다. 그런 후 배지는 제거되고 세포들은 1 ml 빙냉-인산 완충용액(PBS)으로 세척된 후, SDS-샘플 완충액(Tris/HCl, pH6.8, 62.5 mM; 글리세롤, 10%; SDS, 2%; 브로모페놀블루, 0.01%; 베타-메르캅토에탄올, 5%)으로 용해시켰다. 각 웰에 1μl의 0.5 u/μl 벤조네이즈(benzonase; Merck, Darmstadt, 독일)을 첨가하여 실온에서 5 내지 10분 동안 배양한 후, 상기 용해물을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮긴 후, 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후 -20℃에서 이후 실험을 위해 보관하였다.
상기 용해물 25 μl은 10% 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되었다. 그 후, 상기 단백질들은 HybondECL 니트로셀루로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane; Amersham/GE Healthcare, Munich, 독일) 상에 전기블롯(electroblotting)에 의해 전가되었다. 블롯팅(blotting) 후에, 상기 멤브레인은 단백질 로딩(loading) 및 전이에 대한 대조군으로서 폰소-레드(Ponceau-red; 3% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 상에 0.2%)로 염색되었으며, 10% 무지방 건조 우유를 포함하는 TBS-T(0.1% Tween20을 포함하는 Tris-buffered saline(20 mM Tris/HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl) 상에서 2-8℃에서 밤새 반응시켜 블로킹(block)되었다.
상기 멤브레인은 그 후 토끼 항-인산-MAP-키나아제 항체(rabbit anti-Phospho-MAP-kinase antibody; 10% 우유 함유하는 TBS-T상에서 1:1000 희석)로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세 번 세척한 후, 상기 멤브레인은 항-토끼-IgG-HRP-접합체(anti-rabbit-IgG-HRP-conjugate; 10% 우유 함유하는 TBS-T상에서 1:2000희석)로 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 멤브레인을 다시 TBS-T로 5분간 세 번 세척한 후, LumiGloR 화학발광 시약으로 1분간 반응시켰다. 상기 발광은 HyperfilmTMECL 화학발광 필름(Amersham/GE Healthcare)에 30초 내지 2분간 노출시킴으로써 측정되었다. 상기 항체 및 발광 검출 시약들은 PhosphoPlus p44/42 MAP 키나아제(Thr202/Thr204) 항체 키트(Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt a.M., 독일)의 구성품을 사용하였다.
8.2 결과
1 nM 인간 SDF-1으로 5분간 CXCR4-발현 세포들을 자극하는 반응은 활성화된 MAP-키나아제를 반영하는 밴드의 증가된 강도를 통해 확인된 바와 같이, 충분한 MAP-키나아제(kinase)의 자극을 이끌었다. 상기 MAP-키나아제의 활성은 스피에겔머 191-A10-001에 의해 농도-의존적으로 저해될 수 있었다(도 36).
실시예 9. 환상 대동맥 발생 분석법( aortic ring sprouting assay ) 상에서 인간 SDF-1 결합 스피에겔머 193- G2 -012-5'- PEG 의 기능적 분석
인간 SDF-1 결합 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG이 표준 신생혈관형성증기관 배양 어세이법(standard angiogenesis organ culture assay) 상에서도 가능하는지 실험하기 위하여, 환상 대동맥 발생 분석법을 수행하였다. 외식편(explant)으로부터 분리된 혈관 유사 연장물(vessel-like extensions)의 길이 및 풍부도를 측정하는 상기 어세이법은 혈관신생을 위해 가장 널리 사용된 기관 배양 모델이 되었다(Auerbach et al. 2003). 상기 어세이법의 유형에서 SDF-1 발생이 유도되는 것이 입증되었다(Salcedo et al. 1999).
랫트(rat)의 대동맥을 환상 모양으로 자른 후 콜라겐 매트릭스(collagen matrix)에 파묻어, SDF-1, 및 SDF-1와 인간 SDF-1 결합 스피에겔머 193-G2-012-5'-PEG 또는 SDF-1와 SDF-1에 결합하지 않은 비-기능적 PEG화된 대조군 스피에겔머와 함께 반응시켰다. 6 내지 7일 후, 찍힌 사진을 통해 발생(i.e. 내피세포의 성장)을 분석하였으며, 발생 지수 (sprouting index)를 결정하였다.
9.1 방법
수컷 랫트의 대동맥을 회사(Bagheri Life Sciences; Berlin, 독일)로부터 수득하였다. 상기 대동맥은 신선하게 준비하여 얼음 상에서 50 unit/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신 (둘다 Invitrogen, Karlsruhe, 독일) 및 2.5 μg/ml 펀지존(fungizone; Cambrex, 미국)을 함유하는 MCDB 131-배양배지(Invitrogen, Karlsruhe, 독일)로 옮겼다.
실험을 위해 단일 대동맥은 배양 배지와 함께 세포 배양 디쉬로 옮겼으며, 잔재 연결 조직(residual connective tissue)은 제거되었다. 그런 후, 상기 대동맥은 메스(scalpel)를 이용하여 약 1 내지 2 mm 길이를 갖는 환상 모양으로 잘랐다. 상기 환상은 배양 배지 199(Invitrogen, Karlsruhe, 독일)으로 격렬하게(최소한 5번 이상) 세척되었으며, 웰 당 450 μl 콜라겐 용액(collagen solution)을 함유하는 24 웰 플레이트의 웰 내로 주입하였다. 상기 콜라겐 용액은 9 ml 랫트 꼬리 콜라겐(0.1% 아세트산 내 3 mg/ml; Sigma, Deisenhofen, 독일), 1.12 ml 10X 배양배지 199(Invitrogen, Karlsruhe, 독일), 1.12 ml 10X 콜라겐-완충용액(0.05 N NaOH, 200 mM HEPES, 260 mM NaHCO3) 및 0.6 ml 200 mM 글루타민을 혼합함으로서 준비되었다. 상기 환상은 상기 웰의 바닥에 수직(perpendicular)으로 모서리를 다듬어지도록 하였다. 상기 콜라겐은 37℃에서 최소한 한 시간 동안 플레이트를 반응함으로서 고체화시켰다. 그런 후, SDF-1 및 스피에겔머를 함유하는 1 ml MCDB131-배양배지를 웰당 첨가하였다. 상기 환상은 6 내지 7일 동안 37℃에서 배양되었다. 발생(sprouting)의 대조군으로서 VEGF(Vascular endothelial growth factor)을 이용하였다.
발생(sprouting)은 디지털 카메라를 이용하여 사진을 찍음으로서 기록되었다. 일부의 경우에서는 환상을 1 ml 10% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 첨가함으로서 고정화시켰고, 2-8℃상에서 추가 실험 기록을 위해 보관되었다. 상기 사진들은 소프트웨어(Scion Image image processing software)를 이용하여 분석되었다. 스테이지 마이크로미터(stage micrometer)로부터 찍힌 사진으로부터 측정된 후, 환상의 한쪽 끝으로부터 0.33 mm의 거리에서 줄을 그었다. 상기 그은 줄로부터 표시된 히스토그램(histogram)은 스포트웨어를 이용하여 생성되었으며, 히스토그램은 인쇄되고 피크(peak)의 수를 세었다. 상기 숫자는 발생 지수를 의미한다. 각 조건별 4 내지 5 환상(rings)을 평가하였다. 엑셀 상의 WinSTAT으로 통계 분석을 수행하였다.
9.2 결과
상기 결과로부터 SDF-1가 발생을 유도하고 이들의 효과가 인간 SDF-1 결합 스피에겔머 193-G2-012-5’-PEG으로 저해될 수 있음을 확인할 수 있었다. SDF-1 유도된 발생의 저해는 비-기능적(non-functional) PEG화된 대조군 스피에겔머에 의해서는 관찰되지 않았다(도 37 및 38).
실시예 10. 30 또는 40 kDa PEG 로 유도체화된 NOX -A12의 단회 정맥 주사에 의한 마우스에서의 조혈 줄기 세포/조혈 전구 세포 ( HSC / HPC )의 동원
10.1. 시험 물질 및 투여일정
13.4 mg/kg SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 (서열번호 132), SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-NO30 (서열번호 242) 또는 SDF-1에 대해 결합능이 없는 대조군 스피에겔머인 revNOX-A12 (서열번호 243)을 마우스에 정맥 주사하였다. 주사 후 1, 6, 24 또는 48 시간(h) [물질 및 측정 시점당 5 마리 사용]에 상기 동물을 희생시키고 혈액을 회수하였다. 대조군에는 담체 (5 % 포도당), AMD-3100 (Sigma, France, 5 mg/kg 경피(s.c.)) 또는 과립구-집락 자극 인자 (G-CSF, Neupogen) (2.5 ㎍/마우스/주사, 매 12시간당)을 주사하였다. 상기 동물은 상술한 바와 같은 동일 시점에 희생시켰다 (도 39 참조). G-CSF (Neupogen) 군을 위해: 매 12 시간 1회 주사 일정에 기인하여, 1시간 및 6시간째에 희생시킨 동물에게는 1회만 주사를 수행하였으며, 24시간째 희생시킨 동물에게는 2회 주사 (1 및 12시간째 각각), 48시간째 희생시킨 동물에게는 4회 주사 (0, 12, 24 및 36 시간째 각각)를 수행하였다 (도 39 참조). 혈액 세포수 측정은 혈구계산기 (hemocytometer)로 측정하였다.
10.2 HSC / HPC 의 탐지
50 μl 전체 혈액을 먼저 염색용 완충액 (PBS [Ref 17-516F, Lonza], 0.2% BSA [Ref A7030, Sigma], 0.02% NaN3 [Ref S2002, Sigma]중에서 FcR 차단 시약(Ref 130-092-575, Miltenyi Biotec, 파리, 프랑스)과 배양하고, 접합된(conjugated) 항-CD117 및 PE 접합된 항-Ly-6A/E 항체 또는 상응하는 이형체(isotypes)로 30분간 암소 및 상온 조건하에 배양하였다 (하기 표 17 참조).
항원
(Antigens)		 클론
(Clone) 		이형체
(Isotype) 		형광색소
(Fluorochrome)		 참고번호
(Ref) 		기원 (Source) 양(Quantity)
CD117 2B8 IgG2b FITC 553354 BD Biosciences 1 μg
CD117 대조군 이형체 IgG2b FITC 553998 BD Biosciences 1 μg
Ly-6A/E D7 IgG2a PE 553108 BD Biosciences 1 μg
Ly-6A/E대조군 이형체 IgG2a PE 553930 BD Biosciences 1 μg
적혈구 세포는 "고정 및 용해법(Fix and Lyse)" 방법을 이용하여 용해시켰다. 요약하면, 고정 및 용해법 완충액은 25 μl의 IO 시험 용액 3 (10X 고정 용액 [Ref A07800, Beckman Coulter, Villepinte, 프랑스]) 을 1 ml의 VersaLyse [Ref A09777, Beckman Coulter]에 가하여 제조하고 1 ml의 상기 혼합물을 염색된 세포에 첨가하였다. 진탕 및 상온 및 암소 조건하에서 10분간 배양한 후에, 세포를 원심분리 및 3 ml의 염색용 완충액 으로 1회 세척한 후에 1 ml의 참고용 미세비드 용액 (reference microbeads solution; PKH26, Ref P7458, 220,000 비드(beads)/ml, Sigma, 염색용 완충액에서 ½ 로 희석됨)에서 재현탁하였다. 시료는 FACS 분석 전까지 광노출 방지용 얼음에 보관하였다.
세포의 표면 형광도(surface fluorescence)를 레이져 여기 파장 (488 nm)을 이용하여 유세포분석기 (flow cytometer apparatus; FACS, CyFlowspace)로 분석하였다. 개개 시료에 대하여 총 10,000 이벤트(events)를 얻었다.
10.3 ㎕당 절대 세포수(absolute cell numbers)의 계산
혈액 시료 용량은 50 ㎕였다. 제조과정 종료시에, 백혈구 (50 ㎕ 혈액 시료 내에 함유됨)를 0.75 ml의 미세비드 용액(microbead solution) (1 mL에 220,000 비드(beads)를 함유하는 스톡 용액의 1/2 희석화로 제조함)에 재현탁 하였다. 이 후자 용액 mL 당 세포수는 : (CN/BN) x (220000/2) 이고 세포 총수는: (CN/BN) x (220000/2) x (0.75/1)이고, 여기에서 CN은 세포 측정수이고 BN은 미세비드 측정수이다.
따라서, 이러한 세포 총수는 50 ㎕의 혈액에 포함되고 혈액 당 세포 절대수 (ACN)는: (CN/BN) x (220000/2) x (0.75/1) x (1/50)이다.
10.4 집락 형성 단위 ( CFU ) 측정
최대량의 조혈 전구세포 (HPC)/ 조혈 줄기 세포 (HSC)을 나타내는 시점에서의 혈액만을 CFU 어세이(assay)를 수행하기 위하여 선택하였다 (물질당 모든 마우스에 대한 동일한 시점). 정상 말초 혈관 시료의 적혈구 (RBCs) 고갈은 말초 혈관에 10 배 용량(10x)의 용해 완충액(lysis buffer; 0.1 mM EDTA함유 0.8% NH4Cl용액) (ref 07800, StemCell Technologies)을 첨가하고, 튜브를 3-4회 뒤집어 혼합하고 5-15분 동안 얼음에서 배양하였다. 1,200 rpm에서 7분 동안 원심분리한 후에, 백혈구 (WBCs)를 2% 열-불활성화 우태아 혈청 (FBS, Ref DE14-802F, Lonza)을 포함하는 배양액(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium; IMDM)으로 2회 세척하였다. 유핵 적혈구(Nucleated WBCs)는 메틸렌 블루(Ref 07060, StemCell Technologies)함유 3% 초산에서 1/20으로 희석한 후에 혈구계수기 (MS9-5 counter (Melet Schloesing, Osny, France))를 이용하여 판독되었다.
세포를 3중으로 2% 열-불활성화 FBS, 재조합 마우스 (rm) 줄기 세포 인자 (SCF, 비만 세포 성장 및 골수성 및 임파종 전구체), rm IL-3 및 rh IL-6 (모든 계열의 초기 골수성 전구체 성장), 및 재조합 인간 적혈구 조혈인자 (rh EPO, 조혈 전구세포 성장)을 이미 함유한 0.9% 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 함유 IMDM배지 (Ref MethoCult?03434, StemCell Technologies)상에 올려 놓았다. 요약하면, 10-배 농축된 WBCs (0.4 ml)을 메틸셀룰로오스 완전(complete) IMDM (최종 농도가 평가 실험 동안 한정되도록 함)에서 희석, 잘 진탕한 후에 분산 전에 방울이 소멸되도록 2-5분 동안 방치시켰다. 1.1 ml 메틸셀룰로오스 배양액 함유 세포 혼합물을 시린지(luer-lock syringe) 및 16G 주사기(blunt-end needle; Ref 28110, StemCell Technologies)를 이용하여 3개 35 mm 배양 접시(culture dishes; Ref 27150, StemCell Technologies) 각각에 분산시켰다. 접시들은 부드럽게 기울이고 고르게 메틸셀룰로오스가 분배되도록 회전시켰다. 추가적인 비포장된 멸균수 함유 35 mm 접시를 갖는 큰 접시를 37℃, 5% CO2, 95% 습도조건하에서 7 내지 12일 동안의 배양 동안에 35 mm 접시를 고정시키는 데에 사용하였다.
배양 종료시점에, 집락을 수동으로 역상 현미경 및 60 mm 접시(gridded scoring dish; Ref 27500, StemCell Technologies)을 이용하여 BFU-E (Burst-forming unit-erythroid), CFU-GM (집락-형성 단위(Colony-forming unit)-과립구(granulocyte) 및/또는 대식세포) 및 CFU-GEMM (집락-형성 단위-과립구, 적혈구계(erythroid), 대식세포 및 거핵세포)으로서 측정하였고 집락의 수는 CFU/mL 혈액(blood)으로 정상화하였다.
10.5 유세포분석 결과
FACS 분석법하에 CD117 및 Ly-6 A/E 이중 염색법으로 측정된 실험에서 SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 및 NOX-A12-NO30은 뚜렸한 HPC/HSC 이중 염색 상의 증가를 나타냈다 (도 40 참조). 피크를 스피에겔머 투여 6시간 후에 관찰하였다. NOX-A12-JE40 은 700 CD117+Ly-6 A/E+ 세포/㎕로 방출을 유도하였다. SDF-1 결합 스피에겔머, NOX-A12-NO30은 300 CD117+Ly-6 A/E+ 세포/㎕(혈액)로 방출했다. 담체군에서 100 CD117+Ly-6 A/E+ 세포/㎕(혈액)이 측정되었다. G-CSF의 HSC/HPC-동원 효과가 4 G-CSF 주사를 받고 제 1차 주사후(250 CD117+Ly-6 A/E+ 세포/㎕) 48시간 후에 희생된 마우스에서 관찰되었다. AMD-3100 및 SDF-1 결합 스피에겔머, revNOX-A12-JE40은 어떠한 효과를 나타내지 않았다 (모든 측정 시점 및 모든 군의 도식화한, 도 40참조).
SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 처치결과, 총 백혈구 측정상의 일시적인 증가로 인한 HSC/HPCs의 일시적인 증가가 수반되었고, 이는 증가된 대식세포, 과립구 및 호중구 및 호염기구에 의해 주로 유도되었다. 뉴포겐(Neupogen)이 호산구 감소[%] 와 결합된 백혈구 세포 수 증가 (WBC 측정치)를 유도하는 것으로 관찰되었다 (도 47 참조).
10.6 CFU 어세이법 결과
담체 (0.8 CFU/mL)와 비교시, 모든 물질들은 총 CFUs의 평균치상의 증가를 초래하였다. 그러나 revNOX-A12-JE40 (6 시간) 및 AMD3100 (6 시간) 만이 한계 효과(marginal effects) (각각 1.1 및 1.5 CFU/mL)을 나타냈다. SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40의 1회 주사는 G-CSF의 4회 주사 (최초 주사 후 48시간 후 및 4번째 주사 후 12시간에 측정시)와 거의 비슷한 6시간 후 혈중 CFUs/mL를 초래하였다 (각각 3.7 및 3.2). 이는 담체군 수치의 4배이다. SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-NO30은 담체군(1.9 CFU/mL)과 비교시 2배의 CFU 측정치를 나타냈다 (개요를 표시한, 도 41 참조).
실시예 11. 맥락막 신생맥관형성증 ( CNV ) 저해
“레이저-유도 맥락막 신생맥관형성증(laser-induced choroidal neovascularization)” 동물 모델은 인간 망막 및 맥락막 신생맥관구조에 대한 연구 약물의 효과를 예측하는 데 사용된다. 이는 습형(wet) 또는‘증식성(prolif erative)’노인성황반변성증(AMD), 당뇨병성 망막병증 및 망막 정맥 폐쇄증과 같은 질환에서 발생한다. CXCR4은 레이져-유도된 CNV에서 발현되는 것으로 밝혀 졌다 (Limae Silva et al., FASEB J. 21: , 2007). 이는 CD45 및 F4/80 발현 세포와 같은 위치에서 발생되며 이는 이들이 골수(BM)-유래 대식세포임을 의미한다. CXCR4 저해제는 레이저-유도된 CNV를 감소시켰다. 그러나, 이러한 세포들이 SDF1도 발현시키는지 여부는 밝혀지지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자는 SDF-1 결합 스피에겔머인 NOX-A12-JE40 (서열번호 132)가 신생맥관형성증을 차단하는지 여부를 평가하였다.
11.1 방법
12주령 이상의 22마리 C57/BL6J 마우스를 마취하고 안구당 3번 레이져 화상을 처치하였다. 동물들은 레이져 처치 위치에서 맥락막 신생맥관형성증을 발생하였다. 그 다음 날, 2 ㎕의 링거액에 용해시킨, SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 용액 440 ㎛을 다른 안구에는 대조군으로서 링거액을 처치한 데 반하여, 하나의 안구에
는 유리체강내로 주사하였다 (투여량: 0.88 nmol = 12.9 ㎍[분자의 올리고(oligo)부분만] = 48 ㎍[PEG을 포함한 총 분자]). 레이져 처치 14 일후에, 동물들을 덱스트란-플루오레신(dextran-fluorescein)으로 관류시키고, 맥락막 전체 마운트(ch oroidal whole mounts)를 준비하였다. 전체 마운트을 대상으로 맥락막의 혈관성 변화 및 CNV 막 면적을 측정하였다.
개개 동물의 하나의 안구는 스피에겔머로 주사하고 다른 안구는 완충액으로만 주사하고, 개개 동물의 약물처치 안구군 및 대조 안구군 간의 상이성을 시험하는 시험법인 윌콕슨 표시 서열 시험법(Wilcoxon signed ranks test)을 사용하였다. 상기 윌콕슨 표시 서열 시험법은 2개의 관련된 측정간의 상이성, 본 연구에서는 개개 동물의 약물처치 안구군 및 대조 안구군 간의 상이성을 분석하는 것이다. 이는 약물처치 안구군 및 대조 안구군이 통계학적으로 상이하지 않더라도 유의적인 차이를 분석한다. 하기 R 명령어가 사용된다: 윌콕슨 표시 시험법 (V1 ~ V2, 데이터(data) = d0, 분포(distribution) = "정확(exact)") p < 0.05은 95% 수준에서 유의성을 갖는다.
11.2 결과
22 마우스 중 13마리가 평가 가능하였다. NOX-A12-JE40-처치 안구(treated eyes)의 신생맥관형성 면적 평균은 링거액으로 처치한 안구의 평균보다 적었으며, 이는 상기 스피에겔머가 CNV 형성을 감소시켰음을 의미한다. 윌콕슨 일치-쌍 표시 서열 시험법 (Wilcoxon matched-pairs signed-ranks)으로 계산된 p 값(value)은 0.021이었다. 따라서, SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40은 CNV 마우스 모델에서 레이저-유도된 신생맥관형성증을 유의적으로 감소시켰고, 이는 잠재적인 치료학적 장점을 의미한다는 결론에 이르렀다 (도 42 참조).
실시예 12. 당뇨병성 신병증에 대한 유효성
예를 들어, 당뇨병에서, 사구체경화증(Glomerulosclerosis)은 안지오텐신-의존성 병리기전(angiotensin-dependent pathomechanisms)을 목표화하는 하는 것이 항상 질병의 진행을 방지하지는 않으므로 최종단계의 신장 질환의 주요 원인으로 남는다. 따라서, 다른 치료 전략은 사구체경화증 치료를 위한 치료학적 무기를 추가로 요구한다. 최근 실험 연구로부터 얻은 데이터는 신조직내 염증에 대한 당뇨병성 마우스 및 인간에서의 사구체경화증 진행과 관련된다. 예를 들어, 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 메토트렉세에트(methotrexate), 또는 방사선 처리는 스트렙토조토신-유도 당뇨병 유발 래트에서 알부민 분비 및 사구체경화증을 감소시킨다. 또한, 당뇨병성 신병증에서의 신조직내 염증의 분자적 및 세포적 기전은 아직 충분하게 파악되지 않았다. 당뇨병성 신병증 환자는 염증상의 급성 마커의 증가된 혈청 수준을 나타내나, 이는 신조직 내 염증을 대표하지 않을 수도 있다.
본 연구에서, SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 (서열 번호 132)에 의한 SDF-1의 후기-발생 차단작용을 6주령에 일측성 신절제 수술을 받은 db/db 마우스에서 시험하였다. NOX-A12-JE40의 투여는 경피주사로 50 mg/kg 투여량으로 (13.4 mg/kg 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)부분이 상응) 4개월 연령에 시작하여 3차례 수행되었다. 2개월 후에, 상기 동물들을 희생시키고 사구체경화증 점수(glomerulosclerosis score)를 측정하였다.
이 점수에 의하여, 개개 사구체(glomeruli)에 대하여 그 백혈구 침습 및 조직 손상을 점수화하였다. 점수 0은 건강한 사구체, 완전히 섬유소성 형태인 경우는 4로 표기하였다 (Ninichuk, Clauss et al. 2008).
12.2 결과
야생형 마우스는 6-월령에는 신장 손상이 거의 없으나 동일 수령의 db/db 마우스는 현저한 신장손상을 나타냈다. 6주령에서 일측성 신절제 수술을 받은 db/db 마우스에서의 신장 손상은 심지어 보다 심해졌다.
SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 (서열번호 132)은 이의 역서열 (reve rse sequence)을 갖는 비-특이적 대조군 스피에겔머인 revNOX-A12-JE40 (서열번호 243)와는 달리 6주령에서 일측성 신절제 수술을 받은 db/db 마우스에서의 신장 손상을 유의적으로 개선하였다: 가장 높은 손상 점수 (3 및 4)를 갖는 유의적으로 보다 낮은 숫자의 사구체 수를 나타냈다. 대신에, 보다 미묘한 변화(백혈구 침습)가 보다 높은 숫자의 사구체에서 발견되었다 (도 43 참조).
실시예 13. SDF -1 결합 스피에겔머 NOX -A12- JE40 는 유색 가토의 VEGF -유도성 망막 혈관 누수증상을 저해한다
망막 혈관의 혈관성 누수는 노인성 황반변성증 및 망막 정맥 폐쇄증과 같은 몇몇 안 질환에서 발병한다. 이는 시각을 손상시키는 황반성 부종을 유발한다.
13.1 방법
동물 실험 모델에서, 망막혈관 누수증은 토끼에서 유리체강내 VEGF 주사법으로 유도가능하다. 이 실험모델에서, 망막성 맥관구조의 투과성은 VEGF의 유리체강내 주사 48시간 후에 형광측광도 (fluorescein photometry)로 측정된다. 시험 항목의 주사는 VEGF의 자극 5일 전에 수행하였다. VEGF의 투여 2일 후에 발견되는 투과성은 VEGF의 자극 후에 일시적으로 관찰되는 투과성 증가와 직접적으로 관련된 것이 아닌 VEGF의 주사에 의하여 촉발되는 장기간-지탱하는 하위 과정(downstream processes)의 효과인 것으로 사료된다 (Edelman, Lutz et al. 2005).
본 실험에서, 8마리 유색가토 (Fauve de Burgogne, 2-3 월령)를 각 군당 사용하였다.
각 군은:
4 개의 NOX-A12-JE40 (105 nmol, 40 nmol, 8 nmol, 1.6 nmol) 투여군
참고 물질 군 (케나코트 리타드(Kenacort retard)(R) (4 트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide)), 2 mg을 유리체강내 투여) 및
담체 (5 % 수혈용 포도당).
주사용량은 모든 군에 50 ㎕을 투여하였다. 우측 안구에 물질 투여를 한 5일 후에, VEGF도 또한 우측 안구에만 투여했다: (50 PBS중 500 ng 재조합 인간 VEGF165 ) 48시간 후, 망막 투과성을 시각적 형광 광도법 (ocular fluorometry)으로 마취동물에서 측정하였다 (플로오레세인 나트륨(sodium fluorescein; 10 % 0.9 % 염화 나트륨 내, 50 mg/kg)을 정맥내 주사 1시간 후). 요약하면, 형광광도는 형광측정기기(FM-2 Fluorotron Master) 를 이용하여 생체 외에서 양측 안구의 각막으로부터 망막까지의 광학축(optical axis)을 따라 조사되었다. 얻어진 강도 분산 곡선(intensity distribution curves)을 통합시키고 처치된 안구의 비-처치된 안구에 대한 곡선상(AUC) 면적비를 산출하였다. 군 평균치 및 표준 편차를 계산하고 그래프로 도식화하였다.
13.2 결과
재조합 인간 VEGF165 (50 ㎕ 중 500 ng) 주사 5일 전에 50 ㎕ 포도당 중 105 및 40 nmol SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40를 유리체강내 주사시에 VEGF 자극 48시간 후에 망막성 맥관구조의 VEGF-유도 투과성을 유의적으로 저해하였다. 참고 물질인 트리암시놀론(triamcinolone)도 혈관 투과성을 강력하게 감소시켰다. 이전에 수행을 마친 비아코아(BiaCore) 시험은 SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40의 VEGF-결합이 사용된 농도에서는 발견되지 않았음을 확인시킨다. 따라서, NOX-A12-JE40이 연장된 혈관 투과성을 초래하는 VEGF의 하위 경로 (예를 들어, SDF-1 과발현 효과로서, 백혈구의 순항, 치밀 이음부의 풀어짐)을 차단하는 것으로 추정할 수 있다 (도 44 참조). 따라서, NOX-A12-JE40 은 황반성 또는 망막성 부종 자체 또는 부차적으로 노인성 황반 변성증 또는 망막 정맥 폐쇄증의 치료에 유용할 수 있다.
실시예 14. SDF -1 결합 스피에겔머 NOX -A12- JE40 는 산소-유도성 망막병증에서의 신생혈관형성증을 저해한다
산소-유도성 망막병증 마우스 실험모델은 당뇨병성 망막병증, 특히 증식성 당뇨병성 망막병증, 및 노인성 황반 변성증에서 관찰되는 바와 같이, 저산소증-유도 신생맥관형성증을 모방한 실험 모델이다 (Smith, Wesolowski et al. 1994). 또한 상기 모델은 병원 인큐베이터에 들어가 있는 미숙아가 인큐베이터에 있는 동안 및 정상산소 조건(normoxic conditions)으로 귀환 후에 정상 망막 혈관 성장을 초래하는 인큐베이터에서의 너무 높은 산소 노출로 인하여 실명하게 되므로 미숙아의 망막병증(retinopathy of prematurity)으로도 지칭된다.
14.1 방법
마우스 실험모델에서, 신생 C57BL/6J 마우스를 산후 P5-P12부터 75% 산소 조건하에서 인큐베이트(incubate)시켰다. 정상 산소조건으로 귀환 후에 동물들은 상대적으로 저산소증에 기인하여 망막성 신생맥관형성증으로 발병되었다. SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40 (2 ㎕ 링거 액중 880 pmol)을 12일째(P12)에 주사했다. 17일째(P17)에, 마우스를 덱스트란-플로오레신(dextran-fluorescein)으로 관류시켜 망막성 맥관구조를 시각화하였다. 망막성 전체 마운트(Retinal whole mounts)를 점수화 체계에 의하여 점수화하는 방법으로 망막 맥관구조상의 혈관 변화를 평가하는데 사용하였다. FITC-덱스트란 관류법 (Dextran perfusion)은 관류된 혈관의 평가에만 사용된다. 미숙하고, 관류되지 못한 혈관을 시각화하기 위하여, 전체 마운트(mounts)를 염색제(isolectin-B4)로 염색하고 형광 현미경으로 분석하였다. SDF-1 결합 스피에겔머로 처치된 안구는 개인내 측정법하에 담체 처치군과 비교하였다. 유의성은 윌콕슨 표시 서열-시험법(Wilcoxon signed rank-test)으로 계산되었다. p = 0.05은 95 % 신뢰성과 상응한다.
하기 매개변수들이 점수화되었다:
1. 혈관 클러스터 수(Number of vessel clusters)
2. 절대적 클러스터 영역 크기(absolute cluster area size)
3. 상대적 클러스터 영역 크기(relative cluster area size)
4. 발생 혈관 수 (number of sprouting vessels; 타래 (tufts))
5. 무혈 영역의 절대적 크기(absolute size of the avascular zone)
6. 무혈 영역의 상대적 크기(relative size of the avascular zone)
망막병증 점수는 FITC-데스트란 이미지(dextran images)상에 상기 매개변수들로 계산되었다 (Higgins, Yu et al. 1999). 상기 매개변수에 대한 유의성 수준 및 망막변증 점수는 도 46에 표시하였다.
14.2 결과
시험된 34마리 마우스로부터, 24 개의 전체 마운트를 FITC-데스트란 관류(dextran perfusion) 이후에 측정가능하고 15개는 이소렉틴(isolectin) 염색이후에 측정가능하였다. 12일째(P12)의 880 pmol SDF-1 결합 스피에겔머 NOX-A12-JE40의 단일 주사는 타래(tuft) 형성을 유의적으로 저해하고 따라서 17일째(P17)에 관찰되는 바와 같이, 전체 망막변증 점수를 개선하였다 (도 45 및 도 46 참조). 따라서, NOX-A12-JE40은 저산소증-유도 신생맥관형성증, 특히 안구에서의 질환, (예를 들어, 당뇨병성 망막병증, AMD)에 유리한 효과를 가질 수 있다.
<110> NOXXON PHARMA AG PURSCHKE, Werner JAROSCH, Florian EULBERG, Dirk KLUSSMANN, Sven BUCHNER, Klaus MAASCH, Christian DINSE, Nicole <120> SDF-1 BINDING NUCLEIC ACIDS AND THE USE THEREOF <130> DIFI/PA1007/KH <150> PCT/EP2008/006473 <151> 2008-08-06 <160> 241 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65 <210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 65 70 <210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Ile Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65 <210> 4 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys 65 70 <210> 5 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 5 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 6 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 6 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38 <210> 7 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 7 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accgcagc 38 <210> 8 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 8 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accacagc 38 <210> 9 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 9 gcuguaaaag uaacauguca augaaaggua acuacagc 38 <210> 10 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 10 gcuguaaaag uaacaaguca augaaaggua acuacagc 38 <210> 11 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 11 gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua accacagc 38 <210> 12 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 12 gcagugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38 <210> 13 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 13 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacugc 38 <210> 14 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 14 gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua accauagc 38 <210> 15 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 15 gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 16 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 16 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccacagc 38 <210> 17 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 17 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 18 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 18 agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu aaccacgcu 39 <210> 19 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 19 aaagyracah gumaaaugaa agguarc 27 <210> 20 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> L-RNA <400> 20 aaagyracah gumaaugaaa gguarc 26 <210> 21 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 21 aaagyracah gumaaaugaa agguarc 27 <210> 22 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> L-RNA <400> 22 aaagyaacah gucaaugaaa gguarc 26 <210> 23 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <400> 23 rshryr 6 <210> 24 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <400> 24 yrydsy 6 <210> 25 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <400> 25 cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag 36 <210> 26 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 26 ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgca 34 <210> 27 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> L-RNA <400> 27 gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc gc 32 <210> 28 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> L-RNA <400> 28 ugaaagcaac augucaauga aagguagccg 30 <210> 29 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> L-RNA <400> 29 gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc 28 <210> 30 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> L-RNA <400> 30 aaagcaacau gucaaugaaa gguagc 26 <210> 31 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <400> 31 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36 <210> 32 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <400> 32 gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36 <210> 33 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 33 gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc ccgc 34 <210> 34 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 34 cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgcg 34 <210> 35 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 35 gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc gugc 34 <210> 36 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamers and Spiegelmers were produced by solid-phase synthesis with an ABI 394 synthesizer using 2 'TBDMS RNA phosphoramidite chemistry <400> 36 gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc gcgc 34 <210> 37 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 37 cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug 34 <210> 38 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 38 gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc 34 <210> 39 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 39 ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34 <210> 40 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 40 gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggc 34 <210> 41 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 41 ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggg 34 <210> 42 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> s or absent <400> 42 sbbbs 5 <210> 43 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> s or absent <400> 43 sbbvs 5 <210> 44 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> nucleotide = a, g, c or u <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> nucleotide = a, g, c or u <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> s or absent <400> 44 rsnnbv 6 <210> 45 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> nucleotide = a, g, c or u <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> nucleotide = a, g, c or u <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> R or absent <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Y or absent <400> 45 bnbnry 6 <210> 46 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> L-RNA <400> 46 agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47 <210> 47 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> L-RNA <400> 47 agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu 47 <210> 48 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> L-RNA <400> 48 agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu 47 <210> 49 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 49 gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45 <210> 50 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 50 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45 <210> 51 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 51 gcauggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugccc 45 <210> 52 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 52 gcguggugug aucuagaugu aauggcugau ccuagucagg gacgc 45 <210> 53 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 53 gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 54 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 54 gcguggugug aucuagaugu agaggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 55 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 55 gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu ccuagucagg uaugc 45 <210> 56 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 56 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuaguuagg uacgc 45 <210> 57 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 57 gugugaucua gauguadwgg cugwuccuag uyagg 35 <210> 58 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 58 gugugaucua gauguadugg cugauccuag ucagg 35 <210> 59 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> A or absent <400> 59 agcrwg 6 <210> 60 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> U or absent <400> 60 kryscu 6 <210> 61 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 61 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 62 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 62 cgugguguga ucuagaugua guggcugauc cuagucaggu acg 43 <210> 63 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> L-RNA <400> 63 guggugugau cuagauguag uggcugaucc uagucaggua c 41 <210> 64 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 64 uggugugauc uagauguagu ggcugauccu agucaggua 39 <210> 65 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> L-RNA <400> 65 ggugugaucu agauguagug gcugauccua gucaggu 37 <210> 66 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 66 gugugaucua gauguagugg cugauccuag ucagg 35 <210> 67 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 67 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 68 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 68 gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg cgcgc 45 <210> 69 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 69 gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg cgc 43 <210> 70 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 70 gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ccc 43 <210> 71 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 71 ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg gcc 43 <210> 72 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 72 gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc 43 <210> 73 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> G or absent <400> 73 gssbs 5 <210> 74 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> C or absent <400> 74 bvssc 5 <210> 75 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> A or absent <400> 75 agcgug 6 <210> 76 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> U or absent <400> 76 uacgcu 6 <210> 77 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> A or absent <220> <221> misc_feature <222> (2) <223> G or absent <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> nucleotide = a, b, c or u <400> 77 agsvns 6 <210> 78 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> C or absent <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> U or absent <400> 78 bvbscu 6 <210> 79 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 79 gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac 39 <210> 80 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 80 agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu 39 <210> 81 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 81 guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac 39 <210> 82 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(48) <223> L-RNA <400> 82 cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg 48 <210> 83 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 83 agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu 39 <210> 84 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 84 gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac 39 <210> 85 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 85 guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac 39 <210> 86 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 86 guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac 39 <210> 87 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 87 gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac 39 <210> 88 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 88 gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac 38 <210> 89 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 89 gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac 39 <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A or absent <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> A or absent <400> 90 gguyagggcu hraagucgg 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> L-RNA <400> 91 gguyagggcu hraagucgg 19 <210> 92 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> L-RNA <400> 92 gguyagggcu hragucgg 18 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> L-RNA <400> 93 gguuagggcu hgaagucgg 19 <210> 94 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 94 ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca 38 <210> 95 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <400> 95 gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc 36 <210> 96 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 96 gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu 29 <210> 97 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> L-RNA <400> 97 gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc 37 <210> 98 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 98 cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg 35 <210> 99 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> L-RNA <400> 99 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg 33 <210> 100 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> L-RNA <400> 100 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucgc ccg 33 <210> 101 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA <400> 101 cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc g 31 <210> 102 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 102 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29 <210> 103 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 103 gggagguuag ggcuagaagu cgguccc 27 <210> 104 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 104 ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg 27 <210> 105 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 105 cccggguuag ggcuagaagu cggcggg 27 <210> 106 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> L-RNA <400> 106 ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc 27 <210> 107 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 107 cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg 29 <210> 108 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 108 gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc 29 <210> 109 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 109 ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg 29 <210> 110 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 110 cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg 29 <210> 111 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 111 gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc 29 <210> 112 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> L-RNA <400> 112 ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca 37 <210> 113 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 113 gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc 35 <210> 114 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> L-RNA <400> 114 cugcgggggu uagggcuaga agucggccug cag 33 <210> 115 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA <400> 115 ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc a 31 <210> 116 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 116 gcggggguua gggcuagaag ucggccugc 29 <210> 117 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <400> 117 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29 <210> 118 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA <400> 118 ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc c 31 <210> 119 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA <400> 119 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31 <210> 120 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> nucleotide = a, g, c or u <400> 120 rksbusnvgr 10 <210> 121 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n is any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> nucleotide = a, g, c or u <400> 121 yynrcassmy 10 <210> 122 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> L-RNA <400> 122 rksbugsvgr 10 <210> 123 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n is any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> nucleotide = a, g, c or u <400> 123 ycnrcassmy 10 <210> 124 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> s or absent <400> 124 ssssv 5 <210> 125 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> s or absent <400> 125 bssss 5 <210> 126 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 126 sggsv 5 <210> 127 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 127 ysccs 5 <210> 128 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 128 gcsgg 5 <210> 129 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 129 cckgc 5 <210> 130 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 130 ssssr 5 <210> 131 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <400> 131 ysbss 5 <210> 132 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 kDa-PEG <400> 132 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 133 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 KDa-PEG <400> 133 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36 <210> 134 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 kDa-PEG <400> 134 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29 <210> 135 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 kDa-PEG <400> 135 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29 <210> 136 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 kDa-PEG <400> 136 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31 <210> 137 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40 kDa-PEG <400> 137 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 138 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-RNA <400> 138 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40 <210> 139 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 30 kDa-PEG <400> 139 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 140 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 100 kDa-HES <400> 140 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 141 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 130 kDa-HES <400> 141 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 142 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(48) <223> L-RNA <400> 142 cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48 <210> 143 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(49) <223> L-RNA <400> 143 gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag 49 <210> 144 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(49) <223> L-RNA <400> 144 caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag 49 <210> 145 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 145 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 146 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 146 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38 <210> 147 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 147 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accgcagc 38 <210> 148 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 148 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accacagc 38 <210> 149 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 149 gcuguaaaag uaacauguca augaaaggua acuacagc 38 <210> 150 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 150 gcuguaaaag uaacaaguca augaaaggua acuacagc 38 <210> 151 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 151 gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua accacagc 38 <210> 152 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 152 gcagugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38 <210> 153 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 153 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacugc 38 <210> 154 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 154 gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua accauagc 38 <210> 155 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 155 gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 156 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 156 gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccacagc 38 <210> 157 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 157 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua gccgcagc 38 <210> 158 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 158 agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu aaccacgcu 39 <210> 159 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 159 cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag 36 <210> 160 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 160 ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgca 34 <210> 161 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 161 gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc gc 32 <210> 162 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 162 ugaaagcaac augucaauga aagguagccg 30 <210> 163 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 163 gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc 28 <210> 164 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 164 aaagcaacau gucaaugaaa gguagc 26 <210> 165 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 165 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36 <210> 166 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 166 gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc 36 <210> 167 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 167 gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc ccgc 34 <210> 168 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 168 cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgcg 34 <210> 169 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 169 gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc gugc 34 <210> 170 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 170 gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc gcgc 34 <210> 171 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 171 cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug 34 <210> 172 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 172 gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc 34 <210> 173 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 173 ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34 <210> 174 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 174 gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggc 34 <210> 175 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 175 ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggg 34 <210> 176 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 176 agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47 <210> 177 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 177 agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu 47 <210> 178 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 178 agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu 47 <210> 179 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 179 gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45 <210> 180 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 180 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc 45 <210> 181 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 181 gcauggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugccc 45 <210> 182 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 182 gcguggugug aucuagaugu aauggcugau ccuagucagg gacgc 45 <210> 183 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 183 gcguggugug aucuagaugu agaggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 184 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 184 gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 185 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 185 gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu ccuagucagg uaugc 45 <210> 186 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 186 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuaguuagg uacgc 45 <210> 187 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 187 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 188 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 188 cgugguguga ucuagaugua guggcugauc cuagucaggu acg 43 <210> 189 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 189 guggugugau cuagauguag uggcugaucc uagucaggua c 41 <210> 190 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 190 uggugugauc uagauguagu ggcugauccu agucaggua 39 <210> 191 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 191 ggugugaucu agauguagug gcugauccua gucaggu 37 <210> 192 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 192 gugugaucua gauguagugg cugauccuag ucagg 35 <210> 193 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 193 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 194 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 194 gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg cgcgc 45 <210> 195 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 195 gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg cgc 43 <210> 196 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 196 gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ccc 43 <210> 197 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 197 ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg gcc 43 <210> 198 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 198 gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc 43 <210> 199 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 199 gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac 39 <210> 200 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 200 agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu 39 <210> 201 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 201 guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac 39 <210> 202 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 202 cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg 48 <210> 203 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 203 agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu 39 <210> 204 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 204 gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac 39 <210> 205 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 205 guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac 39 <210> 206 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 206 guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac 39 <210> 207 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 207 gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac 39 <210> 208 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 208 gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac 38 <210> 209 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 209 gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac 39 <210> 210 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 210 ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca 38 <210> 211 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 211 gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc 36 <210> 212 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 212 gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu 29 <210> 213 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 213 gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc 37 <210> 214 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 214 cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg 35 <210> 215 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 215 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg 33 <210> 216 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 216 cgggcgaggu uagggcuaga agucggucgc ccg 33 <210> 217 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 217 cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc g 31 <210> 218 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 218 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg 29 <210> 219 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 219 gggagguuag ggcuagaagu cgguccc 27 <210> 220 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 220 ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg 27 <210> 221 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 221 cccggguuag ggcuagaagu cggcggg 27 <210> 222 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 222 ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc 27 <210> 223 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 223 cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg 29 <210> 224 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 224 gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc 29 <210> 225 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 225 ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg 29 <210> 226 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 226 cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg 29 <210> 227 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 227 gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc 29 <210> 228 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 228 ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca 37 <210> 229 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 229 gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc 35 <210> 230 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 230 cugcgggggu uagggcuaga agucggccug cag 33 <210> 231 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 231 ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc a 31 <210> 232 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 232 gcggggguua gggcuagaag ucggccugc 29 <210> 233 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 233 gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 29 <210> 234 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 234 ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc c 31 <210> 235 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 235 cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31 <210> 236 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 236 cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48 <210> 237 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 237 gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag 49 <210> 238 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 238 caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag 49 <210> 239 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> pegylated <400> 239 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40 <210> 240 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 30-kDa-PEG <400> 240 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45 <210> 241 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 40-kDa-PEG <400> 241 cgcauggacu gauccuaguc gguuauguag aucuagugug gugcg 45

Claims (119)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 활성성분인 5′->3′ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 1차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치로 구성되거나 또는 5′->3′ 방향으로 뉴클레오티드(nucleotides)의 제 2차 스트레치(stretch), 핵심 뉴클레오티드 서열(core nucleotide sequence), 및 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치로 구성되며, 핵심 뉴클레오티드 서열은 5′ GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3′ (서열번호 57); 제 1차 스트레치는 5′X1X2SVNS3′ (서열번호 77)의 뉴클레오티드 서열; 및 제 2차 스트레치는 5′BVBSX3X43′ (서열번호 78)로 구성되고, 여기에서 X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X2 는 G이고, X3 는 C이고 X4 는 존재하지 않거나 또는 U이거나 또는 X1 는 존재하지 않고, X2 는 존재하지 않거나 또는 G이고, X3 는 존재하지 않거나 또는 C이고 X4 는 존재하지 않은 L-핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 맥락막 신생맥관형성증 (choroidal neovascularization); 당뇨병성 신병증(Diabetic nephropathy); 망막 혈관 누수(retinal vascular leakage); 산소-유도 망막병증(oxygen-induced retinopathy)의 신생혈관형성증(angiogenesis); 알러지(allergy); 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus); 건선(psoriasis); 척추관절증(spondyloarthropathy); 골관절염(osteoarthritis); 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis); 간, 신장, 장관, 폐, 심장, 피부, 사지(limb), 각막, 랑거한스 섬(islets of Langerhans), 혈관, 췌장으로부터 선택된 이식 기관의 이식 거부증(transplant rejection of a transplanted organ); 및 암(cancer)으로 구성된 군으로부터 선택된 SDF-1 길항제로 치료가능한 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (서열번호 58)의 핵심 뉴클레오티드 서열로 구성되는 약학조성물.
  114. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치가 5′X1GCRWG3′ (서열번호 59)이며 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치가 5′KRYSCX43′(서열번호 60)로 구성되고, 여기에서 X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X4 는 존재하지 않거나 또는 U인 약학조성물.
  115. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치가 5′X1GCGUG3′ (서열번호 75)이며 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치가 5′UACGCX43′ (서열번호 76)로 구성되고, 여기에서 X1 는 존재하지 않거나 또는 A이고, X4 는 존재하지 않거나 또는 U인 약학조성물.
  116. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1차 스트레치가 5′X2SSBS3＇ (서열번호 73)이며 뉴클레오티드의 제 2차 스트레치가 5′BVSSX33′ (서열번호 74)로 구성되고, 여기에서 X2 는 존재하지 않거나 또는 G이고, X3 는 존재하지 않거나 또는 C인 약학조성물.
  117. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 서열번호 46 내지 56, 61 내지 72, 및 132 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 약학조성물.
  118. 제 60항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 HES 기 및 PEG 기를 포함하는 군으로부터 선택된 변형체를 포함하는 것인 약학조성물.
  119. 제 60항에 있어서,
    상기 질환은 암이고 상기 약학조성물은 환자에 화학요법을 수행하기 전에 투여함을 특징으로 하는 약학조성물.
















KR1020107002791A 2007-08-06 2008-08-06 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도 KR101589442B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07015379.6 2007-08-06
EP07015379 2007-08-06
EP08008312 2008-04-30
EP08008312.4 2008-04-30
EP08011024 2008-06-18
EP08011024.0 2008-06-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100050500A KR20100050500A (ko) 2010-05-13
KR101589442B1 true KR101589442B1 (ko) 2016-02-01

Family

ID=39867983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107002791A KR101589442B1 (ko) 2007-08-06 2008-08-06 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도

Country Status (21)

Country Link
US (3) US8772257B2 (ko)
EP (1) EP2190991B1 (ko)
JP (1) JP5815945B2 (ko)
KR (1) KR101589442B1 (ko)
CN (1) CN101796188B (ko)
AU (1) AU2008285939B2 (ko)
BR (1) BRPI0815094B8 (ko)
CA (1) CA2695061C (ko)
DK (1) DK2190991T3 (ko)
ES (1) ES2768051T3 (ko)
HK (1) HK1144956A1 (ko)
HR (1) HRP20200117T1 (ko)
HU (1) HUE047459T2 (ko)
LT (1) LT2190991T (ko)
MX (1) MX2010001490A (ko)
PL (1) PL2190991T3 (ko)
PT (1) PT2190991T (ko)
RU (1) RU2612388C2 (ko)
SG (2) SG10201600632QA (ko)
SI (1) SI2190991T1 (ko)
WO (1) WO2009019007A2 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE510014T1 (de) * 2006-02-14 2011-06-15 Noxxon Pharma Ag Mcp-i-bindende nukleinsäuren
ES2663404T3 (es) 2006-07-18 2018-04-12 Noxxon Pharma Ag Ácidos nucleicos de unión a SDF-1
JP5815945B2 (ja) 2007-08-06 2015-11-17 ノクソン・ファルマ・アクチエンゲゼルシャフト Ｓｄｆ−１結合核酸およびその使用
WO2012025251A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids for treatment of chronic complications of diabetes
MX357770B (es) * 2010-09-09 2018-07-24 Noxxon Pharma Ag Star Ácidos nucleicos de enlace sdf-1 y el uso de los mismos en el tratamiento de cáncer.
JP5843189B2 (ja) * 2011-03-15 2016-01-13 国立大学法人名古屋大学 Ｓｄｆ−１阻害剤を含有した軟骨組織再生用組成物
WO2013155347A1 (en) * 2012-04-11 2013-10-17 Izumi Raquel Bruton's tyrosine kinase inhibitors for hematopoietic mobilization
CN105849323A (zh) 2013-10-28 2016-08-10 多茨设备公司 过敏原检测
CN107073078B (zh) * 2014-09-26 2021-07-06 赫利世弥斯株式会社 利用肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的用于预防或治疗外周动脉疾病的组合物
US11213613B2 (en) * 2015-06-12 2022-01-04 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Three-dimensional tissue scaffold with stem cell attracting element and use thereof
GB201522223D0 (en) * 2015-12-16 2016-01-27 Ucl Business Plc Therapeutic T cells
EP3443095A1 (en) * 2016-04-15 2019-02-20 Noxxon Pharma AG Method of modulating the number and the distribution of tumor-infiltrating leukocytes in tumors
AU2018210853B2 (en) 2017-01-17 2023-09-28 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases and disorders
WO2018136434A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for diagnosing and treating peroxisomal diseases
CN115997122A (zh) 2020-06-26 2023-04-21 拉夸里亚创药株式会社 类维生素a与癌治疗剂的组合疗法有效的癌患者的选择方法、及类维生素a与癌治疗剂的组合药物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032143A1 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Arc Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods relating to inhibiting fibrous adhesions or inflammatory disease using low sulphate fucans

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011020A (en) * 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5567588A (en) * 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5840867A (en) * 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
EP1072273B1 (en) * 1998-03-24 2006-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Vascularization inhibitors
DE60045681D1 (de) * 1999-03-11 2011-04-14 Merck Serono Sa Vaskuläre adhesionsmoleküle und modulierung ihrer funktion
EP1169348B1 (en) * 1999-04-08 2016-02-24 The General Hospital Corporation Purposeful movement of human migratory cells away from an agent source
US6949243B1 (en) * 1999-11-24 2005-09-27 Schering Corporation Methods of inhibiting metastasis
EP1133988A1 (en) * 2000-03-11 2001-09-19 Biognostik Gesellschaft für biomolekulare Diagnostik mbH Mixture comprising an inhibitor or suppressor of a gene and a molecule binding to an expression product of that gene
JP5414958B2 (ja) * 2000-06-05 2014-02-12 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の同定、及び虚血性傷害後の心筋細胞の機能を改善するためのヒト骨髄由来内皮前駆細胞の使用
WO2002101350A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-19 Chemocentryx Cell migration assay
US7468253B2 (en) * 2001-06-07 2008-12-23 Chemocentryx, Inc. Method for multiple chemokine receptor screening for antagonists using RAM assay
GB0225833D0 (en) * 2002-11-06 2002-12-11 Univ Leeds Nucleic acid ligands and uses therefor
CN101111598B (zh) * 2004-11-29 2013-03-27 诺松制药股份公司 结合加压素的l-核酸
EP1993584B1 (en) * 2006-02-02 2012-05-30 Allergan, Inc. Inhibitors of CXCR4 activity for use in the treatment of ocular disorders
ES2663404T3 (es) * 2006-07-18 2018-04-12 Noxxon Pharma Ag Ácidos nucleicos de unión a SDF-1
CA2665239A1 (en) * 2006-10-02 2008-05-22 Medarex, Inc. Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
EP2407558A1 (en) * 2006-10-31 2012-01-18 Noxxon Pharma AG Methods for the detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
EP2100140B1 (en) * 2006-11-30 2015-05-06 University Of Virginia Patent Foundation Methods for diagnosing fibrotic lung diseases
JP5815945B2 (ja) * 2007-08-06 2015-11-17 ノクソン・ファルマ・アクチエンゲゼルシャフト Ｓｄｆ−１結合核酸およびその使用
US20090274687A1 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 University Of Miami Attenuation of hypoxia induced cardiovascular disorders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032143A1 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Arc Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods relating to inhibiting fibrous adhesions or inflammatory disease using low sulphate fucans

Also Published As

Publication number Publication date
US9988636B2 (en) 2018-06-05
EP2190991A2 (en) 2010-06-02
SG183682A1 (en) 2012-09-27
US8772257B2 (en) 2014-07-08
CA2695061C (en) 2021-10-19
AU2008285939A1 (en) 2009-02-12
WO2009019007A3 (en) 2009-04-16
SI2190991T1 (sl) 2020-03-31
LT2190991T (lt) 2020-02-10
CA2695061A1 (en) 2009-02-12
CN101796188B (zh) 2014-10-29
HRP20200117T1 (hr) 2020-04-03
KR20100050500A (ko) 2010-05-13
JP5815945B2 (ja) 2015-11-17
HUE047459T2 (hu) 2020-04-28
US20160326531A1 (en) 2016-11-10
PT2190991T (pt) 2019-12-16
EP2190991B1 (en) 2019-11-06
RU2612388C2 (ru) 2017-03-09
ES2768051T3 (es) 2020-06-19
JP2010535479A (ja) 2010-11-25
US20110223127A1 (en) 2011-09-15
US20140370034A1 (en) 2014-12-18
BRPI0815094A2 (pt) 2015-02-03
MX2010001490A (es) 2010-03-04
HK1144956A1 (en) 2011-03-18
WO2009019007A2 (en) 2009-02-12
CN101796188A (zh) 2010-08-04
BRPI0815094B8 (pt) 2023-04-18
AU2008285939B2 (en) 2014-09-18
SG10201600632QA (en) 2016-03-30
RU2010108222A (ru) 2011-09-20
BRPI0815094B1 (pt) 2020-09-24
PL2190991T3 (pl) 2020-05-18
DK2190991T3 (da) 2020-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101589442B1 (ko) 에스디에프-1 결합형 핵산 및 이의 용도
US20210139909A1 (en) SDF-1 Binding Nucleic Acids
US10093934B2 (en) SDF-1 binding nucleic acids and the use thereof in cancer treatment

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190108

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191224

Year of fee payment: 5