CN109613254B - 一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物pdia2 - Google Patents

Abstract

一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物PDIA2。本发明属于生物医学技术领域，涉及PDIA2蛋白作为肿瘤标志物、肿瘤诊断试剂和肿瘤靶向药物的用途。本发明通过对临床患者样本癌和癌旁组织中的PDIA2进行蛋白质水平的测定，结果显示在癌症组织中PDIA2的表达高于癌旁组织；进一步研究揭示PDIA2通过抑制线粒体功能促进肿瘤发生发展，据此PDIA2可广泛用于作为各种肿瘤标志物，进一步制备肿瘤诊断试剂和制备各种肿瘤靶向药物，以及，本发明体外试验结果显示PDIA2与结肠癌细胞的生长增殖呈正相关，敲减了PDIA2后结肠癌细胞生长缓慢；裸鼠结肠癌模型体内实验证实，敲减了PDIA2的HT29生长慢于正常HT29；进一步，该PDIA2可用于制备治疗结肠癌的靶向药物。

Description

一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物PDIA2

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及肿瘤标志物、肿瘤诊断和抗肿瘤治疗。具体涉及PDIA2蛋白作为肿瘤标志物的用途、针对PDIA2的肿瘤诊断和鉴别诊断试剂，以及用于制备抗各种肿瘤新药的用途。

背景技术

尽管临床诊断和治疗技术的长足进步，预计癌症仍将是21世纪世界上每个国家增加预期寿命的主要障碍。根据世界卫生组织2015年的估计，癌症是172 个国家中91个国家70岁以前的第一或第二大死亡原因，在另外22个国家中排名第三或第四，到2018年，估计将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡。

根据我国国家癌症中心2018年统计数据，2014年全国恶性肿瘤新发病例数 380.4万例,平均每天超过1万人(每分钟有7人)被确诊为癌症；我国肿瘤死亡率为167.89/10万,中标率为106.98/10万(世标率为106.09/10万)，因此，肿瘤仍然是人类健康的重大威胁。

据统计，在前10位高发癌症中，结肠癌(colorectal cancer,CRC)已成为世界范围的一个主要的卫生难题。根据美国癌症协会报道，结肠癌发生率排第三，死亡率排第二。随着人类寿命延长，结肠癌的发病率呈增长的趋势。据2017年美国对结肠癌患者年龄的分析显示，50-64岁之间的新发男性占34％，女性占 28％；65-79岁之间的新发男性占38％，女性占35％；50岁以下的人发病较少。中国男性结肠癌发病率排第五，女性结肠癌发病率排第三，而两性结肠癌死亡率分别排第五和第四。此外，由于我国人口基数庞大，有些筛查并没有普及到全国各地，致使结肠癌的发病率和死亡率仍呈增长态势。

居高不下的肿瘤临床发生率和死亡率映射了癌症治疗效果不佳的现状。过去 100多年来的癌症治疗方案均以杀死癌细胞为唯一目的，通过手术刀杀死癌细胞，小分子化合物毒死癌细胞，放射性射死癌细胞，激活免疫系统咬死癌细胞，但这些治疗手段没有根本改变癌症的治愈率，且毒副作用大。

为了提高疗效和减低毒副作用，近年来越来越多的研究关注于精准靶向治疗，试图通过寻找肿瘤细胞特异性蛋白或者表达异常的蛋白作为生物标志物，研发新的肿瘤精准治疗方法，包括Car-T治疗和针对PD-1/PD-L1的免疫促进治疗等，但它们的疗效和毒副作用尚待评估。因此，继续寻找控制肿瘤生长的关键靶点分子对改善肿瘤的临床治疗效果有着重要的意义。蛋白质组学运用质谱技术，通过标记的方法(iTRAQ标记或者同位素标记)为研发新的肿瘤干预靶点提供了技术平台。通过比较癌症组织和健康组织中蛋白质的差异表达或同一蛋白表达量的变化，发现新蛋白或量变蛋白，然后在体外(细胞水平)或者体内(通过构建动物模型，模拟体内环境)对差异蛋白进行功能验证，动物模型用药物治疗，从而为开发新的抗癌靶向药物和临床诊断试剂提供新的生物标志物。

当针对肿瘤生长信号通路的靶向治疗遇到毒副作用的瓶颈，肿瘤代谢成为了当前的研究热点。支持肿瘤快速增长的基本条件是细胞代谢的改变。通常细胞通过两种代谢途径获得能量，即葡萄糖酵解和线粒体氧化磷酸化，两者互补，共同满足细胞需要。但线粒体是细胞的主要产能细胞器，是细胞的立命之本，除了高效率产能之外，还参与其他的细胞生命活动。比如，它们能控制细胞间的信号传递、细胞的分化与生死周期—如果线粒体不能正常工作，就会促使细胞启动凋亡程序(这种情况下“自杀未遂”的细胞可能会变成癌细胞—提升线粒体效率可以延长细胞的生命。肿瘤细胞的最大改变就是破坏细胞线粒体功能，迫使细胞使用葡萄糖酵解途径产生必要的能量，即所谓“沃尔伯格效应”(Warburg effect)，因此，沃尔伯格效应是所有肿瘤的代谢生物标志物。基于肿瘤代谢改变的普遍性，本申请的发明人假设重朔肿瘤细胞线粒体功能，恢复葡萄糖酵解和线粒体氧化磷酸化动态平衡，抑制癌症细胞的恶性增殖，促进癌症细胞的正常转化，从而达到治疗肿瘤的临床效果。

基于上述的理论假设，本申请以结肠癌为研究模型，通过蛋白质质谱分析，发现了PDIA2在结肠癌细胞中高表达，且存在于线粒体。PDIA2通过抑制线粒体功能和结构，促进结肠腺上皮细胞的恶性转化；抑制PDIA2活性可恢复结肠癌细胞线粒体功能和结构，抑制体外结肠癌细胞增殖率和体内肿瘤生长。这一发现支持上述的假说：即通过肿瘤细胞线粒体重朔促进肿瘤细胞的正常转化，达到肿瘤肿瘤的目的。基于肿瘤代谢变化的普遍性，在结肠癌中的这一发明可以应用于所有其他类型的肿瘤。此外，这一发明也可以作为新的标志物用于肿瘤的早期诊断。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供PDIA2作为新的肿瘤标志物和肿瘤诊断和靶向治疗的新靶标。

与本发明相关的现有技术有，

[1]Siegel R L,Fedewa S A,Anderson W F,et al.Colorectal CancerIncidence Patterns in the United States,1974–2013[J].JNCI:Journal of theNational Cancer Institute,2017,109(8).

[2]Mármol I,Sánchez-de-Diego C,Pradilla Dieste A,et al.ColorectalCarcinoma:A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer[J].International Journal of Molecular Sciences,2017,18(12):197.

[3]Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA:ACancer Journal for Clinicians,2016,66(1):7-30.

[4]Kim H J,Kang U B,Lee H,et al.Profiling of differentially expressedproteins in stage IV colorectal cancers with good and poor outcomes[J].Proteomics, 2011:2983-2997.

[5]Wang P,Zhu B.Usefulness of molecular modeling in characterizingthe ligand-binding sites of proteins:experience with human PDI,PDIp and COX[J]. Current medicinal chemistry,2013,20(31):3840.

[6]Wang F,Chen J G,Wang L L,et al.Up-regulation of LINC00346inhibitsproliferation of non-small cell lung cancer cells through mediating JAK-STAT3signaling pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(22):5135-5142.

[7]DeLong J C,Murakami T,Yazaki P J,et al.Near-infrared–conjugatedhumanized anti-carcinoembryonic antigen antibody targets colon cancer in anorthotopic nude-mouse model[J].Journal of Surgical Research,2017,218:139-143.

[8]Li H,Li M,Luo C,et al.Lactoferrin exerts anti-tumor effects byinhibiting angiogenesis in a HT29human colon tumor model[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2017.。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供新的肿瘤标志物及肿瘤治疗新靶点，具体涉及PDIA2蛋白作为肿瘤标志物的用途，以及PDIA2在制备针对各种肿瘤诊断试剂和针对各种肿瘤靶向药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现，

本发明中以结肠癌为研究模型，进行了下述试验：

PDIA2作为肿瘤标志物的发现：本发明通过DSS和AOM灌胃方法构建了大鼠结肠癌模型，采用2DE-MS方法分析正常结肠粘膜上皮组织和结肠癌组织的差异蛋白质表达，发现PDIA2蛋白在结肠癌组织中高表达，并通过免疫印迹 (WB)方法获得验证；随后对PDIA2高表达进行临床验证：收集结肠癌病人组织做组织芯片，免疫组化定性与半定量分析，同时，对结肠癌病人组织进行免疫印迹(WB)验证，结果均表明人结肠癌组织高度表达PDIA2，且PDIA2表达量与肿瘤转移及临床分期呈正相关；

PDIA2在细胞线粒体中的定位：于文献报道PDIA2主要定位于细胞内质网，调节蛋白质在内质网的准确折叠，本发明中利用Abcam公司的PDIA2单克隆抗体对HT29细胞中PDIA2进行免疫荧光染色分析，第一次观察到线粒体 PDIA2；

PDIA2在肿瘤发生发展中的作用：1：细胞模型：野生型HT29结肠癌细胞株用包装的空载质粒(P0)和含有PDIA2shRNA质粒(P3)的病毒感染，经嘌呤霉素筛选获得对照的P0细胞株和P3PDIA2减低细胞株；P0和P3HT29结肠癌细胞株在体外培养下，利用细胞增殖实验(CCK8)检测PDIA2对HT29细胞的生长、增殖的影响，发现敲低PDIA2明显抑制肿瘤细胞的增殖率；2：小鼠模型：将P0和P3HT29细胞经皮下注射到无免疫能力的裸鼠背部，定时记录肿瘤生长情况，种植肿瘤4周后，在麻醉状态下对裸鼠进行拍照，采集心脏血，然后常规处理,取出肿瘤；从剥离的肿瘤组织中抽提蛋白质和RNA，分别通过q-PCR 方法和蛋白质免疫印迹分析PDIA2在对照组(P0)和PDIA2敲低组肿瘤组织中 RNA与蛋白质水平的表达变化，并用心脏血分析PDIA2干扰对裸鼠肝肾功能的影响；在构建的结肠癌裸鼠模型中，体外测量肿瘤大小发现，PDIA2敲减组(P3) 肿瘤生长明显慢于HT29组和P0组，分析心脏血的肝肾功能，发现三组老鼠中， P3组只有总胆固醇含量与P0组和HT29组有明显差异，P3组总胆固醇低于P0 组和HT29组；同时，用裸鼠肿瘤组织中进行检测，确证PDIA2在蛋白质水平和RNA水平均显示PDIA2基因敲减组的PDIA2含量低于HT29组和空载体P0 组；

PDIA2在肿瘤发生发展中的机制研究：根据观察到的PDIA2对肿瘤细胞增长率和肿瘤生长曲线的抑制作用及PDIA2的线粒体定位，进一步利用线粒体特异染料(MitoTracker-Deep Red)比较P0(野生型对照)和P3(PDIA2减低) HT29结肠癌细胞中线粒体变化，探讨PDIA2对线粒体再生的影响，并利用 Seahorse细胞能量分析仪分析PDIA2对线粒体功能的影响，结果显示敲低 PDIA2明显增加细胞内线粒体密度和荧光强度；显著增加线粒体氧耗量、线粒体 ATP生产量和线粒体呼吸链储备能力，结果表明PDIA2通过抑制细胞线粒体功能促进肿瘤生长。

本发明的实验结果表明：1)PDIA2在结肠癌患者癌组织中高表达；2)敲低 PDIA2抑制结肠癌细胞增长率；3)敲低PDIA2抑制肿瘤生长曲线；4)PDIA2存在于线粒体中；5)敲低PDIA2促进线粒体再生；6)敲低PDIA2促进线粒体代谢功能。

进一步，本发明的PDIA2蛋白可作为肿瘤标志物，以及制备针对PDIA2的肿瘤诊断和鉴别诊断试剂，以及用于制备抗各种肿瘤新药。

本发明提供了新的肿瘤标志物及肿瘤治疗新靶点，尤其涉及PDIA2蛋白作为肿瘤标志物的用途，以及PDIA2在制备针对各种肿瘤诊断试剂和针对各种肿瘤靶向药物中的应用，本发明的技术方案具有重要的临床应用价值。

本发明中，所采用的缩略词如表1所示，

表1缩略词表

附图说明

图1-1，结肠癌动物模型建立与验证，其中，

52)C57小鼠给药过程；B.C57小鼠体重的变化过程；C.病理检测结肠粘膜的变化过程；

图1-2，电泳分离差异蛋白质，其中，A.对照组；B.实验组；

图1-3，WB检测PDIA2的表达，其中，A和B.PDIA2在C57模型结肠粘膜中的表达；B.ImageJ软件定量分析A中WB条带；C和D.PDIA2在结肠癌和癌旁组织中的表达；D.ImageJ软件定量分析C中WB条带；T：癌，N：癌旁；

图1-4，芯片结果，其中，A，a1代表癌组织，b1代表癌旁组织；B，所有样本中癌症和癌旁组织中PDIA2表达的病理评分；C.女性患者中PDIA2表达的病理评分；Adjacent代表癌旁，CRC代表癌症；N0,N1,N2-5,N1-5分别代表没有转移，转移1级，2-5级和1-5级。

图2-1，显微镜下观察慢病毒感染及细胞形态，其中，A，荧光显微镜观察不同靶点病毒感染情况(感染48h)，P1、P2、P3分别代表不同靶点，P0为空载； B，细胞形态变化(感染96h)；

图2-2，慢病毒包装、感染敲减验证，其中，A，不同靶点病毒感染HT29 情况，P1、P2、P3分别代表不同靶点，P0为空载；B，WB检测PDIA2的敲减情况，右边为左边WB的Image J定量分析结果；C.QRT-PCR结果。*表示P＜ 0.05，**表示P＜0.01，**表示P＜0.001。

图3，敲减PDIA2后HT29细胞活性情况，其中，P2、P3分别代表不同靶点，P0为空载，HT29为靶细胞。

图4-1，PDIA2敲减对裸鼠肿瘤的影响，其中，A.28天内肿瘤大小的变化B.28天裸鼠肿瘤的活体照片；C.被拨离的肿瘤；

图4-2，三组裸鼠心脏血中总胆固醇含量的比较，*表示P＜0.05。

图5，PDIA2在细胞亚结构中的分布。

图6，PDIA2对线粒体再生的影响。

图7，PDIA2对线粒体功能的影响。

具体实施方式

本发明实验所采用的材料与设备如下述，

主要试剂

主要溶液配制：

1)1％戊巴比妥钠：称取1g，加100mL的ddH₂O溶解，用0.22μm滤器过滤，10mL分装，放于4℃待用。

2)10×TBS溶液：称取Tris 60.55g，NaCl87.5g，加800mL ddH₂O，调节pH 至7.5，再定容到1L。

3)TBST溶液：上述TBS溶液，取100mL，加900mL的ddH₂O稀释，再加1mL吐温20，混匀待用。

4)5-10％封闭液：称取2-4g脱脂牛奶，加TBST溶液至40g即可。

5)氨苄抗生素：80μg/mL，用高压过的水配制，配好后过滤。

52)2D-lysis裂解液：

配制时，先溶解硫脲，再加入尿素和其他成分，小心加入 NP-40，临用前每1mL裂解液加入下列：100mM的PMSF，10μL， DTT，10mg，DNA酶Ⅰ(1μg/mL),10uL

52)10×电泳缓冲液(2L)

定容至2L，用时稀释至1×即可

8)10×湿转缓冲液

定容至2L，用时稀释至1×湿转缓冲液：200mL的10×湿转缓冲液，100mL 的甲醇，加700mL的ddH₂O定容至1L

9)分离胶缓冲液(1.5MTris-HCl,pH8.8，250mL)

先溶解Tris，用HCl调节pH为8.8，定容后加入2g的SDS，混匀后放4℃，待用。

10)浓缩胶缓冲液(0.5Mtris-HCl,pH6.8，100mL)

先溶解Tris，用HCl调节pH为6.8，定容后加入2g的SDS，混匀后放4℃，待用。

11)2×Loading缓冲液(100mL)

最后，加入一定量的溴酚蓝(肉眼可看出颜色即可)，1mL分装，放于-20℃储存待用。

12)LB液体/固体培养基配制

调节pH至7，然后高压灭菌，固体培养基待冷却至60度左右时，按照1:1000 的比例加入氨苄抗生素(浓度80μg/mL)；液体培养基在临用前按比例加入氨苄抗生素，4℃保存。

主要仪器设备

其他实验器材:1mL注射器，弯头镊子，手术剪刀，手术钳，EDTA抗凝管，采血针等等。

实验动物：4周龄，体重10-15g的SPF级雄性裸小鼠，由上海市公共卫生临床中心动物中心提供[SCXK(沪)2010-0024]，动物饲养于无菌动物实验室 [SYXK(沪)2010-0098]

结肠癌患者组织样本：结肠癌患者癌组织和癌旁组织来源于上海市金山医院，患者事先签署知情同意书。

实施例1动物结肠癌模型中获得PDIA2差异蛋白与验证实验

构建大鼠结肠癌模型：用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)和氧化偶氮甲烷(AOM) 灌胃构建结肠癌模型，并由病理学家判断粘膜受损程度，确定造模成功(如图 1-1所示)；

2DE-MS筛选差异蛋白质：大鼠结肠癌粘膜组织，提取蛋白后电泳染色(如图1-2所示)，然后样本通过LC-MS/MS质谱分析，以对照组做参照，获得上调的蛋白质PDIA2；

免疫印迹技术(WB)验证PDIA在结肠癌中表达上调：用结肠癌模型中处理7和14周的结肠粘膜样品和6份临床患者结肠癌和癌旁组织样品，进行 WB实验，样品用液氮研磨，并加入一定体积的2D-lysis进行裂解，然后进行 SDS-PAGE分离，免疫印迹实验，结果如图1-3所示：在动物模型和临床标本中，PDIA2均在结肠癌中表达上调；

组织芯片技术验证PDIA2在结肠癌中表达上调：通过组织芯片做PDIA2 的免疫组化定性分析和定量分析，将90例结肠癌患者癌和癌旁组织，分别包埋在石蜡中，用取样针将目的区域的组织点在事先规定好的区域，同一个体分别有癌和癌旁两个组织，放于一排；尽量保证所有样本在一张片子上；一抗、二抗孵育后由2位病理专家进行单独读片与评分，如图1-4所示，PDIA2在结肠癌组织的表达显著高于癌旁的，且其表达与肿瘤转移相关。

实施例2 PDIA2敲低实验

细胞培养：HT29细胞培养于McCoy’S 5A完全培养基(90％McCoy’S 5A+10％FBS，必要时加0.1％谷氨酰胺以及0.1％双抗，青霉素和链霉素)，放入 37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；

PDIA2基因干扰：PDIA2敲减的质粒及菌液由吉凯基因公司合成，载体为 GV24811.5kb,靶信息见表2-1；在超净工作台中，用接种环取少量菌液，分区划线接种于加有氨苄抗生素的固体平板中(1:1000加入抗生素)，倒扣放于37℃培养箱中培养16小时或者更长时间，视菌落生长速度而定，挑取单克隆菌落，转接于加有氨苄抗生素的液体培养基中，放于37℃摇床中，220rpm/min培养 12-16h后取出，及时抽取质粒；

表2-1 PDIA2靶点信息

59653-1,59654-2和59655-2下文依次被命名为P1,P2,和P3

干扰基因感染HT29细胞及验证：

慢病毒包装：

①复苏293T细胞，用来包装慢病毒，DMEM完全培养基培养，要求使用代数靠前细胞；

②Day1：转染前一天，用胰酶消化293T 1min，计数后接种于10cm dish中，尽量保证每个皿中有6.5×10⁶个细胞，培养基体积为8.5mL，用于转染；

③Day2：取2mL的EP管，加入1.5mLOPTI-MEM，再加入慢病毒包装辅助质粒psPAX27.5μg、pMD2.G 2.5μg，以及目的质粒10μg，混匀，再加入30μL。HG-Trans293^TM转染试剂，混匀，室温静置30min后，均匀滴加在前一天铺的293T细胞中，注意不要将细胞吹起。8-12h后换DMEM 完全培养基；

④Day4：转染48h后收上清于50mL离心管中，暂存于4℃中，并重新补加10mLDMEM完全培养基，荧光显微镜拍照观察转染效率，然后放于 37℃、5％CO₂中继续孵育；

⑤Day5：72h收上清，和48h上清合并，1000g/min离心10min，根据具体使用量分装，冻存于-80℃中。

病毒感染HT29细胞：

吉凯合成目的质粒四个，其中P0为空载体，P1、P2、P3分别为PDIA2 敲减质粒，载体四个均包装慢病毒；

提前一天在六孔板中接种HT29细胞，每孔细胞数为2×10⁶个，共铺9个孔。感染：P0、P1、P2、P3四个病毒，慢病毒分别加500μL和1000μL，剩下的用McCoy’S 5A完全培养基补至2mL，各加入2μL辅助感染试剂polybrene，混匀，放于孵箱中培养，8h后更换McCoy’S 5A完全培养基，感染HT29细胞 24h、48h、72h、96h后用荧光显微镜观察细胞形态和感染效率(如图2-1和图2-2所示)。

PDIA2敲减蛋白质水平验证：

慢病毒感染96h后收集细胞(胰酶消化后，McCoy’S 5A完全培养基中和， 300g/min离心，去除培养基，用PBS洗涤，离心，尽量去除PBS)，2D-lysis 裂解，冰上裂解细胞半个小时，每隔5min振荡一次，然后4℃，12000rpm离心10min，取上清，定量步骤同上，免疫印迹蛋白上样25μg，步骤同上；

PDIA2敲减RNA水平验证(结果如图2-2所示)；PDIA2引物序列如下表2-2 所示：

表2-2 PCR引物序列表

实施例3 PDIA2对细胞增值的影响--CCK8增殖实验

1)准备一瓶T25规格的HT29细胞，消化下来后，计数配制成5×10⁴/mL 的细胞悬液，均匀加在96孔板中，每孔100μL，使细胞数量保持为5×10³/ 孔，待贴壁完全后进行后续实验；

2)第二天，细胞贴壁后，用病毒感染，根据前面PDIA2基因敲减的验证，选择P3靶点敲减的病毒，分别配制P0、P3的病毒悬液(病毒体积根据前面试验确定)：每个孔65μL病毒+65μL培养基，另外再以1:500或者1:1000 的比例加入辅助感染试剂polybrene，混匀后放置在37℃、5％CO₂的孵箱中培养，8h后更换McCoy’S 5A完全培养基，进行后续的CCK8实验；实验

具体排布如下：

HT29

HT29

HT29

P0

P0

P0

P3

P3

P3

共有五组，分别在第0、2、4、6、8天用CCK8试剂盒测试吸光度；

3)细胞OD值测定：CCK8试剂提前从4℃拿出来，在室温平衡，用McCoy’S 5A完全培养基配制CCK8溶液：100μL培养基+10μLCCK8溶液，混匀，待用；从培养箱中取出96孔板，弃去之前的培养基，再每孔加入110μL上述混合溶液，将96孔板放回培养箱，孵育1h后取出，用酶标仪在波长450nm 处测定OD值，分别在感染第0、2天、4天、6、8天测定(图3)，记录数据，用于后续分析；

4)重复上述实验2次。

实施例4裸鼠结肠癌模型体内实验

1)分为三组：HT29组，P0稳转细胞组，P3稳转细胞组，稳转的细胞用嘌呤霉素筛选14天，每组裸鼠8只，提前大量培养HT29细胞，并用P0、P3 病毒感染96h后消化，消化过程同HT29细胞；细胞悬液浓度参照预实验结果为1×10⁶个/mL，每只老鼠接种100μL，接种过程尽量保证一致；

2)建模期间，定期观察老鼠状态，游标卡尺测量肿瘤生长大小并记录(如图 4-1所示)，用于后续分析。待接种细胞后28天，终止实验；

3)取肿瘤：麻醉老鼠后并拍照记录肿瘤在体情况，然后心脏采血，用于监测肝肾功能，该部分送至上海市公共卫生临床中心检验科测定；剥离肿瘤，拍照记录，并将肿瘤分为四份：一份抽提蛋白质，用WB验证；一份抽提 RNA，用qPCR方法验证；一份液氮冷冻后，寄公司做RNA测序；一份用 4％福尔马林4℃固定过夜，用于做免疫组化；

a)抽提蛋白质：液氮研磨，加裂解液裂解后，离心，收上清；Bradford定量后，用WB方法进行PDIA2含量的验证，步骤同前；

b)抽提RNA：事先准备好带钢珠的冻存管，加入1mLTRIZOL，将组织剪碎后加入，用匀浆机充分振荡混匀，匀浆一次用冰冷却后再一次匀浆，直至没有肉眼可见的组织为止；后续抽提步骤参照细胞RNA抽提的方法进行；Nanodrop定量后，反转录为cDNA，然后用Q-PCR的方法对PDIA2基因进行定量分析，步骤同前。

实施例5：线粒体PDIA2的发现

野生型HT29结肠癌细胞培养于8室细胞培养玻片，CO₂细胞培养箱过夜，加入线粒体染料MitoTracker Deep Red到细胞培养液中，终浓度为100nM，孵育30分钟标记细胞线粒体，然后在避光条件下进行PDIA2染色，细胞经PBS 缓冲液洗三遍，然后用1％福尔马林-PBS缓冲液固定10分钟，再用1％ Triton-X-100-PBS室温下孵育10分钟破膜，并用5％PBS-牛奶缓冲液封闭30分钟；然后，玻片用1:20PBS-T稀释的Abcan公司鼠抗人PDIA2单克隆抗体孵育玻片，于4℃过夜。玻片用PBS-T洗3遍后，与1:100PBS-T稀释的FITC-抗鼠 IgG二抗在室温下孵育1小时，用共聚焦显微镜分析PDIA2(绿色荧光)与线粒体(红色荧光)的融合(深黄色荧光)(如图5)。

实施例6：PDIA2对线粒体再生的影响

P0(对照)和P3(PDIA2敲低)细胞培养于8室细胞培养玻片，CO2细胞培养箱过夜，加入线粒体染料MitoTracker Deep Red到细胞培养液中，终浓度为 100nM，孵育30分钟标记细胞线粒体，用共聚焦显微镜对比分析P0和P3细胞线粒体染色强度和分布情况(如图6 )。

实施例7：PDIA2对线粒体呼吸链功能影响实验

使用Agilent公司Seahorse能量代谢分析仪对比分析P0(对照)和P3(PDIA2 敲低)细胞线粒体呼吸链功能：

1：XFe培养液：

Agilent XF基础培养液加:1):葡萄糖(10mM)2)：丙酮酸(1mM)3： L-谷氨酸(2mM)。调节pH＝7.4

2：使用DMSO配置呼吸链复合物抑制剂浓缩液(2.5mM)：

1)：寡霉素(oligomycin)：呼吸链复合物V抑制剂

2)：羰基4甲氧基苯腙氰化物(FCCP)：呼吸链解偶联剂

3)：鱼藤酮(rotenone)：呼吸链复合物I抑制剂

4)：A抗霉素(antimycin A)：呼吸链复合物II抑制剂

3：水化探针板：24孔XFe-24探针板，每孔加1ml Seahorse XF校准缓冲液，将探针浸入校准液中，置于37℃无CO2培养箱中过夜；

4：细胞准备：将P0和P3细胞种入Agilent XFe-24 24孔板中，6复孔培养于常规细胞培养液中(Corning公司DMEM+10％胎牛血清)过夜，用XFe 培养液洗细胞2次后，每孔加入500ul XFe培养液，置细胞培养板于37℃无CO2培养箱中1小时；

5：线粒体呼吸链功能分析(氧消耗率，OCR)：在探针板顶端A，B，C孔中分别加入寡霉素、FCCP，和鱼藤酮+A抗霉素，使终浓度均为1uM。置探针板于XFe-24细胞能量分析仪，校准探针后，将探针板24孔底板用细胞板置换，依次分析基础OCR，加入寡霉素后OCR，FCCP后OCR，和加入鱼藤酮+A抗霉素OCR变化(如图7所示)。

本发明的实施例中，所得的数据均用SPSS 22.0统计软件进行分析，实验重复2-3次，以P＜0.05为有统计学差异。

本发明的实验结果显示：PDIA2在C57结肠癌模型的粘膜组织(图1-1)中表达上调(图1-2和图1-3)，人体结肠癌组和癌旁组织的WB和组织芯片结果均显示PDIA2在癌组织中含量远高于癌旁组织(图1-3和图1-4)；

干扰基因感染HT29细胞及验证结果显示，慢病毒包装48h后，293T细胞几乎全部被PDIA2病毒混合物感染并高表达GFP荧光信号，表明慢病毒包装成功 (图2-1)，用包好的PDIA2慢病毒感染HT29细胞，96h后拍照记录细胞形态，显示，P0、P1、P2组细胞形态基本和HT29组一致，没有很大变化，但是P3组细胞明显发生变化，细胞密度明显低于其他组，且细胞由原来的梭形变得更加圆 (图2-2)；进一步的Western Blot及QRT-PCR验证结果显示：P3敲减效果较好(图2-2)；

敲减PDIA2后对HT29细胞增殖的影响结果显示，在对敲减的质粒进行验证后，选取P2和P3敲减的质粒，进行病毒包装后，用于感染HT29细胞，并进行细胞增殖的测定，结果显示，分别用P2、P3感染细胞后，加入CCK8试剂盒进行测定，和P2以及P0及HT29细胞相比，从感染第四天开始，P3明显干扰 HT29细胞的生长速度，直至第8天，干扰效果一直在增加，结果表明，敲减 PDIA2基因后，肿瘤细胞增殖受到抑制(图3)，表明PDIA2可以作为肿瘤治疗的一个新靶点；

结肠癌裸鼠模型接种HT29细胞以及P0、P3感染后的HT29细胞后肿瘤的增长检测显示，从接种细胞开始，定期测量肿瘤的大小。从第三天始，三组裸鼠背部长出肿瘤，并且随着时间的延长，肿瘤增长速度有很大的变化，HT29组和 P0组肿瘤增长迅速，两组肿瘤大小比较，无显著差异；但是P3组肿瘤增长缓慢，与HT29组以及P0组比较，均存在明显差异，P3组肿瘤明显小于对照组(图4-1)；对心脏血进行肝肾功能分析结果显示，只有总胆固醇含量在P3和P0以及HT29 之间有所变化，P3组相对HT29和P0组总胆固醇下降15％左右，分析可能PDIA2 的敲减会影响脂肪代谢(图4-2)。

本发明中观察到PDIA2除了分布于HT29结肠癌细胞内质网外，也分布于线粒体(图5)；

敲低PDIA2显著增加线粒体的数量和线粒体结构的清晰度(图6)；

敲低PDIA2增加基础氧耗量、ATP产量和线粒体呼吸储备能力(图7)。

本发明的上述实验结果表明，所述的PDIA2可作为结肠癌的标志物，根据 PDIA2对线粒体功能影响，本发明可以进一步推广至其他肿瘤，因而，PDIA2 可广泛用于制备治疗各种肿瘤的靶向药物及肿瘤诊断试剂盒。

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物PDIA2

<130> 20181106

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> PDIA2-RNAi(59653-1)

<400> 1

ccgcggctct ttcagcagtt t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> PDIA2-RNAi(59654-2)

<400> 2

gagcacgtgc tgcagtactt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> PDIA2-RNAi(59655-2)

<400> 3

gccctgctgg tggaattcta t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH (Forward)

<400> 4

gtcggtgtga acggatttgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH (Reverse)

<400> 5

gcttcccgtt gatgacaagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> PDIA2 (Forward)

<400> 6

ctctgcgctt ggtcaacctt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> PDIA2 (Reverse)

<400> 7

tcttggtttc gtcaaaagcc a 21

Claims (4)

1.PDIA2蛋白作为标志物在制备肿瘤治疗的靶向药物或肿瘤诊断试剂盒中的用途；

所述的肿瘤是结肠癌；

所述的PDIA2蛋白分布于线粒体，并显著抑制线粒体呼吸链功能；

所述的PDIA2蛋白与结肠癌细胞的生长增殖呈正相关，敲减了PDIA2后，显著抑制肿瘤细胞增殖率和荷瘤动物肿瘤生长曲线。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PDIA2蛋白在癌症组织中的表达高于癌旁组织。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，干扰PDIA2蛋白基因后，结肠癌细胞活性降低。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，干扰PDIA2蛋白基因后，荷瘤动物肿瘤变小。

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