CN106566832A - 针对nfat3基因靶点的短发卡rna、重组载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对NFAT3基因靶点的短发卡RNA、重组载体及应用，所述基因靶点的序列如SEQ ID NO：3所示，所述RNA的正义链序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA的反义链序列如SEQ ID NO：2所示。针对NFAT3基因靶点设计了短发卡RNA序列，并构建了相应的重组载体，该重组载体能在宿主细胞内转录得到NFAT3‑shRNA，经宿主细胞加工后可生成小分子干扰RNA，并靶向NFAT3的信使RNA，降低NFAT3的表达，导致基因沉默效应，有效抑制黑色素瘤细胞的增殖，具有抗癌应用价值，为进一步研究NFAT3在皮肤癌细胞中的功能及靶向NFAT3的药物研发提供了基础。

Description

针对NFAT3基因靶点的短发卡RNA、重组载体及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种针对NAT3基因靶点的短发卡RNA、重组载体及应用。

背景技术

皮肤癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，可大致分为恶性黑色素瘤和非黑色素瘤性皮肤癌，后者主要包括鳞状细胞癌和基底细胞癌。皮肤癌严重者可危及生命，其发病率逐年上升，已经成为了一个全球性的公共健康问题。多种危险因素可导致皮肤癌的发生，包括内源性因素(遗传因素、基因突变等)和外源性因素(如紫外线暴露，化学致癌物质和其他环境压力)。早期诊断和治疗，可以减少因该病所造成的死亡和畸形。然而，皮肤癌发生的确切分子机制仍不清楚，这严重的影响了对于该病的治疗和预防。

活化T细胞核因子(NFAT)在活化的T细胞的核提取物中被认为是与白介素-2(IL-2)启动子结合的诱导型核酸结合因子。NFAT可分布于细胞核和细胞质。细胞核中NFAT作为活化蛋白1(AP-1)的转录因子。纯化的NFAT是一个高度磷酸化的蛋白，能够被钙调磷酸酶(Calcineurin)去磷酸化。NFAT转录因子在很多脊椎动物的组织、器官的发育过程中起关键性的作用。此外，NFAT信号的失调与细胞恶性转化及肿瘤发展也密切相关。NFAT3属于NFAT家族。已报道NFAT3作为Ras-JNK1/2-AP-1诱导的NIH-3T3细胞转化的负调控因子。NFAT3在骨关节炎、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌、嗜铬细胞瘤细胞、胶质瘤细胞系中的作用均有报道。NFAT3可以被p38MAPK磷酸化Ser168和Ser170以及被JNK1和JNK2磷酸化Ser213和Ser217位点。丙氨酸替换Ser168和Ser170可促进NFAT3的核转运并增加NFAT3介导的转录活性。而JNK1和JNK2的磷酸化位点的突变抑制NFAT3转录活性。

RNA干扰(RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)对靶基因转录后的信使RNA(mRNA)的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默技术，其作用机制是：dsRNA被Dicer酶识别，并被切割为小干扰RNA(siRNA)。siRNA与RNA介导沉默复合体(RISC)结合后，识别并降解同源的mRNA，特异性抑制目的基因的表达。由于RNA干扰抑制靶基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，尤其适合特异靶向性的基因治疗。

最初RNA干扰采取体外合成siRNA的方法，但存在转染效率低、转移到细胞内的siRNA不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而限制了其应用。将siRNA合成为短发卡RNA(shRNA)并由载体导入细胞，能在细胞内稳定的转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性的siRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。

发明内容

本发明提供一种新的短发卡RNA重组载体的应用。

本发明提供了一种针对NFAT3基因靶点的短发卡RNA，所述基因靶点的序列如SEQID NO：3所示，所述RNA的正义链序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA的反义链序列如SEQ IDNO：2所示。

所述基因靶点的序列如SEQ ID NO：6所示，所述RNA的正义链序列如SEQ ID NO：4所示，所述RNA的反义链序列如SEQ ID NO：5所示。

一种针对NFAT3基因靶点的重组载体，包括所述的短发卡RNA。所述重组载体是质粒载体。所述重组载体是慢病毒载体。所述重组载体是在pLKO.1质粒的多克隆位点插入所述短发卡RNA得到的重组载体。

一种所述的重组载体在制备用于治疗黑色素瘤的药物上的应用。

一种所述的重组载体在制备用于降低黑色素瘤细胞中NFAT3的表达的试剂中的应用。

一种所述的重组载体在制备用于抑制黑色素瘤细胞增殖的试剂中的应用。

一种用于抑制黑色素瘤细胞增殖的药物，包括所述的重组载体。

一种所述的重组载体在制备用于检测黑色素瘤细胞中NFAT3的表达的试剂中的应用。

一种试剂盒，其包括所述重组载体，通过该试剂盒来检测黑色素瘤细胞中NFAT3的表达。

一种表达靶向NFAT3短发卡RNA的质粒在制备用于黑色素瘤的药物上的应用。

一种表达靶向NFAT3短发卡RNA的质粒在制备用于抑制黑色素瘤细胞增殖的试剂上的应用。

一般的，黑色素瘤细胞是细胞A375,G361,SK-MEL-5和SK-MEL-28。

本发明具有以下有益效果：针对NFAT3基因靶点设计了短发卡RNA序列，并构建了相应的重组载体，该重组载体能在宿主细胞内转录得到NFAT3-shRNA，经宿主细胞加工后可生成小分子干扰RNA，并靶向NFAT3的信使RNA，降低NFAT3的表达，导致基因沉默效应，有效抑制黑色素瘤细胞的增殖，具有抗癌应用价值，为进一步研究NFAT3在皮肤癌细胞中的功能及靶向NFAT3的药物研发提供了基础。

附图说明

图1是本实施方式采用的pLKO.1质粒图谱；

图2是黑色素瘤细胞中NFAT3的表达结果；

图3是实时荧光定量PCR检测NFAT3mRNA水平的柱状图和Western Blot检测NFAT3蛋白水平的结果图；

图4是黑色素瘤细胞A375的增殖实验结果图，其中，ctrl对应空载体，shNFAT3-1对应pLKO.1-NFAT3-shRNA1重组载体，shNFAT3-2对应pLKO.1-NFAT3-shRNA2重组载体；

图5是黑色素瘤细胞A375的平板克隆形成实验结果图；

图6是黑色素瘤细胞A375的裸鼠皮下成瘤实验结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明做进一步的说明。

本实施方式中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,3rdedition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用DNA引物均由Invitrogen合成；黑色素肿瘤细胞购自ATCC，由本申请人保存；各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂Lipofectamine购自Invitrogen公司；黑色素瘤细胞培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基。如无特别说明，本实施方式采用的其它试剂均为市售商品。

构建靶向NFAT3的干扰RNA重组载体

合成DNA序列：正义链和反义链分别溶于双蒸水中，浓度为：1mg/mL。各取2μL，加双蒸水至50μL，混合均匀，95℃水浴锅中放置5min，自然冷却至室温。所得退火双链DNA可存于-20℃冰箱备用。

pLKO.1质粒的图谱如图1所示，其中AgeI与EcoRI之间为干扰RNA的DNA序列插入区间。短发RNA可以有两种，每种均包括正义链序列和反义链序列。其中一种短发卡RNA(短发卡RNA1)的正义链序列为5’-CCGGGAGGTGGAGTCTGAGCTAAATCTCGAGATTTAGCTCAGACTCCACCTCTTTTTG-3’(SEQ ID NO:1)；反义链序列为5’-AATTCAAAAAGAGGTGGAGTCTGAGCTAAATCTCGAGATTTAGCTCAGA CTCCACCTC-3’(SEQ ID NO:2)；其针对的NFAT3基因靶点的序列为：5’-GAGGTGGAGTCTGAGCTAAAT-3’(SEQ ID NO:3)。另一种短发卡RNA(短发卡RNA2)的正义链序列为5’-CCGGCGGAATTCAGACATTGAGCTTCTCGAGAAGCTCAATGTCTGAATT CCGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:4)；反义链序列为5’-AATTCAAAAACGGAATTCAGACATTGAGCTTCTCGAGAAGCTCAATGTCTGAATTCCG-3’(SEQ ID NO:5)；针对的NFAT3基因靶点的序列为：5’-CGGAATTCAGACATTGAGCTT-3’(SEQ IDNO:6)。

将pLKO.1空载体质粒1μg，内切酶AgeI、EcoRI各1μL(10units)，10X酶切缓冲液2μL及适当体积的双蒸水混合使总体积达到20μL，37℃反应30min。反应结束后加10X DNA上样缓冲液2μL于1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割7kbp左右DNA条带所在的胶条并回收DNA测定浓度。pLKO.1空载体质粒即pLKO.1-puro质粒，其图谱如图1所示，序列如SEQ ID NO:7所示。

将上述退火后的双链DNA用双蒸水稀释至8ng/μL，取1μL与0.1μg酶切回收后的pLKO.1混合，加入10X链接缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，用双蒸水补足至总体积10μL，16℃反应2h后转化大肠杆菌，涂布于具氨苄霉素抗性的琼脂板中，37℃过夜后挑取单克隆菌落于含氨苄霉素抗性LB培养基中震荡培养过夜。菌液离心收集后抽提质粒并测序验证，将其命名为pLKO.1-NFAT3-shRNA1和pLKO.1-NFAT3-shRNA2。pLKO.1-NFAT3-shRNA1:表达靶向NFAT3短发卡RNA1的质粒，其针对的NFAT3基因靶点的序列如SEQ ID NO:3所示。pLKO.1-NFAT3-shRNA2：表达靶向NFAT3短发卡RNA2的质粒，针对的NFAT3基因靶点的序列如SEQ IDNO:6所示。

黑色素瘤细胞中NFAT3表达的检测

在本申请人保存的黑色素瘤细胞中检测NFAT3的表达，结果如图2所示，NFAT3在黑色素瘤细胞A375,G361,SK-MEL-5和SK-MEL-28中高表达。

RT-qPCR引物：NFAT3的正义链为5’-GACACAGCCCTATCTTCAGGA-3’(SEQ ID NO:8)，反义链为5’-GAGCTTGACTACGGGGTGA-3’(SEQ ID NO:9)；GAPDH的正义链为5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’(SEQ ID NO:10)，反义链为5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’(SEQID NO:11)。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性20S，60℃退火20S，73℃延伸30S，40个循环。

用靶向NFAT3的短发卡RNA降低黑色素瘤细胞中NFAT3的表达

100mm培养皿培养293T细胞至50％覆盖率。将质粒pLKO.1/Δ8.2/VSV-G按4：3：2的比例转染293T细胞，转染后6小时更换新鲜培养基。转染48小时后，收集培养上清，用0.45μm滤膜过滤，即可获得空载体对照慢病毒或表达靶向NFAT3短发卡RNA的慢病毒。

在60mm培养皿中培养黑色素瘤细胞A375至90％-100％覆盖率，细胞1：6传至6孔板，按细胞悬液和慢病毒液1：1加入慢病毒感染细胞。细胞感染24h后更换含有嘌呤霉素的培养基筛选，用未感染病毒细胞作为筛选阴性对照。待嘌呤霉素筛选至未感染病毒细胞全部死亡，存活的感染病毒的细胞为稳定株。命名为A375-ctrl(此为用pLKO.1-puro参与构建的慢病毒感染并用嘌呤霉素筛选过的A375细胞)，A375-shNFAT3-1(此为用pLKO.1-NFAT3-shRNA1参与构建的慢病毒感染并用嘌呤霉素筛选过的A375细胞)和A375-shNFAT3-2(此为用pLKO.1-NFAT3-shRNA2参与构建的慢病毒感染并用嘌呤霉素筛选过的A375细胞)。

稳定株细胞经PBS洗涤一遍后每孔加200μL SDS裂解液，室温裂解15min，将裂解产物于4℃12000G离心10分钟，取上清，一部分用于测定蛋白浓度，一部分加蛋白上样缓冲液100℃加热10min。取50μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，Western Blot检测NFAT3蛋白的水平。所用NFAT3抗体购自Abcam公司。Western Blot检测结果如图3所示，pLKO.1-NFAT3-shRNA1和pLKO.1-NFAT3-shRNA2可显著降低黑色素瘤细胞A375细胞中NFAT3的表达。

用靶向NFAT3的短发卡RNA抑制黑色素瘤细胞A375的增殖

在60mm培养皿中培养稳定株细胞A375-ctrl，A375-shNFAT3-1和A375-shNFAT3-2至90％-100％覆盖率，消化收集细胞，按每孔1000个细胞的密度重新接种到96孔板中，继续培养3d。分别在接种后0hr、24hrs、48hrs、72hrs时加入MTS，4hrs后检测。细胞增殖结果如图4所示，pLKO.1-NFAT3-shRNA1和pLKO.1-NFAT3-shRNA2可显著抑制黑色素瘤细胞A375的增殖。

用靶向NFAT3的短发卡RNA抑制黑色素瘤细胞A375的平板克隆形成

在60mm培养皿中培养稳定株细胞A375-ctrl，A375-shNFAT3-1和A375-shNFAT3-2至90％-100％覆盖率，消化收集细胞，按每孔250个细胞的密度重新接种到6孔板中，继续培养7d后，用2％的结晶紫溶液对细胞进行染色，15min后用清水漂洗，晾干。如图5所示，pLKO.1-NFAT3-shRNA1和pLKO.1-NFAT3-shRNA2可显著抑制黑色素瘤细胞A375的平板克隆形成能力。

用靶向NFAT3的短发卡RNA抑制黑色素瘤细胞A375在裸鼠皮下成瘤的能力

在100mm培养皿中培养稳定株细胞A375-ctrl，A375-shNFAT3-1和A375-shNFAT3-2至90％-100％覆盖率，消化收集细胞。将5×10⁶稳定株细胞注射到4周龄BALB/c裸鼠后腿靠近背部皮下，观察肿瘤生长情况，并用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积(mm³)的计算方法为长×宽×宽/2。如图6所示，pLKO.1-NFAT3-shRNA1和pLKO.1-NFAT3-shRNA2可显著抑制在裸鼠皮下成瘤的能力。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 针对NFAT3基因靶点的发卡RNA、重组载体及应用

<130> 16I23535

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 短发卡RNA1正义链序列

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ccgggaggtg gagtctgagc taaatctcga gatttagctc agactccacc tctttttg 58

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 短发卡RNA1反义链序列

<400> 2

aattcaaaaa gaggtggagt ctgagctaaa tctcgagatt tagctcagac tccacctc 58

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> RNA1针对的NFAT3基因靶点的序列

<400> 3

gaggtggagt ctgagctaaa t 21

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 短发卡RNA2正义链序列

<400> 4

ccggcggaat tcagacattg agcttctcga gaagctcaat gtctgaattc cgtttttg 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 短发卡RNA2反义链序列

<400> 5

aattcaaaaa cggaattcag acattgagct tctcgagaag ctcaatgtct gaattccg 58

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> RNA2针对的NFAT3基因靶点的序列

<400> 6

cggaattcag acattgagct t 21

<210> 7

<211> 7032

<212> DNA

<213> pLKO.1-puro质粒序列

<400> 7

ttggggttgc gccttttcca aggcagccct gggtttgcgc agggacgcgg ctgctctggg 60

cgtggttccg ggaaacgcag cggcgccgac cctgggtctc gcacattctt cacgtccgtt 120

cgcagcgtca cccggatctt cgccgctacc cttgtgggcc ccccggcgac gcttcctgct 180

ccgcccctaa gtcgggaagg ttccttgcgg ttcgcggcgt gccggacgtg acaaacggaa 240

gccgcacgtc tcactagtac cctcgcagac ggacagcgcc agggagcaat ggcagcgcgc 300

cgaccgcgat gggctgtggc caatagcggc tgctcagcag ggcgcgccga gagcagcggc 360

cgggaagggg cggtgcggga ggcggggtgt ggggcggtag tgtgggccct gttcctgccc 420

gcgcggtgtt ccgcattctg caagcctccg gagcgcacgt cggcagtcgg ctccctcgtt 480

gaccgaatca ccgacctctc tccccagggg gatccaccgg agcttaccat gaccgagtac 540

aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 600

gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 660

cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 720

tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 780

ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 840

gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 900

ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 960

ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 1020

ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 1080

cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacg cccgccccac 1140

gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatg catcggtacc tttaagacca 1200

atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 1260

gggctaattc actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg 1320

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 1380

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 1440

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca 1500

tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg 1560

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 1620

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 1680

tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 1740

ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 1800

aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 1860

ggacgtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt 1920

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 1980

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 2040

gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 2100

ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 2160

tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 2220

gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta 2280

gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 2340

ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 2400

ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 2460

tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta 2520

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 2580

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 2640

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 2700

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2760

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2820

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 2880

gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 2940

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 3000

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 3060

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 3120

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 3180

accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 3240

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 3300

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 3360

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 3420

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 3480

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 3540

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 3600

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 3660

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 3720

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3780

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 3840

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 3900

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3960

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 4020

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ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 4320

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 4380

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 4440

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 4500

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 4560

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 4620

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 4680

gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctgca agcttaatgt 4740

agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag caacatgcct 4800

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attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacat aaacgggtct ctctggttag 4980

accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 5040

aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact 5100

agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag 5160

ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 5220

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agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 5580

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 5640

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 5700

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 5760

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 5820

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 5880

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 5940

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 6000

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 6060

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 6120

tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 6180

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 6240

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 6300

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 6360

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 6420

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 6480

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgatcacgag 6540

actagcctcg agcggccgcc cccttcaccg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt 6600

tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa 6660

agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt 6720

taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt 6780

tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgg tgaattctcg acctcgagac 6840

aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag 6900

gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa 6960

ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag cagagatcca ctttggccgc 7020

ggctcgaggg gg 7032

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> NFAT3的正义链序列

<400> 8

gacacagccc tatcttcagg a 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> NFAT3的反义链序列

<400> 9

gagcttgact acggggtga 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> GAPD的正义链序列

<400> 10

ctgggctaca ctgagcacc 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH的反义链序列

<400> 11

aagtggtcgt tgagggcaat g 21

Claims (10)

1.一种针对NFAT3基因靶点的短发卡RNA，其特征在于，所述基因靶点的序列如SEQ IDNO：3所示，所述RNA的正义链序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA的反义链序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种针对NFAT3基因靶点的短发卡RNA，其特征在于，所述基因靶点的序列如SEQ IDNO：6所示，所述RNA的正义链序列如SEQ ID NO：4所示，所述RNA的反义链序列如SEQ ID NO：5所示。

3.一种针对NFAT3基因靶点的重组载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的短发卡RNA。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是质粒载体。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是慢病毒载体。

6.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在pLKO.1质粒的多克隆位点插入所述短发卡RNA得到的重组载体。

7.一种权利要求3所述的重组载体在制备用于治疗黑色素瘤的药物上的应用。

8.一种权利要求3所述的重组载体在制备用于降低黑色素瘤细胞中NFAT3的表达的试剂中的应用。

9.一种权利要求3所述的重组载体在制备用于抑制黑色素瘤细胞增殖的试剂中的应用。

10.一种权利要求3所述的重组载体在制备用于检测黑色素瘤细胞中NFAT3的表达的试剂中的应用。