CN112501165A - 一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法 - Google Patents

一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法 Download PDF

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CN112501165A CN202011263898.3A CN202011263898A CN112501165A CN 112501165 A CN112501165 A CN 112501165A CN 202011263898 A CN202011263898 A CN 202011263898A CN 112501165 A CN112501165 A CN 112501165A
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Abstract

一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE‑pro库的方法，它涉及基因工程领域，本发明的目的是为了提高GUIDE‑seq检测CRISPR脱靶效应的敏感性和特异性，本发明基于链霉亲和素‑生物素系统，开发出GUIDE‑pro，并提供一种准确的可批量进行体内脱靶检测及sgRNA筛选的方法，即一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE‑pro库的方法。本发明的方法敏感性高，脱靶检测更全面；特异性高，假阳性率降低。本发明应用于CRISPR脱靶效应检测领域。

Description

一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法。
背景技术
在基因治疗、药物发现、靶向基因调控、表观遗传调控、染色质操纵和活细胞染色质成像等广泛领域，CRISPR已被证明是一种高度通用的基因编辑工具，具有巨大的潜力。然而，CRISPR技术的准确性和可靠性受到识别和切割近认知DNA序列到目标位点所造成的脱靶效应的严重阻碍。因此，在给定目标位点的各种候选物中鉴定最佳的gRNA，以及潜在的脱靶位点的定位对于保持安全有效的CRISPR扩增是非常重要的。但是，如何快速筛选最佳的gRNA并敏感地检测所有潜在的脱靶仍然是一个巨大的挑战。
GUIDE-seq是一种在全基因组水平无偏倚性检测CRISPR脱靶效应的方法。它依赖于非同源末端连接(NHEJ)介导的外源供应的双链寡脱氧核苷酸(dsODNs)与CRISPR/Cas产生的DNA双链断裂(DSBs)的整合。因此，GUIDE-seq的敏感性和特异性受dsODN整合效率的影响。而dsODN的整合效率进一步受到DSB类型(钝性末端或粘性末端)、DSB 序列上下游序列以及DNA修复过程中DSB附近的dsODN浓度浓度的影响。并且，由真核细胞有丝分裂过程会产生DNA损伤进而产生背景DSB，这些非DSB切割产生的背景 DSB同样有机会整合dsODN。而这些背景DSB整合了dsODN的位点将被GUIDE-seq检测到，但是是非CRISPR切割产生的假阳性脱靶位点。另一方面，有一些脱靶位点的发生频率很低，低于检测的阈值，即使有dsODN的整合，也同样不会被GUIDE-seq检测到。而上述的这些情况会削弱GUIDE-seq的敏感性和特异性。
因此，优化GUIDE-seq实现全面准确的脱靶检测势在必行。已发表文章iGUIDE对GUIDE-seq进行改进。它应用较长的dsODN(46nt VS.34nt)来减少非特异性扩增，以提高GUIDE-seq的特异性。然而，iGUIDE也依赖于dsODN整合效率，仍然面临上述问题。因此亟需开发新的方法来提高脱靶检测的敏感性及特异性。
发明内容
本发明的目的是为了提高GUIDE-seq检测CRISPR脱靶效应的敏感性和特异性，本发明基于链霉亲和素-生物素系统，开发出GUIDE-pro，并提供一种准确的可批量进行体内脱靶检测及sgRNA筛选的方法，即一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法。
本发明的一种生物素化的dsODN，所述的生物素化的dsODN序列如下：
5’-G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T-3’；
5’-A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C-3’。
本发明采用生物素化的dsODN，利用GUIDE-pro建库用引物序列如下：
P701
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGG GCAGTCGGTGA；
P702
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；
P703
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTCCTCTCTATGG GCAGTCGGTGA；
P704
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；
P705
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；
P706
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；
P707
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；
P708
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGG GCAGTCGGTGA；
P5_1AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA；
P5_2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；
A01
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A02
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A03
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A04
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGANNWNNWNNACACTTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A05
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A06
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A07
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A08
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A09
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACATTGTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A10
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGATGGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A11
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTACCTAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A12
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAGAGCTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T。
本发明的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，它是按照以下步骤进行的：
步骤一、细胞转染
培养HEK293细胞，将含有5ug的SpCas9-MSA/sgRNA质粒和5uL、100uM退火的生物素化的dsODN电转至HEK293细胞，转染3天后收细胞提取基因组DNA；
步骤二、建库
1)超声打断基因组DNA
采用超声打断基因组DNA，直至将基因组DNA打断至平均片段为400-700bp；然后采用磁珠纯化，洗脱；
2)DNA片段化与末端修复
末端修复反应体系如下：
Figure RE-GDA0002915096800000041
按上述体系配制后，使用移液器上下吹打6次，充分混匀，离心后，进行末端修复反应，程序如下：20℃反应30min，65℃反应30min，降至4℃后立即进行下一步；反应前PCR在75℃仪热盖；
3)接头连接
接头连接反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000042
Figure RE-GDA0002915096800000051
将上述接头反应体系置于PCR管内，并置于PCR仪上，按下述接头连接反应程序反应： 22℃、15min，PCR仪不设热盖，之后12℃保存，然后采用磁珠纯化，洗脱；
4)将上一步接头连接反应后的样本分均为2份，一份进行GSP+PCR，另一份进行做GSP-PCR；分别进行PCR1反应：
其中GSP+PCR的反应体系如下：
Figure RE-GDA0002915096800000052
GSP-PCR的反应体系如下：
Figure RE-GDA0002915096800000053
Figure RE-GDA0002915096800000061
将上述GSP+PCR的反应体系和GSP-PCR的反应体系分别进行PCR反应，PCR反应程序均为：
Figure RE-GDA0002915096800000062
反应完成后分别采用磁珠纯化，洗脱；
4)进行PCR2反应：
以PCR1反应中的GSP+PCR产物和GSP-PCR产物为样本进行PCR2反应；
GSP+PCR的PCR2反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000063
GSP-PCR的PCR2反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000064
Figure RE-GDA0002915096800000071
将上述GSP+PCR的反应体系和GSP-PCR的反应体系分别进行PCR反应，PCR反应程序均为：
Figure RE-GDA0002915096800000072
反应完成后分别采用磁珠纯化，洗脱，标记为正库和负库。即完成所述的生物素化的 dsODN构建GUIDE-pro库的方法。
进一步地，所述的采用磁珠纯化，洗脱均为采用120uL的1.2×磁珠纯化，20uL TEbuffer洗脱。
进一步地，所述的TE buffer为不含EDTA的10mm Tris-HCL。
进一步地，DNA片段化与末端修复是采用ABclonal快速DNA建库试剂盒完成。
进一步地，接头连接是采用ABclonal快速DNA建库试剂盒。
进一步地，所述的P5_1引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA；
P5_2引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC。
本发明的GUIDE-pro，两个主要元件为：1)与SpCas9融合表达的单体链霉亲和素(MSA)蛋白；2)生物素化标记的dsODN。主要原理是MSA可以在SpCas9切割脱靶位点的时候，招募更多的生物素化的dsODN，进而提高dsODN的整合效率，提高检测的敏感性。另一方面，背景DSB由于没有链霉亲和素-生物素介导的dsODN富集效应，因此它附近的dsODN浓度很低，整合效率显著下降，进而降低背景DSB被作为脱靶位点检测到的几率。降低脱靶检测的假阳性，增加脱靶检测的特异性。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、敏感性高，脱靶检测更全面：本发明基于目前已知最强的链霉亲和素-生物素体系，将链霉亲和素蛋白与SpCas9融合表达，同时将dsODN进行生物素化修饰。在 SpCas9/sgRNA复合物在细胞内进行切割时(在靶位点和脱靶位点)，与SpCas9融合的链霉亲和素蛋白会招募dsODN至切割位点附近，局部dsODN浓度增加，促进了dsODN的整合。使得更多的被CRISPR切割后的位点整合入dsODN，大大提升了脱靶位点检测的敏感性。
2、特异性高，假阳性率降低：GUIDE-seq需要在细胞有丝分裂期电转细胞，而处于有丝分裂期的细胞会由于复制压力等产生大量的DSB。这些DSB同样有整合dsODN的几率，进而被GUIDE-seq作为假阳性位点检测到。而GUIDE-pro由于在CRISPR切割位点具有富集dsODN的效应，而在非CRISPR产生的背景DSB则由于无富集效应，局部 dsODN的浓度大大降低。dsODN整合的几率减小。进而被GUIDE-seq作为假阳性位点检测的机会也减小。因此GUIDE-pro的特异性显著增加，有效减少背景DSB干扰导致的假阳性脱靶位点。
附图说明
图1为GUIDE-pro构建示意图；
图2为采用原始GUIDE-seq，改进GUIDE-seq的iGUIDE和本发明的GUIDE-pro进行脱靶检测图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
通过以下实验验证本发明的有益效果：
具体实验步骤
1.细胞转染：培养8×10^5个HEK293细胞，使用LONZA 4D SEKitDN-100程序进行电转，其中含有5ug的SpCas9-MSA/sgRNA质粒和5uL(100uM)退火的生物素化的 dsODN。转染3天后收细胞提取基因组DNA，
Figure RE-GDA0002915096800000093
Genomic DNA Kit(全式金；货号：TEE101-01)。
2.GUIDE-pro，建库步骤如下：
2.1 超声打断基因组DNA
2.1.1 取1ug基因组DNA，体积用无酶水补足至100uL。设置运行参数，On:30”，OFF:30”，Cycles:3，运行。
2.1.2 取1uL样品进行片段检测，完成打断后DNA的平均片段大小为400-700bp。若偏大，则继续打断
2.1.3 1×磁珠纯化(120uL)，37uL TE buffer(即10mM Tris-HCl，无EDTA)洗脱
2.2 DNA片段化与末端修复
试剂盒：ABclonal快速DNA建库试剂盒
2.2.1 在无菌PCR管中准备如下反应体系：
表1：末端修复反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000091
2.2.2 使用移液器上下吹打6次，充分混匀，短暂离心；
2.2.3 PCR程序如下，PCR仪热盖设置为75℃；温度降至4℃，建议立即冰上进行下一步实验，不要在4℃Hold。可在温控金属浴和水浴锅中进行。
表2：末端修复反应程序
Figure RE-GDA0002915096800000092
Figure RE-GDA0002915096800000101
2.3 接头连接
此步骤为加含有index序列的接头(Adaptor)，用于测序数据的拆分。因此需要认真记录各个样品的接头使用情况。
试剂盒：ABclonal快速DNA建库试剂盒。
2.3.1 准备如下反应体系：
表3：接头连接反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000102
2.3.2 将PCR管放置于PCR仪上，反应程序为22℃、15min，PCR仪不设热盖，之后12℃保存(立即进行下一步)。
2.3.3 0.8×磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mM Tris-HCl，无EDTA)洗脱。
2.4 PCR1
2.4.1 将每个DNA样品分为2份，10uL做GSP+PCR，10uL做GSP-PCR。
2.4.2 按照如下反应配置GUIDE-Pro PCR 1体系(分为GSP+和GSP-两个反应)。
GUIDE-Pro PCR 1GSP+反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000103
Figure RE-GDA0002915096800000111
GUIDE-Pro PCR 1GSP-反应体系：
无酶水 11.9μL
Taq酶缓冲液,10×(无MgCl<sub>2</sub>) 3.0μL
dNTP 10mM 0.6μL
MgCl<sub>2</sub>,50mM 1.2μL
Taq酶 0.3μL
GSP 1-引物 1.0μL
TMAC(0.5M) 1.5μL
p5-1引物 0.5μL
DNA样本 10.0μL
总体积 30.0μL
2.4.3 将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：
Figure RE-GDA0002915096800000112
2.4.5 1.2×磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mM Tris-HCl，无EDTA)洗脱
2.5 PCR 2
2.5.1 按照如下反应配置GUIDE-Pro PCR 2体系(分为GSP+和GSP-两个反应)
GUIDE-Pro PCR 2GSP+反应体系：
Figure RE-GDA0002915096800000113
Figure RE-GDA0002915096800000121
GUIDE-Pro PCR 2GSP-反应体系：
无酶水 5.4μL
Taq酶缓冲液,10×(无MgCl<sub>2</sub>) 3.0μL
dNTP 10mM 0.6μL
MgCl<sub>2</sub>,50mM 1.2μL
Taq酶 0.3μL
GSP 2-引物 1.0μL
TMAC(0.5M) 1.5μL
p5-2引物 0.5μL
P70N 1.5uL
DNA样品(来自PCR1) 15.0μL
Total 13.5μL
2.5.2 将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：
Figure RE-GDA0002915096800000122
Figure RE-GDA0002915096800000131
2.5.3 1.2×磁珠纯化(120uL)，20uL TE buffer(即10mM Tris-HCl，无EDTA)洗脱
2.5.4 Qubit HS测文库浓度
2.6 Illumina Hiseq2500进行二代测序及数据分析
采用本实施例的GUIDE-pro所构建的Mc-U6-sgRNA-SpCas9-MSA的质粒序列如序列表SEQ ID NO.1所示。序列表中单下划线的碱基表示为U6启动子，双下划线的碱基表示为BamHI位点；虚线下划线的碱基表示为sgRNA scaffold；波浪线下划线的碱基表示为SpCas9，点下划线的碱基表示为MSA。
本实施例比较了GUIDE-seq、iGUIDE和GUIDE-pro的脱靶检测性能如图1所示，由图1可知，在比较了GUIDE-seq、iGUIDE和GUIDE-pro的脱靶检测性能后。发现iGUIDE 和GUIDE-pro的实验程序与GUIDE-seq的实验程序相同，但SpCas9和dsODN除外。相应的GUIDE-seq、iGUIDE和GUIDE-pro系统分别是dsODN(34nt)+SpCas9/sgRNA、 dsODN(46nt)+SpCas9/sgRNA和生物素化的dsODN(34nt)+SpCas9/sgRNA(图1a)。与 GUIDE-seq和iGUIDE相比，在GUIDE-pro中，当SpCas9-MSA/sgRNA复合物结合和切割目标位点时，与SpCas9融合的MSA蛋白将招募生物素化的dsODN，并在切割位点附近富集它们，从而提高dsODN整合的效率。(图1b)。
图2为上述实施例分别采用了原始GUIDE-seq，改进GUIDE-seq的iGUIDE和本发明的GUIDE-pro进行脱靶检测图。图中最上面的碱基为靶点序列，最右侧的数字为每个在靶及脱靶位点对应的reads数。reads数越多，代表切割的越多。结果显示：与 GUIDE-seq和iGUIDE相比，GUIDE-seq可以检测到更多的脱靶，并且切割reads数也更多，约GUIDE-seq的2-20倍。这意味着GUIDE-pro可以显著脱靶检测的敏感性及特异性。
序列表
<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司
<120>一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法
<160>33
<210> 1
<211> 10669
<212> DNA
<213> Mc-U6-sgRNA-SpCas9-MSA质粒。
tcttctctca tccgccaaaa cagccaagct ggagaccgtt tgacattacc ctgttatccc 60
tagatacatt accctgttat cccagatgac ataccctgtt atccctagat gacattaccc 120
tgttatccca gatgacatta ccctgttatc cctagataca ttaccctgtt atcccagatg 180
acataccctg ttatccctag atgacattac cctgttatcc cagatgacat taccctgtta 240
tccctagata cattaccctg ttatcccaga tgacataccc tgttatccct agatgacatt 300
accctgttat cccagatgac attaccctgt tatccctaga tacattaccc tgttatccca 360
gatgacatac cctgttatcc ctagatgaca ttaccctgtt atcccagatg acattaccct 420
gttatcccta gatacattac cctgttatcc cagatgacat accctgttat ccctagatga 480
cattaccctg ttatcccaga tgacattacc ctgttatccc tagatacatt accctgttat 540
cccagatgac ataccctgtt atccctagat gacattaccc tgttatccca gatgacatta 600
ccctgttatc cctagataca ttaccctgtt atcccagatg acataccctg ttatccctag 660
atgacattac cctgttatcc cagatgacat taccctgtta tccctagata cattaccctg 720
ttatcccaga tgacataccc tgttatccct agatgacatt accctgttat cccagataaa 780
ctcaatgatg atgatgatga tggtcgagac tcagcggccg cggtgccagg gcgtgccctt 840
gggctccccg ggcgcggaat tccgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata 900
tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat 960
tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat 1020
tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg 1080
ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgggatccg ttttagagct agaaatagca 1140
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 1200
tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc 1260
aattctgcag acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc 1320
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt 1380
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 1440
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 1500
attgtgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 1560
tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 1620
ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 1680
gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 1740
gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 1800
ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 1860
tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc 1920
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 1980
ggctgtaatt agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta 2040
atgtttaatt acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca 2100
ccatggacta taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg 2160
atgacgataa gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag 2220
ccgacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga 2280
tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc 2340
acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg 2400
ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct 2460
atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac 2520
tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca 2580
acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga 2640
aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca 2700
tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg 2760
tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca 2820
tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac 2880
ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc 2940
tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg 3000
atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc 3060
agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc 3120
tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta 3180
tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc 3240
agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg 3300
gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg 3360
aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga 3420
agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg 3480
ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg 3540
agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca 3600
gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag 3660
tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga 3720
acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt 3780
ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga 3840
gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg 3900
tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct 3960
ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta 4020
tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc 4080
tgaccctgac actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc 4140
acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca 4200
ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg 4260
atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca 4320
gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc 4380
acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag 4440
tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga 4500
tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa 4560
tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg 4620
tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg 4680
atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata 4740
tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg 4800
acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga 4860
actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga 4920
ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc 4980
tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca 5040
ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca 5100
agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact 5160
accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt 5220
accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga 5280
tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca 5340
acatcatgaa ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc 5400
ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg 5460
ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc 5520
agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg 5580
ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct 5640
attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga 5700
aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact 5760
ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt 5820
actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc 5880
agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc 5940
actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac 6000
agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga 6060
tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc 6120
ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc 6180
ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag 6240
aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg 6300
acctgtctca gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa 6360
aaaagaaaaa gtatgaattc aaggcctctc gaagcggttc agagacccca ggaactagcg 6420
agagcgctac accggaatcg atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct 6480
gggttccagg ttccactggt gactatccat atgatgttcc agattatgct ggggcccagc 6540
cggccagatc tatggcggaa gcgggtatca ccggcacgtg gtacaaccag tctggttcta 6600
ccttcaccgt taccgcgggt gcggacggta acctgaccgg tcagtacgaa aaccgtgcgc 6660
agggcactgg ttgccagaac tctccgtaca ccctgaccgg tcgttacaac ggtaccaaac 6720
tggaatggcg tgttgaatgg aacaactcta ccgaaaactg ccactctcgt accgaatggc 6780
gtggtcagta ccagggtggt gcggaagcgc gtatcaacac ccagtggaac ctgacctacg 6840
aaggtggttc tggtccggcg accgaacagg gtcaggacac cttcaccaaa gttaaaccgt 6900
ctgcggcgtc tggatcctga gcctctagaa ctatagtgag tcgtattacg tagatccaga 6960
catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 7020
ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 7080
acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 7140
ggttttttaa ttcgcggccg cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 7200
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 7260
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 7320
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gagaatagca 7380
ggcatgctgg ggattttttg gggcccgccc caactggggt aacctttgag ttctctcagt 7440
tgggggtaat cagcatcatg atgtggtacc acatcatgat gctgattata agaatgcggc 7500
cgccacactc tagtggatct cgagttaata attcagaaga actcgtcaag aaggcgatag 7560
aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc 7620
cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg 7680
tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg 7740
atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgctc 7800
gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca 7860
tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct 7920
tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc 7980
atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgtagatgac atggagatcc tgccccggca 8040
cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc 8100
aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcttgc agttcattca 8160
gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga 8220
acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct 8280
ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc 8340
ctcatcctgt ctcttgatca gagcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcgaga 8400
aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca 8460
attccggttc gcttgctgtc cataaaaccg cccagtctag ctatcgccat gtaagcccac 8520
tgcaagctac ctgctttctc tttgcgcttg cgttttccct tgtccagata gcccagtagc 8580
tgacattcat ccggggtcag caccgtttct gcggactggc tttctacgtg ctcgaggggg 8640
gccaaacggt ctccagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca 8700
gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc 8760
ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag 8820
tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc 8880
agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta 8940
ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg 9000
caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg 9060
gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 9120
ccgctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 9180
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 9240
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 9300
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 9360
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 9420
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 9480
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 9540
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 9600
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 9660
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 9720
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 9780
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 9840
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 9900
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 9960
gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 10020
cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca 10080
ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg 10140
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 10200
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagcaga 10260
tcaattcgcg cgcgaaggcg aagcggcatg cataatgtgc ctgtcaaatg gacgaagcag 10320
ggattctgca aaccctatgc tactccgtca agccgtcaat tgtctgattc gttaccaatt 10380
atgacaactt gacggctaca tcattcactt tttcttcaca accggcacgg aactcgctcg 10440
ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc gcgagaaata gagttgatcg tcaaaaccaa 10500
cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc gggtggtgct caaaagcagc ttcgcctggc 10560
tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga cgctaatccc taactgctgg cggaaaagat 10620
gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat gctgtgcgac gctggcgat 10669
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GUIDE-seq dsODN-F的dsODN序列
G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GUIDE-seq dsODN-R的dsODN序列
A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C 38
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> iGUIDE dsODN-F的dsODN序列
G*C*TCGCGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTATACGC*G*A 50
<210>5
<211> 50
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> iGUIDE dsODN-R的dsODN序列
T*C*GCGTATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAAACGCGA*G*C 50
<210>6
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GUIDE-pro dsODN-F1的dsODN序列
G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T 59
<210>7
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GUIDE-pro dsODN-F 2的dsODN序列
A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C 59
<210>8
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P701
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>9
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P702
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>10
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P703
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>11
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P704
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>12
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P705
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>13
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P706
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>14
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P707
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>15
<211> 65
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P708
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA 65
<210>16
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P5_1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA 26
<210>17
<211> 29
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> P5_2
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC 29
<210>18
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A01
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>19
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A02
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>20
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A03
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>21
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A04
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>22
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A05
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>23
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A06
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>24
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A07
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>25
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A08
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>26
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A09
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACATTGTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>27
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A10
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGATGGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>28
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A11
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTACCTAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>29
<211> 79
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> A12
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAGAGCTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 79
<210>30
<211> 48
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GSP1+
GGATCTCGACGCTCTCCCTGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAAC 48
<210>31
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GSP1-
GGATCTCGACGCTCTCCCTATACCGTTATTAACATATGACA 41
<210>32
<211> 45
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GSP2+
CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATACATATGACAACTCAATTAAAC 45
<210>33
<211> 50
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> GSP2-
CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTA 50

Claims (8)

1.一种生物素化的dsODN，其特征在于所述的生物素化的dsODN序列如下：
5’-G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T-3’；
5’-A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C-3’。
2.根据权利要求1所述的一种生物素化的dsODN，其特征在于采用生物素化的dsODN，利用GUIDE-pro建库用引物序列如下：
P701
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P702
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P703
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P704
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P705
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P706
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P707
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P708
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA；
P5_1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA；
P5_2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；
A01
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A02
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A03
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A04
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A05
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A06
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A07
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A08
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A09
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACATTGTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A10
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGATGGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A11
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTACCTAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
A12
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAGAGCTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T。
3.采用权利要求1所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
步骤一、细胞转染
培养HEK293细胞，将含有5ug的SpCas9-MSA/sgRNA质粒和5uL、100uM退火的生物素化的dsODN电转至HEK293细胞，转染3天后收细胞提取基因组DNA；
步骤二、建库
1)超声打断基因组DNA
采用超声打断基因组DNA，直至将基因组DNA打断至平均片段为400-700bp；然后采用磁珠纯化，洗脱；
2)DNA片段化与末端修复
末端修复反应体系如下：
Figure FDA0002775501680000031
按上述体系配制后，使用移液器上下吹打6次，充分混匀，离心后，进行末端修复反应，程序如下：20℃反应30min，65℃反应30min，降至4℃后立即进行下一步；反应前PCR在75℃仪热盖；
3)接头连接
接头连接反应体系：
Figure FDA0002775501680000032
Figure FDA0002775501680000041
将上述接头反应体系置于PCR管内，并置于PCR仪上，按下述接头连接反应程序反应：22℃、15min，PCR仪不设热盖，之后12℃保存，然后采用磁珠纯化，洗脱；
4)将上一步接头连接反应后的样本分均为2份，一份进行GSP+PCR，另一份进行做GSP-PCR；分别进行PCR1反应：
其中GSP+PCR的反应体系如下：
Figure FDA0002775501680000042
GSP-PCR的反应体系如下：
Figure FDA0002775501680000043
将上述GSP+PCR的反应体系和GSP-PCR的反应体系分别进行PCR反应，PCR反应程序均为：
Figure FDA0002775501680000051
反应完成后分别采用磁珠纯化，洗脱；
4)进行PCR2反应：
以PCR1反应中的GSP+PCR产物和GSP-PCR产物为样本进行PCR2反应；
GSP+PCR的PCR2反应体系：
Figure FDA0002775501680000052
GSP-PCR的PCR2反应体系：
Figure FDA0002775501680000053
Figure FDA0002775501680000061
将上述GSP+PCR的反应体系和GSP-PCR的反应体系分别进行PCR反应，PCR反应程序均为：
Figure FDA0002775501680000062
反应完成后分别采用磁珠纯化，洗脱，标记为正库和负库。即完成所述的生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法。
4.根据权利要求3所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于所述的采用磁珠纯化，洗脱均为采用120uL的1.2×磁珠纯化，20uL TE buffer洗脱。
5.根据权利要求3所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于所述的TE buffer为不含EDTA的10mm Tris-HCL。
6.根据权利要求3所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于DNA片段化与末端修复是采用ABclonal快速DNA建库试剂盒完成。
7.根据权利要求3所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于接头连接是采用ABclonal快速DNA建库试剂盒。
8.根据权利要求3所述的一种生物素化的dsODN构建GUIDE-pro库的方法，其特征在于所述的P5_1引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA；
P5_2引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC。
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