JP6784601B2 - シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのないDSBの同定(GUIDE−Seq) - Google Patents
シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのないDSBの同定(GUIDE−Seq) Download PDFInfo
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Description
本出願は、2014/06/23に出願された、米国仮特許出願第62/015,911号明細書;2014/11/10に出願された、第62/077,844号明細書;2014/11/12に出願された、第62/078,923号明細書;および2014/12/5に出願された、第62/088,223号明細書の利益を主張する。前述のものの全内容は、参照により本明細書によって組み込まれている。
本発明は、National Institutes of Healthによって与えられた助成金第DP1GM105378号の下で、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
生細胞において改変ヌクレアーゼの切断部位の位置を同定するための、高感度なバイアスのないゲノムワイドな方法が提供される。
細胞内で外来性の改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが細胞のゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、かつ細胞がDSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含むゲノムDNAの一部を増幅するステップ、および
ゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ
を含み、それによって細胞のゲノムDNA内のDSBを検出する。
例えば切断によって、DNAを断片化すること、
細胞からの断片化されたゲノムDNAの末端をユニバーサルアダプターでライゲーションすること、
組み込まれたdsODNと相補的なプライマー(プライマーA)およびユニバーサルアダプターと相補的なプライマー(プライマーB)を用いて、ライゲーションされたDNAに対して1回目のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うこと、
次いで、プライマーAと相補的な3’ネステッドプライマー(プライマーC)、プライマーBと相補的な3’ネステッドプライマー(プライマーD)、およびプライマーDと相補的なプライマー(プライマーE)を使用して2回目のPCRを行うこと
を含む。一部の実施形態では、プライマーEは、
精製または結合配列、例えば、フローセル結合配列、および
同定配列、例えば、バーコードまたは無作為の分子インデックス
のうちの1つまたは複数を含む。
第1の細胞の集団内で外来性のCas9改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが細胞のゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、かつ細胞がDSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含む、第1の細胞の集団からのゲノムDNAの一部を増幅するステップ、および
第1の細胞の集団からのゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ、
dsODNが第1の細胞の集団のゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を決定するステップ、
第2の細胞の集団を第2のガイドRNAおよび二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)と接触させるステップであって、好ましくは、dsODNが15および75ntの間の長さ、例えば、15〜50nt、50〜75nt、30〜35nt、60〜65nt、または50〜65ntの長さであり、dsODNの両鎖が細胞のゲノムにオルソロガスであり、好ましくは、dsODNの5’末端がリン酸化されており、さらにまた好ましくは、2つのホスホロチオエート結合が両方の3’末端および両方の5’末端に存在する、ステップ、
第2の細胞の集団内で外来性のCas9改変ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼが第2の細胞の集団のゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、細胞がDSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含む、第2の細胞の集団からのゲノムDNAの一部を増幅するステップ、および
第2の細胞の集団からのゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ、
dsODNが第2の細胞の集団のゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を決定するステップ、
dsODNが第1の細胞の集団のゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を、dsODNが第2の細胞の集団のゲノムDNA内に組み込まれた部位の数と比較するステップ
を含み、より少ない(オフターゲット)部位で組み込まれたdsODNがより特異的である。該方法は、第3、第4、第5、第6、またはそれより多種の細胞の集団について繰り返されてもよい。「より少ない」オフターゲット部位とは、より少ない数のDSB部位および/または(1つまたは複数の)個別の部位におけるDSBの発生の頻度の低下の両方を含みうる。
本明細書に記載の方法において、天然に存在しないdsODNは、細胞内で発現される。本方法において、dsODNの両鎖は、細胞のゲノムにオルソロガスである(すなわち、細胞のゲノム内に存在しないまたは細胞のゲノム内に存在する配列に相補的である、すなわち、細胞のゲノム内に存在する配列に10%、20%、30%、40%、または50%以下の同一性を有する)。dsODNは、好ましくは15および75ntの間の長さ、例えば、15〜50nt、50〜75nt、30〜35nt、60〜65nt、もしくは50〜65ntの長さ、または15および50ntの間の長さ、例えば、20〜40もしくは30〜35、例えば、32〜34ntの長さでありうる。dsODNの各鎖は、固有のPCRプライミング配列を含んでいなければならない(すなわち、dsODNは、それぞれの鎖上に1つずつ、2つのPCRプライマー結合部位を含む)。一部の実施形態では、dsODNは、制限酵素認識部位、好ましくは、細胞のゲノムにおいて相対的にまれな部位を含む。
以下の4つの主なクラスの改変ヌクレアーゼがある:1)メガヌクレアーゼ、2)ジンクフィンガーヌクレアーゼ、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、および4)クラスター化された規則的な間隔の短鎖反復回文配列(CRISPR)Cas RNA誘導型ヌクレアーゼ(RGN)。例えば、Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。ヌクレアーゼは、当技術分野において知られている方法を使用して、細胞内で一過的にまたは安定に発現されてもよい;典型的には、発現を得るために、タンパク質をコードしている配列は、直接的な転写のためのプロモーターを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。好適な真核発現系は、当技術分野においてよく知られかつ、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th ed. 2013);Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (2006);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に、記載されている。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準的な技術(例えば、上記の参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい)によって行われる。
メガヌクレアーゼは、多様な生物、例えば、細菌、酵母、藻類および植物の細胞小器官などに由来している配列特異的エンドヌクレアーゼである。内在性メガヌクレアーゼは、12から30塩基対の認識部位を有する;18bpおよび24bpの長さのメガヌクレアーゼ認識部位を有するカスタマイズされたDNA結合部位が記載されており、いずれかが本方法およびコンストラクトにおいて使用されてもよい。例えば、Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (2011);Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006);Arnould et al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011);およびStoddard, Q. Rev. Biophys. 38, 49 (2005);Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18 (2010)を参照されたい。
近年の研究は、クラスター化された、規則的な間隔の、短鎖反復回文配列(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)システム(Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012);Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010);Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011))が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびに全生物、例えば、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどにおいてin vivoで、ゲノム編集を行うための簡単かつきわめて効率的な方法の基礎として役に立ちうることを実証している(Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013);Shen et al., Cell Res (2013);Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013);Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013);Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013);Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013);Cong et al., Science 339, 819-823 (2013);Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c);Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013);Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013))。化膿レンサ球菌(S. pyogenes)からのCas9ヌクレアーゼ(以下、簡単にCas9)は、17〜20ヌクレオチドの改変ガイドRNA(gRNA)(例えば、単一ガイドRNAまたはcrRNA/tracrRNA対)とプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)(例えば、PAMは配列NGGまたはNAGに合致している)の隣にある目的の標的ゲノムDNA配列の相補鎖との間の単純な塩基対相補性を介して誘導されうる(Shen et al., Cell Res (2013);Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013);Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013);Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013);Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013);Cong et al., Science 339, 819-823 (2013);Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c);Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013);Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012))。
キサントモナス属(Xanthomonas)の中の植物病原性細菌のTALエフェクターは、宿主DNAを結合することおよびエフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患において重要な役割を果たす、または防御を始動させる。特異性は、エフェクター可変数の、不完全な、典型的には約33〜35アミノ酸の反復に依存する。多型は、主にリピート部位12および13に存在し、これは、本明細書において反復可変二残基(RVD)と呼ばれる。TALエフェクターのRVDは、それらの標的部位においてヌクレオチドに、直接的、直線的な様式で、1つのRVDが1つのヌクレオチドに、一部は縮重で、かつ見かけ上の前後関係の依存性なく、対応する。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を付与する多型領域は、三残基またはトリプレットとして発現されうる。
ジンクフィンガータンパク質は、独立に折りたたまれた亜鉛を含むミニドメインである、1つまたは複数のジンクフィンガーを含むDNA結合タンパク質であり、その構造は、当技術分野においてよく知られており、かつ、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609;Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99;Lee et al., 1989, Science. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。DNAに結合したジンクフィンガータンパク質Zif268およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存された相互作用のパターンを示し、そこでは、典型的にはジンクフィンガーのアルファヘリックスからの3つのアミノ酸が、DNA内の3つの隣接した塩基対すなわち「サブサイト」と接触する(Pavletich et al., 1991, Science, 252:809;Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451)。したがって、Zif268の結晶構造により、ジンクフィンガーDNA結合ドメインが、ジンクフィンガーとDNA配列内の3塩基対「サブサイト」との間の1対1の相互作用を有するモジュールの様式で機能する可能性があることが示唆される。天然に存在するジンクフィンガー転写因子において、複数のジンクフィンガーは、典型的には、直列の配列内に一緒に結合されて、連続したDNA配列の配列特異的認識を達成する(Klug, 1993, Gene 135:83)。
本明細書に記載の方法は、ゲノムDNAにおいてDSBを修復する能力のあるいかなる細胞においても使用されうる。真核細胞における2つの主要なDSB修復経路は、相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)である。好ましくは、該方法は、NHEJの能力のある細胞において行われる。NHEJ活性を検出するための方法は、当技術分野において知られている;NHEJの標準経路および副経路の概要については、Liu et al., Nucleic Acids Res. Jun 1, 2014; 42(10):6106-6127を参照されたい。
本明細書中で使用される場合、「シークエンシング」は、核酸の配列を決定するいかなる方法をも含む。鎖終結(サンガー)シークエンシングおよび色素終結シークエンシングを含む、シークエンシングのいかなる方法も本方法において使用されうる。好ましい実施形態では、何千または何百万ものシークエンシング反応を並行に行うハイスループットシークエンシング技術である、次世代シークエンシング(NGS)が使用される。異なるNGSプラットフォームは異なるアッセイ化学を使用するが、これらはすべて、多数の鋳型上で同時に行われる多数のシークエンシング反応から配列データを生成する。典型的には、配列データは、スキャナーを使用して収集され、次いで、バイオインフォマティクス的に集結および解析される。したがって、シークエンシング反応は、並行に、実施、読み取り、集結、および解析される;例えば、米国特許第20140162897号明細書、ならびにVoelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009;およびMacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296 (2009)を参照されたい。NGS法には、鋳型増幅を必要とするものもあり、必要としないものもある。増幅を必要とする方法は、ピロシークエンシング(例えば、米国特許第6,210,89号明細書および第6,258,568号明細書を参照されたい;Rocheによって商品化されている);Solexa/Illuminaプラットフォーム(例えば、米国特許第6,833,246号明細書、第7,115,400号明細書、および第6,969,488号明細書を参照されたい);ならびに補助されたオリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出(SOLiD)プラットフォーム(Applied Biosystems;例えば、米国特許第5,912,148号明細書および第6,130,073号明細書を参照されたい)を含む。増幅を必要としない方法(例えば、一分子シークエンシング法)は、ナノポアシークエンシング、HeliScope(米国特許第第7,169,560号明細書;第7,282,337号明細書;第7,482,120号明細書;第7,501,245号明細書;第6,818,395号明細書;第6,911,345号明細書;および第7,501,245号明細書);合成によるリアルタイムシークエンシング(例えば、米国特許第7,329,492号明細書を参照されたい);ゼロモード導波路(ZMW)を使用した一分子リアルタイム(SMRT)DNAシークエンシング法;ならびに、米国特許第7,170,050号明細書;第7,302,146号明細書;第7,313,308号明細書;および第7,476,503号明細書に記載されているものを含む)、他の方法。例えば、米国特許出願公開第2013/0274147号明細書;米国特許出願公開第2014/0038831号明細書;Metzker, Nat Rev Genet 11(1): 31-46 (2010)を参照されたい。
実施例
以下の材料および方法がこの実施例において使用された。
U2OSおよびHEK293細胞は、10% FBS、2mM GlutaMax(Life Technologies)、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったAdvanced DMEM(Life Technologies)中で5%のCO2と共に37℃で培養した。U2OS細胞(プログラムDN−100)およびHEK293細胞(プログラムCM−137)は、Lonza Nucleofector 4−D上で製造業者の説明書に従って20μlの溶液SE中でトランスフェクトした。dsODN組み込み率は、NdeIを使用した制限断片長多型(RFLP)アッセイによって評価した。切断産物は、以前に記載されているように(Tsai et al., Nat. Biotechnol 32, 569-576 (2014))、Qiaxcelキャピラリー電気泳動機器(Qiagen)によって泳動および定量化した。
ゲノムDNAは、固相可逆固定法磁気ビーズ(Agencourt DNAdvance)を使用して単離し、Covaris S200超音波発生装置で500bpの平均長に切断し、末端修復し、Aテール付加し、8ntの無作為な分子インデックスを組み込んでいる半機能的アダプターにライゲーションした。標的濃縮のために、オリゴタグと相補的なプライマーでの、2ラウンドのネステッドアンカードPCRを使用した。例示的なGUIDE−Seqプロトコールの全詳細は、本明細書中で見出すことができる。
配列の最初の6つの同じ塩基ならびに同一の8ntの分子インデックスを共有する読みは、それらが同じ起源のプレPCR鋳型断片に由来するとみなされるので、一緒にビニングされる。これらの読みは、各部位において大多数の塩基を選択することによって単一のコンセンサスの読みに統合した。ノーコール(N)塩基は、10%より高い不一致の読みを有する状況で割り当てた。塩基クオリティスコアは、予め統合された読みの間で最も高くなるようにした。統合された読みは、BWA−MEM(Li and Durbin, Bioinformatics 26, 589-595 (2010))を使用してヒトゲノム参照(GrCh37)にマップした。
マッピングのクオリティ≧50を有する読みの開始マッピング部位を表にし、10bpのスライド式ウィンドウを使用して近くに開始マッピング部位を有する領域をグループ化した。組み込まれたdsODNを有するゲノムウィンドウは、以下の判定基準のうちの1つによって同定した:1)参照配列内の逆鎖に位置する2つ以上の固有の分子インデックス付加された読み、または2)フォワードおよびリバースプライマーによって増幅された2つ以上の固有の分子インデックス付加された読み。推定された切断点の両側の側方の25bpの参照配列を目的の標的部位に対してアライメントし、目的の標的配列から8つ以下のミスマッチを有するRGNオフターゲット部位を判定した。SNPおよびインデルは、これらの部位において、分子インデックスおよびSAMtoolsに基づいたカスタムビンコンセンサスバリアント判定アルゴリズムによって判定し、参照配列と異なったオフターゲット配列は、対応する細胞特異的な配列と置き換えた。
GUIDE−Seqで検出されたDSBのAMP検証のために、プライマーは、以前に記載されているように(Zheng, Z. et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nat Med 2014 Nov 10. doi: 10.1038/nm.3729 (2014))、推定された二本鎖切断点の側方の領域に設計し、8ntの分子インデックスを付加した。可能な場合には、本発明者らは、各DSBの側方に位置するように2つのプライマーを設計した。
平均クオリティスコア>30を有する読みは、GUIDE−Seqで推定されたDSB部位とオーバーラップした挿入、欠失、および組み込みについてPythonを使用して解析した。PCRまたはシークエンシングの誤りからのノイズが入るのを最小限にするために、1bpのインデルは、それらが予測されたDSB部位の1bp以内であった場合のみに含めた。組み込みおよびインデルの頻度は、統合された分子インデックス付加された読みに基づいて算出した。
転座、大きな欠失、および逆位は、スプリットBWA−MEMアライメントに基づいたカスタムアルゴリズムを使用して同定した。同一染色体上の50塩基以内の候補の融合切断点は、Cas9切断部位の周囲の潜在的な切断を含むようにグループ化した。融合事象は、独自にマップされた少なくとも3つのスプリットの読みで判定し、パラメーターもsegemehlツールにより使用した(Hoffmann, Genome biology, 2014))。マッピングストランデッドネスは、2つの関与しているDSBの間の相互融合の同定のため、および欠失または逆位を決定するために維持した。1kbの染色体部位内にDSBを含む融合は、単一のCas9切断によって引き起こされる大きなインデルが考えられるために無効とした。残りの融合DSBは、以下の4つのカテゴリーに分類した:GUIDE−seqに基づく「オンターゲット」、「オフターゲット」もしくは「バックグラウンド」、または他に「その他」。
本発明者らは、MIT CRISPR Design Toolを使用して、10種すべてのRGNについての潜在的なオフターゲット部位を同定した。このツールは、それぞれの潜在的なオフターゲット部位に、対応する百分位数を定める。本発明者らは、次いで、これらの百分位数を可視化目的で五分位群にグループ化した。E−CRISPツールはオフターゲットをランク付けしないので、本発明者らは、単純に、E−CRISPによって正確に予測されたGUIDE−seqオフターゲットを見つけた。これらのGUIDE−Seq対コンピュータ上での予測の両方について、本発明者らは、さらに、コンピュータ上での方法によって予測されなかったGUIDE−Seq結果を、MITツール(最大4つ)およびECRISPR(最大3つ)の範囲内のミスマッチ数を有するオフターゲット、ならびにこれらの予測ツールの閾値を超えるミスマッチ数を有するものに分割した。ChIP−Seq予測とのGUIDE−Seqオフターゲットの比較において、同じ技術を使用し、ChIP−Seqによって正確に予測されたGUIDE−Seqオフターゲットを見つけた。これらの比較のそれぞれについて、なされたすべてのグループ化は、オフターゲットミスマッチ数によって再分割し、正しくおよび誤って予測されたRGNオフターゲットの特性をより良好に特徴付けした。
本発明者らは、推定される切断率に適合した線形回帰モデルを使用して、4つ以下のミスマッチを有する潜在的なオフターゲット部位において特異性に対する、ミスマッチ部位、ミスマッチ型およびDNAアクセシビリティの影響を評価した。ミスマッチ部位の共変動は、PAMの上流のオーバーラップしていない5つの4bpのウィンドウのそれぞれの中のミスマッチされた塩基の数として定義した。ミスマッチ型の共変動は、i)(標的TがCによって置き換えられ、標的GがAによって置き換えられた)ゆらぎ対形成を結果として生じるミスマッチの数、ii)(標的CがTによって置き換えられ、標的AがGによって置き換えられた)非ゆらぎプリン−ピリミジン塩基対形成を結果として生じるミスマッチの数、およびiii)プリン−プリンまたはピリミジン−ピリミジン対形成を結果として生じるミスマッチとしての数と定義した。
室温で保存
品目 販売会社
Covaris S220マイクロチューブ、 Covaris
エタノール、200プルーフ(100%) Sigma Aldrich
MicroAmp Optical 96ウェルプレート Applied Biosystems
ヌクレアーゼ非含有H2O Promega
Qubitアッセイチューブ、500チューブ/パック Invitrogen
Qubit dsDNA BRキット−500アッセイ Invitrogen
TMACバッファー、5M Sigma Aldrich
− 塩化テトラメチルアンモニウム
1×TEバッファー/10mM トリス−HCl、pH8.0 Invitrogen
UltraPure 0.5M EDTA、pH8.0(Gibco)(4×100mL) Life Technologies
品目 販売会社
Agencourt AMPure XPビーズ − 60mL Beckman Coulter
品目 カタログ#
25mM dNTP溶液ミックス Enzymatics,Inc.
Slowライゲーションバッファー Enzymatics,Inc.
末端修復ミックス(低濃度) Enzymatics,Inc.
T4 DNAリガーゼ Enzymatics,Inc.
− 10× T4 DNAリガーゼバッファー(Slowライゲーションバッファー)
Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ Life Technologies
− 10× PCRバッファー(MgCl2なし)
− 50mM MgCl2
qPCR Illuminaライブラリー定量化キット KAPA Biosystems,Inc.
96ウェルプレート磁気スタンド Invitrogen
Qubit蛍光光度計2.0 Life Technologies
Covaris S−2 Focused Ultra−sonicator(商標)機器 Covaris
卓上遠心分離機 Thermo Scientific
卓上ボルテクサー Thermo Scientific
サーモサイクラー Eppendorf
Miseq Illumina
Yアダプター調製
Yアダプターは、Miseq共通オリゴを試料バーコードアダプター(A01からA16、表3を参照されたい)のそれぞれとアニールすることによって作製される。アダプターは、8merのNNWNNWNN(N=A、C、T、またはG;W=AまたはT)分子インデックスも含む。
1×TEバッファー 80.0μL
A##(100μM) 10.0μL
MiSeq Common Adapter_MI(100μM) 10.0μL
合計 100.0μL
アニーリングプログラム:95℃1秒間;60℃1秒間;4℃まで緩徐な傾斜の低下(約−2℃/分);4℃で維持する。−20℃で保存する。
1. dsDNAは、Qubitによって定量化され、1×TEバッファーを使用して400ngが120ulの最終容量にされる。
2. 各試料は、Covaris S2のための標準操作プロトコールに従って500bpの平均長に切断される。
3. 120ulのAMPure XP SPRIビーズ(1×比率)での精製は、製造業者のプロトコールに従って行い、15ulの1×TEバッファー中に溶出される。
末端修復
4. 200μLのPCRチューブまたは96プレート中のウェルに、以下を(反応ごとに)添加する:
ヌクレアーゼ非含有H2O 0.5μL
dNTPミックス、5mM 1.0μL
SLOWライゲーションバッファー、10× 2.5μL
末端修復ミックス(低濃度) 2.0μL
Taqポリメラーゼ用のバッファー、10×(Mg2+なし) 2.0μL
Taqポリメラーゼ(非ホットスタート) 0.5μL
合計 8.5μL
+(前のステップからの)DNA試料 14.0μL
合計 22.5μL
末端修復サーモサイクラープログラム:12℃15分間、37℃15分間;72℃15分間;4℃で維持する
5. 試料反応チューブまたはウェルに、以下の試薬を順番に添加する(ピペッティングによって混合する):
アニールされたY adapter_MI(10μM) 1.0μL
T4 DNAリガーゼ 2.0μL
+(前のステップからの)DNA試料 22.5μL
合計 25.5μl
アダプターライゲーションサーモサイクラープログラム:16℃30分間、22℃30分間、4℃で維持する
6. 0.9× SPRI clean(22.95ul Ampure XPビーズ)、12uLの1×TEバッファー中に溶出
PCR1(オリゴタグプライマー[発見]または大規模なプライマープール[ディープシークエンシング検証])
7. 以下のマスターミックスを調製する:
ヌクレアーゼ非含有H2O 11.9μL
Taqポリメラーゼ用のバッファー、10×(MgCl2なし) 3.0μL
dNTPミックス、10mM 0.6μL
MgCl2、50mM 1.2μL
Platinum Taqポリメラーゼ、5U/μl 0.3μL
GSP1プライマー(10uM)/プライマープール(*) 1.0μL*
TMAC(0.5M) 1.5μL
P5_1、10μM 0.5μL
合計 20.0μL
+(ステップ6からの)DNA試料 10.0μL
合計 30.0μL
*発見用には、+/(センス)および−/(アンチセンス)反応について別々のマスターミックスを作製して、別々のPCR反応を行う。
*ディープシークエンシング検証用には、1種のマスターミックスが作製されうる。プライマープールは、30ulの反応物中に30pmolの総量に標準化されるべきである。
発見サーモサイクラープログラム(タッチダウン):
95℃5分間、
15サイクルの[95℃30秒間、70℃(−1℃/サイクル)2分間、72℃30秒間]、
10サイクルの[95℃30秒間、55℃1分間、72℃30秒間]、
72℃5分間、
4℃維持
検証サーモサイクラープログラム:
95℃5分間、
14サイクルの[95℃30秒間、20%の傾斜で65℃まで下げる、65℃5分間]、
72℃5分間、
4℃維持
8. 1.2× SPRI clean(36.0uL)、15ulの1×TEバッファー中に溶出
9. 以下のマスターミックスを調製する:
ヌクレアーゼ非含有H2O 5.4μL
Taqポリメラーゼ用のバッファー、10×(Mg2+なし) 3.0μL
dNTPミックス、10mM 0.6μL
MgCl2、50mM 1.2μL
Platinum Taqポリメラーゼ、5U/μL 0.3μL
GSP2プライマー(10uM)/プライマープール(*) 1.0μL
TMAC(0.5M) 1.5μL
P5_2、10μM 0.5μL
合計 13.5μL
+P7_#(10uM)* 1.5μL
+(ステップ8からの)ビーズ付きのDNA試料 15.0μL
合計 30.0μL
プライマー濃度は、PCR1に記載の詳細に従うべきである
*P7_#では、Illuminaシークエンサー上での良好な画像記録のために、1つのシークエンシング泳動において少なくとも4種は使用されるべきである(例えば、P701〜P704またはP705〜P708)
発見サーモサイクラープログラム(タッチダウン):
PCR1用と同じ
検証サーモサイクラープログラム:
PCR1用と同じ
10. 0.7× SPRI clean(21.0uL)、30uLの1×TEバッファー中に溶出
qPCR定量化
11. 製造業者の説明書に従って、Illuminaライブラリー定量化キット用のKapa Biosystemsキットを使用してライブラリーを定量化する。
12. 各試料についてqPCR操作によって得られる1uLあたりの分子の数の平均量推定値を使用して、全セットのライブラリーを1.2×10^10分子に標準化することを行ない、シークエンシング用に一緒にプールされるライブラリーの数によって分割する。これは、各試料についての分子によるインプット、およびさらに、各試料についての容量によるインプットを与えることになる。
プーリング後、Vacufugeでライブラリーをシークエンシング用に10uLの最終容量までSpeedvac(乾燥減量)する。
ライブラリーを変性させ、Illumina Miseq試薬キットV2−300サイクル(2×150bp対末端)でのシークエンシングのために、以下を除き、Illumina標準プロトコールに従ってMiseq上にロードする:
1)3ulの100μMのカスタムシークエンシングプライマーIndex 1をMiseq試薬カートリッジ部位13に添加する(Indexプライマーミックス)。3ulの100μMのカスタムシークエンシングプライマーRead 2をMiseq試薬カートリッジ部位14に添加する(Read 2プライマーミックス)。
2)対末端Nexteraシークエンシングプロトコールで以下の数のサイクル「151|8|16|151」でシークエンスする。
下流のバイオインフォマティクス解析のために関連する管路に対してbclまたはfastqフォーマットのいずれかでシークエンシングデータを出す。
例示的なGUIDE−Seq法の概要
一部の実施形態では、GUIDE−Seqは、2つのステージからなる(図5B):ステージIでは、ヒト生細胞のゲノム内のDSBが、これらの切断における平滑末端二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)の組み込みによってタグ付けされる。ステージIIでは、バイアスのない増幅および次世代シークエンシングを使用して、ゲノムDNA内のdsODN組み込み部位がヌクレオチドレベルで正確にマップされる。
本発明者らは、U2OSまたはHEK293ヒト細胞系のいずれかにおいて、Cas9、および多様な内在性ヒト遺伝子を標的とする異なる10種のgRNAでGUIDE−Seqを行った(表1)。dsODN組み込み部位を解析すること(方法)によって、本発明者らは、ヌクレオチドレベルまでマップされた、10種のRGNのそれぞれによって誘発されたDSBの正確なゲノム部位を同定することができた(図5D)。これらのゲノムウィンドウのうちの>80%については、本発明者らは、オンターゲット部位であるまたはそれに関連するいずれかの重複標的配列を同定することができた(方法)。興味深いことに、各RGNについて本発明者らが同定したオフターゲット部位の総数は広範に変化し、ゼロから>150までの範囲に及び(図5E)、いずれの特定のRGNについても望ましくない切断のゲノムワイドな程度が極端に多くまたは少なくなりうることが示された。本発明者らは、(1から6つのミスマッチを有するゲノム部位の総数によって測定されるような)ヒトゲノムに対するgRNAプロトスペーサー配列の直交性と、GUIDE−Seqによって本発明者らが観察したオフターゲット部位の総数との間にいかなる明らかな相関も観察しなかった(図5F)。オフターゲット配列は、ゲノムの全体にわたって分散して見出され(図5Ggおよび図13A〜J)、エクソン、イントロン、および非コード遺伝子間領域において減少する(図5H)。本発明者らが同定したオフターゲット配列の中に含まれていたのは、すべてRGNのうちの4種についての既知の真正のオフターゲット部位4、5であった(図6A〜J)。さらに重要なことには、GUIDE−Seqは、ヒトゲノムの全体にわたって位置する、多数の新しい、これまでに知られていないオフターゲット部位を同定した(図5E、5G、6A〜Jおよび13A〜J)。
10種すべてのRGNについてのGUIDE−Seqによって本発明者らが同定したオフターゲット部位の視覚的検査により、RGNがそこで切断可能なバリアント配列の多様性が強調される。これらの部位は、プロトスペーサー配列内の6つものミスマッチ(最大7つのミスマッチを有する部位のin vitroの切断を示している以前の報告6と一致する)、非標準PAM(以前に記載されているNAGおよびNGA配列5、23だけでなく、新規なNAA、NGT、NGC、およびNCG配列も)、およびgRNA/プロトスペーサー境界面での1bpの「バルジ」型ミスマッチ24を有しうる(図6A〜J)。プロトスペーサーミスマッチは、標的部位の5’末端に生じる傾向にあるが、特定の3’末端部位でも見出されることがあり、部位に基づいてミスマッチ作用を予測するための簡単な法則はないという考えが支持される4。興味深いことに、一部のオフターゲット部位は、実際に、それらの適合したオンターゲット部位よりも高いシークエンシング読み数を有し(図6A〜D、6J)、オフターゲット変異頻度は、特定の場合において、目的のオンターゲット部位でのものよりも高くなりうるという本発明者らの以前の知見4と一致している。特に、RGNのうちの4種についての既知のオフターゲット部位の多くは、高い読み数を有し(図6A〜D)、以前の解析は、最も効率良く切断される部位を主に同定していたことが示唆される。
GUIDE−Seqの効力が確立されたので、本発明者らは、次に、オフターゲット変異部位を予測するための以下の2つの普及している既存のコンピュータの方法との本発明者らの新しい方法の直接的な比較を行った:MIT CRISPR Design Tool25(crispr.mit.edu)およびE−CRISPプログラム26(www.e−crisp.org/E−CRISP/)。これらの両方のプログラムは、ミスマッチ数および部位についての特定の「法則」に基づいて潜在的なオフターゲット部位を同定することを試みるものであり、これまでの刊行物においてオフターゲット部位を同定するために使用されてきた。GUIDE−Seqによって本発明者らが特徴付けした10種のRGNを使用した本発明者らの比較において、本発明者らは、両方のプログラムが、実験的に検証されたオフターゲット部位のきわめて大多数を同定できなかったことを見出した(図9A〜B)。これらの部位の多くは、E−CRISPおよびMITプログラムが、単に、それぞれ3つおよび4つを超えるミスマッチを有するオフターゲットを考慮しないので見落とされた(図9C〜D)。考慮された配列の中でも、これらのプログラムは、依然として真正のオフターゲット部位の大多数を同定することができず(図9C〜D)、切断が生じることになるまたは生じないことになるか否かを決定する因子を説明するためのこれらの現在限られた能力を強調している。MITプログラムによって割り当てられたランク付けスコアは、それが正確に同定する部位の中でいくらかの予測的能力を有するが、特に、見落とされた部位が、わずか1つのミスマッチを有するものを含むことは留意すべきことである(図9C〜D)。最後に、両方のプログラムが、GUIDE−Seqによって同定されない多くの「偽陽性」部位を出すことに留意することは重要である(図9A〜B)。本発明者らは、MITおよびE−CRISPの両方が、真正のRGNオフターゲット部位の同定において本発明者らのGUIDE−Seq法よりも実質的に低い有効性で機能すると結論する。
本発明者らは、RGNオフターゲット部位の同定について、GUIDE−Seqを、以前に記載されているChIP−Seq法と直接に比較することも探求した。本発明者らがGUIDE−Seqによって評価したRGNのうちの4つは、オフターゲット結合部位の大規模なセットの同定につながった、触媒的に不活性なCas9(dCas9)でのChIP−Seq実験において以前に特徴付けされていたgRNA18を使用した。直接的な比較により、GUIDE−Seqによって同定されたCas9オフターゲット切断部位と、ChIP−Seqによって同定されたdCas9オフターゲット結合部位との間できわめて少ない重複しか示されない;4種のgRNAについて本発明者らが同定した、RGNで誘発された149個のオフターゲット切断部位の中で3つだけが、以前に公表された同じgRNAを使用したdCas9 ChIP−Seq実験によって以前に同定されているものであった(図9E)。この重複の欠如は、dCas9オフターゲット結合部位がCas9オフターゲット切断部位とは基本的に異なるからである可能性が高く、本発明者らのデータによって支持される仮説は、GUIDE−Seqによって同定されたこれらの4種のgRNAについてのCas9オフターゲット切断部位が、ChIP−Seq(図9F)および、きわめて少ないdCas9結合部位が活性Cas9の存在下でインデルの証拠を示すことを示している、以前の研究の結果16〜19によって同定されたそれらの結合部位よりも平均ではるかに少ないミスマッチを有することを示している。GUIDE−Seqは、ChIP−Seqによって以前に同定された4つのオフターゲット部位を同定することができず、かつ次いで、Cas9による変異生成の標的であることが示されたが、本発明者らは、これは、それらの部位がその以前の研究18において真正のオフターゲット切断部位として誤って同定されたからであると考えている。その研究からのシークエンシングデータの注意深い解析により、それらの部位において見出されたインデル変異のきわめて大多数は、RGN切断活性によってではなく、PCRまたはシークエンシングの誤りによって代わりに生じた可能性が高いことが示唆される(図15A〜D)。まとめると、これらの発見により、GUIDE−Seqが、真正のオフターゲット切断部位の同定についてChIP−Seqよりも実質的に優れていることが実証され、ChIP−Seqによって発見された(たとえあるとしても)きわめて少ないdCas9オフターゲット結合部位が実際のCas9オフターゲット切断部位を表すという考えについての実験的支持が得られる。
本発明者らのGUIDE−Seq実験は、本発明者らの研究のために使用されたU2OSおよびHEK293細胞における合計30個の固有のRGN非依存性DSBホットスポットの存在も予想外に明らかにした(表2)。本発明者らは、RGNをコードしているプラスミドなしでdsODNのみをトランスフェクトしたU2OSおよびHEK293細胞での対照実験からのゲノムDNAを解析するときには、これらの部位を明らかにした(方法)。特異的な塩基対部位に正確に位置するRGNで誘発されたDSBとは対照的に、RGN非依存性DSBは、それらが生じるそれぞれの座位においてより広く分散したdsODN組み込みパターンを有する(方法)。これらの30個の切断点ホットスポットは、多くの染色体にわたって分布していて、セントロメアもしくはテロメア領域にまたはその近くに存在するように見えた(図10F)。興味深いことに、少数のこれらのDSB(2つ)のみが両方の細胞系に共通であって、大多数は細胞系特異的であるようであった(U2OSにおける25つおよびHEK293細胞における7つ;図10Fおよび表2)。知る限りでは、GUIDE−Seqは、ヒト生細胞において、直接的でかつバイアスのない、切断点ホットスポットの同定を、それらの存在を明らかにするために潜在的に有毒な薬剤(例えば、アフィジコリンなどのDNA複製阻害剤)を必要とすることなく、可能にする最初の方法である。
RGNで誘発されたDSBおよびRGN非依存性DSBにおけるインデルを同定するために設計された本発明者らの次世代シークエンシング実験の結果を解析する過程において、本発明者らは、これらの切断の一部が、転座、逆位および大きな欠失に関与しうることも発見した。使用されたAMP法により、本発明者らがこれらの大規模なゲノムの変化を観察することが可能となった。これは、調査される各DSB部位について、この方法では、1対の隣接座位特異的なプライマーではなく、ただ1つの固定された末端にアンカーされる、座位特異的なネステッドプライマーのみが使用されるからである(図10A)。したがって、AMPに基づいたシークエンシングは、DSBにおいてインデル変異が生じているかどうかを同定するだけでなく、DSBが別の配列に結合されているかどうかも検出することができる。
本発明者らのグループによる以前の研究は、全長gRNAs27によって指向されるRGNの既知のオフターゲット部位におけるトランケートされた17または18ntの相補性領域を有するgRNAの使用により、変異頻度が低下されうることを示している27。しかし、この解析は少数の既知のオフターゲット部位に限定されていたので、これらのトランケートされたgRNA(tru−gRNA)のゲノムワイドな特異性は、本発明者らの以前の実験では不明確なままであった。本発明者らは、3種のtru−gRNAによって指向されるRGNのゲノムワイドなDSBプロファイルを得るためにGUIDE−Seqを使用したが、そのそれぞれは、本発明者らが上記でアッセイした10種の全長gRNAのうちの1つのより短いバージョンである。
GUIDE−Seqは、RGNで誘発されたDSBを検出するための、バイアスのない、高感度、かつゲノムワイドな方法を可能にする。該方法は、オフターゲット部位の性質についての仮説をたてること(例えば、オフターゲット部位が配列においてオンターゲット部位に密接に関連すると推定すること)なくDSBを検出するのでバイアスがない。GUIDE−Seqは、エクソン、イントロン、および遺伝子間領域内を含む、オフターゲット部位をゲノムワイドに同定し、最大6つのプロトスペーサーミスマッチおよび/または、以前の研究5、23に記載されている代替のNAGおよびNGA配列以外の、新しいミスマッチのPAM部位を有していた。この実施例において本発明者らが調査したRGNでは、GUIDE−Seqにより、すべての既知のオフターゲット部位の同定が成功しただけでなく、何百もの新しい部位も同様に明らかにされた。
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Claims (15)
- 細胞のゲノムDNA(gDNA)内の二本鎖切断(DSB)を検出するための方法であって、
前記細胞を平滑末端の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)と接触させるステップであって、前記dsODNの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記dsODNの5’末端がリン酸化されており、さらに(a)ホスホロチオエート結合が両方の3’末端に存在するか、または(b)2つのホスホロチオエート結合が両方の3’末端および両方の5’末端に存在する、ステップ、
前記細胞内で外来性の改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前記細胞の前記ゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記DSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含むゲノムDNAの一部を増幅するステップ、並びに
前記ゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ
を含み、それによって前記細胞の前記ゲノムDNA内のDSBを検出する、方法。 - ゲノムDNAの一部を増幅するステップが、
前記DNAを断片化すること、
前記細胞からの断片化されたゲノムDNAの末端をユニバーサルアダプターでライゲーションすること、および
ライゲーションされたDNAに対してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うこと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記改変ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化された規則的な間隔の短鎖反復回文配列(CRISPR)/Cas RNA誘導型ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas RGN)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記DSBがオフターゲットDSBである、請求項1または2に記載の方法。
- 複数のガイドRNAのうちのいずれが最も特異的であるか、すなわち、最も少ないオフターゲットDSBを誘発するかを決定する方法であって、
第1の細胞の集団を第1のガイドRNAおよび平滑末端の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)と接触させるステップであって、前記dsODNの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記dsODNの5’末端がリン酸化されており、さらに(a)ホスホロチオエート結合が両方の3’末端に存在するか、または(b)2つのホスホロチオエート結合が両方の3’末端および両方の5’末端に存在する、ステップ、
前記第1の細胞の集団内で外来性のCas9改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前記細胞のゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記DSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含む、前記第1の細胞の集団からのゲノムDNAの一部を増幅するステップ、および
前記第1の細胞の集団からの前記ゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ、
前記dsODNが前記第1の細胞の集団の前記ゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を決定するステップ、
第2の細胞の集団を第2のガイドRNAおよび平滑末端の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(dsODN)と接触させるステップであって、前記dsODNの両鎖が前記細胞のゲノムにオルソゴナルであり、前記dsODNの5’末端がリン酸化されており、さらに(a)ホスホロチオエート結合が両方の3’末端に存在するか、または(b)2つのホスホロチオエート結合が両方の3’末端および両方の5’末端に存在する、ステップ、
前記第2の細胞の集団内で外来性のCas9改変ヌクレアーゼを、前記ヌクレアーゼが前記第2の細胞の集団のゲノムDNA内にDSBを誘発するのに十分な時間、かつ前記細胞が前記DSBを修復して、1つまたは複数のDSBにおいてdsODNを組み込むのに十分な時間、発現または活性化させるステップ、
組み込まれたdsODNを含む、前記第2の細胞の集団からのゲノムDNAの一部を増幅するステップ、および
前記第2の細胞の集団からの前記ゲノムDNAの増幅された部分をシークエンスするステップ、
前記dsODNが前記第2の細胞の集団の前記ゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を決定するステップ、
前記dsODNが前記第1の細胞の集団の前記ゲノムDNA内に組み込まれた部位の数を、前記dsODNが前記第2の細胞の集団の前記ゲノムDNA内に組み込まれた部位の数と比較するステップ
を含み、より少ない(オフターゲット)部位で組み込まれた前記dsODNがより特異的である、方法。 - 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記改変ヌクレアーゼがCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、前記Cas9ヌクレアーゼを前記ゲノム内の標的配列に導くガイドRNAを前記細胞内で発現させるステップも含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記dsODNが30〜35ntの長さである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記dsODNがビオチン化される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記gDNAを断片に切断するステップ、および
dsODNを含む断片を前記ビオチンへの結合によって単離するステップ
を含む、請求項9に記載の方法。 - 前記dsODNが、無作為化されたDNAバーコードを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法であって、
前記gDNAを断片に切断するステップ、および
前記断片を、末端修復、aテーリング、および単一テールのシークエンシングアダプターのライゲーションによってシークエンシング用に調製するステップ
を含む方法。 - 前記dsODNが15〜50ntの間の長さである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記dsODNが50〜75ntの間の長さである、請求項1〜12いずれか1項に記載の方法。
- 前記dsODNが60〜65ntの間の長さである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
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