CN112980948A - Nfat3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。本发明以口腔鳞癌作为研究模型，发现NFAT3基因敲减可抑制HNSCC细胞增殖，NFAT3过表达则呈现相反趋势；进一步研究发现其以NFAT3‑SFPQ‑NONO蛋白复合物形式，通过MYC/GLS抑制谷氨酰胺代谢，抑制细胞增殖，延缓HNSCC的发展。表明NFAT3可以作为治疗靶点用于筛选或制备用于治疗头颈部鳞状细胞癌的药物；同时还发现，NFAT3在头颈部鳞状细胞癌组织中异常高表达。高表达NFAT3与HNSCC患者存活率下降相关；因此，NFAT3还可作为头颈部鳞状细胞癌的诊断标记物，用于HNSCC预后诊断。

Description

NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中 的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

背景技术

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cellcarcinoma，HNSCC)，是头颈部最常见的恶性肿瘤，起源于口腔、口咽、下咽和喉，居全球肿瘤发病率第六，每年影响超过600,000名患者，其癌变过程通常会经历一个以扁平苔藓(OLP)等口腔潜在恶性疾患为表现的过渡性阶段，诊断后5年生存率不及50％，属预后较差、毁容性疾病。尽管过去三十年间，手术、放疗及化疗等肿瘤治疗手段得到长足的发展，但HNSCC患者生存率的提高却十分有限，这种持续高的死亡率主要归咎于HNSCC的转移和复发。HNSCC是体细胞基因突变、烟草、酒精、HPV感染等内外部多种因素共同作用的结果，且具有高度异质性，造成临床上治疗效果和预后差异很大。因此，找寻HNSCC相关的治疗靶点对于筛选或制备头颈部鳞状细胞癌治疗药物具有重要意义。

活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一类重要的转录因子。NFAT不仅调控T细胞的活化和分化，还可以调节其他免疫细胞，包括树突状细胞、B细胞以及巨核细胞。此外，NFAT在很多脊椎动物的发育过程中也发挥关键性的作用。但NFAT在肿瘤细胞转化和生长中的功能尚不十分明确。NFAT在免疫细胞和非免疫细胞(如软骨细胞、脂肪细胞和上皮细胞)中均有表达，在癌症的发生、转移中具有重要作用。但不同的NFAT亚型在不同肿瘤中功能不一。NFAT家族由NFAT1-NFAT4四个家族成员组成，NFAT2可诱导皮肤癌和卵巢癌的发生(Tripathi P,Wang Y,Coussens M,et al.Activation of NFATsignaling establishes a tumorigenic microenvironment through cell autonomousand non-cell autonomous mechanisms.[J].Oncogene,2014,33(14):1840-1849.)，NFAT1则可诱导细胞周期阻滞和凋亡，并抑制促癌基因H-rasV12介导的细胞转化(Faget D V,Lucena P I,Robbs B K,et al.NFAT1C-Terminal Domains Are Necessary but NotSufficient for Inducing Cell Death[J].PLOS ONE,2012,7.；Robbs B K,Cruz A L S,Werneck M B F,et al.Dual Roles for NFAT Transcription Factor Genes asOncogenes and Tumor Suppressors[J].Molecular&Cellular Biology,2008,28(23):7168.)。其中针对NFAT3的研究较少，而关于NFAT3在HNSCC中的研究，目前未见相关报导。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供NFAT3作为诊断标记物在制备头颈部鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明以口腔鳞癌作为研究模型，研究NFAT3在HNSCC肿瘤的作用。本发明发现，NFAT3基因敲减可抑制HNSCC细胞增殖，NFAT3过表达则呈现相反趋势。进一步研究发现，其以NFAT3-SFPQ-NONO蛋白复合物形式，通过MYC/GLS抑制谷氨酰胺代谢，进而抑制细胞增殖，延缓HNSCC的发展。表明NFAT3可作为治疗靶点用于治疗头颈部鳞状细胞癌。

同时还发现，NFAT3、Myc、GLS在头颈部鳞状细胞癌组织中异常高表达。高表达NFAT3-SFPQ-NONO与HNSCC患者(n＝490，P＝0.0012)存活率下降相关；因此，NFAT3还可作为头颈部鳞状细胞癌的诊断标记物，用于HNSCC预后诊断。

另外，本发明发现他克莫司可以抑制HNSCC细胞增殖，他克莫司在HNSCC中靶向NFAT3，进一步研究发现，其是通过NFAT3-SFPQ-NONO/c-Myc/GLS途径抑制谷氨酰胺代谢，进而影响细胞增殖，延缓HNSCC肿瘤发展。提出了他克莫司全新的非免疫抑制作用模式，是一种潜在的治疗HNSCC的治疗药物，同时也表明NFAT3在筛选潜在的头颈部鳞状细胞癌治疗药物与评估现有临床用药的安全性及其治疗适用范围上具有巨大潜力。

因此，本发明请求保护下列关于NFAT3和他克莫司的相关用途：

NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

NFAT3在制备头颈部鳞状细胞癌谷氨酰胺代谢调控制剂中的应用。

NFAT3作为诊断标记物在制备头颈部鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

NFAT3表达抑制剂在制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

本发明还提供一种头颈部鳞状细胞癌治疗药物，含有NFAT3表达抑制剂。

优选地，所述抑制剂为抑制NFAT3表达的siRNA或shRNA。

优选地，所述siRNA或shRNA的序列为TCAGGTGCACCGTATCACA或AGCTGAGGATCGAGGTACA。

本发明还提供一种头颈部鳞状细胞癌诊断产品，包含检测NFAT3表达量的试剂。所述产品为制剂、芯片或试剂盒等，包含可通过Western Blot检测NFAT3蛋白表达含量的实际或通过实时荧光定量PCR检测NFAT3基因表达量的引物。

优选地，所述引物上游序列为：5’-ACTGGAGTGAAGGCGTGTCTAGAG-3’；下游序列为：5’-CTCCAAAGAGCTCTGGAGCCT-3’。

他克莫司在制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

他克莫司在制备NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物抑制剂中的应用。

优选地，所述药物还含有他克莫司，从而使NFAT3表达抑制剂和他克莫司可共同发挥治疗作用。

本发明阐明了NFAT3在头颈部鳞状细胞癌中的作用与分子机制，NFAT3通过形成NFAT3-SFPQ-NONO蛋白复合物与c-Myc启动子结合，调控GLS，影响肿瘤细胞谷氨酰胺代谢及细胞增殖的分子机制。他克莫司的应用能够靶向降低NFAT3核表达，降低谷氨酰胺代谢及细胞增殖，从而延缓肿瘤的发展。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了NFAT3作为治疗靶点在头颈部鳞状细胞癌中的应用，首次提出NFAT3在HNSCC中构成蛋白复合体NFAT3-SFPQ-NONO，与c-Myc启动子结合，进一步调控下游GLS，影响谷氨酰胺代谢，影响肿瘤细胞增殖。并借助数据库进行了蛋白结合的电脑模拟，定义了可能的结合氨基酸序列。借助数据库进行了生存分析，证实NFAT3-SFPQ-NONO在HNSCC与预后存在相关性；表明，NFAT3可作为治疗靶点或诊断标记物用于头颈部鳞状细胞癌的预后诊断，及治疗药物的制备或筛选。

附图说明

图1为他克莫司抑制HSC3和SCC25细胞的增殖。A：他克莫司组细胞增殖下降；B：他克莫司组克隆形成菌落平均面积及数量低于对照组，*p<0.05，**p<0.01。

图2为他克莫司处理后HSC3、SCC25细胞耗氧率(OCR)明显下降。表明他克莫司抑制HN SCC的细胞代谢。

图3为通过海马Mito燃料实验测试线粒体氧化葡萄糖途径、谷氨酰胺途径和脂肪酸途径的潜力，发现谷氨酰胺代谢途径的依赖性和灵活性均受他克莫司影响。B：他克莫司处理使GSH、ROS水平下降。表明他克莫司主要抑制HNSCC细胞的谷氨酰胺代谢。*p<0.05，**p<0.01。

图4为他克莫司抑制HSC3和SCC25细胞的增殖。添加谷氨酰胺(Gln)或谷氨酰胺代谢物α-酮戊二酸(AKG)、丙酮酸钠(Pyr)，细胞增殖速率恢复正常。*p<0.05。

图5为他克莫司处理后，NFAT3蛋白表达明显受到抑制。

图6为他克莫司在裸鼠移植瘤模型中能够明显抑制肿瘤细胞增长。A：裸鼠皮下成瘤活体成像，他克莫司组荧光强度低于对照组；裸鼠肿瘤大体观，他克莫司组肿瘤质量、体积均低于对照组；B：大鼠4NQO成瘤大体观显示他克莫司组与对照组无明显异常，4NQO组与4NQO+他克莫司组成瘤，其中4NQO组瘤体较大；病理切片ki67染色，H-Score评分结果与大体观相似，显示他克莫司组与对照组无明显差异，4NQO组与4NQO+他克莫司组恶性程度明显升高，4NQO组恶性程度较4NQO+他克莫司组高。C：裸鼠皮下成瘤活体成像荧光强度，sh-NC>sh-NFAT3，over-NFAT3>over-NC>over-NFAT3+FK506；D：裸鼠肿瘤大体观，sh-NFAT3组肿瘤体积低于sh-NC组；over-NFAT3组肿瘤较over-NC组及over-NFAT3+FK506明显增大。*p<0.05，**p<0.01。

图7为Western Blot检测siRNA为100nM时的转染效率。NFAT3被成功敲减。

图8为NFAT3表达量对细胞增殖影响。A：NFAT3基因敲减抑制细胞增殖；B：NFAT3过表达促进细胞增殖；C：他克莫司处理可逆转NFAT3过表达引起的细胞增殖变化。*p<0.05，**p<0.01。

图9为NFAT3敲减后GSH水平降低，ROS水平升高。NFAT3过表达呈现相反趋势。证明NFAT3敲减抑制谷氨酰胺代谢。他克莫司处理可逆转NFAT3过表达引起的代谢变化。*p<0.05，**p<0.01。

图10为NFAT3、SFPQ和NONO存在蛋白与蛋白之间的结合。

图11为敲减NFAT3破坏了NFAT3、SFPQ和NONO之间的结合，NFAT3是维持这种蛋白质复合物的关键因素。

图12为电脑模拟NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物结合模式。

图13为他克莫司能够抑制NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物的构成。

图14为NFAT3-SFPQ-NONO以复合物形式与c-Myc启动子结合，调控基因表达。*p<0.05，**p<0.01。

图15为电脑模拟NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物与c-My启动子结合模式

图16为Myc表达与谷氨酰胺酶(GLS)表达正相关，可进一步影响下游谷氨酰胺代谢。

图17为NFAT3、Myc、GLS在癌组织中异常高表达。

图18为高表达NFAT3-SFPQ-NONO与HNSCC患者(n＝490，P＝0.0012)存活率下降相关，其结论在其他类型的肿瘤中得到类似验证，具有一定普适性。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

人舌鳞癌细胞(HSC3和SCC25)，正常口腔角化细胞(NOK)，人发育不良型口腔角化细胞(DOK)，HEK293T细胞购自ATCC细胞库。

本发明下列实施例中涉及的一些试验方法具体操作步骤如下所示：

1、细胞培养与传代

以购自ATCC细胞库的HSC3和SCC25细胞，正常口腔角化细胞(NOK)，人发育不良型口腔角化细胞(DOK)和HEK293T细胞为研究对象。

细胞培养：HSC-3，HEK293T细胞使用10％胎牛血清的DMEM培养基。SCC-25细胞使用10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基。NOK使用K-SFM培养基。DOK使用加入10％胎牛血清及氢化可的松(5μg/mL)的DMEM高糖培养基。所有细胞在37℃、5％CO₂的环境中培养。

细胞传代：当细胞融合度达70-80％时，弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2-3次，根据培养器皿底面积大小加入1-3ml 0.25％胰蛋白酶消化3-5min，在倒置显微镜下观察到细胞间隙增大，缩小成圆形，轻拍有大量细胞漂浮时，加入胰蛋白酶3倍体积的完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，重悬细胞并以1：3接种传代，每1-2d换液。

2、CCK8细胞增殖实验

使用CCK8试剂盒(Telenbiotech)测量细胞增殖能力。

(1)待各组细胞长到合适密度时，消化重悬，调整细胞浓度为3.0×10⁴个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，每组设置六个复孔。培养箱预培养(37℃，5％CO2)。

(2)将培养板在培养箱中分别孵育0h，24h、48h、96h

(3)达到预定孵育时间后每孔加入10μl CCK试剂，培养箱继续孵化1h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。根据吸光度绘制生长曲线。

3、平板克隆形成实验

(1)取对数生长期的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮完全培养基中备用。

(2)稀释细胞悬液，以每孔500个细胞的密度接种于6孔板中，轻轻混匀，使细胞分散均匀。置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养7-14天。

(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。4％多聚甲醛固定15min。去固定液，加适量0.1％结晶紫染液染色10min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

(4)扫描计数克隆，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％，相对克隆形成率为每组的克隆形成率分别除以自身对照组的克隆形成率

4、代谢实验

seahorse实验：采用seahorse实验试剂盒(103325-100，103260-100，AgilentTechnologies)检测HNSCC细胞的OCR和ECAR。

(1)将细胞(HSC3 8000个/80μl/孔，SCC25 10000个/80μl/孔)接种到Seahorse XF细胞培养板中，室温放置1小时促进细胞的分散并减少边缘效应，培养箱培养24h。

(2)水化探针：在Utility Plate中每孔加入200μl Seahorse XF校准液，将探针板放回Utility Plate上，置于37℃无CO2培养箱中过夜水化探针。

(3)用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入10mM葡萄糖,1mM丙酮酸钠,2mM谷氨酰胺，将溶液加热至37℃，用1N NaOH调pH值至7.4，0.22μM滤膜过滤，4℃保存，用前37℃预热。

(4)实验前将细胞板从培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态良好，背景孔中无细胞。将培养基更换为检测液，显微镜下观察细胞有无被冲洗掉，然后将细胞放置在37℃无CO2培养箱中1小时。

(5)取出utility plate并排除探针在预热中产生的气泡。加入他克莫司，采用XF96细胞外通量分析仪进行试验，最终数据采用wave、report generator进行分析。

ATP水平测量：使用ATP检测试剂盒(Beyotime)测量

(1)细胞他克莫司预处理72h。

(2)6孔板每孔加入200μl裂解液，反复吹打并晃动培养板，使细胞充分裂解。4℃，12000g离心5min，保留上清液。

(3)检测孔内每孔加入100μl ATP检测工作液，室温放置3-5分钟。

(4)每孔加入20μl样品迅速混匀，化学发光仪测定。将单位转换为nmol/mg蛋白。

GSH水平测量：使用谷胱甘肽检测试剂盒(Beyotime)测量

(1)离心收集细胞，吸尽上清。

(2)向细胞中加入裂解试剂，充分涡旋后4℃，10,000g离心10min，保留上清。

(3)96孔板每孔加入150μl检测试剂、10μl样品或标准品，室温孵化5min。

(4)每孔加入50μl NADPH开始反应。分别于5，10，20min监测412nm处的吸光度。将单位转换为nmol/mg蛋白。

ROS水平测量：使用ROS检测试剂盒(Beyotime)测量ROS水平

(1)离心收集细胞，加入DCFH-DA，37℃避光孵育20min，每隔3-5分钟颠倒混匀使探针和细胞充分接触。

(2)用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

(3)使用488nm激发波长，525nm发射波长，流式细胞仪观察结果。

5、WesternBlot

预先接种细胞，待细胞融合度约80％，提取总蛋白并检测目标蛋白的表达。

(1)总蛋白提取

A.培养好的细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，吸净液体，加入适量预先配制好的蛋白裂解液(RIPA、蛋白酶抑制剂按100:1比例混合)，4度摇床裂解30min。

B.采用细胞刮将裂解后的混合物收集并转移至预冷的1.5mlEP管中，4℃，14000rpm离心20min。将上层清液转移至新EP管中，-80℃储存备用。

(2)BCA测蛋白浓度

A.标准曲线：将浓度为2mg/ml的蛋白标准品等比稀释，使其浓度分别为2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0mg/ml。以20μl/孔加入96孔板中，每组设置两个复孔。

B.样品：每孔加入18μl/孔的PBS及2μl蛋白样品，混匀，每组设置两个复孔。

C.取BCA试剂A与试剂B按50:1配制适量BCA工作液，充分混匀备用。

D.以200μl/孔加入BCA工作液，37℃孵育30min。

E.酶标仪测定各孔在波长为562nm紫外光下的OD值，制作标准曲线并计算样品蛋白浓度。

(3)蛋白凝胶电泳

A.将样品蛋白溶液与5x上样缓冲液4:1混合，99℃下加热5min将蛋白变性。

B.根据说明书配置10％分离胶及5％浓缩胶。安装电泳槽，加入电泳缓冲液，使液面超过上样孔顶端，轻轻拔去梳子，按预先计算好的上样量，在各上样孔内按设计好的次序加入蛋白样品，并在适当位置的上样孔内加入4μl蛋白分子量marker。组装好电泳设备后，先在70V的恒压下电泳30min，待样品跑过浓缩胶后，转为110V恒压。至所需的蛋白分子彻底分离开或溴酚蓝指示剂接近凝胶底部时终止电泳。

C.5.5x8.5cmPVDF膜甲醇浸润1min，轻轻将凝胶撬开，取出凝胶切除多余部分，于预冷的转膜液中按夹子黑面、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、夹子透明面顺序安装转膜夹，安装于转移槽中，低温下以0.2A-0.25A恒流转膜1-1.5h。

D.转完膜后，取出PVDF膜，5％脱脂奶粉溶液室温封闭1h。

E.根据蛋白marker指示及一抗说明书所示的理论分子量，将PVDF膜进行裁剪，然后浸入适量对应的一抗稀释液(anti-NFAT3(1:1000，cst2188s，CST)，anti-Myc(1:1000，cst5605s，CST)，anti-GLS(1:1000，12855-1-AP，Proteintech)，anti-SFPQ(1:1000，15585-1-AP，Proteintech)，anti-NONO(1:1000，11058-1-AP，Proteintech)，anti-GAPDH(1:4000，60004-1-Ig，Proteintech)，anti-LamineB1(1:1000，12987-1-AP，Proteintech))，置于摇床上4℃过夜。

F.TBST洗膜3x5min后，将PVDF膜浸入适量二抗稀释液(1：3000)，常温孵育1h，TBST洗膜3x5min。

G.曝光：将曝光液A和B按1：1比例混合，均匀滴至PVDF膜条带上孵育2min，在化学发光成像分析系统中曝光显影，储存蛋白显影图片。

6、实时荧光定量PCR

细胞预先接种于6cm培养皿中，待细胞融合度约80％，提取RNA，逆转录后检测表达变化。具体步骤如下：

(1)RNA提取

A.用冷的PBS将培养好的细胞清洗三次，加入1ml Trizol，室温裂解5min后，将样品收集到1.5mlEP管中。

B.每1ml的Trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml氯仿。涡旋振荡管体15秒后，室温放置15min。4℃下12000rpm离心15min。

C.RNA沉淀：小心吸取水相上层并转移到一无RNA酶的EP管中。加等体积异丙醇混合，混匀后室温放置5-10min，于4℃下12000rpm离心10min。

D.RNA清洗：小心弃去上清液，每1ml Trizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的不含RNA酶的75％乙醇，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下8000rpm离心5min。重复2次。

E.RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10min。

F.溶解RNA沉淀：根据沉淀的量加入适量无RNA酶的DEPC水。测量A260/A280的值在1.8-2.1之间，属于合格样品。-80℃储存备用。

(1)逆转录

以上提取的合格的RNA样品继续进行逆转录。按如下步骤逆转录：

A.基因组DNA去除：

表1基因组DNA去除体系配方

用移液器轻轻吹打混匀，42℃，2min。

B.逆转录：在步骤A的反应管中加入4μl的5×HiScript II qRT SuperMix II，用移液器轻轻吹打混匀，50℃，15min后85℃，5s得到cDNA。-80℃储存备用。

(2)qPCR

A.逆转录结束后得到的cDNA，按如下20μl体系进行荧光实时定量PCR技术：

表2 qPCR体系配方

B.PCR条件：

50℃，2min。95℃，10min。【95℃，10s。56℃，30s。72℃，30s】40个循环。95℃，15s。60℃，1min。95℃，1s。

C.PCR结束后得到各组CT值，采用2-^△△Ct法计算各组基因的表达水平，对计算结果进行统计学分析。

7、免疫组织化学

(1)组织标本固定，脱水包埋，切片。

(2)60℃恒温箱中烤片2h。

(3)脱蜡和水化：二甲苯中浸泡2次，每次5-10min，随后在梯度酒精(100％、95％、85％、75％)中各浸泡5min，PBS清洗两次，每次5min。

(4)细胞通透：在0.1％TritonX-100中浸泡10min，PBS清洗3次，每次5min。

(5)封闭内源性过氧化物酶：滴加3％H₂O₂，室温湿盒孵育10min，PBS清洗3次，每次5min。

(6)抗原修复：用烧杯盛装600ml柠檬酸抗原修复液(PH＝6.0)，于微波炉中加热10min，再将切片轻轻放入烧杯中已沸腾的缓冲液里，继续加热7min，随后取出烧杯，自然冷却至室温后，PBS清洗3次，每次5min。

(7)山羊血清室温湿盒封闭30min。

(8)抗体用一抗稀释液进行稀释，Ki67(1:2000，ARG53222，Arigo)、NFAT3(1:2000，AB41221，itech)、GLS(1:2000，12855-1-AP，Proteintech)、Myc(1:2000，MAB3696，RD)4℃湿盒孵育过夜。

(9)PBST液清洗2次，每次5min，PBS清洗5min，3％H₂O₂浸泡10min，PBS清洗2次，每次5min。

(10)二抗孵育：复温后，二抗室温孵育30min。

(11)PBS清洗3次，每次5min。

(12)DAB显色：滴加DAB显色液于组织上，并在显微镜下观察显色情况，组织出现棕黄色颗粒后自来水浸泡终止反应。

(13)苏木素复染，自来水清洗30min。

(14)脱水：梯度酒精(75％、80％、95％、、100％、100％)中浸泡5min。

(15)二甲苯浸泡2次，每次5min。

(16)中性树脂封片，晾干。

(17)扫描分析。

8、细胞转染

实验前一天接板，根据接种细胞的容器确定接种密度。

瞬时转染：

(1)使用lipofectamine3000试剂盒(Thermofisher)与siRNAs(Ribobio)。siRNA+125μl Opti-MEM混匀静置5min。5μl Lipo3000+125μl Opti-MEM混匀静置5min。以上两种混匀的液体再次混匀静置10min后，加入1750μl的完全培养基混匀。

(2)弃去原先的培养基，PBS清洗，加入上述混匀的液体。

(3)培养箱中37℃培养24小时后换新完全培养基继续培养。

(4)转染48h后收获细胞进行其他实验。

慢病毒转染：

(1)使用慢病毒包装试剂盒(GeneCopoeia)进行，加入适量病毒悬液孵育。

(2)培养24小时后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

(3)培养48小时后，在倒置荧光显微镜下观察是否有明显荧光表达。

(4)培养3-4天后，加入含2μg/ml嘌呤霉素的培养基培养，筛选稳定转染细胞株4周。

9、免疫荧光

(1)预先将细胞接种至激光共聚焦培养皿，培养箱内孵育24h。

(2)PBS清洗，加入4％多聚甲醛固定15min，PBS清洗。

(3)加入0.3％TritonX-100，透膜15min，PBS清洗。

(4)加入10％山羊血清，常温封闭1h。

(5)抗体稀释液稀释一抗(NFAT3，1：200)，4℃孵育过夜，PBS清洗。

(6)抗体稀释液稀释二抗(1：5000)，常温避光孵育2h，PBS清洗。

(7)加入DAPI(1：2000)，避光孵育1h，PBS清洗。

(8)63X油镜下激光共聚焦显微镜观察拍照。

10、免疫共沉淀(Co-IP)

(1)预先接板，待细胞生长至80％融合率时用预冷的RIPA冰上裂解15min，12000g离心30min后取上清。

(2)取少量离心完的裂解液以备WesternBlot分析

(3)剩余裂解液加入相应的抗体NFAT3(3μg，abcam，ab3447)SFPQ(3μg，abcam，ab99357)或NONO(3μg，proteintech，11058-1-ap)。

(4)取20μlA/G磁珠，用适量裂解缓冲液清洗3次后加入细胞裂解液中，4℃摇晃孵育过夜，使抗体与A/G磁珠偶联。

(5)免疫沉淀反应后，吸附磁珠，小心除去上清。磁珠用1mL裂解液洗3-4次。

(6)WesternBlot分析，具体步骤见5WesternBlot部分。

10、染色质免疫共沉淀(CHIP)

使用ChIP试剂盒(Millipore)进行

(1)1×10⁷细胞在室温下加入1％甲醛处理10min,10×甘氨酸淬灭5min，交联裂解。

(2)超声仪裂解生成平均200-1000bp长度的DNA片段。

(3)NFAT3抗体免疫沉淀(abcam,ab3447)DNA和蛋白交联物

(4)DNA和蛋白交联物的洗脱和反交联

(5)DNA自旋柱纯化

(6)qPCR分析具体步骤详见6实时荧光定量PCR部分。

序列：

实施例1他克莫司对HSC3和SCC25细胞的影响

选取2株HNSCC细胞系HSC3和SCC25作为研究对象，他克莫司处理，药物处理浓度为HSC3细胞6.925μg/mL，SCC25细胞16.73μ6/mL，处理时间都是72小时，检测用药组和对照组(DMSO溶剂)的细胞增殖与克隆形成差异。

1、使用CCK8试剂盒(Telenbiotech)测量细胞增殖能力；平板克隆形成实验检测集落形成差异。

结果如图1所示，他克莫司抑制HSC3和SCC25细胞的增殖。A：他克莫司组细胞增殖下降；B：他克莫司组克隆形成菌落平均面积及数量低于对照组，*p<0.05，**p<0.01。

2、采用seahorse实验试剂盒(103325-100，103260-100，AgilentTechnologies)检测HNSCC细胞的OCR和ECAR；使用ATP检测试剂盒(Beyotime)测量ATP水平。

结果如图2所示，他克莫司处理后HSC3、SCC25细胞耗氧率(OCR)明显下降；表明他克莫司抑制HNSCC的细胞代谢。

3、海马实验分析用药组和对照组葡萄糖氧化途径、谷氨酰胺途径、脂肪酸途径代谢的差异；分析用药组和对照组GSH及ROS水平的差异、谷氨酰胺代谢下游相关代谢产物的变化。

结果如图3所示，A：通过海马Mito燃料实验测试线粒体氧化葡萄糖途径、谷氨酰胺途径和脂肪酸途径的潜力，发现谷氨酰胺代谢途径的依赖性和灵活性均受他克莫司影响。B：他克莫司处理使GSH、ROS水平下降。表明他克莫司主要抑制HNSCC细胞的谷氨酰胺代谢。*p<0.05，**p<0.01。表明，谷氨酰胺代谢途径的依赖性和灵活性均受他克莫司影响。

4、在用药组中加入谷氨酰胺(Gln)或谷氨酰胺代谢物α-酮戊二酸(AKG)、丙酮酸钠(Pyr)进行挽救实验。

结果如图4所示，他克莫司抑制HSC3和SCC25细胞的增殖。添加谷氨酰胺(Gln)或谷氨酰胺代谢物α-酮戊二酸(AKG)、丙酮酸钠(Pyr)，细胞增殖速率恢复正常。*p<0.05。添加谷氨酰胺(Gln)或谷氨酰胺代谢物α-酮戊二酸(AKG)、丙酮酸钠(Pyr)可逆转他克莫司的细胞增殖抑制作用。表明他克莫司主要抑制HNSCC细胞的谷氨酰胺代谢。

5、他克莫司对HSC3和SCC25细胞后，NFAT3蛋白表达含量检测。

结果如5所示，Western Blot检测结果显示，他克莫司处理后，NFAT3蛋白表达明显受到抑制。他克莫司在HNSCC细胞中以NFAT3为主要靶点，抑制其表达。

实施例2他克莫司在实验鼠肿瘤模型中的治疗效果

1、选取12只雄性BALB/c裸鼠并随机分为2组。在裸鼠右侧腋下皮下注射3.0×10⁶SCC25细胞，用游标卡尺每两天测量一次裸鼠的肿瘤体积(简化公式V＝L*W²/2)，并记录裸鼠体重。肿瘤体积约达100mm³时，以2mg/kg/d的用量开始腹腔注射他克莫司。继续使用游标卡尺每两天测量一次肿瘤体积并记录裸鼠体重，当裸鼠肿瘤生长到约1000mm³时进行荧光体内成像。成像后处死裸鼠，记录肿瘤重量，每个肿瘤标本分为两半，一半石蜡包埋、切片以进行病理诊断，另一半收集用于其他实验。

2、选取24只雄性SD大鼠并随机分为4组。第1组和第2组大鼠饮用蒸馏水，第3组和第4组饮用0.002％4NQO溶液。18周后停用4NQO溶液，使用渗透泵对第2、第4组大鼠给药，用量为他克莫司5mg/kg/d。第22周处死大鼠，每个标本一半石蜡包埋、切片以进行病理诊断，一半收集用于其他实验。

3、选取30只雄性BALB/c裸鼠并随机分为5组。在所有裸鼠右侧腋下皮下注射3.0×10⁶SCC25处理及相应对照组细胞：第一组为sh-NC，第二组为sh-NFAT3；第三组为over-NC，第四、五组为over-NFAT3(具体细胞系构建详见实施例3)。使用游标卡尺每两天测量一次裸鼠的肿瘤体积(简化公式V＝L*W²/2)，并记录其体重。肿瘤体积约达100mm³时，对第五组以2mg/kg/d的用量开始腹腔注射他克莫司。继续使用游标卡尺每两天测量一次肿瘤体积并记录裸鼠体重，当裸鼠肿瘤生长到约1000mm³时进行荧光体内成像。成像后处死裸鼠，记录肿瘤重量，每个肿瘤标本分为两半，一半石蜡包埋、切片以进行病理诊断，另一半收集用于其他实验。

结果如图6所示，他克莫司在实验鼠移植瘤与成瘤模型中均能明显抑制肿瘤细胞增长。与对照组相比，sh-NFAT3在裸鼠移植瘤模型中能够明显抑制肿瘤细胞增长；over-NFAT3能够明显促进肿瘤细胞增长，FK506可显著减缓over-NFAT3肿瘤细胞的增殖。

A：裸鼠皮下成瘤活体成像，他克莫司组荧光强度低于对照组；裸鼠肿瘤大体观，他克莫司组肿瘤质量、体积均低于对照组；B：大鼠4NQO成瘤大体观显示他克莫司组与对照组无明显异常，4NQO组与4NQO+他克莫司组成瘤，其中4NQO组瘤体较大；病理切片ki67染色，H-Score评分结果与大体观相似，显示他克莫司组与对照组无明显差异，4NQO组与4NQO+他克莫司组恶性程度明显升高，4NQO组恶性程度较4NQO+他克莫司组高。C：裸鼠皮下成瘤活体成像荧光强度，sh-NC>sh-NFAT3，over-NFAT3>over-NC>over-NFAT3+FK506；D：裸鼠肿瘤大体观，sh-NFAT3组肿瘤体积低于sh-NC组；over-NFAT3组肿瘤较over-NC组及over-NFAT3+FK506明显增大。*p<0.05，**p<0.01。

实施例3 NFAT3表达对HSC3和SCC25细胞系的影响

1、选取2株HNSCC细胞系HSC3和SCC25作为研究对象，构建si-NFAT3、sh-NFAT3、over-NFAT3和对照细胞系，检测四组细胞中NFAT3的表达量。载体构建方式如表3所示：

表3

Target sequence：

NFATC4-overexpression：

ATGATAACCACCCTCCCATCTCTCCTACCCGCCAGCCTCGCCAGTATCTCCCACCGAGTCACGAATCTCCCATCTAACTCCCTCTCACACAACCCAGGCCTCTCCAAGCCTGACTTTCCCGGAAACTCCAGTCCAGGTCTTCCTTCCTCCTCCAGCCCAGGCCGGGACCTGGGGGCTCCTGCCGGATCCATGGGGGCGGCCAGCTGCGAGGATGAGGAGCTGGAATTTAAGCTGGTGTTCGGGGAGGAAAAGGAGGCCCCCCCGCTGGGCGCGGGGGGATTGGGGGAAGAACTGGACTCAGAGGATGCCCCGCCATGCTGCCGTCTGGCCTTGGGAGAGCCCCCTCCCTATGGCGCTGCACCTATCGGTATTCCCCGACCTCCACCCCCTCGGCCTGGCATGCATTCGCCACCGCCGCGACCAGCCCCCTCACCTGGCACCTGGGAGAGCCAGCCCGCCAGGTCGGTGAGGCTGGGAGGACCAGGAGGGGGTGCTGGGGGTGCTGGGGGTGGCCGTGTTCTCGAGTGTCCCAGCATCCGCATCACCTCCATCTCTCCCACGCCGGAGCCGCCAGCAGCGCTGGAGGACAACCCTGATGCCTGGGGGGACGGCTCTCCTAGAGATTACCCCCCACCAGAAGGCTTTGGGGGCTACAGAGAAGCAGGGGGCCAGGGTGGGGGGGCCTTCTTCAGCCCAAGCCCTGGCAGCAGCAGCCTGTCCTCGTGGAGCTTCTTCTCCGATGCCTCTGACGAGGCAGCCCTGTATGCAGCCTGCGACGAGGTGGAGTCTGAGCTAAATGAGGCGGCCTCCCGCTTTGGCCTGGGCTCCCCGCTGCCCTCGCCCCGGGCCTCCCCTCGGCCATGGACCCCCGAAGATCCCTGGAGCCTGTATGGTCCAAGCCCCGGAGGCCGAGGGCCAGAGGATAGCTGGCTACTCCTCAGTGCTCCTGGGCCCACCCCAGCCTCCCCGCGGCCTGCCTCTCCATGTGGCAAGCGGCGCTATTCCAGCTCGGGAACCCCATCTTCAGCCTCCCCAGCTCTGTCCCGCCGTGGCAGCCTGGGGGAAGAGGGGTCTGAGCCACCTCCACCACCCCCATTGCCTCTGGCCCGGGACCCGGGCTCCCCTGGTCCCTTTGACTATGTGGGGGCCCCACCAGCTGAGAGCATCCCTCAGAAGACACGGCGGACTTCCAGCGAGCAGGCAGTGGCTCTGCCTCGGTCTGAGGAGCCTGCCTCATGCAATGGGAAGCTGCCCTTGGGAGCAGAGGAGTCTGTGGCTCCTCCAGGAGGTTCCCGGAAGGAGGTGGCTGGCATGGACTACCTGGCAGTGCCCTCCCCACTCGCTTGGTCCAAGGCCCGGATTGGGGGACACAGCCCTATCTTCAGGACCTCTGCCCTACCCCCACTGGACTGGCCTCTGCCCAGCCAATATGAGCAGCTGGAGCTGAGGATCGAGGTACAGCCTAGAGCCCACCACCGGGCCCACTATGAGACAGAAGGCAGCCGTGGAGCTGTCAAAGCTGCCCCTGGCGGTCACCCCGTAGTCAAGCTCCTAGGCTACAGTGAGAAGCCACTGACCCTACAGATGTTCATCGGCACTGCAGATGAAAGGAACCTGCGGCCTCATGCCTTCTATCAGGTGCACCGTATCACAGGCAAGATGGTGGCCACGGCCAGCTATGAAGCCGTAGTCAGTGGCACCAAGGTGTTGGAGATGACTCTGCTGCCTGAGAACAACATGGCGGCCAACATTGACTGCGCGGGAATCCTGAAGCTTCGGAATTCAGACATTGAGCTTCGGAAGGGTGAGACGGACATCGGGCGCAAAAACACACGTGTACGGCTGGTGTTCCGGGTACACGTGCCCCAGGGCGGCGGGAAGGTCGTCTCAGTACAGGCAGCATCGGTGCCCATCGAGTGCTCCCAGCGCTCAGCCCAGGAGCTGCCCCAGGTGGAGGCCTACAGCCCCAGTGCCTGCTCTGTGAGAGGAGGCGAGGAACTGGTACTGACTGGCTCCAACTTCCTGCCAGACTCCAAGGTGGTGTTCATTGAGAGGGGTCCTGATGGGAAGCTGCAATGGGAGGAGGAGGCCACAGTGAACCGACTGCAGAGCAACGAGGTGACGCTGACCCTGACTGTCCCCGAGTACAGCAACAAGAGGGTTTCCCGGCCAGTCCAGGTCTACTTTTATGTCTCCAATGGGCGGAGGAAACGCAGTCCTACCCAGAGTTTCAGGTTTCTGCCTGTGATCTGCAAAGAGGAGCCCCTACCGGACTCATCTCTGCGGGGTTTCCCTTCAGCATCGGCAACCCCCTTTGGCACTGACATGGACTTCTCACCACCCAGGCCCCCCTACCCCTCCTATCCCCATGAAGACCCTGCTTGCGAAACTCCTTACCTATCAGAAGGCTTCGGCTATGGCATGCCCCCTCTGTACCCCCAGACGGGGCCCCCACCATCCTACAGACCGGGCCTGCGGATGTTCCCTGAGACTAGGGGTACCACAGGTTGTGCCCAACCACCTGCAGTTTCCTTCCTTCCCCGCCCCTTCCCTAGTGACCCGTATGGAGGGCGGGGCTCCTCTTTCTCCCTGGGGCTGCCATTCTCTCCGCCAGCCCCCTTTCGGCCGCCTCCTCTTCCTGCATCCCCACCGCTTGAAGGCCCCTTCCCTTCCCAGAGTGATGTGCATCCCCTACCTGCTGAGGGATACAATAAGGTAGGGCCAGGCTATGGCCCTGGGGAGGGGGCTCCGGAGCAGGAGAAATCCAGGGGTGGCTACAGCAGCGGCTTCCGAGACAGTGTCCCTATCCAGGGTATCACGCTGGAGGAAGTGAGTGAGATCATTGGCCGAGACCTGAGTGGCTTCCCTGCACCTCCTGGAGAAGAGCCTCCTGCCTAG

NFATC4-shRNA-1：TCAGGTGCACCGTATCACA

NFATC4-shRNA-2：AGCTGAGGATCGAGGTACA

构建si-NFAT3所用的siRNA序列与shRNA一致。

结果如图7所示，Western Blot检测si/sh-NFAT3及over-NFAT3的效率，显示NFAT3敲低及过表达成功。在接下来的实验中，选取si-NFAT3细胞进行细胞实验，sh-NFAT3细胞进行动物实验。

2、检测si-NFAT3、over-NFAT3和对照组细胞增殖和集落形成差异。

结果如图8所示，NFAT3基因敲减抑制细胞增殖；NFAT3过表达促进细胞增殖，表明NFAT3的表达与头颈部鳞状细胞癌增殖相关。而他克莫司处理可逆转NFAT3过表达引起的细胞增殖变化。

3、检测si-NFAT3、over-NFAT3和对照组GSH、ROS水平差异

结果如图9所示，NFAT3敲减后GSH水平降低，ROS水平升高。NFAT3过表达呈现相反趋势。证明NFAT3敲减抑制谷氨酰胺代谢。他克莫司处理可逆转NFAT3过表达引起的代谢变化。

实施例4 NFAT3互作蛋白研究

1、用NFAT3抗体进行蛋白质免疫沉淀质谱(IP-MS)鉴定其可能的互作蛋白，通过Co-ip鉴定NFAT3、NONO、SFPQ间的相互作用

结果如图10所示，NFAT3、SFPQ和NONO存在蛋白与蛋白之间的结合。

2、敲低NFAT3，检测NFAT3、SFPQ和NONO之间的结合

结果如图11所示，敲减NFAT3破坏了NFAT3、SFPQ和NONO之间的结合，表明NFAT3、SFPQ和NONO存在蛋白与蛋白之间的结合，NFAT3是维持这种蛋白质复合物的关键因素。

3、借助PDB数据库提供的蛋白结构，计算机模拟NFAT3-SFPQ-NONO的结合。

结果如图12所示，电脑模拟NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物结合模式。

4、在HSC3和SCC25细胞系检测用药组与对照组之间NFAT3-SFPQ-NONO蛋白复合物的形成。

结果如图13所示，他克莫司能够抑制NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物的构成。

5、敲除SFPQ或NONO，CHIP-qPCR检测NFAT3-SFPQ-NONO复合物与c-Myc启动子之间的结合。

结果如图14所示，NFAT3-SFPQ-NONO以复合物形式与c-Myc启动子结合，调控基因表达。

6、借助PDB数据库提供的蛋白结构，计算机模拟NFAT3-SFPQ-NONO复合物和c-Myc启动子之间的结合。

结果如图15所示，电脑模拟NFAT3/SFPQ/NONO蛋白复合物与c-Myc启动子结合模式

7、TCGA数据库分析GLS与c-Myc表达相关性。

结果如图16所示，Myc表达与谷氨酰胺酶(GLS)表达正相关，可进一步影响下游谷氨酰胺代谢。

实施例5临床样本分析

2005-06至2017-12于中山大学附属第一医院及口腔医院临床收集45例HNSCC肿瘤及其癌旁正常组织。所有患者术前无局部手术、放疗和化疗病史，全身检查无其他恶性肿瘤。手术后肿瘤组织均经病理诊断，为口腔鳞状细胞癌。所有患者在研究前均知情同意，研究方案已提交中山大学口腔医院伦理委员会审核批准。

1、收集临床标本，分析其NFAT3表达情况，分析各分子表达相关性及预后。

结果如图17所示，NFAT3、Myc、GLS在癌组织中异常高表达。

2、TCGA数据库分析各分子在其他类型肿瘤中的表达及预后

结果如图18所示，高表达NFAT3-SFPQ-NONO与HNSCC患者(n＝490，P＝0.0012)存活率下降相关，其结论在其他类型的肿瘤中得到类似验证，具有一定普适性。表明NFAT3还可作为头颈部鳞状细胞癌的诊断标记物，用于HNSCC预后诊断。

Claims (10)

1.NFAT3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

2.NFAT3在制备头颈部鳞状细胞癌谷氨酰胺代谢调控制剂中的应用。

3.NFAT3作为诊断标记物在制备头颈部鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

4.NFAT3表达抑制剂在制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用。

5.一种头颈部鳞状细胞癌治疗药物，其特征在于，含有NFAT3表达抑制剂。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述抑制剂为抑制NFAT3表达的siRNA或shRNA。

7.根据权利要求6所述的的药物，其特征在于，所述siRNA或shRNA的序列为TCAGGTGCACCGTATCACA或AGCTGAGGATCGAGGTACA。

8.一种头颈部鳞状细胞癌诊断产品，其特征在于，包含检测NFAT3表达量的试剂。

9.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于，还含有他克莫司。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述头颈部鳞状细胞癌为口腔鳞癌。

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