CN101528925B - 双链断裂诱饵及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于干扰双链断裂(DSBs)的DNA修复的组合物和方法。本发明公开了新的双链核酸分子，其用作诱饵并劫持负责DNADSB感应、信号传导和/或修复途径，特别是DSB修复的非同源性末端连接(NHEJ)途径的酶的全复合物。本发明公开了这些分子作为佐剂组合物，与可药用载体组合，与DNA断裂性治疗特别是放射疗法或化学疗法结合使用，以有效量导入到肿瘤细胞的核中，以便暂时中和它们的DNA修复能力并触发它们的死亡的应用。

Description

双链断裂诱饵及其应用
本发明涉及了在哺乳动物细胞中干扰DNA修复途径的组合物和方法。具体来说，本发明涉及了干扰DNA损伤的感应、信号传导和/或修复途径、特别是双链断裂(DSB)修复的非同源性末端连接(NHEJ)途径的核酸分子，以及它们的应用，特别是用于触发经历了抗癌症疗法的肿瘤的细胞致死。本发明公开一类新型核酸分子，被称为“DSB诱饵”或“Dbait(双链断裂诱饵)”，可用于哺乳动物对象中的各种不同的治疗性病症，用于干扰DNA DSB修复途径。
发明背景
放射疗法和化学疗法、单独地或与外科手术相结合，是针对人类癌症的主要治疗手段。
离子化辐射直接或间接地引起双链断裂(DSBs)并触发细胞/组织死亡(坏死或凋亡)。离子化辐射的细胞毒性效应形成了广泛用于人类癌症治疗的放射疗法的基础。目前，放射疗法的效率受到了某些肿瘤(例如，成胶质细胞瘤、头颈鳞状上皮细胞腺癌)的放射性抗性以及辐射邻近正常组织引起的副作用(例如在乳腺癌和宫颈癌的治疗中)的限制。
在过去的几年，许多研究集中于与离子化辐射反应有关的生物学机制，以便获得对潜伏在肿瘤细胞的放射性敏感性或放射性抗性之下的现象的复杂性的了解。对精细调控对离子化辐射的反应的不同途径的理解，是朝向鉴定新的药物和疗法的分子靶的一个重要步骤，这些新的药物和疗法与放射疗法相结合，可以增加从对辐射具有高度抗性的肿瘤，例如脑部或头颈肿瘤复原的机会。
化疗药剂的使用可能引起DNA损伤，包括直接或间接的DSBs。使用最多的化疗药剂(化学细胞毒性药剂)家族的例子是：拓扑异构酶I或II抑制剂(喜树碱/拓扑替康，表柔比星/依托泊苷)，DNA交联剂(顺铂/卡铂/奥沙利铂)，DNA烷基化试剂(卡莫司汀/达卡巴嗪)或抗代谢药剂(5-氟尿嘧啶/吉西他滨/卡培他滨)，以及有丝分裂纺锤体抑制剂(紫杉醇/多烯紫杉醇/长春瑞滨)。
开发生物药物(单克隆抗体、细胞因子/激酶抑制剂、免疫治疗剂/疫苗)中的最新进展已经证明了它们对一部分肿瘤的效力和特异性。但是它们通常与化学细胞毒性药剂结合使用。尽管在开发新的细胞毒性药物中有许多进展，但是对化学疗法的药物抗性仍然是癌症治疗中的主要临床关注的问题。对于涉及药物摄入/流出、代谢降解、靶的诱变、增强的修复、细胞死亡(凋亡和坏死)的信号传导的药物抗性的机制的理解，对于特别是在某些对治疗有抗性的肿瘤中保证化疗的效力和改善治疗指标是非常必要的。
化学疗法和放射疗法的结合被广泛用于癌症治疗中。尽管还没有完全阐明，但细胞毒性药剂的作用的生物学基础依赖于细胞机制，例如细胞周期或DNA损伤，它们对于放射性诱导的细胞死亡也是重要的，因此当在癌症治疗中组合不同的治疗方法时导致了加成的或甚至更好的协同效益。
在最近10年中，在该领域进行了许多研究，对辐射作出反应的信号传导的复杂性进行描述。在这一方面，特别感兴趣的作为离子化辐射的靶的基因是参与辐射诱导的致死机制的调控，例如凋亡或DNA修复的基因。因为DSBs是最致命的DNA损伤，当DSB修复增加时，离子化辐射的效力降低了。
两种机制参与了DSBs的修复：非同源性末端连接(NHEJ，不依赖于序列的途径)和同源重组(HR，序列依赖性途径)(综述在Jackson，2002中)。对参与这两种主要DSB修复途径的基因进行的定向到目前为止导致了很少或中度的放射性敏感性，这依赖于所使用的方法和癌症细胞系(Belenkov等，2002；Marangoni等，2000；Ohnishi等，1998)。
Ku(例如Ku70和Ku80)和DNA-PKcs蛋白在放射性或化学物质诱导的DNA DSBs的修复中是重要的。如果损伤没有被及时修复，细胞将死亡。因此，它们代表了用于使靶细胞和组织对放射疗法和化学疗法致敏的潜在有兴趣的分子靶。据此，已经设想了许多方法并进行了尝试，以抑制这些参与在哺乳动物细胞中占优势的NHEJ途径的关键蛋白(Ku70/Ku80，DNA-PKcs等)：
1)PI3K抑制剂(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKcs、ATM、ATR)(Boulton等，2000；Durant & Karran，2003；Willmore等，2004；Vauger等2004)；
2)显性失活的肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000；Kim等，2002)；
3)单链抗体可变区片段(scFv)(DNA-PKcs)(Li等，2003)；
4)RNA适体(Aptamer)(SELEX：RNA结合的Ku)(Yoo & Dynan，1998)；
5)反义物(Ku70，Ku80，DNA-PKcs)(Li等，2003b；Marangoni等，2000；Sak等，2002)；
6)siRNA(DNA-PKcs)(Peng等，2000)。
尽管作出了这些极大的努力，将参与DNA修复途径的基因的靶向与癌症疗法相结合仍然处于早期实验阶段，到目前为止，还没有临床研究显示出任何被证明的益处。值得注意的是上面描述的方法具有共同的特点：它们靶向于参与具有可能的旁路或补偿途径的复杂的级联途径(例如NHEJ)的单个效应子(蛋白)。
发明简述
本发明涉及在哺乳动物细胞中干扰DNA修复途径的新的组合物和方法。具体来说，本发明涉及以非基因特异性方式干扰DNA损伤的感应、信号传导和/或修复途径的核酸分子，以及它们的应用，特别是用于触发经历了抗癌症疗法的肿瘤的细胞致死。
本发明人已经发现，细胞对直接或间接DNA损伤疗法的敏感性可以通过使用(化学修饰的或未修饰的)短dsDNA分子来加强，这些短dsDNA分子用作断裂DNA片段的模拟物，并被识别成DNA损伤治疗所诱导的DSB位点(即DSB的底物模拟物)。
正如在实施例中显示的，本发明的分子在体外和体内都有效，可用于赋予或增加任何肿瘤细胞对DNA损伤性癌症疗法的敏感性。
因此，本发明的一个目标涉及这样的dsDNA分子，也被命名为“DSB诱饵”分子(缩写为Dbait(双链断裂诱饵))，它们能够增加对治疗有抗性的肿瘤对放射疗法和化学疗法的反应。正如将在下面进一步公开的那样，Dbait子通过引诱和劫持DNA修复酶的全复合物(holocomplex)起作用，从而干扰DNA损伤的感应、信号传导和/或修复过程。这种新的方法被命名为“DNA诱饵”。
在优选实施方案中，本发明涉及Dbait分子，它是核酸分子，其中该分子含有至少24bp的双链部分，具有至少一个游离末端，无CpG，与人类基因组中的任何基因具有小于70％的序列同一性，在每条链的末端或至少在3’末端链上含有一个或几个硫代磷酸酯或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸，其中所述分子是参与双链断裂(DSB)修复的NHEJ途径的至少Ku蛋白的结合底物。优选情况下，Dbait分子选自Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc、Dbait32Hd、Dbait32Hc-3’mp、Dbait32Hc-5’3’mp、Dbait32Hc-Cy3、Dbait32Hc-Cy5和Dbait32Hd-FITC。更优选情况下，Dbait分子是Dbait32Hc。
本发明的另一个目的是含有Dbait分子和可药用的载体或赋形剂的组合物。在具体的实施方案中，该组合物适合于口服途径或用于静脉内、肿瘤内或皮下注射，或用于颅内或动脉内注射或灌注或用于局部施用。
本发明的另一个目的是Dbait分子与能够直接或间接引起DNA的DSBs的物理手段和/或化学试剂的组合。具体来说，本发明涉及含有本发明的Dbait分子和能够直接或间接引起DNA的双链断裂的化学药剂的药物产品，作为组合的制备物用于治疗癌症。优选情况下，Dbait分子在化学药剂之前或同时施用。
本发明的另一个目的是使用Dbait分子和直接或间接引起DNA损伤的疗法的组合，治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法。因此，本发明涉及使用本发明的Dbait分子制造用于治疗癌症的药物，该药物与DNA损伤性抗癌症疗法组合使用。具体来说，DNA损伤性抗癌症疗法选自放射疗法和化学疗法。优选情况下，Dbait分子将在放射疗法之前使用。或者，Dbait分子在化学疗法之前或同时施用。在具体的实施方案中，分子将通过口服途径，或通过静脉内、肿瘤内或皮下注射，或通过颅内或动脉内注射或灌注或用于局部施用。优选情况下，癌症选自CNS、头颈、结肠直肠、肝脏、胃肠道、生殖泌尿道、肺、皮肤、乳腺癌和宫颈癌。
本发明的另一个目的涉及使用Dbait分子制造抗癌症疗佐剂，用于增加癌症治疗的效力，特别是对于对放射和/或化学疗法反应不强的肿瘤。
本发明的另一个目的是增加肿瘤对DNA损伤性抗癌症疗法的敏感度的方法，该方法包括给对象施用上面定义的Dbait分子。
因此，本发明涉及使用本发明的Dbait分子制造用于增加肿瘤对DNA损伤性抗癌症疗法的敏感度的药物。具体来说，DNA损伤性抗癌症疗法选自放射疗法和化学疗法。优选情况下，Dbait分子将在放射疗法之前施用。或者，Dbait分子在化学疗法之前或同时施用。在具体的实施方案中，分子将通过口服途径，或通过静脉内、肿瘤内或皮下注射，或通过颅内或动脉内注射或灌注施用或用于局部施用。优选情况下，癌症选自CNS、头颈、结肠直肠、肝脏、胃肠道、生殖泌尿道、肺、皮肤、乳腺癌和宫颈癌。
本发明的另一个目的是治疗癌症的方法，该方法包括给对象施用Dbait分子和DNA损伤性抗癌症疗法的组合。
本发明的另一个目的是与DNA断裂治疗，特别是放射疗法或化学疗法相结合使用的组合物，所述组合物含有至少一种与可药用载体组合的Dbait分子，以有效量导入到肿瘤细胞的核中。
本发明可用于在哺乳动物对象，特别是人类对象中的各种不同类型的癌症中，赋予对癌症疗法的敏感性，所述癌症为例如实体癌和白血病，特别是对放射疗法或化学疗法具有抗性的癌症。
附图说明
图1.1：在存在不同量的Hep2细胞的核提取物(0、10、20、40、80、160、320ng/μl)的情况下对不同的32P放射性标记的Dbait分子进行的带移动分析。移动的带被编号为1和2。3号带是载样孔。
图1.2：在包括Hep2细胞核提取物(0、20、80、320ng/μl)中的蛋白的不同32P放射性标记的Dbait分子的蛋白阻滞的条带中鉴定Ku蛋白的存在。在α-Ku泳道中，指示了在将样品上样到凝胶之前在结合反应中加入(+)或没加入(-)抗Ku抗体。移动的带被编号为1、2和3，对于在结合了抗Ku抗体后显示出迁移变化的条带，在编号上加上星号。
图1.3：使用20μg Hep2核蛋白提取物进行的DNA末端连接分析。上图：在20μl分析缓冲液中，在不存在和存在20μM Dbait的情况下，经过不同的时间，0.2μM 32P标记的DNA片段的连接。条带1-4指示了初始的605-bp DNA片段(单体[1])以及与二体[2]、三体[3]或四体[4]一样移动的连接产物。下图：连接产物的百分率被定量并显示成时间的函数(菱形，不含Dbait；圆圈，含有200nM Dbait32H)以及Dbait分子的化学结构的函数(在与200nM各种不同的Dbait温育2小时后)。
图1.4：在1.5μg Hep2核蛋白提取物中，对多种具有不同长度、序列和化学结构包括修饰的骨架的以下2μg Dbait分子进行的DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)活性分析：Dbait32ss和Dbait32css是两个32-nt的单链DNA；Dbait32C是哑铃状的32-bp的双链DNA(不具有游离的平末端)；Dbait8H、Dbaitl6H、Dbait24H和Dbait32H是发夹状双链DNA，茎分别为8、16、24和32-bp；Dbait32H、Dbait32Hb、Dbait32Hc和Dbait32Hd是32-bp的发夹状DNA，具有不同的序列但是具有同样的碱基组成；Dbait32d-F和DbaitHc-cy3分别是带有荧光和花青素3标签的Dbait32Hd和Dbat32Hc；Dbait32H-po是全长磷酸二酯Dbait32H，与它相比其它的Dbait分子在游离的平末端具有3-bp的磷酸硫酯，只有DbaitHc-3’mp和Dbait32Hc-5’3’mp除外，它们分别在3’末端或5’和3’末端具有3-nt的甲基膦酸酯。Dbait32Hc5’5’具有3’-3’键合，因此表现出5’/5’平末端；对于这些Dbait分子的详细情况可以参考表1.1和表1.2。数据代表了至少3次独立实验的平均值和标准偏差。
图2.1：在存在不同Dbait分子的情况下用来自137铯源的γ-射线进行4x0.5Gy(间隔2小时)的辐射后，Hela细胞的克隆存活分析。图A：在存在Dbait32和Dbait32H的情况下归一化的存活克隆数的剂量依赖性。图B：在存在83nM(培养基中的浓度)的不同Dbait分子的情况下归一化的存活克隆数。
图2.2：在存在不同Dbait分子的情况下用来自137铯源的γ-射线进行4x0.5Gy(间隔2小时)的辐射后，Hela细胞的附加的克隆存活分析。上图：在存在Dbait32H和Dbait8H的情况下归一化的存活克隆数的剂量依赖性。下图：在存在2μg不同Dbait分子的情况下归一化的存活克隆数。
图2.3：2μg Dbait32H分子对带有编码新霉素抗性基因的线性质粒片段(2μg)的辐射增强的非正常整合的抑制。
图2.4：各种不同Dbait32分子(2μg)对带有编码嘌呤霉素抗性基因的线性质粒片段(2μg)的辐射增强的非正常整合的抑制的附加分析。上图：在存在分步(4x0.5Gy)辐射(实心圆圈)或不存在辐射(实心三角形)的情况下Dait32H分子的剂量依赖性；下图：在存在2μg各种不同Dbait分子或200μM DNA-PK抑制剂(渥曼青霉素(wortmannin)或NU7026)的情况下，使用辐射(黑色)或不使用辐射(灰色)时的质粒整合效率。
图2.5：在2Gy辐射后2小时，通过荧光Dbait32H-FITC分子转染的Hela细胞中的γ-H2AXfoci显示出的双链断裂(DSB)位点的免疫检测。左图：通过核中的γ-H2AX抗体的免疫荧光检测到的Dbait32H-FITC(亮点和小片)和DSB位点的荧光；右图：通过γ-H2AX抗体的免疫荧光和DAPI复染检测到的带有DSB位点的核的相同照片。左下角的箭头显示在核中不存在Dbait32H-FITC和γ-H2AX信号。右上角的箭头显示协同定位的Dbait32H-FITC和γ-H2AX信号。
图2.6：上图：组蛋白H2AX被PIKKs磷酸化。通过western印迹分析总细胞提取物的磷酸化形式的组蛋白H2AX(γ-H2AX)的水平，并与总H2AX蛋白进行比较。用各种不同Dbait分子32Hc、24H、16H和8H转染Hep2细胞5小时，或不转染。在转染结束时将它们辐射，温育1小时，然后进行分析。结果表示成γ-H2AX/H2AX的归一化比率的柱形图。下图：通过对γ-H2AXfoci的FACS显示的辐射过(IR)的细胞中DSB位点的持久性的动力学：Dbait32Hc+IR(实线)；单独的IR(虚线)和未处理的(点线)。
图3.1：未处理的GMA32细胞、单独转染的细胞、或通过脂质转染胺(lipofectamine)用不同Dbait分子转染的、但是没有进一步辐射或用有丝分裂抑制剂处理的细胞的FACS分析。M1期显示了处于表明细胞死亡的亚G1期的细胞的百分率。
图3.2：在未处理的GMA32细胞、单独转染的细胞、或通过脂质转染胺用不同Dbait分子转染的细胞中通过γ-H2AX标记(核中的亮点或小片)进行的DNA修复位点的免疫检测。细胞膜和细胞核的复染用FITC-DiOC6和DAPI进行。
图3.3：未处理的GMA32细胞、单独转染的细胞、或通过脂质转染胺用不同Dbait分子转染的、但是没有进一步辐射或用有丝分裂抑制剂处理的细胞的p53的15位丝氨酸残基的磷酸化状态的Western印迹分析。
图3.4：在存在不同Dbait分子的情况下，未处理的和用4Gy辐射或用不同的有丝分裂抑制剂(200nM诺考达唑、100nM异长春花碱(长春瑞滨)或200nM紫杉醇(太平洋紫杉醇))处理的GMA32细胞的克隆存活性。
图4.1：处理和未处理的小鼠上异体移植的人类喉肿瘤的生长，被监测为t时的肿瘤体积与初始体积的比率(Vt/Vi)。图A：未处理的小组(n＝38)；图B：使用20μl培养基(MEM)+3x2Gy/周辐射的对照小组(n＝30)；图C：使用1nmole(20μg)Dbait32H+3x2Gy/周辐射的小组(n＝35)。MEM或Dbait32H在辐射之前5小时通过肿瘤内注射来递送。每两天中的一天给予分份的辐射剂量(2Gy)，每周三次。处理持续5周，总辐射剂量为30Gy。点代表了每只小鼠的肿瘤体积的时间过程。实线是最佳的多项式拟合。图D显示了肿瘤体积的增加(Vt/Vi)小于5的所有小鼠的Kaplan-Meier图。
图4.2：裸鼠中Hep2异体移植肿瘤中花青素C3标记的Dbait32H的分布。将20μg用Superfect(转染试剂)配制的Dbait32H-Cy3注射到1.5cm3Hep2肿瘤中。在注射后6小时将小鼠处死。取出肿瘤，低温切片，不用固定进行分析。DAPI用于核染色。
图4.3：裸鼠中Hep2异体移植肿瘤的放射性致敏作用。在进行了不同处理的4组10只动物中，监测了处理期间(在35天中进行了15期处理；灰色背景)和处理后(白色背景)肿瘤的生长。对于每只动物标出了每个肿瘤的生长。处理方法在顶部标明。对于每期处理期间，在2Gy辐射之前5小时，将2μg用转染试剂(PEI)配制的Dbait32H注射到肿瘤中。也标出了每组的肿瘤体积增加5倍所用的平均时间。对每个接受组合处理的组计算p-值，并与只接受辐射的组进行比较。
图4.4：上图：Hep2肿瘤皮下异体移植的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示法。处理方法描述在图4.3中。5个组包括了：未处理的，模拟转染和辐射的，通过组合的辐射和增加量的Dbait32H(20，60和120μg/期)处理的。每组动物的数量在表3.2中标出。灰色背景表示处理的时期。下图：在处理开始后15天、处理结束时(35天)和处理结束后13天(35+13天)拍摄的代表3个组(未处理，用20和60μg Dbait32H/期与2Gy辐射联合处理的)的肿瘤的照片。
图4.5：在处理中期(7期处理)异体移植的Hep2肿瘤的组织学分析。肿瘤在标明的各种不同处理方法开始后20天取出。将它们固定在福尔马林中，将组织切片用苏木精、曙红和番红花色素染色。对于每种处理方法通过显微镜分析两个肿瘤。图a：每种方法的代表性视野的照片。比例尺表示400mm(图1-4)和100mm(图5-8)。一旦需要可以获得彩色照片。图b：坏死的程度被表示为被分析为坏死的组织切片的表面积的比例。有丝分裂的细胞和凋亡的细胞的数量从高倍率下分析的大约1,000个细胞的代表性非坏死视野来估算。
图4.6：在处理中期(7期处理)时异体移植的Hep2肿瘤的NMR成像。显示了未处理的肿瘤、用辐射(2Gy/期)处理的肿瘤和用组合的Dbait32H(20μg/期)和辐射(2Gy/期)处理的肿瘤的三个代表性的横截面照片。肿瘤用白色圆圈勾画出。肿瘤中的灰色实体表示坏死的区域。
图4.7：用不同肿瘤(Hep2：鳞状细胞癌；U87：成胶质细胞瘤；LU1205和SK28：两种类型的黑素瘤)皮下异体移植的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示法。处理的时期用灰色区域标明。
图5.1：图A：用于3组/小组的平均年龄为12周的K-RasV12G xApc1638N转基因小鼠的处理方法：对照组(未处理)，用5FU+CPT11处理的组，用5FU+CPT11和Dbait32H处理的组。进行了三轮的处理。每轮包括腹膜内注射0.6mg 5FU和0.6mg CPT11，以及口服0.1mgDbait32H，一周三次，然后休息一周。每组中涉及的小鼠的数量标在括号中。终点是存活时间；图B：三个组的存活曲线的Kaplan-Meyer作图；图C：图B中显示三个组的中值存活时间。
图5.2：在用5FU+CPT11以及5FU+CPT11和Dbait32H处理的组中通过放大镜或组织学检查在每只动物的消化道中发现的肿瘤的平均数量。每个组中动物的数量标在括号中。在上图中显示的方法后2周(第18周)，将所有小鼠处死。对照小组(未处理的组，n＝101)的平均数量是30.8/动物(数据未显示)。
图5.3：消化道组织的荧光显微镜分析。图A：方法图解(i.p.：腹膜内注射；o.：口服)。图B：在按照图A中给出的方法处理的动物的肿瘤组织的5μm切片上，Dbait32H-FITC分子(左)和免疫荧光标记的γ-H2AX(右)的荧光。下面的部分显示了上面部分(使用10x透镜，白框)中标出的区域的详细情况(使用63x透镜)。在DAPI复染的核上的亮点显示了荧光Dbait32H-FITC和标记的γ-H2AX的协同定位(co-localization)。
发明详述
正如上面讨论的，本发明公开了一类新型的治疗性分子，它们能够以非基因特异性的方式干扰哺乳动物细胞中的DNA修复系统。这些被命名为Dbait分子的新分子，是参与NHEJ途径(不依赖于序列的途径)的蛋白、特别是Ku和/或DNA-PKcs蛋白的全复合物的底物，并且可以中和细胞的DNA修复能力，从而增加它们对DNA损伤性治疗的敏感性。
因此，本发明涉及了这样的分子，它们的制造和它们的治疗性应用，特别是与DNA损伤性治疗相结合用于治疗增殖性疾病。
本发明的Dbait分子可以根据多种特征来定义，所述特征例如为它们的极小长度、至少存在游离末端、以及存在双链部分。正如下面将要讨论的那样，Dbait分子的重要特征是它们的具体核苷酸序列基本上不影响它们的活性。此外，Dbait分子可以含有修饰的和/或非天然的骨架。
因此，本发明的第一个目的是核酸分子，其中所述分子含有至少大约16bp的双链部分，具有至少一个游离末端，并至少与参与NHEJ途径的Ku复合物结合。
分子优选为非人类来源的(即其核苷酸序列和/或构象(例如发夹)不原样存在于人细胞中)，最优选为重组和/或合成来源的。
根据Dbait分子的作用机制，Dbait分子的序列如果有作用的话发挥了很小的作用。因此，与在现有技术中使用的用于基因/蛋白特异性靶向的分子(例如反义分子、抗原、siRNA、适体、核酶等)相反，Dbait分子可以不与已知的基因、启动子、增强子、5’-或3’-上游序列、外显子、内含子等具有任何显著程度的序列同源性或同一性。换句话说，Dbait分子干扰NHEJ途径的作用是不依赖于序列的，Dbait分子可以与人类基因组中的任何基因具有少于70％、甚至少于50％的序列同一性。
这种不依赖于序列的作用机制是Dbait分子的标志，这将它们与其它基因特异性或蛋白特异性(序列依赖性)治疗试剂例如反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA、shRNA和miRNA)、免疫刺激性CpG寡核苷酸以及被设计用于捕获特异性蛋白的适体清楚地区分开来。
在优选实施方案中，Dbait分子的序列与人类核酸序列的总体同一性程度小于大约70％、60％、55％或50％。确定序列同一性的方法在本技术领域中是众所周知的，并且包括例如Blast。
在具体的实施方案中，Dbait分子在严谨条件下不与人类基因组DNA杂交。典型的严谨条件是能够允许将完全互补的核酸与部分互补的核酸区分开来的条件(参考例如Sambrook等)。
在优选实施方案中，Dbait分子的序列不含有CpG，以避免众所周知的toll样受体介导的免疫反应，如果不想要这样的效应的话。CpG是指由胞嘧啶后面跟着鸟嘌呤构成的二核苷酸。
考虑到它们的作用机制，Dbait分子的长度可以是不同的，只要它足以允许与Ku蛋白复合物的适当结合就行。实验部分显示出为了确保与Ku复合物的结合，Dbait分子的最小长度是大约16bp。优选情况下，Dbait分子包括16-200bp，最优选情况下包括24-100bp。Dbait分子的具体例子含有24bp，最优选32bp。正如在实施例中显示的，这样的长度足以允许结合含有Ku和DNA-PKc蛋白的Ku复合物。
特别优选的Dbait分子包括24-100bp，更有利情况下包括32-100bp。
本发明的Dbait分子必须具有至少一个游离末端作为DSB的模拟物。该游离末端可以是游离的平末端，也可以是5′-/3′-突出末端。在具体的实施方案中，它们只含有一个游离末端。在另一个具体的实施方案中，它们含有两个游离末端。
Dbait分子可以是线性的，或者优选情况下，由发夹状双链核酸制成。在这种情况下，环可以是核酸或本领域技术人员已知的其它化学基团，优选为连接子例如六甘醇或四脱氧胸苷酸(T4)。
在优选实施方案中，Dbait分子具有下列特征：
1)当与可药用载体/赋形剂一起使用时，双链Dbait分子能够被细胞/组织体摄取到细胞核内；
2)Dbait分子的至少一个游离末端能够被参与DSB损伤感应、信号传导和/或修复过程的酶的全复合物识别；
3)Dbait分子的至少一个游离末端可以被所述复合物接受以掺入到肿瘤细胞的基因组DNA中。
在具体的实施方案中，由于它们的结构和/或骨架，Dbait分子具有非复制性结构。
就此而言，本发明的Dbait分子可以只含有或主要(超过50％)含有天然的磷酸二酯骨架或化学修饰的磷酸二酯骨架，或者另一种具有化学基团或化学基团的混合物的骨架，只要修饰的dsDNA仍然是参与NHEJ途径、特别是Ku和DA-PKcs蛋白、以及DSB损伤感应或信号传导途径的全复合物的底物。有利的是，化学修饰被打算用于赋予Dbait分子以化学稳定性，和/或防止它们在整合到染色体中之后进一步复制(诱变效应的潜在原因)，如果整合发生的话。
它们也可以具有糖模拟物例如2′-O-烷基核糖、2′-O-烷基-C4′支链核糖、环丁基或其它碳环或己糖醇取代呋喃戊糖基团。
优选的Dbait在一条或每条链的末端含有一个或几个化学基团。优选的化学基团包括硫代磷酸酯。或者，优选的Dbait具有存在甲基膦酸酯骨架的核苷酸。
本发明的其它修饰骨架包括氨基磷酸酯，吗啉代核酸、2′-0，4′-C亚甲基/亚乙基桥接的锁核酸，肽核酸(PNA)，以及低级烷基或环烷基糖间键合，或具有可变长度的短链杂原子或杂环糖内键合，或本领域技术人员已知的任何修饰核苷酸。
美国专利No.5,677,437描述了杂芳香寡核苷酸连键。氮连接子或含有氮的基团也可用于制备寡核苷酸模拟物(美国专利No.5,792,844和No.5,783,682)。美国专利No.5,637,684描述了氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡聚化合物。还设想了具有吗啉代骨架结构的的寡核苷酸(美国专利No.5,034,506)。在其它实施方案中，例如肽核酸(PNA)骨架、寡核苷酸的磷酸二酯骨架，可以被聚酰胺骨架代替，碱基直接或间接结合到聚酰胺骨架的氮杂氮原子上。其它的合成寡核苷酸可以含有取代的糖基团，它们在2′位置含有下列基团之一：OH；SH；OCH3；SCH3；F；OCN；OCH2CH2OCH3；O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n是1到大约10；C1到C10低级低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-S-；或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO；NO；N3。
该不可复制的元件可以掺入到双链片段的内部位置或末端。它(它们)可以含有：a)不能被用作DNA复制的模板的单元，例如聚乙二醇链，优选为六甘醇链，或任何被一个或多个杂原子例如氧、硫、氮或含有一个或多个杂原子的杂芳基或杂环基最终中断和/或取代的碳氢化合物链；b)不能被DNA聚合酶或外切核酸酶处理的作为阻断元件的单元，例如3′-修饰的核苷酸或本领域技术人员已知的其它物质；c)用在发夹片段的环中的天然寡核苷酸，例如Tn、例如四聚脱氧胸苷酸(T4)。
所述链通过化学合成、半生物合成或生物合成、任意扩增方法来制造，然后进行任意提取和制备方法并进行任意化学修饰。
Dbait分子的生物活性可以通过体外和基于培养的细胞的分析进行评估，例如在实施例2和3中描述的分析方法，和/或也可以通过体内分析进行评估，例如在实施例4和5中描述的。最容易和适合的分析是DNA依赖性蛋白激酶活性分析(参见实施例2，图1.4)。到目前为止，这种简单的分析方法被用于预测Dbait分子的体内活性。但是，其它基于培养的细胞的分析方法，例如对辐射增强的非正常整合的抑制分析，也是适合的(参见实施例3，图2.3和图2.4)。
在具体的实施方案中，本发明的Dbait分子能够活化DNA-PK。
在具体的实施方案中，本发明的Dbait分子能够抑制辐射增强的非正常DNA整合。
在另一个具体的实施方案中，本发明的Dbait分子在体外与Ku复合物结合，例如通过凝胶迁移分析测定的那样。这样的Ku复合物可以仅含有一个或几个Ku蛋白，也可以是一个或几个Ku蛋白与至少一个DNA-PKc蛋白的组合。
在另一个具体的实施方案中，本发明的Dbait分子穿透细胞核。
本发明的最优选的Dbait分子兼有上述特征中的几个或全部。
在培养的细胞以及裸鼠和遗传修饰小鼠上的异体移植肿瘤中进行的实验已经显示，本发明的Dbait分子触发了进行放射治疗和/或化学治疗的肿瘤的细胞/组织的致死。
因此，本发明还涉及与DNA断裂性治疗结合使用的佐剂组合物，该组合物含有例如上面定义的Dbait分子以及可药用的载体/赋形剂，以有效量导入到肿瘤细胞的核中。
本发明还涉及用于增加肿瘤对抗癌症疗法的敏感性的方法，包括下面的组合：
-将例如上面定义的Dbait分子导入癌症细胞/组织中，和
-通过DNA损伤性方法在细胞中诱导DNA断裂。
按照本发明的实施方案，在该导入步骤中使用了转染试剂。
基于在体内研究中使用的方法，本发明提供了使用Dbait分子与放射疗法或化学疗法的组合建立临床方法的原理。任意方法之下的原理是当DNA损伤性事件发生时，Dbait分子应该被递送到细胞的核中。因此，优选情况下，Dbait分子应该在放射疗法之前施用，但是取决于给药模式和每种药物的药物动力学，它们可以与化疗药剂一起给药。
典型的方法包括在辐射之前例如5小时使用Dbait分子。使用分级辐射是特别有效的，例如在6周内15x2Gy，或在2周内6x5Gy。
有利的是，所述方法包括了将Dbait分子治疗与双重化疗相结合。例如，将5FU和CPT 11一起注射3次，连续3天，中间间隔一周的休息时间。或者，Dbait分子的治疗可以与放疗相结合。
本领域技术人员可以容易地将其改造以适用于人类，特别是根据患者的体重/身体表面积。
在优选实施方案中，Dbait分子是例如上面描述的以及在人类疗法的其它实践中使用的化学修饰的Dbait分子。
在另一个实施方案中，Dbait分子不是化学修饰的，而是对应于天然的核酸片段，但是表现出化学修饰的片段的特征，特别是具有对应于该化学修饰的Dbait分子的碱基对数量和所定义的特性。
更具体来说，DNA链的断裂由离子化辐射(放射疗法)或化学反应(化学疗法)来实现。
这种方法是一种新的辅助性治疗，与DNA损伤性疗法一起用于治疗由于不受控制的细胞增殖导致的疾病、特别是癌症。换句话说，Dbait主要被打算用于抗癌症疗法，但是它也可以用于许多抗增殖治疗，例如用于治疗牛皮癣。
本方法可定位于治疗增殖性疾病：
它们可以是非恶性的，例如牛皮癣和血管增殖性狭窄/再狭窄。
它们可以是恶性的。
相关的器官或区域可以是：肺和支气管，头颈，胃肠道，结肠直肠癌，生殖泌尿道，妇科器官，乳腺，内分泌腺，皮肤，视网膜，CNS，血液器官，原发位点已知或未知的转移肿瘤，遗留物(remnant)(例如胸腺)。
组织学本质可以是上皮的，鳞状细胞癌，腺癌，移行性癌，成纤维细胞/成血管细胞来源的(肉瘤)，神经元，神经胶质来源的，内分泌的，类癌瘤，胃肠基质，内皮的，造血的，胚胎的。
本发明也涉及使用所述非化学修饰的Dbait分子制造抗癌症药物，用于治疗肿瘤、特别是对放疗和/或化疗具有高度抗性的肿瘤，所述药物与DNA断裂(例如损伤性)治疗、特别是放疗或化疗组合使用。
在体内，化学修饰的或未修饰的Dbait分子通过任意适合的途径与适合的可接受的载体/赋形剂一起施用，例如口服，或静脉内或肿瘤内施用，或皮下注射，或局部施用，等等。
本发明的另一个目的是与DNA断裂性治疗，特别是放疗和化疗结合使用的组合物，所述组合物含有至少一种Dbait分子以及可药用的载体，以有效的量被导入到肿瘤细胞的核中。例如，当使用肿瘤内给药时，所述有效量是每1cm3肿瘤至少0.01mg，优选为每1cm3肿瘤0.1mg，最优选为每1cm3肿瘤0.5mg。有效量可以在每日治疗方案中使用(例如每周5天，连续3到6周，或每周3次，连续3到6周)。或者，每1cm3肿瘤至少0.1mg，优选情况下每1cm3肿瘤0.5mg，最优选情况下每1cm3肿瘤1mg的有效量，可以在每周治疗方案中施用例如连续的3到6周。当使用其它给药路线时，本领域技术人员可以改变用量，以特别是在每日治疗方案中获得Dbait分子在肿瘤中的有效量为每1cm3肿瘤至少0.01mg，优选为每1cm3肿瘤0.1mg，最优选为每1cm3肿瘤0.5mg，或在特别是在每周治疗方案中获得Dbait分子在肿瘤中每1cm3肿瘤至少0.1mg、优选情况下每1cm3肿瘤0.5mg、最优选情况下每1cm3肿瘤1mg的有效量。当然，本领域技术人员在考虑了化疗和/或放疗方案后可以对剂量和方案进行改变。
本发明的另一个目的是使用上面定义的Dbait分子制造药物，以增加细胞(例如，肿瘤)对DNA损伤性疗法的敏感性。
本发明的另一个目的是使用上面定义的Dbait分子制造药物，与DNA损伤性抗癌症疗法一起用于治疗癌症。
优选情况下，DNA损伤性抗癌症疗法选自放射疗法和化学疗法。更优选情况下，所述分子在放疗之前施用，和/或与化疗一起施用。
在下面的实施例中，参考随附的图和表，将给出本发明的其它特点和优点。
实施例
在裸鼠上异体移植的人类放射性抗性肿瘤(头颈鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤，黑色素瘤)中和转基因小鼠消化道中RasV12G x Apc1638N双重突变诱导的肿瘤中，进行了分子和细胞研究以及分析，以便：
i)评估Dbait分子的生物学活性；
ii)通过在使抗癌症疗法的致敏中使用Dbait分子，来证实DNA诱饵方法；
iii)阐明隐藏在观察到的Dbait介导的致敏作用之下的分子和细胞机理。这些研究的结果在实施例中进行了描述和概括。
实施例1：Dbait分子的设计、合成和制备
设计了两种类型的Dbait分子：线性的或发夹状的dsDNA片段。对于发夹状Dbait分子来说，使用六甘醇连接子或四聚脱氧胸苷酸作为环。
通过掺入硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或3′-3′核苷酸键合，可以保护dsDNA茎的末端免受3′-外切核酸酶的化学降解。原则上说，其它的化学修饰也可以使用，只要它们与Ku70/Ku80的结合和DNA-PKcs的活化相容(Martensson & Hammarten，2002)。分析了具有各种不同茎长度8bp(Dbait8H)、16bp(Dbait16H)、24bp(Dbait24H)和32bp(Dbait32H)，以及具有不同茎序列的Dbait分子。还设计了两个末端被两个六亚乙基环封闭的哑铃状dsDNA片段(Dbait32C)作为对照。通过用荧光素(Dbait32H-FITC)、花青素3(Dbait32H-Cy3)、花青素5(Dbait32Hc-Cy5)或生物素(Dbait32H-Biot)标记的T，对一些Dbait分子进行了标记。表1.1、1.2和1.3概述了在本工作中使用的Dbait分子的序列和化学结构。
Figure G2007800352051D00211
表1.1：Dbait分子的序列和化学结构。大写字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗体大写字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。半圆形实线表示六甘醇连接子。Dbait32-T4含有4个胸腺嘧啶(T4)作为连接子代替六甘醇连接子。Dbait32C是哑铃状(封闭的)分子。Dbait32Hc-5’5’具有互相换位的(shuffled)序列(同样的碱基组成但次序不同，参考表1.1中的Dbait32Hb)和3’-3’键合。Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc和Dbait32Hd与Dbait32H序列相比具有同样的碱基组成，但次序不同。
Figure G2007800352051D00221
表1.2：所示的各种不同的标记的Dbait分子的序列和化学结构。大写字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗体大写字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。粗体小写字母是具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。半圆形实线表示六甘醇连接子。指示了各种不同标记(花青素3或5，FITC)的Dbat8Hc、Dbait32H、Dbait32Hc和Dbait32Hd分子。
Figure G2007800352051D00222
表1.3：64-bp的Dbait64和Dbait64L分子的序列和化学结构。大写字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗体大写字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。实线表示六甘醇连接子。
所有Dbait分子通过自动固相寡核苷酸合成法(Eurogentec，Belgium)制备。它们通过变性反相HPLC纯化。变性毛细管凝胶电泳。MALDI-TOF/LC-MS被用于质量控制。超过90％的寡核苷酸是全长的。所有样品在运输前被冷冻干燥。
收到后，将所有样品溶解在双蒸水中。Dbait分子的浓度根据在变性条件下(60℃-90℃，依赖于Dbait分子的热稳定性)260nm处的吸收值计算(Cantor & Warshaw，1970)。荧光染料标记的Dbait分子的浓度根据在具体染料的适合波长下(FITC在490nm处ε＝80000M-1.cm-1；Cy3在550nm处ε＝150000M-1.cm-1；Cy5在650nm处ε＝250000M-1.cm-1)的吸光度计算。哑铃状dsDNA片段(Dbait32C)通过将两个带有六甘醇连接子并具有3’-突出和互补末端的半发夹结构进行退火并用DNA T4连接酶(BioLabs)连接来制备。
基于热力学和动力学考虑，按照它们的分子性，使用了下面的方法来制备Dbait分子的样品：
-对于双分子Dbait分子(Dbait32、Dbait32-NH2、Dbait64和Dbait64L)来说：
将溶解在双蒸水中的每条链的储液(以可能的最高浓度配制)的1∶1的混合物在90℃加热5分钟以将每条链完全变性。通过平缓回复到室温(样品一般保留在水浴中)来进行退火，将得到的双链体分子分成小份储存在-20℃。
-对于单分子的Dbait分子(发夹)来说：
将含有200μM发夹状Dbait分子的双蒸水溶液在90℃加热5分钟以完全变性。通过将样品在冰水(0℃)中冷却来进行退火。将等份试样储存在-20℃。
实施例2：Dbait分子的生物化学分析
作为剖析Dbait分子的作用机制的第一步，按照标准方法，在存在来自Hep2细胞的核蛋白提取物的情况下，使用不同的32P放射性标记的Dbait分子进行了一系列条带迁移分析。典型情况下，将10nM 32P放射性标记的Dbait分子，在存在不同浓度的核蛋白(0、10、20、40、80、160和320ng/μL)的情况下，在TBE缓冲液中在30℃温育10分钟。然后将样品上样在5％丙烯酰胺非变性凝胶上。电泳在4℃以95V进行2小时。将凝胶干燥，使用phosphorimager(Molecular Dynamics)进行扫描。
图1.1显示了Hep2核蛋白提取物与不同长度的各种不同Dbait分子的滴定的滞留条带图谱。除了最短的8bp长的Dbait分子(Dbait8H)之外，对于较长的Dbait分子观察到了最多2条滞留的条带：对于16-、24-bp长的Dbait分子(Dbait16H和Dbait24H)观察到了一条滞留的条带，而对于32-bp长的Dbait分子(Dbait32H、Dbait32H-po和Dbait32)观察到了两条滞留的条带。对于32-bp的Dbait分子来说，随着蛋白浓度的增加，滞留条带1的强度先增加然后降低，而滞留条带2的强度作为核蛋白提取物的浓度的函数增加。
使用小鼠单克隆抗Ku70抗体(Santa Cruz Biotechnology)进行的免疫结合和条带迁移分析的组合，表明滞留条带1和2含有Ku复合物。在加入抗Ku70抗体后，条带1和2进一步迁移到条带1*和2*(图1.2)。可能条带1有一个Ku70/80复合物结合到16到32-bp的Dbait上，而条带2具有两个Ku70/80复合物结合到32-bp的Dbait分子上。用纯化的Ku蛋白进行了对照实验证实了这种解释。
Ku蛋白的鉴定清楚地表明Dbait分子以长度依赖性的方式与NHEJ机制相互作用。
通过在存在各种不同Dbait分子的情况下将32P标记的605-bp的线性DNA片段与Hep2核提取物进行温育，监测DNA末端连接。连接产物从605-bp的单体开始，迁移到二体、三体或四体的位置。
图1.3显示了在Hep2细胞核提取物中，各种不同Dbait分子对DNA末端连接反应的影响。在温育的前2个小时，大约16％的32P标记的平端线性双链体DNA分子被连接成二体和三体。在16小时后，高分子量连接产物的量增加到高达总输入DNA的30％。当与线性32P标记的片段相比摩尔数过量100倍的Dbait32H被加入到反应中时，反应被强烈抑制。使用从HeLa细胞制备的提取物时也观察到了类似的对末端连接活性的抑制(数据未显示)。在大多数实验中，Dbait32H与标记的DNA片段同时加入到核提取物中。当在加入片段前将Dbait32H与提取物温育30分钟时，抑制的程度是相似的。相比之下，当Dbait32H在加入核提取物后30分钟加入时，没有对连接的抑制发生(数据未显示)。这些数据表明Dbait分子是DNA末端连接反应的竞争物，但是不置换所结合的复合物。
通过将分子加入到核提取物中并与DNA片段温育2小时，测试了各种不同的Dbait分子对无细胞分析的影响。短的分子(Dbait8H)、单链32-nt长分子(Dbait32ss)或哑铃状分子(Dbait32C)对连接没有较大的影响。仅仅结合一个Ku异源二聚体的Dbait24H和Dbait16H，与Dbait32H同样有效地抑制连接。这些数据表明DNA片段的重新连接被能够募集Ku的Dbait分子强烈抑制。
使用试剂盒SignaTECT DNA依赖性蛋白激酶分析系统(Promega，Madison，USA)监测了DNA-PK活性。在存在250nM Dbait的情况下，分析了增加量的Hep2核提取物(通过DEAE-Sepharose过滤清除了内源DNA)。按照制造商的说明，将生物素酰化肽底物和各种不同量的核提取物与(γ-32P)ATP在30℃温育5分钟。将生物素酰化底物捕获在链亲和素膜上，清洗，并在闪烁计数器中计数。通过用结合的放射活性除以每个样品的(γ-32P)ATP的总数，计算出磷酸化的百分率。反应(10μl)在60mM KOAc、100μg/ml BSA、0.5mM Mg(Cl)2、1μl T4 DNA连接酶10X缓冲液(Promega，Madison，USA)中进行。在加入32P标记的DNA(10ng)前将核提取物和Dbait温育2分钟。将样品在37℃温育不同的时间，然后通过加入20mM EDTA和1mg/ml蛋白酶K将连接终止。将连接产物在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后进行放射自显影，用phosphorimaging进行定量。
图1.4显示了多种具有不同长度、序列和化学结构包括修饰的骨架的2μg Dbait分子，在1.5μg Hep2核蛋白提取物中的DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)活性。激酶的活性直接依赖于Dbait分子的双链“茎”的长度和结构。使用被两个Ku二体复合物结合的32-bp长的Dbait分子时，观察到了高的DNA-PK活化。仅仅结合一个Ku二体的Dbait分子(Dbait16H和Dbait24H)与不结合Ku的短的Dbait8H同样无效。类似地，没有游离双链末端的单链Dbait32ss/Dbait32css和哑铃状Dbait32C，不活化DNA-PK。此外，在游离平末端的各种不同的骨架修饰(硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、3’-3’键合)(最多3-bp)以及内部标记配体(例如荧光染料)，能够活化DNA-PK活性。值得注意的是，DNA-PK活性对Dbait分子的序列的依赖性，如果有的话，也是不显著的，正如Dbait32H、Dbait32Hb、Dbait32Hc和Dbait32Hd所显示的那样。
这种简单的无细胞DNA-PK活性分析指出，只有Dbait分子的长度(至少大约32-bp)和具有游离末端的双链DNA是激酶活化所必需的，在某种程度上与它们的序列和化学修饰无关。这与DNA-PK参与NHEJ途径——一种不依赖于序列的DNA末端连接机制相一致。
实施例3：Dbait分子的体外活性
通过在源自于女性宫颈癌(HeLa)和HNSCC(Hep2)的两个放射性抗性人类癌症细胞系中进行与离子化辐射相关的克隆存活分析，通过抑制外源DNA片段的非正常整合，以及通过检测在Dbait分子转染的细胞中辐射后持续的DSB位点，研究了培养的细胞中Dbait分子的活性。
已建立的人类细胞系Hep2(头颈部鳞状细胞癌，HNSCC)、LU1205和SK28(黑素瘤)被用于动物研究。使用Hep2、HeLa S3(上皮宫颈癌)、MO59K和MO59J(成胶质细胞瘤)进行了细胞培养物研究。在含有10％热失活的胎牛血清(FBS；Invitrogen，Cergy Pontoise，France)和抗生素(100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)的完全DMEM中，将细胞在37℃、100％湿度、95％空气和5％CO2的条件下将细胞生长成单层培养物。将LU1205生长在含有4％热失活的FBS、1％谷氨酰胺和抗生素(100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)的MCDB中。
将在6孔板中指数生长的细胞收获，并与700ml含有Dbait分子和Superfect试剂(Qiagen，Courtaboeuf，France)混合物的完全DMEM进行温育，比例为每μg DNA 10μl Superfect。在标准条件下在37℃温育5小时后，将细胞用PBS清洗，加入完全DMEM。在指定的时间，在转染开始后5小时将细胞暴露于一次处理(10Gy)，或在转染开始后3、4、5和6小时将细胞暴露于用137Cs单位(1Gy/min)进行的4次处理，每次0.5Gy，然后允许细胞生长2周。当测量质粒整合时，在转染后48小时，将2μg质粒加入到Dbait转染物中，将嘌呤霉素(1.7μg/ml)加入到生长培养基中。质粒转染效率通过在FACScan流式细胞仪(FACSalibur，Beckton-Dickinson，USA)上分析10,000个细胞的GFP表达来估算。
3.1)诱导的细胞致死
在经过8小时将Dbait分子转染到Hela细胞中并用来自137Cs源的γ-射线进行了四次间隔2小时的0.5Gy分步辐射(4x0.5Gy)后，与未转染的细胞相比，观察到了克隆存活性的显著降低。结果在图2.1中给出，其中图A给出了在存在Dbait32和Dbait32H的情况下归一化的克隆存活数的剂量依赖性，而图B给出了在存在83nM(培养基中的浓度)不同Dbait分子的情况下归一化的存活克隆数。细胞培养在添加了10％血清的MEM中进行。Superfect(Qiagene)按照制造商的说明书被用作转染试剂。克隆存活率被估算为处理过的细胞形成的克隆的数量与未处理细胞的数量的比率。
效应以剂量依赖性的方式依赖于Dbait分子的长度和化学本质。在该分析中，发夹状Dbait分子(Dbait32H、Dbait32-T4和Dbait24H)以及线性双链Dbait分子(Dbait64和Dbait64L)显著降低了克隆存活率。值得注意的是，缺少游离dsDNA末端(由两个末端的六甘醇连接子加帽)的哑铃状Dbait32C分子没有显示出任何效应。环的化学本质没有影响(Dbait32H对Dbait32-T4)。这些观察表明，在培养的细胞中，某些Dbait分子可以有效地增加细胞对离子化辐射的敏感性。
图2.2证实了前面的观察，并为单链或短的8-bp Dbait分子没有任何效应提供了附加的数据。此外，它显示出效应不是序列依赖性的(Dbait32H对Dbait32Hc)。
Figure G2007800352051D00281
表2：用辐射和Dbait处理后DNA-PK感受态细胞(MO59K)和DNA-PK缺陷细胞(MO59J)的细胞存活率。将细胞稀释并铺于摇瓶中以形成克隆，然后进行10Gy辐射和/或用2μg Dbait32Hc转染。当两种处理被结合使用时，辐射在转染后5小时进行。存活率被计算为处理后形成克隆的细胞数量除以在未处理样品中形成克隆的细胞数量。从三次独立的实验计算出平均值和标准偏差(在括号中)。
通过克隆形成估算了Dbait32Hc转染对γ-辐射后DNA-PK野生型和突变型细胞存活率的影响。辐射后的存活率从未转染的MO59K细胞中的9.83％降低到Dbait32Hc转染的细胞中的3.47％。相比之下，在对应的无DNA-PK突变体细胞系MO59J中，存活率不受Dbait32Hc转染的影响。在辐射过和Dbait32Hc转染的野生型细胞系中的存活率水平，与仅仅进行辐射的无DNA-PK突变体细胞中观察到的相似(3.47％对3.97％)。这表明在野生型转染细胞中，Dbait32Hc抑制了DNA-PK依赖性修复。
3.2)Dbait分子对外源DNA的非正常整合的抑制
离子化辐射已知可以增加外源DNA的非正常整合，该过程被称为辐射增强的整合。Hela细胞培养物被用于该分析。使用2μg带有新霉素抗性编码基因的线性质粒，以三种不同的DNA/superfect比例(1∶2，1∶5，1∶10)在8小时的时间内对细胞进行了转染。在转染期间，将细胞暴露于不同的辐射方案：没有辐射，1Gy和2Gy的单次辐射，以及以每2小时0.5Gy的分步剂量递送的2Gy辐射(4x0.5Gy)。通过在含有0.6mg/ml G418的培养基中筛选NeoR细胞来监测质粒的整合。分步辐射方案明显增加了质粒的整合。当在转染混合物中加入2μg Dbait32H分子时，辐射增强的整合消失(图2.3)。
图2.4提供了附加的数据，显示了只有32-bp的Dbait分子(Dbait32H和Dbait32Hc)能够抑制带有嘌呤霉素抗性编码基因的环状质粒的辐射增强的非正常整合，而较短的Dbait分子(Dbait16H，Dbait8H)、单链或哑铃状Dbait分子(Dbait32ss和Dbait32C)没有效果。使用了已知的PI3K(包括DNA-PK)的抑制剂Wortmann(Wort)和NU7026(NU)作为对照。
这些实验显示出，需要Ku、DNA-PK和ATM蛋白的外源DNA的辐射增强的非正常整合(Nimura et al.，2002)，正如预期的那样以不依赖于序列的方式被32-bp的Dbait分子抑制，因为这些Dbait分子的作用机制是通过绑架参与NHEJ途径的蛋白来进行的。
3.3)在Dbait分子转染的细胞中辐射后DSB位点的持久性
核中的DSB位点可以通过结合在磷酸化的H2AX(组蛋白H2A的变体)上的γ-H2AX抗体的免疫荧光来监控。在辐射后大多数γ-H2AX位点很快出现，并随着DSB修复过程的进展而消失。
转染和辐射方案与上面描述的那些相似。对于免疫检测来说，将细胞生长在直径5cm的皮氏培养皿中的盖玻片表面上，用2μg FITC标记的Dbait32H-FITC分子使用Superfect(Qiagene)按照制造商的说明书进行转染。在转染开始后4小时，对细胞进行辐射(2Gy)，然后在培养基中在37℃静置2小时。经过3轮清洗后，将细胞用2％PFA固定10分钟。经过再一次清洗后，使用在1xPBS、1％BSA中稀释100倍的兔抗γ-H2AX抗体(4411-PC，Trevigen)检测γ-H2AX的存在。将细胞用1xPBS、0.5％TritonX-100清洗3次，然后在室温与在1xPBS、1％BSA中稀释100倍的罗丹明结合的山羊抗兔抗体温育1小时。细胞通过落射荧光显微镜观察。
图2.5显示了在2Gy辐射后2小时从荧光Dbait32H-FITC分子转染的Hela细胞获得的结果。左图：通过核中的γ-H2AX抗体的免疫荧光检测到的Dbait32H-FITC(亮点和小片)和DSB位点的荧光；右图：通过γ-H2AX抗体的免疫荧光和DAPI复染检测到的带有DSB位点的核的同样的照片。左下角的箭头显示在核中不存在Dbait32H-FITC和γ-H2AX信号。右上角的箭头显示了Dbait32H-FITC和γ-H2AX的协同信号。如图2.5所示，在辐射(2Gy)后2小时，DSB位点仍保持在Dbait32H-FITC分子转染的Hela细胞中，正如Dbait32H-FITC和γ-H2AX抗体的双重荧光标记所显示的。值得注意的是，在没有被Dbait32H-FITC有效转染的细胞中，DSB位点几乎不能被检测到。这些数据表明，在Dbait32H有效转染的细胞中DSB的修复受损，而在转染不太好的细胞中DNA修复是完整的。
使用兔抗phosphoThr68-Chk2单克隆抗体(Cell SignalingTechnology，Denver，USA)，抗β-肌动蛋白单克隆抗体AC-15克隆(Sigma，MS，USA)，抗H2AX抗体(Cell Signaling Technology，Denver，USA)和小鼠抗磷酸化组蛋白H2AX(Ser139)抗体(Upstate，Tempcula，CA，USA)进行了Western印迹。
图2.6上图显示了磷酸化形式的组蛋白H2AX(γ-H2AX)的westem印迹分析，并与PIKKs对组蛋白H2AX的总H2AX蛋白的磷酸化进行比较。用各种不同Dbait分子32Hc、24H、16H和8H转染Hep2细胞5小时，或不转染。在转染结束时将它们辐射，温育1小时，然后进行分析。显示出与对照细胞相比，Dbait32Hc极大地增加了磷酸化形式的H2AX(γ-H2AX)(都是辐射过的细胞，或都没有辐射过)。其它较短的Dbait分子有低得多的或没有效果。
为了研究Dbait对离子化辐射诱导的γ-H2AX位点的形成和丧失的影响，通过superfect(Qiagen)将Dbait32H-Cy3转染到Hep2细胞中。对转染的和未转染的Hep2细胞进行10Gy辐射。在不同时间将细胞固定(0分钟，30分钟，1小时，5小时，24小时，48小时，72小时和7天)。针对g-H2AX(ser139)的小鼠单克隆抗体(Upstate，Tempcula，CA，USA)作为第一抗体稀释500倍使用，在0℃温育2小时，然后用PBS缓冲液清洗，并与稀释200倍的Alexa 488结合的第二抗体抗小鼠IgG抗体(Molecular Probe，Eugene，OR，USA)在暗室中温育1小时。
通过用FACScan流式细胞仪(FACSalibur，Beckton-Dickinson，USA)检测辐射过的细胞中的γ-H2AX，揭示了DSB位点所持续时间的动力学。图2.6下图显示出与对照(辐射但未转染的细胞或未处理的细胞)相比，在Dbait32H转染的细胞中γ-H2AX保持较高水平并在该水平持续较长时间。该实验表明Dbait32H显著阻止了离子化辐射诱导的DSBs的修复。
实施例4：Dbait分子在GMA32细胞系中的效应以及它们与辐射或有丝分裂抑制剂的关联
将允许DNA断裂的GMA32中华仓鼠成纤维细胞维持在添加有1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、1xMEM非必需氨基酸、1x青霉素/链霉素和10％马血清的MEM培养集中(Gibco)。典型情况下，在用脂质转染胺2000(Life Technologies)作为转染试剂(以1∶3的比率)按照制造商的说明书转染不同Dbait分子(4.5μg)之前24小时，将2×105到4×105个细胞接种到直径为5cm的皮氏培养皿中不含抗生素的培养基中。在转染结束时，将细胞辐射(4Gy)或用如下有丝分裂抑制剂处理：诺考达唑(200nM)、诺维本(100nM)或紫杉醇(200nM)。
大约16小时后，除去药物，允许细胞恢复。细胞辐射使用来自137Cs源的γ-射线进行。经过24小时恢复后，收集细胞并用于FACS、western印迹分析，或用于确定克隆形成率(存活率)和每种处理的效果。
图3.1显示了未处理的GMA32细胞，单独转染的细胞或通过脂质转染胺用不同Dbait分子转染，但没有进一步辐射或用有丝分裂抑制剂处理的细胞的FACS分析。M1期代表了处于表明细胞死亡的亚G1期的细胞的百分率。仅仅在存在双链Dbait32和发夹状Dbait32H分子的情况下观察到了显著的细胞死亡，而发夹状Dbait16H和单链Dbait32ss分别诱导了中度和温和的细胞死亡。最短的发夹状Dait8H与对照(只用脂质转染胺转染的细胞)相比，不能触发细胞死亡。
实验使用FACS calibur流式细胞仪(Becton Dickinson)进行。收集细胞，悬浮在1ml冷的GM缓冲液中(6.5mM葡萄糖，137mM NaCl，5.4mM KCl，2mM Na2HPO4，1mM KHPO4，0.5mM EDTA)，并在加入3ml冷的100％乙醇后在4℃保存至少2小时。
在该阶段，最后将细胞用1xPBS清洗，然后在室温下在PI溶液(1xPBS缓冲液中含有50μg/ml碘化丙啶和25μg/ml RNase A)中染色30分钟。使用Cellquest软件分析10,000个事件，细胞聚集体被门控。具有亚G1DNA内含物的细胞的百分率被记分。
在同样条件下，在未处理的GMA32细胞、单独转染的细胞或通过脂质转染胺用不同Dbait分子转染的细胞中，通过γ-H2AX标记对139位的丝氨酸被磷酸化的γ-H2AX的DSB位点(核中的亮点或小片)进行了免疫检测。细胞膜和细胞核的复染通过FITC-DiOC6和DAPI进行。观察到了Dbait分子的类似的效果(图3.2)。该实验显示出双链Dbait32和发夹状Dbait32H都能有效触发类似的细胞应答，就像在核中发生了DNA损伤。这为这些Dbait分子能够用于捕获经过NHEJ途径参与DSB修复的蛋白提供了看得到的证据。
对于免疫检测来说，在用不同的Dbait分子进行转染之前24小时，将细胞生长在直径5cm的皮氏培养皿中的盖玻片上。在转染后1天，将FITC-DiOC6(分子探针)加入到培养基中，37℃ 5分钟(以对膜进行复染)。经过3轮清洗后，将细胞用4％PFA固定20分钟。
经过再次清洗后，使用在1xPBS、1％BSA中稀释100倍的兔抗γ-H2AX抗体(4411-PC，Trevigen)检测在139位丝氨酸(γ-H2AX)上磷酸化的γ-H2AX。将细胞用1xPBS、0.5％ TritonX-100清洗3次，然后与在1xPBS、1％BSA中稀释100倍的山羊抗兔抗体Alexa 594(Molecular Probes)在室温温育1小时。细胞通过落射荧光显微镜观察。
为了寻找DNA损伤信号传导的证据，进行了进一步的实验。p53蛋白是一种众所周知的介导DNA损伤信号传导以及通过改变其磷酸化状态协调适当反应(DNA修复、凋亡等)的主要蛋白。具体来说，p53的15位残基丝氨酸的磷酸化参与了与用作反馈控制的MDM2蛋白的相互作用。因此，通过Western印迹评估了p53的15位丝氨酸的磷酸化状态。图3.3显示了当细胞被双链Dbait32或发夹状Dbait32H分子转染时，p53的15位丝氨酸被高度磷酸化，而较短的发夹状Dbait16H诱导温和的磷酸化。最短的Dbait8H和单链Dbaut32ss分子都不能在p53蛋白的15位丝氨酸上诱导显著的磷酸化。
该实验提供了额外的证据，证明了GMA32细胞中双链Dbait32和发夹状Dbait32H的存在被检测为DNA损伤，并可能通过ATM活化途径诱导了对传感器应答的信号例如p53蛋白的磷酸化。
对于Western印迹分析来说，将细胞在Laemmli缓冲液中裂解。将等量的裂解物在12％聚丙烯酰胺凝胶上分离。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶阻断(1小时)，然后与在含有5％脱脂奶的TBST缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中稀释500倍的抗p53Ser15抗体(9284，Cell Signaling)温育过夜。然后将印迹与在TBST中稀释5000倍的辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG第二抗体(P0448，Dako)温育。蛋白-抗体复合物通过增强的化学发光(RPN2106ECL，Amersham)检测。
Dbait分子在GMA32细胞中的放射致敏和化学致敏效应通过克隆形成(克隆存活)分析来评估。对于克隆形成分析来说，在对细胞计数后制备连续的稀释液，用于以不同的细胞量接种5cm皮氏培养皿。细胞数量的范围从100-200(对照细胞)到3000(转染的或/和处理过的细胞)。10天后，将细胞(形成克隆)用4％聚甲醛固定(20分钟)，然后用亚甲基蓝染色(15分钟)，对每个平板(三份平行样)中的克隆数量进行计数。
图3.4显示出在用双链Dbait32或发夹状Dbait32H分子转染的GMA32细胞中观察到了对4Gy辐射的辐射致敏。此外，对于用双链Dbait32或发夹状Dbait32H分子转染的GMA32细胞来说，当它们被有丝分裂抑制剂(200nM诺考达唑、100nM诺维本(长春瑞滨)或200nM紫杉醇(太平洋紫杉醇))处理时，也观察到了化学致敏。这些药物已知能够作为微管聚合或解聚的潜在抑制剂。Dbait32和Dait32H能够增加这些有丝分裂抑制剂的细胞毒性活性。
实施例5：对裸鼠上异体移植的人类肿瘤的处理的放射致敏作用
使用通过皮下注射放射抗性细胞系(源自于头颈部鳞状细胞癌HNSCC的Hep2))或肿瘤片段(以前通过皮下注射源自于成胶质细胞瘤的U87细胞获得的)获得的异体移植人类肿瘤的裸鼠，评估了与放射疗法结合的Dbait分子的体内活性。
研究主要在用放射性抗性人类HNSCC肿瘤异体移植的小鼠上进行，以建立体内概念的证据。辐射使用来自137Cs源的γ-射线进行，对小鼠进行适当的保护，以进行肿瘤的定位辐射。典型的分析条件由在辐射前5小时，在肿瘤内注射1 nmole Dbait分子与转染试剂(阳离子树枝状聚合物(dendrimer)(Superefct，Qiagene)，双十八烷基酰氨基甘氨酰基-精胺(DOGS，Polyplus Transfection)，聚乙烯亚胺(PEI，Polyplus Transfection))按照制造商的说明书制备的适合的制备物组成。在5周内递送了30Gy的总剂量：i)3x2Gy/周(大约每两天一次)；ii)5Gy/周；iii)15Gy/2周。
肿瘤的大小每周测量2-3次。用辐射和肿瘤内注射MEM培养基(Dbait稀释缓冲液)进行的处理，被用作不使用Dbait的辐射处理的对照。计算肿瘤的体积(V＝2×a×b2，其中a＝长度，b＝宽度)。在t时测量的体积与起始体积的比率(Vt/Vi)被用作肿瘤进程的指示。对小鼠跟踪最多达到100天。试验了至少4个独立的动物组每组6只动物。
结果显示在图4.1中(图A：未处理的小组(n＝38)；图B：使用20μl培养基(MEM)+3x2Gy/周辐射的对照小组(n＝30)；图C：使用1nmole(20μg)Dbait32H+3x2Gy/周辐射的小组(n＝35)。
MEM或Dbait32H在辐射前5小时通过肿瘤内注射来递送。每两天递送一次分步辐射剂量(2Gy)，一周三次。处理持续5周，总共30Gy辐射。点表示每只小鼠的肿瘤体积的时间过程。实线是最佳的多项式拟合。图D显示了所有肿瘤体积的增加(Vt/Vi)小于5的小鼠的Kaplan-Meyer作图。
在使用Dbait32H和3x2Gy/周辐射的小组上已经积累了显著量的数据(图C，n＝35)，与对照小组：未处理的(图A，n＝38)，MEM+3x2Gy(图B，n＝30)相比，它们清楚地显示出了放射性致敏作用。Man和Whitney统计学检验给出了Dbait32H+3x2Gy对MEM+3x2Gy小组的p-值＝0.00067。在肿瘤体积小于初始体积的5倍(Vt/Vi＜5)的小鼠的Kaplan-Meyer作图中观察到了同样的趋势(图D)。
随后对异体移植了人类HNSCC、U87、LU1205和SK28肿瘤的小鼠进行了进一步的研究，以确定Dait分子的分子特征和体内活性的最适方案。从被研究的群体获得的数据与在生物化学和体外研究(参见实施例2、3和4)中观察到的Dbait分子的分子特征相一致。此外，它显示出放射性致敏作用依赖于Dbait32H的肿瘤内注射和离子化辐射之间的停留时间：5小时＞＞1小时。
在异体移植了人类成胶质细胞瘤肿瘤的小鼠中也观察到了放射性致敏作用。成胶质细胞瘤是最高等级的脑肿瘤，其特征为它的具有快速致死结果的具有异常侵袭性的发展，以及对放疗和化疗的抗性。首先将2-3百万个源自于人类成胶质细胞瘤的U87细胞皮下注射到裸鼠中。然后取出植入的肿瘤，用于随后通过皮下移植大约8mm3成胶质细胞瘤肿瘤来接种其它的裸鼠。
表3.1显示了一组实验性的裸鼠上异体移植的人类成胶质细胞瘤肿瘤的数据。在接受了肿瘤内注射Dbait32H(1nmole)和辐射(1x15Gy/周或3x5Gy/周，随后休息一周，然后进行第二轮处理，离子化辐射的总剂量为30Gy)的小组中，50％的小鼠在处理开始后25天时具有小于4cm3的肿瘤体积，而在对照小组中(未处理的，或辐射和用盐溶液(PBS)注射的)，100％的小鼠具有超过4cm3的肿瘤体积，并在分析结束前按照现有的动物伦理学法规在处理结束前处死。
Figure G2007800352051D00371
表3.1：Dbait32H(1nmole/肿瘤内注射)对裸鼠上异体移植的人类成胶质细胞瘤的放射性致敏的分析。使用了两种辐射方案(肿瘤内注射后5小时)：1x15Gy/周，或3x5Gy/周，然后休息一周，进行第二轮处理。总的辐射剂量是30Gy。对照组是未处理的或接受了盐溶液(PBS)注射的组。
根据这些为Dbait分子可以有效增加放射疗法的效率提供证据的鼓励性的体内数据，设计并进行了进一步的实验，以提供与使用Dbait分子作为辅助试剂增加放射疗法的敏感性相关的附加的数据，从而强化DNA诱饵方法在抗癌症疗法中的原理的证据。
图4.2显示了裸鼠中Hep2(HNSCC细胞系)异体移植的肿瘤中花青素3标记的Dbait32H的分布。将用Superfect(转染试剂)配制的20μgDbait32H-Cy3注射到1.5cm3Hep2肿瘤中。在注射后6小时将小鼠处死。取出肿瘤，冷冻切片，用于不用固定的分析。DAPI用于核染色。花青素3的荧光显示出Dbait32H-Cy3分子从血液毛细管分布到肿瘤组织中，并被定位于细胞核中。
图4.3显示了在图4.1中描述的Hep2异体移植肿瘤的另一个实验。在四组(每组10只动物)进行了不同处理的动物中(未处理，只用Dbait32H处理，只用辐射处理，以及Dbait32H和辐射的组合)，在处理过程中和处理后监测肿瘤的生长。对于每只动物标出了每个肿瘤的生长。处理方案与图4.1中描述的相同。当Hep2肿瘤的体积达到150-200mm3时开始实验。对于每个处理时期，将按照制造商的说明书用聚乙烯亚胺(PEI，Polyplus Transfection，Strasbourg，France)配制的20μg Dbait32H在2Gy辐射之前5小时注射到肿瘤中。在使用了Dbait32H和辐射的组合的组中，与用辐射或Dbait32H单独处理的组相比，肿瘤的生长明显减小了。
图4.4显示了皮下异体移植了Hep2肿瘤的裸鼠的存活率的Kaplan-Meier表示。出于伦理学原因，当动物的肿瘤达到2cm3时将动物处死。该终点在存活率分析中被用作死亡。处理方案描述在图4.3中。5个组包括：未处理的，模拟转染和辐射的，通过组合的辐射和增加量的Dbait32H(20、60和120μg/期)处理的。每组动物的数量在表3.2中标出。在用Dbait32H和2Gy辐射处理的组中观察到了明显的剂量依赖性效应。在处理开始后15天，处理结束时(35天)和处理结束后13天(35+13天)，获得了各个组(未处理的，用20和60μg Dbait32H/期以及2Gy辐射处理的)的代表性的肿瘤照片。
图4.5显示了在处理中期(7期处理)异体移植的Hep2肿瘤的组织学分析。肿瘤在图4.3标明的各种不同处理方案开始后20天取出。将它们固定在福尔马林中，将组织切片用苏木精、曙红和番红花色素染色。对于每种处理方案通过显微镜分析两个肿瘤。在用Dbait32H和辐射组合处理的肿瘤中，与只用辐射处理的肿瘤相比，观察到了坏死和凋亡的增加。
图4.6显示了在处理中期(7期处理)时异体移植的Hep2肿瘤的NMR成像。显示了未处理的肿瘤、用辐射处理的肿瘤和用Dbait32H(20μg/期)和辐射(2Gy/期)的组合处理的肿瘤的三个代表性的横截面照片。在用Dbait32H和辐射处理的肿瘤中，与只用辐射处理的肿瘤相比，坏死区域更为重要。这与肿瘤的细胞学分析(参考图4.5)相一致。
图4.7显示了用Hep2、U87、LU1205和SK28肿瘤皮下异体移植的裸鼠以及它们的对照组(未处理的，只用辐射处理的)的存活率的Kaplan-Meier表示图。Hep2的方案描述在图4.3中。其它的肿瘤通过修改的方案处理，其中在连续的三天中施用了5Gy分步辐射，然后休息4天，然后将处理重复一次。总的辐射剂量(6x5Gy)与用于处理Hep2肿瘤的方案的剂量(15x2Gy)相等。
在所有四种异体移植的人类肿瘤中观察到了Dbaut32H和辐射的组合的有益的结果。由于Dbait分子的隐含作用机制以及在所有细胞中普遍的NHEJ途径，预计对于具有不同组织学的其它肿瘤来说也将是这样。
对于每种处理和每个肿瘤类型进行了肿瘤应答的描述性分析。第1天是第一次处理时期的日期。所有的动物都被跟踪至少150天，直到它们由于伦理学原因被处死。按照Kaplan-Meier方法估计中值寿命。通过从每个处理的组中的每只小鼠的肿瘤体积增加四倍所需的时间中减去对照组的肿瘤体积增加四倍所需的平均时间，计算出TGD。对于每个处理组，使用个体的测量值计算出平均TGD。
通过Kaplan-Meier评算来评估总的存活曲线，并使用非参数LogRank检验进行比较，因为数据不符合正态分布。分析使用了S-Plus 6.2版软件(MathSoft Inc.，Seattle，WA)和statEL(ad Science，Paris，France)。首先对具有同样肿瘤类型的每个组进行全面Log Rank。然后将Dbait处理与模拟处理的对照进行比较。动物的数量(n)、相对风险(RR)和P值被报告在表3.2中。所有的检验在显著性水平为0.05时被认为是显著的。
Figure G2007800352051D00401
表3.2总结了一部分上面描述的数据，并提供了在裸鼠中皮下异体移植的三种人类肿瘤细胞系中，通过不同方案(各种Dbait32分子+辐射与辐射+模拟注射)处理的异体移植动物的存活率的比较。此外，它显示出Dbait分子的序列是不重要的，这由Dbait32Hc与Dbait32H相比相似的结果所证实。还显示出单链Dbaut32ss即使是在高剂量下也是无活性的。
应该指出，在Dbait32Hc的序列中不含有CpG，以避免由于众所周知的Toll样受体介导的免疫刺激作用所引起的免疫反应的影响。
总之，裸鼠上异体移植
的人类放射性抗性肿瘤(Hep2、U87和SK28)和放射性敏感肿瘤(LU1205)的肿瘤生长的明显减小，提供了证据，表明Dbait分子能够有效增加这些放射疗法对侵袭性肿瘤效应的敏感性。因此，在体内获得了DNA诱饵方法的概念的证据。
实施例6：在K-RasV12G x Apc1638N转基因小鼠中诱导的消化道肿瘤的处理的化学致敏作用
选择了内源小鼠肿瘤模型来评估Dbait分子增加抗癌症化学疗法敏感性的能力。为此，使用了带有K-RasV12G和Apc1638N突变的转基因小鼠。它们是通过将两种转基因小鼠进行杂交来获得的：一种带有在小鼠villin启动子控制下的K-RasV12G突变(pVill/K-RasV12G)(Janssen等，2002)，另一种在一个等位基因上含有Apc1638N突变(Fodde等，1994)。具有pVill/K-RasV12G x Apc1638N突变的转基因小鼠在大约5月龄时在消化道中发展出自发性肿瘤，并很快死亡。
它们在平均12周龄时，按照图5.1图A中显示的方案，用化疗(5FU+CPT11)和Dbait32H的组合与单独的化疗进行处理。方案包含了三轮循环。
每轮由腹膜内注射0.6mg 5FU和0.6mg CPT11，同时口服施用0.1mg Dbait32H组成，每周3次，然后休息一周。
将5FU(5-氟尿嘧啶，Teva)在0.9％NaCl溶液中制备成浓度为50mg/ml。将CPT11/伊立替康(Campto，Aventis)在0.9％NaCl溶液中制备成浓度为20mg/ml。监测小鼠的健康状态和存活，直到死亡。没有观察到由Dbait分子引起的附加毒性效应的临床适应症。
结果显示在图5.1中。图A：用于3组/小组平均为12周龄的K-RasV12G x Apc1638N转基因小鼠的处理方案：对照组(未处理)，用5FU+CPT11处理的组，用5FU+CPT11和Dbait32H处理的组。进行了三轮的处理。每轮由腹膜内注射0.6mg 5FU和0.6mg CPT11，以及口服0.1mg Dbait32H组成，一周三次，然后休息一周。每组中涉及的小鼠的数量标在括号中。终点是存活时间；图B：三个组的存活曲线的Kaplan-Meyer作图；图C：图B中显示的三个组的中值存活时间。
尽管群体较小，但在接受了化疗(5FU+11CPT)和Dbait32H的组合的小组中(中值存活时间＝226天，p-值＝0.2)，与单独化疗(173天)和对照小组(175天)相比，观察到了存活时间的增加(图B和C)。
其它增加5FU+CPT11+Dbait32H和5FU+CPT11小组的群体的分析目前正在进行中，以增加统计学显著性。
在处理结束后两周(平均为18周龄)，将一系列小鼠处死，以评估每只动物的肿瘤的平均数量。通过放大镜和组织学检查(用苏木精-曙红-番红花色素进行标准染色)来检查肠。
结果给出在图5.2中。每组中的动物数量标在括号中。所有的小鼠在图5.1的图A中显示的方案后两周(第18周)被处死。对照小组(未处理的组，n＝101)的平均数量是30.8/动物。
两种检查一致显示出，在接受了5FU+CPT11和Dbait32H的组合的小组中(n＝8)，与只接受化疗的小组(n＝7)相比，肿瘤数量明显减少了(＞30％)(图5.2)。值得注意的是，对照小组(未处理的组，n＝101)的平均数量是30.8/动物。
使用免疫荧光染色方法，分析了从用荧光素标记的Dbait分子(Dbait32H-FITC)和5FU+CPT11处理的动物中制备的肿瘤样品。γ-H2AX标记的位点用荧光素Dbait分子共染色，参见体外发现(参考实施例3.3和4)。图5.3显示了附加的分析，其中将18周龄的K-RasV12Gx Apc1638N转基因小鼠用化疗(5FU+CPT11)和Dbait32H-FITC连续处理3天，再按照图A中指示的最后一次处理后2小时处死小鼠。取出肠并用PBS清洗。然后对肿瘤组织取样并冷冻在-80℃。对于该分析来说，从冷冻的肿瘤组织通过低温恒温器制备5μm的组织学样品。使用在PBS中稀释500倍的兔抗γ-H2AX多克隆抗体(Trevigen)，然后用在PBS中稀释200倍的花青素3标记的山羊抗兔抗体(Jackson)通过免疫荧光检测DNA修复位点。样品也用DAPI复染。通过落射荧光显微镜观察样品。发现了Dbait32H-FITC的荧光在肿瘤组织中是非均质散布的(腺体结构之间的上皮和基质)，并具有优选的核定位(图5.3，图B，左边)。对于γ-H2AX位点发现了同样的样式(图5.3，图B，右边)。几乎总是观察到共定位的Dbait32H-FITC和γ-H2AX信号。
总之，存活的改善和每只动物的肿瘤数量的减少，一致地显示了在带有K-RasV12G x Apc1638N突变的转基因小鼠中用Dbait分子(Dbait32H)处理消化道肿瘤的化学致敏作用的证据。在处理过的动物中对肿瘤组织的深入分析，为Dbait分子干扰DNA修复过程提供了证据。
应该指出，在本研究中Dbait32H分子的口服施用不包含任何转染试剂。
总的来说，生物化学和体外数据与Dbait分子通过干扰经NHEJ途径的DSB修复的作用机制，以及由直接或间接的DNA损伤(离子化辐射或化学治疗试剂)引起的修复信号传导途径明显相一致。由于不依赖于序列的NHEJ途径(Jackson，2002；Barnes，2001；Downs &Jackon，2004)的性质，对于超出最小长度(大约32-bp)之外的Dbait分子的序列和长度没有限制。体内研究已经证实了Dbait分子对小鼠中肿瘤的有效的放射性和化学致敏作用。合起来看，所有数据都一致地为DNA诱饵方法的概念提供了证据，表征了Dbait分子的分子特性。
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<130>SCT090533-00
<150>US 11/524,528
<151>2006-09-21
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the  5′and 3′ends of the compl ementary strand the
three last nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>modified_base
<222>(30)..(32)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<400>1
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                      32
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait 32H-po
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>2
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                      32
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>3
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                       32
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait24H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(24)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>4 acgcacgggt gttgggtcgt ttgt                                                24
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait16H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(16)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>5
acgcacgggt gttggg                                                             16
<210>6
<211>8
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait8H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note：″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(8)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>6
acgcacgg                                                                  8
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32ss
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>modified_base
<222>(30)..(32)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<400>7
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                  32
<210>8
<211>68
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32-T4
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary sttrand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(36)
<223>loop
<400>8
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ctttttagat ccgaacaaac gacccaacac     60
ccgtgcgt                                                              68
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32C
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>9
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                  32
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32HC-5′5′
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the last nucleotide at the 3′end of the complementary
strand is linked with 3′-3′linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>10
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc                                      32
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32-NH2
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the  nucleotide at the 5′end of the complementary strand
is linked to NH2group″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_binding
<222>(32)..(32)
<223>linker＝NH2
<400>11
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                      32
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-FITC
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker＝FITC
<400>12
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                      32
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker＝cyanine3
<400>13
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                      32
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-Biot
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker＝biotine
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>14
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct                                        32
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Ha
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝at the 3′end of the complementary strain the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>15
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac                                        32
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hb
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>16
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc                                      32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc
<220>
<221>misc_feature
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<400>17
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                      32
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hd
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″at the 3′end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>18
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac                                    32
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc-3′mp
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″last 3nucleotides at the 3′end of the complementary
strand with methylphosphonate linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>19
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                    32
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc-5′3′mp
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with methylphosphonate linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝methylphosphonate linkage
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>20
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                        32
<210>21
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hcss-po
<400>21
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                        32
<210>22
<211>8
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait8Hc-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the nucleotide at the 5′end of the complementary strand
linked to cyanine 3″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the last three nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(8)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>22
gctgtgca                                                                   8
<210>23
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32HC-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the last three nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the nucleotide at the 5′end of the complementary strand
linked to Cyanine 3″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>23
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                        32
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32Hc-Cy5
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the last three nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the nucleotide at the 5′end of the complementary strand
linked to Cyanine-5″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>24
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga                                        32
<210>25
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32Hd-FITC
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the last three nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the second nucleotide from the 5′end of the complementary
strand linked to FITC″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop＝hexaethyleneglycol linker
<400>25
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac                                   32
<210>26
<211>64
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait64
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three nucleotides at the 5′end of the complementary
strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<220>
<221>modified_base
<222>(62)..(64)
<223>mod_base＝phosphorothioate backbone
<400>26
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ctacgcacgg tcgtttgttc ggtgttggcg     60
atct                                                                  64
<210>27
<211>63
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait64-L
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three last nucleotides at the 3′end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note＝″the three nucleotides at the 5′end of the complementary
strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>repeat_region
<222>(32)..(33)
<223>rpt_type＝hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>modified_base
<222>(61)..(63)
<223>mod_base＝hexaethyleneglycol linker
<400>27
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat cacgcacggt cgtttgttcg gtgttggcga     60
tct                                                                   63

Claims (12)

1.核酸分子，其中所述分子含有至少24bp的双链部分，具有至少一个游离末端，无CpG，与人类基因组中的任意基因具有小于70％的序列同一性，在每条链的末端或至少在3′末端链含有一个或几个硫代磷酸酯或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸，并且其中所述分子是至少被参与双链断裂DSB修复的NHEJ途径的Ku蛋白结合的底物，其中所述分子为Dbait32Hc。
2.含有权利要求1的分子和可药用载体或赋形剂的药物组合物。
3.权利要求2的药物组合物，适合用于口服途径，或用于静脉内、肿瘤内或皮下注射，或用于颅内或动脉内注射或灌注，或用于局部施用。
4.含有权利要求1的分子和能够直接或间接导致DNA双链断裂的化学试剂的药物产品，作为用于治疗癌症的组合制剂。
5.权利要求4的药物产品，其中的分子在化学药剂之前或同时施用。
6.权利要求1的分子在制备用于增加肿瘤对DNA损伤性抗癌症疗法的敏感性的药物中的应用。
7.权利要求1的分子在制备用于与DNA损伤性抗癌症疗法相结合来治疗癌症的药物中的应用。
8.权利要求6或7的应用，其中的DNA损伤性抗癌症疗法选自放射疗法和化学疗法。
9.权利要求6到8任一项的应用，其中的分子在放射疗法之前施用。
10.权利要求6到8任一项的应用，其中的分子在化学疗法之前或同时施用。
11.权利要求6到10任一项的应用，其中的癌症选自CNS、头颈、结肠直肠、肝脏、胃肠道、生殖泌尿道、肺、皮肤，乳腺癌和宫颈癌。
12.权利要求6到11任一项的应用，其中的分子通过口服途径，或通过静脉内、肿瘤内或皮下注射，或通过颅内或动脉内注射或灌注施用，或用于局部施用。
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