ES2633652T3 - DBAIT y usos de las mismas - Google Patents

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Marie Dutreix
Jian-Sheng Sun
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Curie
Museum National dHistoire Naturelle
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Museum National dHistoire Naturelle
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula comprende una parte de doble cadena de 32 a 100 pb, tiene al menos un extremo libre, carece de CpG, tiene menos de un 70 % de identidad de secuencia con cualquier gen del genoma humano, comprende uno o varios fosforotioatos o nucleótidos con esqueleto de metilfosfonato en el extremo de cada cadena o al menos en el extremo 3' de la cadena, y en donde dicha molécula es un sustrato para unirse al menos a la proteína Ku implicada en la ruta NHEJ de reparación de roturas de doble cadena DSB, en donde la parte de doble cadena tiene la secuencia de las moléculas Dbait32Hc (SEQ ID No 17), Dbait32Hc-3'mp (SEQ ID No 19), Dbait32Hc-5'3'mp (SEQ ID No 20), Dbait32Hc-Cy3 ID No 23) y Dbait32Hc-Cy5 (SEQ ID No 24).

Description

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de Kaplan-Meyer de curvas de supervivencia de los tres grupos; Panel C: la mediana del tiempo de supervivencia de tres grupos como se muestra en el panel B.
Figura 5.2: Número medio de tumores en el tracto digestivo por animal por macroscopía o examen histológico de los grupos tratados con 5FU+CPT11 y con 5FU+CPT11 y Dbait32H. El número de animales en cada grupo se indicó entre paréntesis. Todos los ratones se sacrificaron dos semanas (semana 18) después del protocolo mostrado en el panel superior. El número medio del conjunto de control (grupo no tratado, n=101) es 30,8/animal (datos no mostrados).
Figura 5.3: Análisis de microscopía de fluorescencia del tejido del tracto digestivo. Panel A: esquema del protocolo (i.p.: inyección intraperitoneal; o.: administración oral). Panel B: fluorescencia de moléculas Dbait32H-FITC (izquierda) y de γ-H2AX marcada con inmunofluorescencia (derecha) en la sección de 5 μm procedente del tejido tumoral del animal tratado de acuerdo con el protocolo proporcionado en el panel A. Las partes inferiores muestran los detalles (usando objetivos de 63 aumentos) de la zona indicada en las partes superiores (usando objetivos de 10 aumentos, recuadro blanco). La colocalización de Dbait32H-FITC fluorescente y γ-H2AX marcada aparece como puntos brillantes sobre núcleos contrateñidos con DAPI.
Descripción detallada de la invención
Como se ha analizado anteriormente, la invención desvela una nueva clase de moléculas terapéuticas que pueden interferir, de una manera no específica de gen, con sistemas de reparación del ADN en células de mamífero. Estas nuevas moléculas, denominadas moléculas Dbait, son sustratos de los holocomplejos de proteínas implicados en la ruta NHEJ (ruta independiente de la secuencia), particularmente proteínas Ku y/o DNA-PKcs, y pueden neutralizar la capacidad de reparación de ADN de las células, aumentando de esta manera su sensibilidad a los tratamientos que producen lesiones en el ADN.
De esta manera, la invención se refiere a dichas moléculas, a su fabricación y a su uso terapéutico, particularmente para tratar enfermedades proliferativas en combinación con un tratamiento que produce lesiones en el ADN.
Las moléculas Dbait de la presente divulgación pueden definirse por varias características, tales como su longitud mínima, la presencia de un extremo libre al menos y la presencia de una parte bicatenaria. Como se analizará más adelante, una característica importante de las moléculas Dbait es que su secuencia de nucleótidos precisa no impacta sustancialmente sobre su actividad. Además, las moléculas Dbait pueden contener un esqueleto modificado y/o no natural.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente divulgación reside en una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula comprende una parte bicatenaria de al menos aproximadamente 16 pb, tiene al menos un extremo libre y se une al menos a un complejo Ku implicado en la ruta NHEJ.
La molécula preferentemente es de origen no humano (es decir, su secuencia de nucleótidos y/o conformación (por ejemplo, de horquilla) no existe como tal en una célula humana), más preferentemente de origen recombinante y/o sintético.
De acuerdo con el mecanismo de acción de las moléculas Dbait, la secuencia de las moléculas Dbait juega un papel pequeño o nulo. Por consiguiente, a diferencia de las moléculas usadas en la técnica anterior para la dirección específica de gen/proteína (por ejemplo, antisentido, antígeno, siRNA, aptámero, ribozima, etc.), las moléculas Dbait pueden no tener un grado significativo de homología o identidad de secuencia con genes conocidos, promotores, potenciadores, secuencias cadena arriba 5’ o 3’, exones, intrones, etc. En otras palabras, la acción de las moléculas Dbait para interferir con la ruta NHEJ es independiente de la secuencia, y las moléculas Dbait pueden tener menos de un 70 %, incluso menos de un 50 % de identidad de secuencia con cualquier gen de un genoma humano.
Este mecanismo de acción independiente de la secuencia es un rasgo característico de las moléculas Dbait, que las distingue claramente de otros agentes terapéuticos específicos de gen o específicos de proteína (dependientes de la secuencia) tales como oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia pequeño (siRNA, shRNA y miRNA) y oligonucleótidos CpG inmunoestimuladores, así como aptámeros diseñados para atrapar una proteína específica.
En un aspecto preferido, la secuencia de las moléculas Dbait tiene un grado de identidad global con secuencias de ácido nucleico humanas que es menor de aproximadamente un 70 %, 60 %, 55 % o 50 %. Los métodos para determinar la identidad de secuencia son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, Blast.
En un aspecto particular, la molécula Dbait no hibrida, en condiciones rigurosas, con ADN genómico humano. Las condiciones rigurosas típicas son tales que permiten distinguir ácidos nucleicos completamente complementarios de ácidos nucleicos parcialmente complementarios (véase, por ejemplo, Sambrook et al.).
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En un aspecto preferido, la secuencia de las moléculas Dbait carece de CpG para evitar las reacciones inmunológicas mediadas por receptor de tipo toll bien conocidas, si dicho efecto es indeseable. CpG se refiere a un dinucleótido que consiste en una citosina seguida por una guanina.
Considerando su mecanismo de acción, la longitud de las moléculas Dbait puede ser variable, siempre que sea suficiente para permitir una unión apropiada del complejo de proteína Ku. La sección experimental muestra que la longitud mínima de las moléculas Dbait es de aproximadamente 16 pb, para asegurar la unión a un complejo Ku. Preferentemente, las moléculas Dbait comprenden entre 16 y 200 pb y, más preferentemente, entre 24 y 100 pb. Los ejemplos específicos de moléculas Dbait contienen 24 pb, más preferentemente 32 pb. Como se muestra en los ejemplos, dicha longitud es suficiente para permitir la unión de un complejo Ku que comprende Ku y proteínas DNA-PKc.
Las moléculas Dbait particularmente preferidas comprenden 24-100 pb y, más ventajosamente, 32-100 pb.
Las moléculas Dbait de acuerdo con la divulgación deben tener al menos un extremo libre, como un mimético de DSB. Dicho extremo libre puede ser un extremo romo libre o un extremo cohesivo 5’/3’. En un aspecto particular, contienen únicamente un extremo libre. En otro aspecto particular, contienen dos extremos libres.
Las moléculas Dbait pueden ser lineales o, preferentemente, estar constituidas por ácidos nucleicos bicatenarios en horquilla. En este caso, el bucle puede estar formado por ácidos nucleicos u otros grupos químicos conocidos por un experto en la materia, preferentemente un enlazador tal como hexaetilenglicol o tetradesoxitimidilato (T4).
En un aspecto preferido, las moléculas Dbait son tales que:
1) las moléculas Dbait de doble cadena pueden captarse por células/tejidos corporales al interior del núcleo celular cuando se usan en vehículos/excipientes farmacéuticamente aceptables; 2) dicho al menos un extremo libre de las moléculas Dbait se puede reconocer por el holocomplejo de enzimas implicado en los procesos de detección, señalización y/o reparación de lesiones de DSB; 3) dicho al menos un extremo libre de las moléculas Dbait es susceptible, mediante dicho complejo, de incorporarse en el ADN genómico de la célula tumoral.
En un aspecto particular, las moléculas Dbait tienen una estructura no replicativa debido a su estructura y/o esqueleto.
A este respecto, las moléculas Dbait de acuerdo con la divulgación pueden tener exclusivamente o principalmente (por encima de un 50 %) un esqueleto fosfodiéster nativo o un esqueleto fosfodiéster modificado químicamente, u otro esqueleto con grupos químicos o mezclas de grupos químicos, siempre que el ADNbc modificado permanezca como un sustrato para el holocomplejo implicado en la ruta NHEJ, particularmente proteínas Ku y DNA-PKcs, así como la ruta de detección o señalización de lesiones de DSB. Ventajosamente, las modificaciones químicas están destinadas a conferir estabilidad química a las moléculas Dbait y/o prevenir su replicación adicional (posible causa de efecto mutagénico) tras su integración genómica, si esta se produce.
También pueden tener miméticos de azúcar tales como 2’-O-alquilrribosa, 2’-O-alquilrribosa ramificada C4’, ciclobutilos u otros compuestos carbocíclicos o hexitol en lugar del grupo pentofuranosilo.
La Dbait preferida comprende uno o varios grupos químicos al final de una o de cada cadena. Los grupos químicos preferidos comprenden fosforotioatos. Como alternativa, la Dbait preferida tiene nucleótidos con esqueleto de metilfosfonato.
Otros esqueletos modificados de la divulgación comprenden fosforamidatos, ácido morfolino nucleico, ácido nucleico bloqueado con puentes 2’-0,4’-C metileno/etileno, ácido péptido nucleico (PNA), y enlaces interazúcar alquilo de cadena corta o cicloalquilo, o enlaces intra-azúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta de longitud variable, o cualquier nucleótido modificado conocido por un experto en la materia.
La patente de Estados Unidos n.º 5.677.437 describe enlaces oligonucleosídicos heteroaromáticos. También pueden usarse enlazadores de nitrógeno o grupos que contienen nitrógeno para preparar miméticos de oligonucleótidos (patentes de Estados Unidos n.º 5.792.844 y 5.783.682). La patente de Estados Unidos n.º 5.637.684 describe compuestos oligoméricos de fosforamidato y fosforotioamidato. También se prevén oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto morfolino (patente de Estados Unidos n.º 5.034.506). En otros aspectos, tal como el esqueleto de péptido-ácido nucleico (PNA), el esqueleto fosfodiéster del oligonucleótido puede reemplazarse con un esqueleto de poliamida, uniéndose las bases directas o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza del esqueleto de poliamida. Otros oligonucleótidos sintéticos pueden contener restos de azúcar sustituidos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: OH, SH, OCH3, SCH3, F, OCN, OCH2CH2OCH3, O(CH2)nNH2 o (CH2)nCH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; 0-S-; o N-alquilo; 0-, S-o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO; NO; N3.
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Dicho o dichos elementos no replicables pueden incorporarse en la posición interna o en el extremo del fragmento bicatenario. Este o estos elementos pueden comprender: a) una unidad que no puede usarse como plantilla para la replicación de ADN, tal como una cadena de polietilenglicol, preferentemente una cadena de hexaetilenglicol, o cualquier cadena de hidrocarburo, finalmente interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, oxígeno, azufre, nitrógeno o grupos heteroatómicos o heterocíclicos que comprenden uno o más heteroátomos; b) una unidad que es un elemento bloqueante ya que no es susceptible a las ADN polimerasas o exonucleasas, tal como cualquier nucleótido modificado en el extremo 3’, u otros conocidos por el experto en la materia; c) un oligonucleótido nativo tal como Tn, cuando se usa en el bucle de un fragmento de horquilla, tal como tetradesoxitimidilato (T4).
Dichas cadenas se obtienen por síntesis químicas, semibiosíntesis o biosíntesis, cualquier método de amplificación seguido de cualquier método de extracción y preparación y cualquier modificación química.
La bioactividad de las moléculas Dbait puede evaluarse por ensayos in vitro y ensayos basados en células cultivadas, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos 2 y 3, y/o también por ensayos in vivo, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos 4 y 5. El ensayo más fácil y relevante es el ensayo de la actividad proteína quinasa dependiente de ADN (véase el ejemplo 2, Figura 1.4). Este ensayo sencillo ha sido predictivo hasta ahora de la actividad in vivo de moléculas Dbait. Sin embargo, también son relevantes otros ensayos basados en células cultivadas, tales como el ensayo de la inhibición de la integración ilegítima potenciada por radiación (véase el ejemplo 3, Figura 2.3 y Figura 2.4).
En un aspecto particular, las moléculas Dbait de esta divulgación pueden activar la DNA-PK.
En un aspecto particular, las moléculas Dbait de esta divulgación pueden inhibir la integración de ADN ilegítima potenciada por radiación.
En otro aspecto particular, las moléculas Dbait de esta divulgación se unen a un completo Ku in vitro, por ejemplo, como se determina por ensayo de desplazamiento en gel. Dicho complejo Ku puede comprender una o varias proteínas Ku únicamente, tales como Ku70 y/o Ku80, o una combinación de una o varias proteínas Ku y al menos una proteína DNA-PKc.
En otro aspecto particular, las moléculas Dbait de esta divulgación penetran en el núcleo.
Las moléculas Dbait más preferidas de esta divulgación combinan varias o todas de las características anteriores.
Los experimentos realizados en células cultivadas y en tumores xenoinjertados en ratones desnudos y ratones modificados genéticamente han demostrado que las moléculas Dbait de esta invención provocan letalidad en células/tejidos de tumores sometidos a radio-y/o quimioterapia.
Por lo tanto, la invención también se refiere a composiciones adyuvantes a usar en asociación con un tratamiento de ruptura de ADN, comprendiendo dichas composiciones una molécula Dbait tal como se ha definido anteriormente, en combinación con un vehículo/excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz a introducir en el núcleo de células tumorales.
La invención también se refiere a un método para promover la sensibilidad de tumores a terapias anticancerosas que comprende, en asociación
-introducir en la célula/tejido canceroso moléculas Dbait tales como las que se han definido anteriormente, e
-inducir en las células la ruptura de ADN por un método que produce lesiones en el ADN.
De acuerdo con un aspecto de la divulgación, en dicha etapa de introducción se usa un agente de transfección.
Basándose en el protocolo usado en los estudios in vivo, la divulgación proporciona una base lógica para establecer un protocolo clínico del uso de moléculas Dbait en combinación con radioterapia o quimioterapia. La base lógica subyacente a cualquier protocolo es que las moléculas Dbait deben administrarse en el núcleo de las células cuando se producen lesiones en el ADN. Por lo tanto, las moléculas Dbait preferentemente se administrarán antes de radioterapia, aunque pueden administrarse junto con uno o más agentes quimioterapéuticos dependiendo del modo de administración y la farmacocinética de cada fármaco.
Un protocolo típico comprende la administración de moléculas Dbait antes de la irradiación, por ejemplo 5 horas. El uso de una irradiación fraccionada es particularmente eficaz, por ejemplo, 15 x 2 Gy en seis semanas, o 6 x 5 Gy en dos semanas.
Ventajosamente, dicho método comprende acoplar el tratamiento con moléculas Dbait con una quimioterapia doble. Por ejemplo, 5FU y CPT 11 se inyectan conjuntamente 3 veces, 3 días consecutivos, dejando una semana completa de reposo. Como alternativa, el tratamiento con moléculas Dbait se asocia con radioterapia.
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Un experto en la materia podrá adaptarlo fácilmente a seres humanos, particularmente dependiendo del peso/superficie corporal del paciente.
En un aspecto preferido, las moléculas Dbait son moléculas Dbait modificadas químicamente tales como se han definido anteriormente y de otras prácticas en terapia humana.
En otro aspecto, las moléculas Dbait no están modificadas químicamente y corresponden a fragmentos de ácido nucleico nativos, pero presentan las características de fragmentos modificados químicamente, particularmente tienen el número de pares de bases y propiedades definidas con respecto a dichas moléculas Dbait modificadas químicamente.
Más particularmente, la ruptura de la cadena de ADN se consigue por radiación ionizante (radioterapia) o reacción química (quimioterapia).
Dicho método es un nuevo adyuvante terapéutico junto con terapias que producen lesiones en el ADN para el tratamiento de enfermedades debidas a una proliferación celular incontrolada, en particular cáncer. En otras palabras, Dbait está destinada principalmente a usarse en terapias anticancerosas, pero también puede usarse en muchos tratamientos antiproliferativos, tal como para el tratamiento de la psoriasis.
Este método se puede adaptar para tratar trastornos proliferativos:
Estos pueden ser no malignos, tales como psoriasis y estenosis/reestenosis proliferativa vascular.
Pueden ser malignos.
El órgano o región afectada puede ser: pulmón y bronquios, cabeza y cuello, tracto gastrointestinal, cáncer colorrectal, tractor genitourinario, órganos ginecológicos, mama, sistema endocrino, piel, retina, SNC, órganos hematológicos, metástasis de sitio primario conocido o desconocido, y otros (timo, por ejemplo).
La naturaleza histológica puede ser epitelial, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma transicional, derivado de fibroblastos/angioblastos (sarcomas), neuronal, derivado de la glía, endocrino, carcinoide, estroma gastrointestinal, endotelial, hematopoyético y embrionario.
La invención también se refiere al uso de dichas moléculas Dbait no modificadas químicamente para fabricar fármacos anticancerosos para el tratamiento de tumores, particularmente tumores altamente resistentes a radio-y/o quimioterapias, usándose dichos fármacos en asociación con un tratamiento de rotura de ADN (por ejemplo, que produce lesiones), particularmente radioterapia o quimioterapia.
In vivo, las moléculas Dbait modificadas químicamente o no modificadas se administran por cualquier vía apropiada con vehículos/excipientes aceptables apropiados, tal como administración oral, intravenosa o intratumoral, inyecciones subcutáneas, administración tópica, o por otras vías.
Otro aspecto de esta divulgación es una composición para uso en asociación con un tratamiento de rotura de ADN, particularmente radioterapia o quimioterapia, comprendiendo dicha composición al menos una molécula Dbait en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para introducirse en el núcleo de células tumorales. Por ejemplo, cuando se usa la administración intratumoral, dicha cantidad eficaz es de al menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferentemente 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, más preferentemente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor. La cantidad eficaz puede administrarse en un protocolo de tratamiento diario (por ejemplo, 5 días por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas o 3 veces por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas). Como alternativa, puede administrarse una cantidad eficaz de al menos 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, preferentemente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, más preferentemente 1 mg por 1 cm3 de tumor, en un protocolo de tratamiento semanal durante 3-6 semanas consecutivas, por ejemplo. Cuando se usan otras vías de administración, el experto en la materia puede adaptar la cantidad para obtener una cantidad eficaz de las moléculas Dbait en el tumor de al menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferentemente 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, más preferentemente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, en particular en un protocolo de tratamiento diario, o para obtener una cantidad eficaz de las moléculas Dbait en el tumor de al menos 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, preferentemente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, más preferentemente 1 mg por 1 cm3 de tumor, en particular en un protocolo de tratamiento semanal. Por supuesto, la dosificación y el régimen pueden adaptarse por un experto en la materia teniendo en cuenta el régimen de quimioterapia y/o radioterapia.
Otro aspecto de esta divulgación reside en el uso de una molécula Dbait como se ha definido anteriormente para la fabricación de una medicina para aumentar la sensibilidad celular (por ejemplo, de un tumor) a una terapia que produce lesiones en el ADN.
Otro aspecto de esta divulgación reside en el uso de una molécula Dbait como se ha definido anteriormente para la fabricación de una medicina para tratar cáncer en combinación con una terapia anticancerosa que produce lesiones en el ADN.
5 Preferentemente, la terapia anticancerosa que produce lesiones en el ADN se selecciona entre radioterapia y quimioterapia. Además, preferentemente, la molécula se administra antes de la radioterapia y/o antes de y/o junto con la quimioterapia.
Otras características y ventajas de la divulgación se proporcionarán en los siguientes ejemplos, haciendo referencia 10 a las figuras y tablas adjuntas.
Ejemplos
Se realizaron estudios moleculares y celulares, así como ensayos, en tumores humanos radiorresistentes 15 xenoinjertados (carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, glioblastoma, melanoma) en ratones
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desnudos y en un tumor inducido por doble mutación RasV12G x en el tracto digestivo en ratones transgénicos, con el fin de:
i) evaluar las actividades biológicas de las moléculas Dbait;
20 ii) validar el enfoque de “DNA bait” usando moléculas Dbait para la sensibilización frente a terapias anticancerosas; iii) esclarecer mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la sensibilización mediada por Dbait observada. Los resultados de estas investigaciones se indican y resumen en los ejemplos.
25 Ejemplo 1: Diseño, síntesis y preparación de moléculas Dbait.
Se diseñaron dos tipos de moléculas Dbait: fragmentos de ADNbc lineal o de horquilla. Para las moléculas Dbait de horquilla, se usó como bucle un enlazador de hexaetilenglicol o un tetradesoxitimidilato.
30 El extremo o los extremos del tallo de ADNbc pueden protegerse frente a la degradación química por 3’ exonucleasas mediante la incorporación de fosforotioatos, metilfosfonatos o enlaces nucleotídicos 3’-3’. En principio, pueden usarse otras modificaciones químicas siempre que sean compatibles con la unión de Ku70/Ku80 y la activación de DNA-PKcs (Martensson & Hammarten, 2002). Se ensayaron diferentes moléculas Dbait con diversas longitudes de tallo, 8 pb (Dbait8H), 16 pb (Dbait16H), 24 pb (Dbait24H) y 32 pb (DBait32H como se describe en el
35 documento WO-A-2005/040378), así como diferentes secuencias de tallo. También se diseñó, como control, un fragmento de ADNbc de tipo “dumbbell” (Dbait32C) en el que los dos extremos estaban sellados por dos bucles de hexaetileno. Algunas moléculas Dbait se marcaron a través de una etiqueta T con fluoresceína (Dbait32H-FITC), cianina 3 (Dbait32H-Cy3), cianina 5 (Dbait32Hc-Cy5) o biotina (Dbait32H-Biot). Las tablas 1.1, 1.2 y 1.3 resumieron las secuencias y estructuras químicas de las moléculas Dbait usadas en este trabajo.
40 Tabla 1.1: Secuencias y estructuras químicas de moléculas Dbait. Las letras en mayúscula son nucleótidos con esqueleto fosfodiéster. Las letras en mayúscula y en negrita son nucleótidos con esqueleto de fosforotioato. La línea continua en forma de semicírculo simboliza el enlazador de hexaetilenglicol. Dbait32-T4 contiene cuatro timinas (T4) como enlazador en lugar de un enlazador de hexaetilenglicol. Dbait32C es una molécula de tipo dumbbell (cerrada).
45 Dbait32Hc-5’5’ tiene una secuencia revuelta (la misma composición de bases pero en orden diferente, véase Dbait32Hb en la tabla 1.1) y un enlace 3’-3’. Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc y Dbait32Hd tienen la misma composición de bases pero en diferente orden en comparación con la secuencia de Dbait32H.
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La Figura 1.3 muestra el efecto de diversas moléculas Dbait sobre la reacción de unión a los extremos de ADN en los extractos nucleares de células Hep2. Aproximadamente el 16 % de las moléculas de ADN dúplex lineales romas marcadas con 32P se ligaron en dímeros y trímeros durante las dos primeras horas de incubación. La cantidad de productos de ligamiento de alto peso molecular aumentó hasta un 30 % del ADN aportado total después de 16 h. Cuando se añadió Dbait32H a la reacción en un exceso molar de 100 veces en comparación con el fragmento marcado con 32P lineal, la reacción se inhibió fuertemente. También se observó una inhibición similar de actividad de unión de extremos con extractos preparados a partir de células HeLa (datos no mostrados). En la mayoría de los experimentos, se añadió Dbait32H simultáneamente con los fragmentos de ADN marcados al extracto nuclear. Cuando se incubó Dbait32H con el extracto durante 30 minutos antes de la adición de los fragmentos, el grado de inhibición fue similar. Por el contrario, cuando se añadió Dbait32H 30 minutos después del extracto nuclear, no hubo inhibición del ligamiento (datos no mostrados). Estos datos indican que las moléculas Dbait son competidores de la reacción de unión a los extremos de ADN, pero no desplazan el complejo unido.
Se ensayaron diversas moléculas Dbait con respecto a su efecto sobre el ensayo sin células añadiendo las moléculas al extracto nuclear e incubando durante 2 h con los fragmentos de ADN. El ligamiento no se vio afectado en gran medida por la molécula corta (Dbait8H), la molécula larga de 32 nucleótidos de una sola cadena (Dbait32ss)
o la molécula de tipo “dumbbell” (Dbait32C). Dbait24H y Dbait16H, que se unen únicamente a un heterodímero Ku, inhibían el ligamiento tan eficazmente como Dbait32H. Estos datos indican que el religamiento de fragmentos de ADN se inhibe fuertemente por moléculas Dbait que pueden reclutar Ku.
Se supervisó la actividad DNA-PK se supervisó usando el kit del sistema de ensayo de proteína quinasa dependiente de ADN SignaTECT (Promega, Madison, Estados Unidos). Se ensayaron cantidades crecientes de extracto nuclear de Hep2 (limpio de ADN endógeno por filtración con DEAE-Sepharose) en presencia de Dbait 250 nM. El extracto, sustrato peptídico biotinilado y diversas cantidades de extracto nuclear se incubaron durante 5 minutos a 30 ºC con (γ-32P)ATP de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El sustrato biotinilado se capturó en una membrana de estreptavidina, se lavó y se contó en un contador de centelleo. El porcentaje de fosforilación se calcula dividiendo la radiactividad unida por el recuento total de (γ-32P)ATP por muestra. Las reacciones (10 μl) se realizaron en KOAc 60 mM, 100 μg/ml de BSA, Mg(Cl)2 0,5 mM, 1 μl de ADN ligasa de T4 y tampón 10X (Promega, Madison, Estados Unidos). El extracto nuclear y Dbait se incubaron 2 minutos antes de la adición de ADN marcado con 32P (10 ng). Las muestras se incubaron varias veces a 37 ºC antes de detener el ligamiento por EDTA 20 mM y la adición de 1 mg/ml de proteinasa K. Los productos de ligamiento se analizaron por electroforesis a través de geles de agarosa al 0,7 % seguido de autorradiografía y cuantificación utilizando un Phosphorimager.
La Figura 1.4 muestra la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PK) de varias moléculas Dbait 2 μg con diversas longitudes, secuencias y estructuras químicas incluyendo esqueletos modificados, en 1,5 μg de extracto de proteína nuclear de Hep2. La actividad quinasa dependía directamente de la longitud y estructura del “tallo” bicatenario de la molécula Dbait. Se observó una alta activación de DNA-PK con las moléculas Dbait de 32 pb de longitud que se unieron por dos complejos diméricos Ku. Las moléculas Dbait que se unieron solo a un dímero de Ku (Dbait16H y Dbait24H) fueron tan ineficaces como la Dbait8H corta que no se unía a Ku. De forma similar, el complejo Dbait32ss/Dbait32css monocatenario y Dbait32C de tipo “dumbbell”, que no tienen extremos bicatenarios libres, no activaban la DNA-PK. Además, diversas modificaciones del esqueleto (fosforotioato, metilfosfonato, enlace 3’-3’) en el extremo romo libre (hasta 3 pb), así como los ligandos marcados internamente (por ejemplo, colorantes fluorescentes), son capaces de activar la actividad DNA-PK. Debe tenerse en cuenta que la actividad DNA-PK no depende significativamente, si lo hace en alguna medida, de la secuencia de las moléculas Dbait, como se muestra por Dbait32H, Dbait32Hb, Dbait32Hc y Dbait32Hd.
Este ensayo sencillo de la actividad DNA-PK sin células indica que solo se necesitan la longitud (al menos aproximadamente 32 pb) y el ADN bicatenario con un extremo libre de las moléculas Dbait para la activación de la quinasa, independientemente de su secuencia y de las modificaciones químicas hasta cierto punto. Esto es coherente con la implicación de DNA-PK en la ruta NHEJ, un mecanismo de unión a extremos del ADN independiente de la secuencia.
Ejemplo 3: actividad in vitro de moléculas Dbait
La actividad de las moléculas Dbait en células cultivadas se estudió por ensayos de supervivencia clonogénicos en dos líneas celulares de cáncer humanas radiorresistentes derivadas de un carcinoma de cuello de útero de una mujer (HeLa) y de HNSCC (Hep2) en asociación con radiación ionizante, mediante la inhibición de la integración ilegítima de un fragmento de ADN exógeno y mediante la detección de los focos de DSB persistentes después de la irradiación en las células transfectadas por moléculas Dbait.
Para los estudios en animales, se usaron líneas celulares humanas establecidas Hep2 (carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, HNSCC), LU1205 y SK28 (melanomas). Los estudios de las células en cultivo se realizaron usando Hep2, HeLa S3 (carcinoma del cuello uterino epitelial), MO59K y MO59J (glioblastoma). Las células se cultivaron a 37 ºC en cultivos de monocapa en DMEM completo que contenía suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10 % (FBS; Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) y antibióticos (100 μg/ml de estreptomicina y 100 μ/ml de penicilina) en condiciones de 100 % de humedad, 95 % de aire y 5 % de CO2. LU1205
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muestra que Dbait32Hc aumentaba en gran medida la forma fosforilada de H2AX (γ-H2AX) en comparación con el control (ambas células irradiadas, o ninguna). Otras moléculas Dbait más cortas tenían un efecto mucho menor o no tenían efecto.
Para investigar el efecto de Dbait sobre la formación y la pérdida de focos de γ-H2AX inducidos por radiación ionizante, se transfectaron Dbait32H-Cy3 en las células Hep2 por Superfect (Qiagen). Se irradiaron células Hep2 transfectadas o no transfectadas a 10 Gy. Las células se fijaron a diferentes tiempos (0 min, 30 min, 1 hora, 5 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 7 días). Se usó anticuerpo monoclonal de ratón primario para g-H2AX (ser139) (Upstate, Tempcula, CA, Estados Unidos) en una dilución 1/500 y se incubó durante 2 horas a 0 ºC, después se lavó con tampón PBS y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 anti-IgG de ratón (Molecular Probe, Eugene, OR, Estados Unidos) diluido 1/200 durante 1 hora en una sala oscura.
La cinética de la persistencia de los sitios de DSB se reveló por γ-H2AX en las células irradiadas por un citómetro de flujo FACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, Estados Unidos). El panel inferior de la figura 2.6 muestra que el nivel de γ-H2AX permanecía elevado y prolongado en las células transfectadas con Dbait32H en comparación con los controles (células irradiadas pero no transfectadas o no tratadas). Este experimento indicó que Dbait32H retardaba sustancialmente la reparación de las DSB inducidas por radiación ionizante.
Ejemplo 4: efectos de moléculas Dbait en la línea celular GMA32 y su asociación con la irradiación o inhibidores mitóticos.
Se mantuvieron fibroblastos de hámster chino GMA32 permisivos a roturas de ADN en medio MEM (Gibco) complementado con piruvato sódico 1 mM, glutamina 2 mM, MEM 1x sin aminoácidos esenciales, penicilina/estreptomicina 1x y suero equino al 10 %. Típicamente, se sembraron de 2x105 a 4x105 células en medio sin antibióticos, en placas Petri de 5 cm de diámetro 24 horas antes de la transfección de diferentes moléculas Dbait (4,5 μg) con Lipofectamine 2000 (Life Technologies) como agente de transfección (en una relación 1:3), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al final de la transfección, las células se irradiaron (4 Gy) o se trataron con inhibidores mitóticos: nocodazol (200 nM), navelbina (100 nM) o taxol (200 nM).
Después de aproximadamente 16 horas, se retiró el fármaco y se dejó que se recuperaran las células. Se realizó irradiación celular con rayos γ a partir de una fuente de 137Cs. Después de 24 horas de recuperación, las células se recogieron y se usaron para FACS, análisis de transferencia de Western o para determinar la clonogenicidad (supervivencia) y el efecto de cada tratamiento.
La figura 3.1 muestra el análisis FACS de las células GMA32 no tratadas, las células transfectadas individualmente o transfectadas con diferentes moléculas Dbait por Lipofectamine, pero sin irradiación adicional o tratamiento con inhibidor mitótico. La fase M1 representa el porcentaje de células en estadio sub-G1 indicativo de muerte celular. Se observó una muerte celular significativa únicamente en presencia de moléculas Dbait32 de doble cadena y Dbait32H de horquilla, mientras que Dbait16H de horquilla y Dbait32ss monocatenaria inducían una muerte celular intermedia y moderada, respectivamente. La Dbait8H de horquilla más corta no pudo desencadenar la muerte celular en comparación con el control (células transfectadas por Lipofectamine únicamente).
Los experimentos se realizaron con un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson). Se recogieron células, se suspendieron en 1 ml de tampón GM frío (glucosa 6,5 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, NaH2HPO4 2 mM, KHPO4 1 mM, EDTA 0,5 mM) y se almacenaron a 4 ºC durante al menos 2 horas después de la adición de 3 ml de etanol al 100 % frío.
En ese estadio, las células finalmente se lavaron con PBS 1x y después se tiñeron durante 30 minutos a temperatura ambiente en solución de PI (50 μg/ml de yoduro de propidio, 25 μg/ml de RNasa A en tampón PBS 1x). Se analizaron 10.000 acontecimientos con el software Cellquest y se seleccionaron agregados celulares. Se puntuó el porcentaje de células con un contenido de ADN de sub-G1.
En las mismas condiciones, se realizó la inmunodetección de focos de DSB de γ-H2AX fosforilada en la serina 139 por marcaje con γ-H2AX (puntos o manchas brillantes en los núcleos) en las células GMA32 no tratadas, las células transfectadas individualmente o transfectadas con diferentes moléculas Dbait por Lipofectamine. La contratinción de las membranas celulares y los núcleos se consiguieron por FITC-DiOC6 y DAPI. Se observaron efectos similares de las moléculas Dbait (Figura 3.2). Este experimento muestra que tanto la Dbait32 bicatenaria como la Dbait32H de horquilla pueden provocar eficazmente una respuesta celular similar a la que se produciría si se hubieran producido lesiones de ADN en los núcleos. Esto proporciona una evidencia visual de que estas moléculas Dbait pueden usarse para atrapar proteínas implicadas en la reparación de DSB a través de la ruta NHEJ.
Para la inmunodetección, las células se cultivaron en cubreobjetos en placas Petri de 5 cm de diámetro, 24 horas antes de la transfección con diferentes moléculas Dbait. Un día después de la transfección, se añadió FITC-DiOC6 (Molecular probes) en el medio durante 5 minutos a 37 ºC (para contrateñir las membranas). Después de 3 ciclos de lavado, las células se fijaron con PFA al 4 % durante 20 minutos.
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Después de un lavado adicional, se detectó γ-H2AX fosforilada en la serina 139 (γ-H2AX) con anticuerpo de conejo anti-γ-H2AX (4411-PC, Trevigen) diluido 1/100 en PBS 1x, BSA al 1 %. Las células se lavaron tres veces con PBS 1x, TritonX-100 al 0,5 % y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos de cabra anti-conejo Alexa 594 (Molecular Probes) diluidos 1/100 en PBS 1x, BSA al 1 %. Las células se visualizaron por microscopía de epifluorescencia.
Se realizaron experimentos adicionales para buscar indicios de señalización de lesiones en el ADN. La proteína p53 es una proteína bien conocida importante en la mediación de la señalización de las lesiones del ADN y en la coordinación de las respuestas apropiadas (reparación de ADN, apoptosis, etc.) mediante el cambio de su estado de fosforilación. En particular, la fosforilación del resto de serina 15 está implicada en la interacción con la proteína MDM2 que actúa como un control de retroalimentación. Por lo tanto, se evaluó el estado de fosforilación de la serina 15 de p53 por transferencia de Western. La figura 3.3 muestra que la serina 15 de p53 estaba altamente fosforilada cuando las células se habían transfectado con moléculas Dbait32 bicatenarias o Dbait32H de horquilla, mientras que Dbait16H de horquilla más corta inducía una fosforilación moderada. Ni la Dbait8H más corta ni las moléculas Dbait32ss monocatenarias podían inducir una fosforilación significativa en la serina 15 de la proteína p53.
Este experimento proporciona indicios adicionales de que la presencia de Dbait32 bicatenaria y Dbait32H de horquilla en células GMA32 se detectaba como lesiones en el ADN e inducía respuestas de señalización al transductor tales como la fosforilación de la proteína p53, probablemente a través de una ruta de activación de ATM.
Para el análisis de transferencia de Western, se lisaron células en tampón de Laemmli. Se resolvieron cantidades iguales de lisados en geles de poliacrilamida al 12 %. Se transfirieron proteínas a membranas de nitrocelulosa, que se bloquearon con leche desnatada al 5 % (1 hora) antes de la incubación durante una noche con anticuerpo antip53Ser15 (9284, Cell Signaling) diluido 500 veces en tampón TBST (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1 %) que contenía leche desnatada al 5 %. Después, las manchas de transferencia se incubaron con anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (P0448, Dako) diluidos 1/5000 en TBST. Se detectaron complejos de proteína-anticuerpo por la quimioluminiscencia aumentada (RPN2106 ECL, Amersham).
El efecto de radiosensibilización y quimiosensibilización de las moléculas Dbait en células GMA32 se evaluó por ensayo de clonogenicidad (supervivencia clonal). Para el ensayo de clonogenicidad, se realizaron diluciones seriadas después del recuento de las células para sembrar placas Petri de 5 cm con diferentes cantidades de células. El número de células variaba de 100-200 (células de control) a 3000 (células transfectadas y/o tratadas). Diez días después, las células (que formaban clones) se fijaron con paraformaldehído al 4 % (20 minutos), después se tiñeron con azul de metileno (15 minutos) y se puntuó el número de clones en cada placa (por triplicado).
La Figura 3.4 muestra que se observaba radiosensibilización a la irradiación de 4 Gy en células GMA32 transfectadas con moléculas Dbait32 bicatenarias o Dbait32H de horquilla. Además, también se observó quimiosensibilización en el caso de las células GMA32 transfectadas con moléculas Dbait32 bicatenarias o Dbait32H de horquilla cuando se trataron por inhibidores mitóticos (nocodazol 200 nM, navelbina 100 nM (vinorelbina) o taxol 200 nM (paclitaxel)). Estos fármacos se conocen como potentes inhibidores de la polimerización o despolimerización de microtúbulos. Dbait32 y Dait32H pudieron potenciar la actividad citotóxica de estos inhibidores mitóticos.
Ejemplo 5: radiosensibilización del tratamiento de tumores humanos xenoinjertados en ratones desnudos
La actividad in vivo de moléculas Dbait en asociación con radioterapia se evaluó usando ratones desnudos xenoinjertados con tumores humanos por inyección subcutánea de líneas celulares radiorresistentes (Hep2 derivada de carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, HNSCC) o fragmentos de tumor (obtenidos previamente por inyección subcutánea de las líneas celulares U87 derivadas de glioblastoma).
Las investigaciones principalmente se realizaron en los ratones con xenoinjertos de tumores HNSCC humanos radiorresistentes para establecer la prueba de concepto in vivo. Se realizó irradiación con rayos γ desde una fuente de 137Cs con la protección apropiada de los ratones para realizar una irradiación localizada de los tumores. Las condiciones de ensayo típicas consisten en la inyección intratumoral de una preparación apropiada de 1 nmol de moléculas Dbait con agentes de transfección (dendrímero catiónico (Superfect, Qiagene), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Polyplus Transfection) y polietilenimina (PEI, Polyplus Transfection) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, 5 horas antes de la irradiación. Se administró una dosis total de 30 Gy en 5 semanas: i) 3 x 2 Gy/semana (aproximadamente una cada dos días); ii) 5 Gy/semana; iii) 15 Gy/2 semanas.
El tamaño del tumor se midió 2-3 veces por semana. Como control del tratamiento de irradiación sin Dbait se usó el tratamiento por irradiación e inyección intratumoral de medio MEM (el tampón de dilución de Dbait). Se calculó el volumen tumoral (V=2 x a x b2, en donde a=longitud, b=anchura). La relación de volumen medido a tiempo t con respecto al volumen inicial (Vt/Vi) se usó como indicador de la progresión tumoral. Se realizó un seguimiento de los ratones durante un periodo de hasta 100 días. Se ensayaron al menos 4 series independientes de seis animales.
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