ES2354359T3 - Ácidos nucleicos útiles para desencadenar la mortalidad de células tumorales. - Google Patents

Abstract

- Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24- 100 bp, que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para intensificar la sensibilidad tumoral a terapia anticancerosa que daña el DNA.

Description

Esta invención se encuentra, en general, en el campo del uso de fragmentos de oligonucleótidos/DNA para aplicaciones biológicas y terapéuticas, y más específicamente, en el campo de los ácidos nucleicos que interfieren con las vías de indicación y reparación de daños del DNA, en particular la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) de reparación de roturas de las dobles 5 cadenas (DSB).

La invención se refiere a ácidos nucleicos, útiles como herramientas para desencadenar la mortalidad celular de tumores sometidos a terapias anticancerosas.

La radioterapia. la quimioterapia, solas o combinadas con cirugía, son arsenales terapéuticos esenciales contra el cáncer humano. 10

Las radiaciones ionizantes ocasionan directa o indirectamente roturas de las dobles cadenas del DNA (DSBs) y desencadenan la muerte de células /tejidos (necrosis o apoptosis). El efecto citotóxico de la radiación ionizante forma la base de la terapia de radiación, ampliamente utilizada en el tratamiento de cánceres humanos. La eficacia de la radioterapia está limitada actualmente por la resistencia a la radiación de ciertos tumores (por ejemplo, glioblastomas), y por los efectos secundarios causados por 15 irradiación de los tejidos normales próximos (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de mama y del cáncer cervical).

En los años pasados, muchos estudios se han enfocado sobre mecanismos biológicos relacionados con la respuesta a la radiación ionizante, con objeto de conseguir una nueva percepción de la complejidad de los fenómenos que subyacen en la radiosensibilidad o en la radiorresistencia de las 20 células tumorales. El entendimiento de las diferentes vías que regulan finalmente la respuesta a la radiación ionizante, constituye una fase importante conducente a la identificación de dianas moleculares para nuevos fármacos y nuevos tratamientos terapéuticos que, en asociación con la radioterapia, podrían mejorar la oportunidad de mejoría de tumores resistentes a la radiación, tales como tumores cerebrales o de cabeza y de cuello. 25

El empleo de agentes quimioterápicos puede ocasionar daños del DNA, con inclusión de DSBs, directos o indirectos. Son ejemplos de la mayoría de las familias de agentes quimioterápicos empleados (agentes citotóxicos químicos) los inhibidores de las topoisomerasas I ó II (camptotecina/topotecán, epirubicina/etóposido), agentes de entrecruzamiento del DNA (cisplatino/carbo-

platino/oxaliplatino), agentes de alquilación del DNA (carmustina/dacarbacina), o agentes antimetabólicos 30 (5-fluorouracilo/gemcitabina/capecitabina), así como inhibidores de husos mitóticos (paclitahel/docetaxel/vinorelbina). Progresos recientes en el desarrollo de compuestos citotóxicos biológicos (anticuerpos monoclonales, inhibidores de citoquinas/quinasa, inmunoterapia/vacunas), han puesto de manifiesto su eficacia y especificidad frente a un subconjunto de tumores. Pero estos agentes se utilizan frecuentemente en combinación con compuestos citotóxicos químicos. A pesar de muchos 35 progresos en los desarrollos de nuevos fármacos citotóxicos, la resistencia de fármacos a la quimioterapia es, todavía, un asunto clínico importante en el tratamiento de los cánceres. La comprensión del mecanismo de resistencia a los fármacos en lo que respecta a la aceptación/efusión, degradación metabólica, mutagénesis de diana, reparación intensificada, indicación de muerte celular (apoptosis y necrosis), etc., es esencial para asegurar la eficacia de la quimioterapia y mejorar el índice terapéutico, 40 en especial, en algunos tumores resistentes a tratamiento.

La asociación entre quimioterapia y radioterapia se utiliza ampliamente para el tratamiento de cánceres. Aun cuando no ha sido completamente esclarecido todavía, los fundamentos biológicos de acción de los compuestos citotóxicos se basan en mecanismos celulares, tales como el ciclo celular o el daño del DNA, que son también factores importantes para la muerte celular inducida por las radiaciones, 45 que conducen a beneficios sinérgicos aditivos o incluso mejores, combinando tratamientos diferentes en la terapia del cáncer.

En la última década han sido llevadas a cabo muchas investigaciones en este campo. Comenzó a ser delineada la complejidad de la transducción de señales en respuesta a la radiación.

Entre los genes de interés particular para ser considerados dianas de las radiaciones ionizantes 50 están los implicados en la regulación de los mecanismos de mortalidad inducidos por radicaciones, tales como la apoptosis o la reparación del DNA. La muerte celular inducida por una radiación ionizante depende en la mayoría de los casos, de la reparación de DSBs.

Dos mecanismos están involucrados en la reparación de estas lesiones: la unión de extremos no homólogos (NHEJ, vía independiente de la secuencia) y la recombinación homóloga (HR, vía dependiente de la secuencia) (revisados por Jackson, 2002). La consideración como dianas de genes implicados en estas dos vías principales de reparación de DSB conduce a una radiosensibilidad pequeña o moderada, dependiendo de los enfoques utilizados y de las líneas de las células cancerosas (Belenkov et al., 2002; 5 Marangoni et al., 2000; Ohnishi et al., 1998).

Las proteínas Ku70 y Ku80, proteínas de DNA-PKsc, son importantes para reparar daños del DNA inducidos por radiaciones o por quimioterapia. Si el daño no pudiera ser reparado a tiempo, las células mueren. Por consiguiente, son dianas moleculares interesantes para sensibilizar células y tejidos diana a la radioterapia y a la quimioterapia. Muchos enfoques han sido concebidos y puestos en práctica 10 para inhibir estas proteínas clave (Ku70/Ku80, DNA-PKsc, etc.) implicadas en la vía NHEJ, considerada como predominante en células de mamífero:

1) Inhibidores de PI3K (fosfatidilinositol-3-quinasa)(es decir DNA-PKsc, PARP-1, ATM, ATR) (Boulton et al., 2000; Durant y Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004).

2) Dominante negativo y péptidos (extremo C-terminal de KU80) (Marangoni et al., 2000; Kim et 15 al., 2002).

3) Fragmento variable de anticuerpo monocatenario (scFv) (DNA-PKsc) (Li et al., 2003).

4) Tecnología de adaptación de DNA (SELEX: Ku que une RNA) (Yoo y Dynan, 1998).

5) Antisentido (Ku70, Ku80, DNA-PKsc) (Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al., 2002)

6) siRNA (DNA-PKsc) (Peng et al., 2000). 20

A pesar de estos enormes esfuerzos, la combinación de elección como dianas genes de reparación del DNA y terapias anticancerosas están todavía en fases experimentales precoces y no se han mostrado hasta la fecha estudios clínicos que manifiesten beneficios. Merece la pena hacer notar que los enfoques anteriores participan de una faceta común: estos enfoques consideran un único efector (proteína ) implicado en una vía compleja en cascada (tal como la NHEJ) con desviaciones posibles. 25

Besmer et al., (1998, Molecular Cell, 2, 817-828) describen moléculas de DNA de una longitud de 20 bp. El documento WO03/070914 describe siRNA, El documento WO03/069306 describe oligonucleótidos antisentido y siRNA.

Los inventores han descubierto que la sensibilidad tumoral a tratamientos terapéuticos anticancerosos directos o indirectos que dañan el DNA, puede intensificarse utilizando moléculas de 30 ácidos nucleicos de dobles cadenas. modificadas o no químicamente, que actúan como miméticos de fragmentos de DNA rotos y reconocidos como sitios DSB inducidos por los tratamientos que dañan el DNA. Las moléculas pueden tener estructura no replicativa debido a dichas modificaciones.

Un objeto de la invención es, por tanto, proporcionar tales fragmentos de ácidos nucleicos de dobles cadenas, denominados también en lo sucesivo moléculas de “mortalidad inducida por reparación 35 de DNA” (abreviadamente moléculas DRIL), capaces de intensificar la respuesta de tumores resistentes a tratamientos de radioterapia y quimioterapia.

Más particularmente, la invención pretende proporcionar nuevas moléculas DRIL para ser usadas en combinación con agentes físicos y químicos que pueden causar directa o indirectamente DSBs del DNA, y un método de tratamiento del cáncer que combina el uso de dichas moléculas DRIL con 40 terapias anticancerosas que ocasionan daño directo o indirecto del DNA.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de moléculas DRIL para obtener adyuvantes terapéuticos antitumorales para intensificar la eficacia del tratamiento del cáncer, en particular para tumores altamente resistentes a radioterapia y/o quimioterapia.

Las moléculas DRIL son sustratos de proteínas involucradas en la vía NHEJ (vía independiente 45 de la secuencia), en particular proteína Ku, y comprenden una estructura fundamental independiente de la secuencia de al menos 4-10000 pares de bases (bp), en particular 4-1000 bp.

Estas son tales que

- las moléculas DRIL de doble cadena son capaces de ser captadas en el núcleo celular por células/tejidos cuando se emplean con excipientes farmacéuticamente aceptables; 50

- los extremos libres de las moléculas DRIL son reconocibles por las proteínas de unión de DNA implicadas en la reparación de roturas de dobles cadenas y de indicación de daño.

- los extremos libres de las moléculas DRIL son aceptables por dichas enzimas para incorporarse en el DNA genómico de las células tumorales.

Según el mecanismo de acción de las moléculas DRIL mediante la vía NHEJ, sus longitudes no 5 son una limitación per se, excepto por consideraciones prácticas, pero deben incluir por lo menos 4 bp, más preferiblemente, por lo menos 8 bp.

Preferiblemente las moléculas DRIL comprenden entonces 8-500 bp y lo más preferible, 16-200 bp.

Las moléculas DRIL particularmente preferidas comprenden 16-100 bp y más ventajosamente, 10 24-100 bp.

Las moléculas DRIL según la invención poseen una estructura nativa de fosfodiéster o una estructura de fosfodiéster modificada químicamente, u otra estructura fundamental con grupos químicos o mezclas de grupos químicos. con tal que los oligómeros modificados permanezcan como sustratos de las proteínas involucradas en la vía NHEJ, en particular las proteínas Ku, y la vía de indicación de daños 15 DSB. Ventajosamente, las modificaciones químicas están destinadas a comunicar estabilidad química a las moléculas DRIL y/o evitar su replicación posterior (causa potencial de efecto mutagénico) sobre su integración genómica, si esto ocurre,

Estas moléculas pueden tener partes miméticas de azúcares tales como 2’-O-alquilribosa, 2’-O-alquil-C4’ ribosa ramificada, ciclobutilos u otros compuestos carbocíclicos o hexitol en lugar del grupo 20 pentofuranosilo.

Pueden ser lineales o hechas de ácidos nucleicos de doble cadena en horquilla en los que el lazo puede ser ácidos nucleicos u otros grupos químicos conocidos por los técnicos experimentados, preferiblemente un engarce tal como hexaetilenglicol o tetradesoxitimidilato (T4).

Puede obtenerse moléculas DRIL de la invención con al menos un extremo del dsDNA libre, 25 pudiendo ser dicho extremo libre romo o con un extremo 5’-/3’ que sobresale, y comprenden estructuras fundamentales de ácidos nucleicos modificadas u otros grupos químicos o mezcla de grupos químicos conocidos por los técnicos experimentados.

Los fragmentos preferidos comprenden uno o varios grupos químicos en el extremo de cada cadena. Los grupos químicos preferidos comprenden fosforotioatos. Alternativamente, los fragmentos 30 preferidos poseen ligamiento de nucleótidos 3’-3’.

Otras estructuras fundamentales modificadas de la invención, comprenden metilfosfonatos, fosforamidatos, ácido morfolino nucleico, ácido nucleico fijado, con puente 2’-O,4’-C metileno/etileno, ácido nucleico peptídico (PNA) y ligamientos inter-azúcares de alquilo de cadena corta o de cicloalquilo, o ligamientos intra-azúcares heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta, de longitud variable, o 35 cualesquiera nucleótidos modificados conocidos por los técnicos experimentados.

La patente de EE.UU. No. 5.677.437 describe ligamientos de oligonucleósidos heteroaromáticos. También pueden usarse engarces nitrogenados o grupos que contienen nitrógeno, para preparar imitadores de oligonucleótidos (Patentes de EE.UU. Nos. 5.792.844 y 5.783.682). La patente de EE.UU. No. 5.637.684 describe compuestos oligoméricos fosforoamidato y fosforotioamidato. También se 40 contemplan oligonucleótidos que poseen estructuras fundamentales morfolino (patente de EE.UU. No. 5.034.506). En otras realizaciones, tales como la estructura de ácido nucleico peptídico (PNA), la estructura de fosfodiéster del oligonucleótido puede ser reemplazada con una estructura de poliamida, estando las bases unidas directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la estructura de poliamida. Otros oligonucleótidos sintéticos pueden contener restos de azúcares sustituidos 45 comprendiendo uno de los siguientes en la posición 2’ : OH, SH, OCH3, SCH3, F, OCN, OCH2CH2OCH3, O(CH2)nNH2 ó (CH2)nCH3 en cuyas fórmulas n es desde 1 a 10 aproximadamente; alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-; S-; o N-alquilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3 NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de un 50 oligonucleótido; y otros sustituyentes que posean propiedades semejantes.

Las moléculas DRIL están basadas esencialmente en nucleótidos naturales, o bien 2’-desoxinucleótidos o bien 2’-ribonucleótidos y comprenden, opcionalmente, uno o varios nucleótidos modificados y/o nucleobases modificadas distintas de adenina, citosina, guanina, timina y uracilo.

Son nucleobases apropiadas distintas de las bases habituales, por ejemplo, C5-metilcitosina , uracile, pseudoisocitosina, C5-propiniluracilo, N7-desazaguanina, N7-guanina glicosilada, o anómero alfa, 5 u otras nucleobases modificadas o un resto básico.

Las moléculas DRIL modificadas químicamente, que pueden estar en la célula en el tejido o en el cuerpo cuando son irradiadas o tratadas por quimioterapia, pueden estar incorporadas o bien en el DNA genómico en los sitios DSB, o reconocidas como sitios DSB inducidos por una radiación ionizante mediante un mecanismo de reparación del DNA celular tal como NHEJ. Después, estas moléculas 10 pueden unirse mediante proteínas de reparación de DSB, o bien integrándose en los cromosomas rotos o bien saturando el sistema de reparación.

Según una realización de la invención, dichas moléculas DRIL comprenden, además, al menos un elemento embutido que estorba la replicación del DNA, la reparación del DNA, o el proceso de indicación de daño. 15

Dichos elementos no replicables pueden ser incorporados en la posición interior o en el extremo del fragmento de doble cadena. Dichos elementos pueden comprender:

a) Una unidad que no puede ser usada como molde para la replicación del DNA, tal como una cadena de polietilenglicol, preferiblemente una cadena de hexaetilenglicol, o cualquier cadena hidrocarbonada, finalmente interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, 20 oxígeno, azufre, nitrógeno, o grupos heteroatómicos o heterocíclicos que comprenden uno o más heteroátomos;

b) una unidad que es un elemento de bloqueo ya que no es tratable por DNA polimerasas o exonucleasas, tales como cualesquiera nucleótidos modificados en 3’, u otros conocidos por los técnicos experimentados; 25

c) un oligonucleótido nativo, tal como Tn ,cuando se usa en el lazo de un fragmento en horquilla, preferiblemente un tetradesoxitimidilato (T4).

Dichas cadenas se obtienen mediante síntesis química, semi-biosíntesis o biosíntesis, un método de amplificación, seguido de un método cualquiera de extracción y preparación y una modificación química cualquiera. 30

Los experimentos llevados a cabo en células cultivadas y en tumores xenotrasplantados sobre ratones desnudos y ratones modificados genéticamente, han puesto de manifiesto que dichas moléculas DRIL desencadenan la mortalidad de tumores de células/tejidos sometidos a radio-y/o quimioterapia.

La invención, por tanto, se refiere también a composiciones adyuvantes para ser utilizadas en asociación con un tratamiento de rotura del DNA comprendiendo dichas composiciones una molécula 35 DRIL según se ha definido anteriormente, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para ser introducida en el núcleo de las células tumorales.

La invención se refiere, asimismo, a un método para promover sensibilidad tumoral a terapias anticancerosas, que comprende, en asociación:

- Introducir en la célula/tejido canceroso, moléculas DRIL tales como las definidas anteriormente; e 40

- inducir en células, rotura del DNA mediante un método que dañe el DNA. Según una realización de la invención, se usa un agente de transfección en dicha etapa de introducción.

Basada en el protocolo usado en estudios in vivo, la invención proporciona un método racional para establecer el protocolo clínico del uso de moléculas Dril en combinación con radioterapia o quimioterapia. El método racional que subyace en cualquier protocolo es que las moléculas DRIL deben 45 ser distribuidas en los núcleos de las células cuando tiene lugar un acontecimiento de daño del DNA. Por consiguiente, las moléculas DRIL deben administrarse varias horas antes de la radioterapia, mientras que pueden administrarse junto con agentes quimioterápicos dependiendo del modo de administración y de las características farmacocinéticas de cada componente.

El protocolo en ratones comprende la administración de moléculas DRIL varias horas antes de la 50 irradiación, por ejemplo, 5 horas, y 3 veces por semana, correspondiendo la dosis total de irradiación a 30

Gy a lo largo de 6 semanas de tratamiento. Es especialmente eficaz el empleo de una irradiación fraccionada.

Ventajosamente, dicho método comprende asociar el tratamiento con moléculas DRIL con un tratamiento de quimioterapia doble. Por ejemplo, 5-FU y CPT 11 se inyectan juntos 3 veces, 3 días consecutivos, separados por una semana completa de descanso. Alternativamente, el tratamiento con 5 moléculas DRIL se asocia con radioterapia.

El método puede adaptarse fácilmente a seres humanos por los expertos en la técnica dependiendo, en particular, del peso del paciente.

En una realización preferida, las moléculas DRIL son moléculas DRIL modificadas químicamente según se ha definido anteriormente y conforme a otras prácticas utilizadas en terapia humana. 10

En otra realización, las moléculas DRIL no han sido modificadas químicamente y corresponden a fragmentos de ácidos nucleicos nativos, pero manifiestan las características de los fragmentos modificados químicamente, en particular poseen el número de pares de bases y las propiedades definidas con respecto a dichas moléculas DRIL modificadas químicamente.

Más particularmente, la rotura de cadenas del DNA se consigue mediante radiación ionizante 15 (radioterapia) o reacción química (quimioterapia).

Tal método tal es un nuevo adyuvante terapéutico en conjunción con tratamientos terapéuticos de tumores con daño del DNA.

La invención se refiere también al uso de dichas moléculas DRIL no modificadas químicamente para obtener fármacos antitumorales para tratar tumores, en particular tumores altamente resistentes a 20 radioterapia y/o quimioterapia, utilizándose dichos fármacos en asociación con un tratamiento de rotura del DNA, particularmente radioterapia o quimioterapia.

In vivo, las moléculas DRIL modificadas químicamente o sin modificar se administran por cualquier vía apropiada, con un excipiente apropiado, tal como administración oral, o intravenosa o intratumoral, o inyecciones subcutáneas, u otras. 25

Otras características y ventajas de la invención se proporcionan en los ejemplos que siguen, con referencia a las figuras 1 a 5, y a las Tablas 1 y 2, cuyas figuras representan, respectivamente:

Figura 1.1: Ensayos de desplazamientos de bandas realizados sobre diferentes moléculas DRIL radiomarcadas con 32P, en presencia de cantidades diversas de extracto nuclear procedente de células Hep2; 30

Figura 1.2: Identificación de la presencia de proteína Ku en las bandas retardadas de diferentes moléculas DRIL radiomarcadas con 32P, que implican proteínas en el extracto nuclear de células Hep2;

Figura 2.1: Ensayo de supervivencia clonogénica de células Hela después de irradiación de moléculas DRIL realizada con rayos ; 35

Figura 2.2: Inhibición de integración ilegítima intensificada por radicación, de un fragmento plasmídico lineal (2 g) que lleva el gen que codifica resistencia a neomicina, por moléculas DRIL32-PEG.

Figura 2.3: Células Hela transfectadas por moléculas DRIL32-FITC fluorescentes después de irradiación; 40

Figura 3.1: Análisis FACS de las células GMA32 sin tratar, las células transfectadas solas, o transfectadas con diferentes moléculas DRIL por lipofectamina, pero sin irradiación posterior ni tratamiento inhibidor mitótico;

Figura 3.2: Inmunodetección de focos de reparación del DNA por marcado con -H2AX en las células GMA32 sin tratar, las células transfectadas solas o transfectadas con diferentes moléculas 45 DRIL por lipofectamina.

Figura 3.3: Análisis de transferencia Western del estado de fosforilación del resto 15 de serina de p53 de las células , de las células GMA32 sin tratar, las células transfectadas solas o transfectadas

con diferentes moléculas DRIL por lipofectamina, pero sin irradiación posterior ni tratamiento con inhibidor mitótico.;

Figura 3.4: Supervivencia clonogénica de células GMA32 sin tratar y tratadas por irradiación o por diferentes inhibidores mitóticos;

Figura 4: Crecimiento del tumor de laringe, humano, xenotrasplantado, en ratones, monitorizado 5 como la relación del volumen tumoral al tiempo t sobre el volumen inicial (Vt/Vi) con o sin tratamientos;

Figura 5.1: Quimiosensibilización del tratamiento de tumores digestivos inducidos en ratones transgénicos K-RasV12G x Apc1638N; y

Figura 5.2: Número medio de tumores digestivos por animal, mediante examen macroscópico o 10 histológico

Figura 5.3: Panel A; Esquema de protocolo (i.p.: inyección intraperitoneal; o.: administración oral). Panel B: Fluorescencia de DRIL32-FITC (izquierda) y de -H2AX marcada por inmunofluorescencia (derecha) sobre la sección de 5 m procedente del tejido tumoral del animal tratado según el protocolo indicado en el panel A. Las partes inferiores muestran los detalles (usando lentes de 63x) 15 de la zona indicada en las partes superiores (usando lentes de 10x, caja blanca) La localización conjunta de DRIL32-FITC fluorescentes y -H2AX aparece como puntos brillantes sobre núcleos con tinción de contraste DAPI. Fotografías en color están disponibles a petición.

Estudios moleculares y celulares así como ensayos de tumores humanos resistentes a radioterapia, xenotrasplantados, (glioblastoma de cabeza y cuello) en ratones desnudos, y de tumores 20 inducidos por mutación doble en el tracto digestivo de ratones transgénicos RasV12G x Apc1638N, fueron llevados a cabo con objeto de: i) apreciar las actividades biológicas de moléculas DRIL, ii) validar el enfoque de Cebo del DNA usando moléculas DRIL para sensibilizar terapias anticancerosas; iii) esclarecer los mecanismos moleculares y celulares que subyacen en los efectos observados de DRIL. Los resultados de estas investigaciones están explicados en términos generales y resumidos en las 25 secciones que siguen (ejemplos).

Ejemplo 1: Diseño, síntesis y preparación de moléculas DRIL

Dos tipos de moléculas DRIL fueron diseñados: fragmentos de dsDNA lineales y en horquilla. Para las moléculas DRIL en horquilla se usó como lazo un engarce de hexaetilenglicol (abreviado como PEG) o uno de tetradesoxitimidilato (abreviado como T4). El extremo o extremos del tronco de dsDNA 30 puede ser protegido contra la degradación química mediante 3’-exonucleasas, por incorporación de fosforotioatos, o ligamiento de nucleótidos 3’-3’. En principio, pueden emplearse otras modificaciones químicas con tal que sean compatibles con la unión de PKsc de Ku70/Ku80-DNA (Martensson y Hammarten, 2002). Se utilizaron diferentes moléculas DRIL con diversas longitudes del tronco, 8 bp (DRIL8-PEG), 16 bp (DRIL16-PEG), 24 bp (DRIL24-PEG) y 32 bp (DRIL32-PEG), así como diferentes 35 secuencias del tronco. Un fragmento dumbell de dsDNA (DRIL32-2xPEG) en el que ambos extremos estaban herméticamente cerrados por dos lazos de PEG, fue diseñado también, como testigo. Algunas moléculas DRIL fueron marcadas mediante una T marcada con fluoresceína (DRIL32-FITC), cianina 3 (DRIL32-Cy3) o biotina (DRIL32-Bt). La Tabla 1.1 y la Tabla 1.2 resumen las secuencias y las estructuras químicas de las moléculas DRIL empleadas en este trabajo. 40

Todas las moléculas DRIL fueron obtenidas por síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, automatizada (Eurogentec, Bélgica). Las moléculas obtenidas fueron purificadas por HPLC de fase invertida, desnaturalizante. Se utilizaron para el control de calidad electroforesis en gel, capilar,

desnaturalizante y MALDI-TOF/CL-EM. Más de 90% de los oligonucleótidos tenían longitud completa. Todas las muestras fueron liofilizadas antes de transportar.

Una vez recibidas, todas las muestras fueron disueltas en agua bidestilada. Las concentraciones de las moléculas DRIL sin marcar fueron medidas por espectrofotometría (Cantor and Warshaw, 1970) en condiciones desnaturalizantes (60ºC-90ºC, dependiendo de la estabilidad térmica de las moléculas DRIL). El fragmento de dsDNA “dumbell” (DRIL32-2xPEG) se preparó mediante hibridación de extremos complementarios y ligación por DNA ligasa T4 (BioLabs) de dos semi-horquillas que llevan 5 lazo de PEG y con extremos 3’ salientes y complementarios.

Basándose en consideraciones termodinámicas y cinéticas, se usaron los protocolos que siguen para preparar las muestras de moléculas DRIL, según su característica molecular

- Para moléculas DRIL bimoleculares (DRIL 32, DRIL64 y DRIL64-PEG) :

La mezcla de solución de reserva 1:1 (máxima concentración posible) de cada cadena en agua 10 bidestilada ha de ser calentada a 90ºC durante 5 minutos para la desnaturalización completa de cada cadena. La hibridación de los ácidos nucleicos se llevó a cabo mediante retorno suave a la temperatura ambiente (típicamente, las muestras se dejan en un baño de agua) y las moléculas dùplex resultantes se almacenaron en partes alícuotas a –20ºC.

- Para moléculas DRIL monomoleculares (en horquilla): 15

La solución en agua bidestilada que contiene 200 M de moléculas DRIL en horquilla ha de calentarse a 90ºC durante 5 minutos para desnaturalización completa. La hibridación de los ácidos nucleicos ha de llevarse a cabo enfriando las muestras en una mezcla de agua y hielo (0ºC). El almacenamiento de partes alícuotas se realiza a –20ºC.

Ejemplo 2: Análisis bioquímico de moléculas DRIL 20

Como primera etapa para determinar cuidadosamente el mecanismo de acción de las moléculas DRIL, se llevaron a cabo una serie de ensayos de desplazamiento de bandas con diferentes moléculas DRIL radiomarcadas con 32P, en presencia de extractos de proteína nuclear procedente de células Hep2, según el protocolo estándar. Típicamente, 10 nM de moléculas DRIL radiomarcadas con 32P fueron incubados en presencia de concentraciones diversas de proteínas nucleares (0, 10, 20, 40, 80, 160 y 320 25 ng/l) a 30ºC durante 10 minutos en el seno de solución tampón TBE. Después las muestras fueron cargadas sobre un gel nativo de acrilamida al 5%. La electroforesis se realizó a 95V durante 2 horas, a 4ºC. El gel se secó y se escaneó mediante un fosfoformador de imágenes (Molecular Dynamics).

La figura 1.1 muestra que, excepto las moléculas DRIL-PEG de 8 bp (la molécula DRIL más corta), se observaron hasta 3 bandas retardadas para moléculas DRIL más largas con una banda común 30 (banda 1). Otras bandas aparecieron en presencia de moléculas DRIL largas. El tipo de banda retardada de la titulación de extractos de proteína nuclear de Hep2 con moléculas DRIL largas de 32 bp (DRIL32-PEG, DRIL32po-PEG y DRIL32), es más complejo. La intensidad de la banda retardada 1 aumenta y disminuye después a medida que aumenta la concentración de proteína. La intensidad de las bandas retardadas 2 y 3 aumenta en función de la concentración de proteína hasta que alcanza una meseta. 35

La realización de ensayos de interacciones de unión y de desplazamientos de bandas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ku70 (Santa Cruz Biotechnology), reveló que las bandas retardadas 1 y 2 contienen el complejo de Ku (figura 1.2: En la línea -Ku, se indica cuando se añadieron anticuerpos anti-Ku (+) o no se añadieron (-) a la reacción de unión antes de cargar la muestra sobre el gel. Las bandas fueron numeradas 1, 2 y 3 y se añadió una estrella al número para las bandas que 40 manifiestan una emigración desplazada después de la unión anti-Ku.

La banda 1 y la banda 2 están superdesplazadas hacia la banda 1* y 2* por la adición del anticuerpo anti-Ku-70. Es probable que la banda 1 tenga un complejo Ku70/80 unido a las moléculas DRIL y la banda 2 dos complejos Ku70/80 unidos a las moléculas DRIL. Experimentos testigo llevados a cabo con proteínas Ku purificadas confirmaron esta interpretación. Hay que apreciar que la banda 3 45 desapareció al añadir el anticuerpo anti-Ku70 (observado claramente con las moléculas DRIL24-PEG y DRIL32po-PEG), lo que indica que la banda 3 contiene también el complejo de Ku.

La identificación de proteína Ku indica claramente que las moléculas DRIL interaccionan con la maquinaria de la vía NHEJ.

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Ejemplo 3: Actividad in vitro de moléculas DRIL

La actividad de las moléculas DRIL en células cultivadas fue estudiada mediante un ensayo de supervivencia clonogénica en dos líneas de células cancerosas humanas radio-resistentes, derivadas de un carcinoma femenino de cérvix (HeLa) y de carcinoma de laringe (Hep2) en asociación con una radiación ionizante. 5

3.1) Mortalidad celular inducida

Al cabo de 8 horas de transfección de moléculas DRIL en células Hela y cuatro dosis de irradiación divididas de 0,5 Gy, espaciadas 2 horas (4x0,5 Gy) efectuadas con rayos  procedentes de 137Cesio, se observó una disminución importante de la supervivencia clonogénica en comparación con la de las células sin transfectar. Los resultados se exponen en las figura 2.1 en la que el Panel A indica la 10 dependencia de la dosis del número normalizado de clones supervivientes en presencia las moléculas DRIL32 y DRIL32-PEG, y el Panel B, el número normalizado de clones supervivientes en presencia de diferentes moléculas DRIL en 83 nM (concentración en el medio de cultivo).

El efecto depende de la naturaleza química de las moléculas DRIL de un modo dependientes de la dosis. En este ensayo, las moléculas DRIL en horquilla (DRIL32-PEG, DRIL32-T4 y DRIL24-PEG) y las 15 moléculas DRIL lineales de doble cadena (DRIL64-PEG y DRIL64) redujeron significativamente la supervivencia clonogénica. Merece la pena apreciar que la molécula DRIL “dumbell” (DRIL32-2xPEG) que carece de extremos libres dsDNA (rematado por engarce de hexaetilenglicol en ambos extremos) no puso de manifiesto efecto alguno. La naturaleza química de lazo no importa (por ejemplo, DRIL32-PEG frente a DRIL32-T4). Estas observaciones indican que algunas de las moléculas DRIL pueden sensibilizar 20 células a las radiaciones ionizantes.

El cultivo de células se llevó a cabo en medio MEM suplementado con suero al 10%. Se usó Superfect (Qiagene) como agente de transfección según las indicaciones del fabricante. La supervivencia clonogénica se estimó como el número de células tratadas que forman colonia con respecto al número de células sin tratar. 25

3.2) Inhibición de integración ilegítima de DNA exógeno por moléculas DRIL

Se sabe que la radiación ionizante mejora la transfección de DNA exógeno, un proceso denominado integración intensificada por radiación. Para este ensayo se empleó un cultivo de células Hela. Las células fueron transfectadas durante 8 horas con 2 g de un plásmido lineal (que lleva el gen que codifica resistencia a la neomicina) y tres diferentes relaciones de DNA/Superfect (1:2, 1:5 y 1:10). 30 Durante el tiempo de transfección, las células fueron expuestas a diferentes protocolos de irradiación: sin irradiación, una sola irradiación de 1 Gy y 2 Gy, así como una irradiación de 2 Gy administrada mediante dosis divididas de 0,5 Gy cada 2 horas (4 x 0,5 Gy).La integración del plásmido fue verificada por selección de células NeoR que crecían en un medio que contenía 0,6 mg/ml de G418. La integración del plásmido se intensificó significativamente por el protocolo de irradiación dividida. Cuando se añadieron 2 35 g de moléculas DRIL32-PEG a la mezcla de transfección, se anuló la integración intensificada por radiación (figura 2.2).

Este experimento puso de manifiesto que la integración ilegítima, intensificada por radiación, del DNA exógeno que requería proteínas Ku, DNA-PK y ATM (Nimura et al., 2002) es inhibida por las moléculas DRIL, como era de esperar, puesto que el mecanismo de acción de las moléculas DRIL32-40 PEG actúa atrapando las proteínas implicadas en una vía NHEJ.

3.3) Inhibición inducida de la reparación de DSBs

Los daños de DSB de los núcleos pueden ser inmunodetectados usando el anticuerpo -H2AX que marca roturas del DNA. La mayor parte de los focos de H2AX aparecen rápidamente después de irradiación y desaparecieron a medida que progresaba el proceso de reparación de DSBs. Pocos focos 45 H2AX fueron detectados en células sin transfectar dos horas después de irradiar.

La figura 2.3 indica los resultados obtenidos con células Hela transfectadas por moléculas DRIL32-FITC fluorescentes, 2 horas después de una irradiación de 2 Gy. Panel de la izquierda: fluorescencia de DRIL32-FITC (puntos y manchas brillantes) y focos de reparación del DNA detectados por inmunofluorescencia del anticuerpo -H2AX en los núcleos.; Panel de la derecha: la misma imagen de 50 núcleos con focos de reparación del DNA detectados por inmunofluorescencia del anticuerpo -H2AX y tinción de contraste de DAPI. Las flechas de la esquina inferior izquierda muestran la ausencia de señal

de DRIL32-FITC y de -H2AX en el núcleo. Las flechas de la esquina superior derecha muestran las señales localizadas conjuntamente de DRIL32-FITC y -H2AX.

Como indica la figura 2.3, persistían roturas de DSB sin reparar en las células Hela transfectadas por moléculas DRIL32-FITC dos horas después de irradiación (2 Gy), como se puso de manifiesto mediante doble marcado fluorescente con DRIL32-FITC y el del anticuerpo -H2AX. Merece la 5 pena apreciar que en el mismo cultivo los focos de reparación de DSB eran casi indetectables en las células que no habían sido transfectadas eficazmente por DRIL32-FITC, lo que sugiere que la reparación del DNA había sido completa en esas células.

Los protocolos de transfección e irradiación fueron similares a los descritos anteriormente. Para inmunodetección, las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos en placas Petri de 5 cm de diámetro, 10 transfectadas con 2 g de moléculas DRIL32-FITC marcadas con FITC con Superfect (Qiagene) según las indicaciones del fabricante. Cuatro horas después del comienzo de la transfección, las células fueron irradiadas (2 Gy) y luego dejadas en reposo 2 horas en el medio, a 37ºC. Después de 3 ciclos de lavado, las células fueron fijadas con PFA al 2% durante 10 minutos. Después de un lavado adicional, se detectó la presencia de -H2Ax con anticuerpo de conejo anti--H2AX (441-PC, Trevigen) diluido 1/100 en 15 1xPBS, BSA al 1%. Las células fueron lavadas tres veces con 1xPBS, Triton X-100 al 0,5% e incubadas después durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con rodamina, diluidos 1/100 en 1xPBS, BSA al 1%. Las células fueron visualizadas mediante microscopio de epifluorescencia.

Ejemplo 4: Efectos de moléculas DRIL en la línea celular GMA32 y su asociación con irradiación o 20 inhibidores mitóticos

Las células de fibroblasto de hámster chino, GMA32, que permiten roturas del DNA, fueron mantenidas en medio MEM (Gibco) suplementado con piruvato sódico 1 mM, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x MEM, 1x penicilina/estreptomicina y suero de caballo al 10%. Típicamente, 2x105 a 4x105 células fueron sembradas en medio sin antibióticos, en placas Petri de 5 cm de diámetro, 25 24 horas antes de la transfección de diferentes moléculas DRIL (4,5 g) con lipofectamina 2000 (Life Technologies) como agente de transfección (en una relación 1:3), según las instrucciones del fabricante. Al término de la transfección, las células fueron o bien irradiadas (4 Gy) o bien tratadas con inhibidores mitóticos: nocodazol (200 nM), navelbina (100 nM) o taxol (200 nM). Aproximadamente 16 horas más tarde el fármaco fue retirado y se dejó recuperar las células . La irradiación de las células se realizó con 30 rayos  procedentes de una fuente de 137Cesio. Después de una recuperación de 24 horas, las células fueron recogidas y empleadas o bien para FACS, análisis de transferencia Western, o bien para determinar la clonogenicidad (supervivencia) y el efecto de cada tratamiento.

La figura 3.1 muestra un análisis FACS de las células GMA32 sin tratar, las células transfectadas solas, o transfectadas con diferentes moléculas DRIL por lipofectamina, pero sin tratamiento 35 posterior de irradiación ni de inhibidores mitóticos. La Fase M1 representa el porcentaje de células en el estado sub-G1 indicativo de muerte celular. Se observó muerte celular importante solo en presencia de moléculas DRIL-32 de doble cadena y DRIL32-PEG en horquilla, mientras que las DRIL16-PEG en horquilla y las DRIL32ss de una sola cadena indujeron muerte celular intermedia y moderada, respectivamente. La molécula DRIL8-PEG en horquilla, la más corta, falló en desencadenar muerte 40 celular en comparación con el testigo (células transfectadas con lipofectamina sola)

Los experimentos fueron llevados a cabo con un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson). Las células fueron recogidas, suspendidas en 1 ml de solución tampón GM fría (glucosa 6,5 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, Na2HPO4 2 mM, KHPO4 1 mM, EDTA 0,5 mM) y mantenidas a 4ºC al menos 2 horas después de la adición de 3 ml de etanol de 100% frío. En esta etapa, las células fueron 45 finalmente lavadas con 1xPBS, y teñidas después durante 30 minutos, a temperatura ambiente, con solución PI (yoduro de propidio, 50 g/ml, RNasa, 25 g/ml, en el seno de tampón PBS 1x). 10.000 acontecimientos fueron analizados con el soporte lógico Cellquest, y los agregados celulares fueron dejados fuera de cómputo. Se puntuó el porcentaje de células con un contenido sub-G1 de DNA.

En las mismas condiciones, .la inmunodetección de focos de reparación del DNA de H2AX 50 fosforilado sobre la serina 139 por marcado con -H2AX (puntos o zonas brillantes en los núcleos) se llevó a cabo en las células GMA32 sin tratar, las células transfectadas solas, o transfectadas con diferentes moléculas DRIL por lipofectamina. La tinción de contraste membranas y núcleos celulares se consiguió por FITC-DiOC6 y DAPI. Se observaron efectos similares de las moléculas DRIL (Figura 3.2). Este experimento pone de manifiesto que tanto las moléculas DRIL-32 de doble cadena y las DRIL32-PEG en 55 horquilla, pueden desencadenar eficazmente respuestas celulares semejantes al igual que si los daños

del DNA hubieran ocurrido en los núcleos. Esto proporciona evidencia visual de que estas moléculas DRIL pueden ser usadas para captar proteínas involucradas en la reparación de DSB por la vía NHEJ.

Para la inmunodetección, las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos en placas Petri de 5 cm de diámetro 24 horas antes de la transfección con diferentes moléculas DRIL. Un día después de la transfección, se añadió en el medio FITC-DiOC6 (Molecular Probes) 5 minutos, a 37ºC (para la tinción de 5 contraste de las membranas). Al cabo de 3 ciclos de lavado, las células fueron fijadas con PFA al 4% durante 20 minutos. Después de lavados adicionales, H2AX fosforilado sobre la serina 139 (-H2AX) se detectó con anticuerpo de conejo anti--H2AX (4411-PC, Trevigen) diluido 1/100 en 1xPBS, BSA al 1%. Las células fueron lavadas tres veces con 1xPBS y Triton X-100 al 0,5% e incubadas luego durante 1 hora, a temperatura ambiente, con anticuerpos de cabra anti-conejo Alexa 594 (Molecular Probes) 10 diluidos 1/100 en 1xPBS, BSA al 1%. Las células fueron visualizadas por microscopio de epifluorescencia.

Otro experimento fue realizado con objeto de buscar evidencia de indicación de daño del DNA. La proteína p53 es una proteína importante, bien conocida, para mediar en la indicación de daños del DNA y en la coordinación de respuestas apropiadas (reparación del DNA, apoptosis, etc.) por cambio de su estado de fosforilación, En particular la fosforilación del resto de serina 15 está implicada en la 15 interacción con la proteína MDM2 que actúa como testigo de realimentación. Por tanto, el estado de fosforilación de la serina 15 de p53 fue determinado mediante transferencia Western. La figura 3.3 muestra que la serina 15 de la proteína p53 estaba altamente fosforilada cuando las células habían sido transfectada o bien por moléculas DRIL32 de doble cadena o DRIL32-PEG en horquilla, mientras que la molécula DRIL16-PEG de forma de horquilla, más corta, indujo una fosforilación moderada. Ni la molécula 20 DRIL8-PEG, la mas corta, ni la molécula DRIL32ss, de una sola cadena, fueron capaces de inducir una fosforilación importante en la serina 15 de la proteína p53. Este experimento proporciona una evidencia adicional de que la presencia de ambas moléculas, DRIL32 de doble cadena y DRIL32-PEG en horquilla, en células GMA32, fue detectada como daño del DNA e indujo la señal para transducir respuestas tales como la fosforilación de la proteína p53, probablemente a través de la vía de activación de ATM. 25

Para los análisis de transferencia Western, las células fueron lisadas en solución tampón de Laemmli. Cantidades iguales de lisados fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 12%. Se hicieron pasar las proteínas a membranas de nitrocelulosa, que habían sido bloqueadas con leche desnatada al 5% (1 hora) antes de incubación durante la noche con anticuerpo anti-p53Ser15 (9284, Cell Signaling) diluido 500 veces en solución tampón TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1%) 30 que contenía leche desnatada al 5%. Las transferencias fueron incubadas luego con anticuerpos secundarios de cabra anti-IgG de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (P0448, Dako) diluidos 1/5000 en TBST. Los complejos de proteína -anticuerpo mediante quimiluminiscencia intensificada (RPN2106 ECL, Amersham).

El efecto de radiosensibilización y de quimiosensibilización de moléculas DRIL en células 35 GMA32 fue evaluado mediante un ensayo de clonogenicidad (supervivencia clonal) . La figura 3.4 muestra que la radiosensibilización a irradiación de 4 Gy se observó en células GMA32 transfectadas o bien con moléculas DRIL 32 de doble cadena o bien DRIL32-PEG en horquilla. Además, se observó también quimiosensibilización para células GMA32 transfectadas con moléculas DRIL-32 de doble cadena o DRIL32-PEG en horquilla cuando fueron tratadas con inhibidores mitóticos (nocodazol 200 nM; 40 navelbina (vinorelbina) 100 nM o taxol (paclitaxel) 200 nM. Estos fármacos bloquean o bien la polimerización o bien la despolimerización de microtúbulos, y pueden inducir indirectamente rotura del DNA.

Para el ensayo de clonogenicidad, se prepararon diluciones en serie después de recuento de células para sembrar placas de Petri de 5 cm con cantidades diferentes de células. El número de células 45 varió desde 100-200 (células testigo) a 3000 (células transfectadas y/o tratadas). Diez días después, las células (que forman clones) fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (20 minutos) y coloreadas después con azul de metileno (15 minutos), y se puntuó el número de clones de cada placa (por triplicado).

Ejemplo 5: Radiosensibilización del tratamiento de tumores humanos xenotrasplantados en ratones desnudos 50

Se evaluó la actividad in vivo de moléculas DRIL en asociación con radioterapia utilizando ratones desnudos xenotrasplantados con tumores humanos mediante inyección subcutánea de líneas celulares resistentes a la radiación (células Hep2 derivadas de carcinoma de laringe) o fragmentos de tumor (obtenidos previamente por inyección subcutánea de las líneas de células U87 derivadas de glioblastoma). Las investigaciones fueron llevadas a cabo principalmente sobre los ratones trasplantados 55 con tumores humanos de laringe resistentes a la radiación, con objeto de establecer una prueba de concepto in vivo. La irradiación se llevó a cabo con rayos  procedentes de una fuente de 137Cesio con

protección adecuada de los ratones al objeto de realizar una irradiación localizada de los tumores. La condición típica del ensayo consiste en la inyección intratumoral de una preparación apropiada de 1 nmol de moléculas DRIL con agentes de transfección (dendrímero catiónico (Superefect, Qiagene), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Polyplus Transfection), polietilenimina (PEI, Polyplus Transfection) según las instrucciones del fabricante, 5 horas antes de irradiación. Se administró una dosis 5 total de 30 Gy en 4-5 semanas: i) 3x2 Gy/semana (aproximadamente una cada dos días); ii) 5 Gy/semana; iii) 15 Gy/2 semanas. El tamaño de los tumores se midió 2-3 veces por semana. Se usó tratamiento por irradiación e inyección intratumoral de medio MEM (la solución tampón de dilución de DRIL), como testigo del tratamiento de irradiación sin DRIL (MEM). El volumen del tumor se calculó (V = (a+b2)/2, en cuya fórmula a = longitud, b = anchura). La relación del volumen medido en el tiempo t con 10 respecto al volumen inicial (Vt/Vi) se utilizó como indicador de la progresión tumoral. Se efectuó un seguimiento de los ratones hasta 100 días. Se ensayaron por lo menos 4 series independientes de seis animales.

Los resultados están ilustrados en la figura 4 (panel A:: Serie sin tratar (n=38); Panel B: Serie testigo con 20 l de medio de cultivo (MEM) + 3x2 Gy de irradiación/semana (n=30); Panel C: la serie con 15 1 nmol (20 g) de DRIL 32-PEG + irradiación de 3x2 Gy/semana (n=35). Se administró MEM o DRIL32-PEG mediante inyección intratumoral 5 horas antes de irradiar. La dosis de irradiación dividida (2 Gy) se aplicó uno de cada dos días, tres veces por semana. El tratamiento duró 5 semanas, totalizando una irradiación de 30 Gy. Los puntos representan el curso del volumen del tumor con el tiempo, de cada ratón. Las líneas llenas son el mejor ajuste polinómico. El Panel D muestra una representación de Kaplan-Meyer 20 de todos los ratones en los que el aumento del volumen del tumor (Vt/Vi) < 5).

Se ha acumulado una cantidad importante de resultados sobre la serie de DRIL32-PEG con irradiación de 3x2 Gy/semana (panel C, n=35) que mostraron claramente radiosensibilización en comparación con las series testigo: sin tratar (panel A, n=38), MEM + 3x2 Gy (panel B, n=30). El ensayo estadístico de Man y Whitney dio el valor p=0,00067 para la serie de DRIL32-PEG + 3x2 Gy frente a MEM 25 + 3x2 Gy. La misma tendencia se observó en una representación de Kaplan-Meyer de ratones con un volumen tumoral (Vt/Vi < 5) menor que 5 veces el volumen inicial (panel D).

Investigaciones adicionales fueron llevadas a cabo en ratones con tumores humanos de laringe xenotrasplantados, con objeto de definir características moleculares de las moléculas DRIL y el protocolo óptimo de actividad in vivo. Los resultados obtenidos del grupo estudiado fueron consistentes con las 30 características moleculares de las moléculas DRIL, observados en estudios bioquímicos y estudios in vitro (véanse los ejemplos 2, 3 y 4). Además, se puso de manifiesto que:

1) el fraccionamiento de la irradiación, 3x2Gy por semana, dio la mejor radiosensibilización, en recuerdo con el protocolo clínico humano;

2) la radiosensibilización depende de la dosis: 1 nmol (20 g) de DRIL32-PEG > 0,3 nmol (6 g) 35 de DRIL32-PEG, sin efecto a 0,1 nmol (2 g) de DRIL32-PEG;

3) la radiosensibilización depende del tiempo de permanencia entre la inyección intratumoral de DRIL32-PEG y la radiación ionizante: 5 horas >> 1 hora;

4) las moléculas DRIL deben usarse con agentes de transfección (Superefect, DOGS o PEI) según las instrucciones del fabricante. 40

La tinción histológica de la sección transversal de los tumores y la formación de imágenes de resonancia magnética, revelaron la presencia de necrosis después del tratamiento combinado de moléculas DRIL asociado con radioterapia.

También se observó radiosensibilización en ratones trasplantados con tumores humanos glioblastomas. El glioblastoma es el máximo grado de tumores cerebrales, y se caracteriza por su 45 extraordinaria progresión agresiva con resultado fatal rápido y resistencia a radioterapia y quimioterapia. 2-3 millones de células U87 derivadas de un glioblastoma humano fueron inyectados primeramente por vía subcutánea en ratones desnudos, El tumor injertado fue extraído luego y utilizado para sembrar sucesivamente otros ratones desnudos por trasplante subcutáneo de aproximadamente 8 mm3 de tumor de glioblastoma. La Tabla 2 muestra los resultados de una serie piloto de tumores humanos de 50 glioblastoma xenotrasplantados en ratones desnudos. El 50% de los ratones de la serie que recibió DRIL32-PEG (1 nmol) por inyección intratumoral e irradiación (1x15 Gy/semana ó 3x5 Gy/semana, seguido de una semana de descanso, y después un segundo ciclo de tratamiento, la dosis total de radiación ionizante fue 30 Gy), tenían un volumen tumoral < 4 cm3 el día 25 después del comienzo del tratamiento, mientras que el 100% de los ratones tenían de las series testigos (sin tratar o irradiados e 55

inyectados con solución salina (PBS), tenían un volumen tumoral que sobrepasaba los 4 cm3 y fueron sacrificados antes del final del ensayo según la regulación actual sobre características éticas en animales, antes del fin del tratamiento.

Tabla 2 : Ensayo de radiosensibilización de glioblastoma humano xenotrasplantado en ratones desnudos por DRIL32-PEG (1 nmol/inyección intratumoral). Se utilizaron 2 protocolos de irradiación : 1x15 5 Gy/semana, ó 3x5 Gy/semana, seguido de una semana de descanso, y el segundo ciclo de irradiación. La dosis total de irradiación fue 30 Gy. Los grupos testigo fueron los grupos sin tratar o los que habían recibido una inyección de solución salina (PBS).

Grupos de ensayo Número de ratones en los que el

(Glioblastoma xenotrasplantado) volumen tumoral < 4 cm3 el día 25 10

(6 ratones por grupo)

Sin tratar 0 / 6

PBS + 1x15 Gy/semana 0 / 6

15

DRIL32-PEG + 1x15 Gy/semana 3 / 6

PBS + 3x5 Gy/semana 0 / 6

DRIL 32-PEG + 3x5 Gy/semana 3 / 6 20

En conclusión, la disminución importante de la progresión tumoral de dos tumores humanos radio-resistentes (de laringe y glioblastoma) xenotrasplantados en ratones desnudos, proporciona evidencia de que las moléculas DRIL pueden radiosensibilizar eficazmente el efecto de la radioterapia sobre estos tumores agresivos resistentes a las radiaciones. Por tanto, se ha conseguido in vivo , el

Ejemplo 6 : Quimiosensibilización del tratamiento de tumores digestivos inducidos en ratones 25 transgénicos K-RasV12G x Apc1638N

Se escogió un modelo de tumor murino endógeno para determinar la aptitud de las moléculas DRIL para sensibilizar la quimioterapia anticancerosa. Para este fin, se emplearon ratones transgénicos portadores de mutaciones K-RasV12G y Apc1638N. Estos ratones fueron obtenidos por cría de dos ratones transgénicos : uno que lleva el mutante K-RasV12G bajo el control del promotor villin del ratón (pVill/K-30 RasV12G) (Janssen et al., 2002) y el otro contiene la mutación Apc1638N en un alelo (Fodde et al., 1994) Los ratones transgénicos con las mutaciones pVill/K-RasV12G x Apc1638N desarrollaron tumores espontáneos en el tracto digestivo a la edad de aproximadamente 5 meses y murieron rápidamente.

Los ratones fueron tratados a la edad media de 12 semanas por una combinación de quimioterapia (5FU+CPT11) y de DRIL32-PEG frente a quimioterapia sola, según el protocolo indicado en 35 el panel A de la figura 5.1. El protocolo incluye tres ciclos de tratamiento. Cada uno de los ciclos consiste en la inyección intraperitoneal de 0,6 mg de 5FU y 0,6 mg de CPT11, junto con 0,1 mg de DRIL32-PEG por administración oral, tres veces por semana, seguido de una semana de descanso. El 5FU (5-fluorouracilo, Teva) se preparó en el seno de una solución de NaCl al 0,9%, a la concentración de 50 mg(ml. El CPT11/Irinotecán (Campo, Aventis) se preparó en el seno de una solución de NaCl al 0,9%, a la 40 concentración de 20 mg/ml. El estado de salud y la supervivencia de los ratones se verificaron hasta la muerte. No se observó indicación clínica de efecto tóxico adicional debido a las moléculas DRIL.

Los resultados se exponen en la figura 5.1. Panel A: Protocolo de tratamiento para tres grupos/series de los ratones transgénicos K-RasV12G x Apc1638N a la edad media de 12 semanas : el grupo testigo (sin tratar), el grupo tratado con 5FU+CPT11, el grupo tratado con 5FU+CPT11 y DRIL32-PEG. El 45 ensayo se realizó con tres ciclos de tratamiento. Cada ciclo consistió en la inyección intraperitoneal de 0,6 mg de 5FU u 0,6 mg de CPT11, junto con 0,1 mg de DRIL32-PEG por administración oral, tres veces por semana, seguido de una semana de descanso. El número de ratones involucrados en cada grupo se

indica entre paréntesis. El punto final es el tiempo de supervivencia; Panel B: Representación gráfica de Kaplan-Meyer de curvas de supervivencia de los tres grupos; Panel C: el tiempo medio de supervivencia de tres grupos como manifiesta el panel B.

A pesar del conjunto reducido, se apreció una mejoría importante del tiempo de supervivencia en la serie que había recibido la combinación de quimioterapia (5FU+11CPT) y DRIL32-PEG (supervivencia 5 media = 226 días, valor p = 0,2), en comparación con la sección de quimioterapia sola (173 días) y la sección testigo (175 días) (paneles B y C). Actualmente están en vías de realización ensayos adicionales para aumentar el conjunto de las series de 5FU+CPT11+DRIL32-PEG y 5FU+CPT11, con objeto de intensificar el significado estadístico.

Una serie de ratones se sacrificó dos semanas después del final del tratamiento (a la edad 10 media de 18 semanas) con objeto de evaluar el número medio de tumores por animal. Se examinó el intestino al microscopio y mediante examen histológico (tinción estándar mediante Hematoxilina-Eosina-Safrán).

Los resultados se indican en la figura 5.2. El número de animales de cada grupo se ha indicado entre paréntesis. Todos los ratones fueron sacrificados dos semanas (semana 18) después del protocolo 15 expuesto en el panel A de la figura 5.1. El número medio de la serie testigo (grupo sin tratar, n=101) es 30,8/animal.

Ambos exámenes pusieron de manifiesto consistentemente una disminución importante del número de tumores (>30%) en la serie que había recibido la combinación de 5FU+CPT11 y DRIL32-PEG (n = 8) en comparación con la serie que había recibido solamente quimioterapia (n = 7) (figura 5.2) 20 Merece la pena apreciar que el número medio de la serie testigo (grupo sin tratar, n = 101) es 30,8/animal.

Muestras de tumores preparadas partiendo de animales tratados con moléculas DRIL marcadas con fluoresceína (DRIL32-FITC) y 5FU-CPT11 fueron analizadas usando métodos de tinción de inmunofluorescencia. Los focos marcados H2AX fueron teñidos conjuntamente con moléculas DRIL fluorescentes, en reminiscencia del encuentro in vitro (véase, por ejemplo 3.3 y 4). La figura 6.3 muestra 25 un ensayo adicional en el que un ratón transgénico K-RasV12G x Apc1638N de 18 semanas de edad fue tratado consecutivamente por quimioterapia (5FU+CPT11) y DRIL32-FITC durante tres días y sacrificado dos horas después del último tratamiento, como indica el panel A. El intestino fue extraído y lavado con PBS. Después se tomaron muestras de los tejidos tumorales y se congelaron a –80ºC. Para su análisis se obtuvieron muestras histológicas de 5 m desde los tejidos tumorales congelados, por criostato. Los focos 30 de reparación del DNA fueron detectados por inmunofluorescencia con anticuerpo policlonal de conejo anti--H2AX (Trevigen) diluido 1/500 en PBS, y luego con anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con cianina 3 (Jackson) diluido 1/200 en PBS. Las muestras fueron sometidas a tinción de contraste por DAPI (Sigma). Las muestras fueron visualizadas mediante microscopio de epifluorescencia. Se encontró que la fluorescencia de DRIL-32-FITC estaba diseminada heterogéneamente en los tejidos tumorales (epitelio y 35 estroma entre estructuras glandulares) y tenía una localización preferente en el núcleo (figura 6.3, panel B, izquierda). Una distribución similar se encontró para los sitios de -H2AX (figura 6.3, panel B, derecha). Las señales de DRIL32-FITC y -H2AX situadas conjuntamente, fueron observadas casi al mismo tiempo.

En conclusión, la mejora de supervivencia y la disminución del número de tumores por animal, ponen de manifiesto, consistentemente, la evidencia de quimiosensibilización del tratamiento de tumores 40 digestivos en los ratones transgénicos que son portadores de las mutaciones K-RasV12G y Apc1638N, mediante moléculas DRIL (DRIL32-PEG). El análisis en profundidad de tejidos tumorales de animales tratados, proporciona evidencia de que las moléculas DRIL interfieren con el proceso de reparación del DNA.

Debe apuntarse que la administración oral de moléculas DRIL32-PEG no incluyó en este estudio 45 agente alguno de transfección.

En resumen, los resultados bioquímicos e in vitro obtenidos son claramente consistentes con un mecanismo de acción de las moléculas DRIL mediante interferencia con la reparación de DSB por la vía NHEJ, y la vía de transducción de señales de la reparación causada por daño directo o indirecto del DNA (radiación ionizante o agentes quimioterápicos). Debido a la naturaleza de la vía NHEJ (vía independiente 50 de la secuencia), no existe limitación sobre las secuencias ni sobre la longitud de las moléculas DRIL (Jackson, 2002; Barnes, 2001, Downs y Jackon, 2004). Estudios in vivo han confirmado una radiosensibilización y quimiosensibilización eficaz de tumores en el ratón mediante moléculas DRIL. Tomados en conjunto, todos los resultados obtenidos han proporcionado consistentemente pruebas de concepto del enfoque DNA Bait, y han caracterizado las características moleculares de las moléculas 55 DRIL.

Referencias

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES
2. 1.- Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para intensificar la sensibilidad tumoral a terapia anticancerosa que daña el DNA. 5
3. 2.- Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para tratar el cáncer en combinación con una terapia anticancerosa que daña el DNA.
4. 3.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, 10 que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para usar para tratar el cáncer en combinación con una terapia anticancerosa que daña el DNA.
5. 4.- El uso según la reivindicación 1 ó 2, o la molécula según la reivindicación 3, en la que dicha molécula es un fragmento de DNA. 15
6. 5.- El uso según la reivindicación 1, 2 ó 4, o la molécula según la reivindicación 3 ó 4, en la que dicha molécula es una molécula de ácido nucleico lineal o en forma de horquilla.
7. 6.- El uso o molécula según la reivindicación 5, en la que dicha molécula es una molécula de ácido nucleico en horquilla y en la que el lazo comprende ácido nucleico o grupos químicos.
8. 7.- El uso o molécula según la reivindicación 6, en la que el lazo es un engarce de 20 hexaetilenglicol o de tetradesoxitimidilato.
9. 8.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el extremo libre es romo o sobresale en 5’ ó 3’-
10. 9.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula inhibe in vitro la integración ilegítima de DNA exógeno intensificada por radiación 25
11. 10.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula es capaz de ser captada por una célula en el núcleo celular.
12. 11.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula comprende una estructura de fosfodiéster o una estructura de fosfodiéster modificada químicamente, u otra estructura con uno o varios grupos químicos. 30
13. 12.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha molécula comprende una estructura de 2’-desoxinucleótido y comprende, opcionalmente, uno o varios 2’-ribonucleótidos y/u otros nucleótidos modificados y/o nucleobases modificadas distintas de adenina, citosina, guanina y timina.
14. 13.- El uso o molécula según la reivindicación 11 ó 12, en la que dicha estructura comprende 35 metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforotioato, ácido morfolino nucleico, ácido nucleico fijado por un puente de 2’-O,4’-C metileno/etileno , ácido nucleico peptídico (PNA), o ligamientos inter-azúcares de alquilos de cadena corta o cicloalquilos, o ligamientos de longitud variable intra-azúcares, heterocíclicos o heteroátomicos de cadena corta.
15. 14.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende, 40 además, miméticos de azúcares tales como 2’-O-alquilribosa, 2’-O-alquil-C4’ ribosa ramificada, ciclobutilos u otros compuestos carbocíclicos o hexitol en lugar del grupo pentofuranosilo.
16. 15.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende uno o varios grupos químicos en el extremo de cada cadena o, al menos, en la cadena del extremo 3’.
17. 16.- El uso o molécula según la reivindicación 15, que comprende uno o varios fosforotioatos en 45 el extremo de cada cadena o, al menos, en la cadena del extremo 3’.
18. 17.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende, además, al menos un elemento incluido que estorba la replicación del DNA, la reparación del DNA, o el

    proceso de indicación de daño, estando incorporado dicho al menos un elemento en el centro o en el extremo de la molécula de doble cadena.
19. 18.- El uso o molécula según la reivindicación 17, que comprende:

    a) una cadena de polietilenglicol, preferiblemente una cadena de hexaetilenglicol o una cadena hidrocarbonada, opcionalmente interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos, por 5 ejemplo, oxígeno, azufre o nitrógeno, o grupos heteroatómicos o heterocíclicos, que comprenden uno o varios heteroátomos;

    b) una unidad que es un elemento de bloqueo ya que no es aceptable por DNA polimerasas o exonucleasas, tal como cualesquiera nucleótidos modificados en la posición 3’;

    c)un oligonucleótido nativo tal como Tn, cuando se utiliza en el lazo de un fragmento en 10 horquilla, preferiblemente un tetradesoxitimidilato (T4).
20. 19.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que dicha molécula se obtiene mediante síntesis química, semi-biosíntesis o biosíntesis.
21. 20.- El uso según la reivindicación 1 ó 2 o la molécula según la reivindicación 3, en la que dicha molécula está seleccionada entre 15

    DRIL32

    DRIL32-FITC, DRID32-Cy3, DRIL32-Bt

    en la que t es T marcada con fluoresceína para DRIL32-FITC, cianina-3 para DRIL32-Cy3 y biotina para DRIL32-Bt

    DRIL 64

    5

    y

    DRIL64-PEG

    en la que las letras en negrita son nucleótidos con estructura de fosforotioato, la línea llena simboliza engarce de hexaetilenglicol y T4 se refiere a tetradesoxitimidilato. 10
22. 21.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la terapia anticancerosa que daña el DNA está seleccionada entre radioterapia y quimioterapia.
23. 22.- El uso o molécula según la reivindicación 21, en la que la molécula ha de ser administrada varias horas antes que la radioterapia.
24. 23.- El uso o molécula según la reivindicación 21, en la que la molécula ha de ser administrada 15 junto con quimioterapia.
25. 24.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el cáncer es glioblastoma o cáncer de laringe.
26. 25.- El uso o molécula segín una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el cáncer es un tumor altamente resistente a radioterapia y quimioterapia. 20
27. 26.- El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la molécula ha de ser administrada mediante inyección intravenosa, intratumoral o subcutánea, o por vía oral.