CN110967486B - hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用 - Google Patents

hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用。本发明的磷酸化质谱定量结果显示，hnRNPC的Ser260位点所对应的磷酸化肽段在CRC干性特征细胞中上调17.6倍，免疫印迹实验也证实该磷酸化在CRC干性特征细胞中表达上调具有普遍性，并通过体内和体外实验证实过表达hnRNPC能够促进CRC干性，而将hnRNPC的260位丝氨酸突变为丙氨酸后则无法促进干性。因此，hnRNPC蛋白的S260位点磷酸可以作为肿瘤尤其是结直肠癌干性的标记物，为临床肿瘤检测、以及靶向药物设计提供了坚实的理论依据。

Description

hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的 应用
技术领域
本发明涉及磷酸化蛋白质科学技术领域，特别涉及hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用。
背景技术
目前结肠癌(CRC)仍是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一[1]。越来越多证据表明肿瘤干细胞(CSCs)的存在是肿瘤发展与复发的根源[2]。CSCs是一群拥有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，它们与胚胎干细胞有很多共性，在维持肿瘤发生与发展，促进肿瘤对化疗与放疗耐受中都发挥重要作用[3,4]。CSC理论认为，在肿瘤中只有CSCs具有自我复制的能力，与普通肿瘤细胞相比，CSCs往往能躲过放疗和化疗等传统肿瘤治疗手段，转移到合适的转移灶，分化出肿瘤细胞以及各种肿瘤相关细胞形成转移瘤[5]，CSCs的存在是CRC发生发展的根源。然而肿瘤干性的调控非常复杂，目前针对肿瘤干性的诊断和治疗并不理想，其中重要的原因是许多肿瘤干性调控因子尚未被发现。
磷酸化是细胞内最重要的可逆蛋白质翻译后修饰之一，通过激酶将ATP的磷酸基团转移到底物蛋白质的特定位点(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上，磷酸化酶去除修饰的磷酸基团而完成可逆的修饰调控[6]。蛋白质磷酸化与去磷酸化过程参与调控胞内许多网络的信号转导，包括调节细胞增殖、发育、分化、凋亡及新陈代谢等过程[7,8]。此外，有研究表明蛋白质磷酸化水平的动态变化，对于调控肿瘤干性的信号网络至关重要[9,10]。由于细胞中磷酸化调控所涉及的生物过程错综复杂，因此，利用蛋白质组学可以从整体上观察细胞中蛋白磷酸化修饰的状态及其定量变化。
蛋白质组学，能够实现全蛋白质与蛋白质翻译后修饰的差异检测，越来越多的肿瘤相关候选标志物被发现，成为探寻肿瘤诊断和治疗的重要突破口，也是发现翻译后修饰位点的重要手段。DIA(Data Independent Acquision)是近几年来迅速发展起来的一种新的数据非依赖型质谱数据采集模式，将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息，数据利用度大大提高，缺失值较少[11]。作为一种非标记的蛋白质定量方法，具有选择性好，定量准确，重复性高等优点[12]。
核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs)，是一类与mRNA生物学功能密切相关的RNA结合蛋白。hnRNPs蛋白家族庞大，生物学功能广泛，包括了近30种蛋白，命名依次从A到U，hnRNPs能够通过特异结构与前体mRNA(pre-mRNA)结合，参与到新生RNA的加工、成熟与转运[13]。hnRNPC是已知参与mRNA前体加工的核内不均一核糖蛋白家族成员之一，存在两个转录本，hnRNPC1和hnRNPC2，C2与C1相比多了一段13个氨基酸序列的插入[14]。hnRNPC蛋白参与mRNA代谢的各个方面，包括pre-mRNA加工，mRNA转运以及稳定mRNA[15-17]，hnRNPC蛋白也可以通过激活IRES(Internal ribosome entry sites)调控翻译[18]。有研究表明，HNRNPC结合位点包含一段尿嘧啶核苷酸，它位于茎环上，与m6A位点相对。当RNA发生m6A位点的甲基化，通过打破碱基对的平衡、增加富含尿嘧啶核苷酸单链的环长度来改变茎环的结构，从而使得HNRNPC蛋白更易与RNA结合，hnRNPC与m6A甲基化相结合共同调节RNA的丰度和可变剪切[16]。
目前关于hnRNPC翻译后修饰在肿瘤相关研究中还很少，而hnRNPC蛋白的260位Ser磷酸化，对CRC干性的调控，至今未见任何报道。
参考文献：
[1]Siegel,R.L.,Miller,K.D.,Fedewa,S.A.,Ahnen,D.J.,et al.,Colorectalcancer statistics,2017.CA:a cancer journal for clinicians 2017,67,177-193.
[2]Siegel,R.,Desantis,C.,Jemal,A.,Colorectal cancer statistics,2014.CA:a cancer journal for clinicians 2014,64,104-117.
[3]Zeuner,A.,Todaro,M.,Stassi,G.,De Maria,R.,Colorectal cancer stemcells:from the crypt to the clinic.Cell stem cell 2014,15,692-705.
[4]Ricci-Vitiani,L.,Lombardi,D.G.,Pilozzi,E.,Biffoni,M.,et al.,Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.Nature2007,445,111-115.
[5]Frank,N.Y.,Schatton,T.,Frank,M.H.,The therapeutic promise of thecancer stem cell concept.The Journal of clinical investigation 2010,120,41-50.
[6]The TRAIL to cancer therapy:Hindrances and potential solutions；10.1016/j.critrevonc.2019.08.008.
[7]Brognard,J.,Hunter,T.,Protein kinase signaling networks incancer.Current opinion in genetics&development 2011,21,4-11.
[8]Linding,R.,Jensen,L.J.,Ostheimer,G.J.,van Vugt,M.A.,et al.,Systematic discovery of in vivo phosphorylation networks.Cell 2007,129,1415-1426.
[9]Lee,P.,Jiang,S.,Li,Y.,Yue,J.,et al.,Phosphorylation of Pkp1 byRIPK4 regulates epidermal differentiation and skin tumorigenesis.The EMBOjournal 2017,36,1963-1980.
[10]Yi,T.,Zhai,B.,Yu,Y.,Kiyotsugu,Y.,et al.,Quantitativephosphoproteomic analysis revealssystem-wide signaling pathways downstream ofSDF-1/CXCR4 in breast cancer stem cells.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 2014,111,E2182-2190.
[11]Gillet,L.C.,Navarro,P.,Tate,S.,Rost,H.,et al.,Targeted dataextraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition:anew concept for consistent and accurate proteome analysis.Molecular&cellularproteomics:MCP 2012,11,O111 016717.
[12]Bilbao,A.,Varesio,E.,Luban,J.,Strambio-De-Castillia,C.,et al.,Processing strategies and software solutions for data-independent acquisitionin mass spectrometry.Proteomics 2015,15,964-980.
[13]Piccolo,L.L.,Corona,D.,Onorati,M.C.,Emerging roles for hnRNPs inpost-transcriptional regulation:what can we learn from flies？Chromosoma 2014,123,515-527.
[14]Christian,K.J.,Lang,M.A.,Raffalli-Mathieu,F.,Interaction ofheterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 with a novel cis-regulatoryelement within p53 mRNA as a response to cytostatic drug treatment.Molecularpharmacology 2008,73,1558-1567.
[15]Shetty,S.,Regulation of urokinase receptor mRNA stability byhnRNP C in lung epithelial cells.Molecular and cellular biochemistry 2005,272,107-118.
[16]Pinol-Roma,S.,Dreyfuss,G.,hnRNP proteins:localization andtransport between the nucleus and the cytoplasm.Trends in cell biology 1993,3,151-155.
[17]Choi,Y.D.,Grabowski,P.J.,Sharp,P.A.,Dreyfuss,G.,Heterogeneousnuclear ribonucleoproteins:role in RNA splicing.Science 1986,231,1534-1539.
[18]Kim,J.H.,Paek,K.Y.,Choi,K.,Kim,T.D.,et al.,Heterogeneous nuclearribonucleoprotein C modulates translation of c-myc mRNA in a cell cyclephase-dependent manner.Molecular and cellular biology 2003,23,708-720.
[19]Liu,N.,Dai,Q.,Zheng,G.,He,C.,et al.,N(6)-methyladenosine-dependent RNA structural switches regulate RNA-protein interactions.Nature2015,518,560-564.
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用。
本发明的另一目的在于提供一种hnRNPC蛋白突变体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：hnRNPC蛋白的S260(hnRNPC蛋白的260位丝氨酸)位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用。
hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物在制备检测结直肠癌干性的试剂盒、试纸或芯片中的应用。
hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化在制备治疗结直肠癌的药物和/或制备调控结直肠癌干性的药物中的应用。
所述的调控为通过如下任一种方式实现：
M1：促进hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化，以增加结直肠癌干性；
M2：抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化，以降低结直肠癌干性。
方式M1中所述的促进hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化优选为通过在细胞内过表达hnRNPC的方法实现。
所述的细胞优选为HT29细胞。
所述的在细胞内过表达hnRNPC为通过如下方法实现：
(1)将hnRNPC的基因序列插入到用BamH I酶切后的慢病毒质粒PLVX-puro中，构建重组质粒PLVX-puro-hnRNPC-WT；
(2)将重组质粒PLVX-puro-hnRNPC-WT、包装质粒PSPAX2和PMD2G混合组成三质粒系统，然后加入到对数期的293T细胞中进行培养，过滤，取上清液；
(3)将上清液加入到HT29细胞中感染24～48h，经过筛选、培养，获得过表达hnRNPC的稳定细胞株hnRNPC-WT。
步骤(1)中所述的hnRNPC的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤(2)中所述的培养的时间为48～54小时。
步骤(3)中所述的筛选为采用嘌呤霉素进行筛选；优选为采用1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。
方式M2中所述的抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化为通过如下任一种方法实现：
(I)通过试剂或药物等抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化；
(II)将hnRNPC蛋白的第260位丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala)；
(III)在细胞内过表达hnRNPC蛋白突变体；其中，hnRNPC蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
方法(III)中所述的hnRNPC蛋白突变体的编码基因如SEQ ID NO.2所示。
方法(III)中所述的在细胞内过表达hnRNPC蛋白突变体为通过如下方法实现：
(i)将hnRNPC蛋白突变体的基因插入到用BamH I酶切后的慢病毒质粒PLVX-puro中，构建重组质粒PLVX-puro-hnRNPC-S260A；
(ii)将重组质粒PLVX-puro-hnRNPC-S260A、包装质粒PSPAX2和PMD2G混合组成三质粒系统，然后加入到对数期的293T细胞中进行培养，过滤，取上清液；
(ii)将上清液加入到HT29细胞中感染24～48h，经过筛选、培养，获得过表达hnRNPC的稳定细胞株hnRNPC-S260A。
步骤(i)中所述的hnRNPC蛋白突变体的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤(ii)中所述的培养的时间为48～54小时。
步骤(iii)中所述的筛选为采用嘌呤霉素进行筛选；优选为采用1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。
检测hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化的试剂在制备检测结直肠癌干性的试剂盒或试纸中的应用。
一种hnRNPC蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种hnRNPC蛋白突变体的基因，其编码所述hnRNPC蛋白突变体。
所述的hnRNPC蛋白突变体的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
含有所述的hnRNPC蛋白突变体的基因的重组表达载体、重组宿主细胞等。
所述的载体包括病毒载体；优选为慢病毒载体。
所述的重组宿主细胞为重组结直肠癌细胞。
所述的结直肠癌细胞优选为HT29细胞。
所述的hnRNPC蛋白突变体，所述的hnRNPC蛋白突变体的基因以及所述的重组表达载体或重组宿主细胞中的至少一种在筛选或制备抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化的药物，或治疗结直肠癌的药物中的应用。
所述的药物包括药物学上可以接受的载体；所述载体为稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、或吸附载体。
肿瘤干细胞(CSCs)是一群拥有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，许多研究表明结肠癌(CRC)的发生发展和转移复发都与CSCs的存在有着重要关联。需要指出的是，现有靶向CSCs的诊断与治疗并不理想，其中最重要的原因就是部分肿瘤干性调控因子仍未被发现。蛋白质的磷酸化修饰已经被证实是生物体内主导细胞分化、生长以及迁移等生命活动的最普遍的调控手段，且许多磷酸化蛋白与激酶在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用。
本发明利用数据非依赖型(DIA)非标定量磷酸化蛋白质组学技术，对已经建立的结肠癌肿瘤干细胞模型进行磷酸化组的测定，为进一步认识肿瘤干性信号转导提供新的研究思路。此外，我们首次报道人核内不均一蛋白C(hnRNPC)的第260位丝氨酸(Ser260)磷酸化，即p-hnRNPC-S260在CRC干性的维持中起到至关重要的作用，为针对该位点设计靶向药物的研发提供坚实的理论依据。
注：本发明中的“肿瘤干性”是指肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性；同理，“结直肠癌干性”是指结直肠癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的磷酸化质谱结果表明p-hnRNPC-S260在CRC干性特征细胞中上调17.6倍，免疫印迹实验也证实该磷酸化在CRC干性特征细胞中表达上调具有普遍性；在临床表现方面，本发明利用免疫组化手段检测到p-hnRNPC-S260在结肠癌病人的癌组织中显著高表达(n＝87，P<0.001)；在功能上，体内和体外实验证实过表达hnRNPC能够促进CRC干性，而突变260位点后则无法促进干性。
2、本发明采用DIA定量磷酸化蛋白质组学技术，全面系统的分析CRC干性特征细胞与CRC细胞的差异蛋白，并从中寻找包括磷酸化hnRNPC在内的一系列参与CRC干性调控的新的调控因子，为针对该磷酸化位点的临床肿瘤检测，以及针对该位点设计靶向药物的研发提供坚实的理论依据。
附图说明
图1是对比p-hnRNPC-S260的磷酸化肽段MESEGGADDS[+80]AEEGDLLDDDDNEDRGDDQLELIKDDEK在CRC干性特征细胞与亲本CRC细胞(HT29细胞)中的二级离子流图。
图2是免疫印迹法考察p-hnRNPC-S260在CRC干性特征细胞与亲本CRC细胞中的表达情况图(Actin为内参蛋白，SOX2是肿瘤干性标志蛋白)。
图3是免疫组织化学方法检测hnRNPC 260位丝氨酸磷酸化在CRC病人临床样品中的表达情况图；其中，A为p-hnRNPC-S260抗体免疫组化在癌组织与癌旁组织中的染色图片；B为p-hnRNPC-S260在结肠癌与癌旁的表达情况统计图。
图4是免疫印迹分析考察hnRNPC蛋白过表达及260位Ser突变情况图(hnNRPC-WT表示CRC细胞(HT29细胞)中过表达野生型hnRNPC蛋白；hnRNPC-S260A表示过表达260位Ser突变成丙氨酸的蛋白)。
图5是免疫印迹实验评价过表达野生型与突变型hnRNPC稳定细胞株(HT29细胞)中干性相关分子指标的变化情况图。
图6是体外实验评估Ser260位点突变前后，hnRNPC调控CRC细胞(HT29细胞)干性的能力变化情况图；其中，A为克隆形成实验与统计结果；B为肿瘤球形成实验与统计结果。
图7是体内实验验证p-hnRNPC-S260对肿瘤发展的作用结果图；其中，A为肿瘤图片；B为肿瘤体积增长统计结果；C为平均肿瘤重量统计结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂均可通过市售获得。
实施例1
1、本研究采用DIA定量磷酸化蛋白质组的方法，比较结肠癌贴壁细胞(CRC细胞)与干性特征细胞(CRC干性特征细胞)之间的磷酸化蛋白组间的表达与定量差异。采用肿瘤球悬浮培养的方法建立CRC干性特征细胞模型，所用细胞为结肠癌HT29细胞(购自ATCC)；其中，肿瘤球悬浮培养具体方法如下：
对HT29贴壁细胞进行消化处理及细胞计数，将细胞按照1000个/孔的密度，平铺到超低吸附6孔板中。每孔加入3mL无血清培养液DMEM/F12(含1％B27、25ng/mL bFGF、20ng/mLEGF)(DMEM/F12培养基：购自Invitrogen公司；bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)：购自上海依科赛生物制品有限公司；EGF(表皮细胞生长因子)：购自上海依科赛生物制品有限公司；B27添加剂：购自Invitrogen公司)每天水平摇晃6孔板2次，隔4天半量换液。于37℃细胞培养箱连续培养8天，收集肿瘤球蛋白，得到CRC干性特征细胞。
将CRC贴壁细胞和CRC干性特征细胞分别采用Titansphere Phos-TiO试剂盒(GLSCIENCES公司)进行磷酸化肽段的富集，然后将其用于DIA质谱分析[参考文献：W.Zhang etal.,Detergent-Insoluble Proteome Analysis Revealed Aberrantly AggregatedProteins in Human Preeclampsia Placentas,J.Proteome Res.2017,16,4468-4480]，重复3次。
结果如图1所示，在磷酸化质谱的三次重复中，hnRNPC的Ser260位点所对应的磷酸化肽段MESEGGADDS[+80]AEEGDLLDDDDNEDRGDD QLELIKDDEK在肿瘤球组鉴定到的该肽段离子强度均大于贴壁细胞组。磷酸化质谱定量结果显示，该磷酸化肽段在CRC干性特征细胞中上调17.6倍。
2、为了进一步验证上述质谱结果，我们分别收集了6株CRC细胞在贴壁状态(CRC细胞)与肿瘤球状态(CRC干性特征细胞)的总蛋白，应用免疫印迹法检测其中p-hnRNPC-S260表达。我们选取RKO、SW620、HT29、HCT116、DLD1和Ls-174-T这6株结肠癌细胞(购自ATCC)进行肿瘤球悬浮培养并收集蛋白(方法同上)。收集的蛋白进行免疫印迹分析，具体步骤如下：
配制浓度为10％或12％的SDS-PAGE凝胶；蛋白样品中加入适量的5X蛋白电泳缓冲液(购自Sigma公司)，混匀，100℃水浴5min，样品冷却上样；200V恒压电泳约40min；230mA湿转法转2h将蛋白质转至PVDF膜上，转膜结束后5％(v/v)牛奶室温封闭1h；加入一抗(SOX2或p-hnRNPC-S260)4℃孵育过夜；弃抗体用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次10min，加入5％(v/v)牛奶稀释的二抗，室温孵育1h；弃二抗用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次10min；ECL显影；其中，一抗SOX2(肿瘤干性标志蛋白)，Actin(内参蛋白)，以及二抗购自武汉ProteintechGroup公司；一抗p-hnRNPC-S260购自Thermo Fisher公司(货号为：PA5-38589，全称为phospho-hnRNP C(Ser260)Polyclonal Antibody)。
结果如图2所示，SOX2在6株细胞的肿瘤球细胞中的表达量均高于对应的贴壁细胞，表明这6株肿瘤球细胞的干性均强于对应的亲本细胞。在上述成功模型下，我们首先观察到在HT29细胞中，p-hnRNPC-S260确实在肿瘤球中表达上调，印证了我们的质谱结果。此外，在另外5株结肠癌细胞中p-hnRNPC-S260均是在肿瘤球中表达量更高。综上所述，结肠癌细胞干性增强与p-hnRNPC-S260表达上调呈正相关。
3、为了确定p-hnRNPC-S260在CRC中的临床表现情况，我们利用免疫组化IHC检测p-hnRNPC-S260在87例CRC组织及癌旁组织(癌组织及癌旁组织购于上海芯超生物)的表达情况。具体步骤如下：
免疫组化实验所用抗体为p-hnRNPC-S260(Thermo Fisher公司)，稀释比例为1：1000，所用芯片为结肠癌180点组织芯片(HColA180Su11，上海芯超生物)；实验操作由上海芯超生物完成。IHC染色结果判读：染色比例分别用0，1，2，3表示<25％；25–50％；50–75％；75–100％。染色强度用0，1，2，3分别表示没有染色、弱染、中度染色、强染色4种程度。染色比例*染色强度即为免疫组化得分。统计结果比较采用Pearson’s chi-square检验。
结果如图3所示，图3A为代表性图片显示p-hnRNPC-S260在CRC病人癌旁与癌组织中的表达强度差异；图3B为3A的统计结果，说明p-hnRNPC-S260在癌组织中高表达，结果表明p-hnRNPC-S260高表达于CRC癌组织，而低表达于癌旁组织中。以上分析提示p-hnRNPC-S260有重要的临床意义和临床应用价值。
4、载体构建
(1)构建融合表达hnRNPC-WT的慢病毒质粒采用ClonExpressTM II快速克隆技术进行构建。具体操作按照其试剂盒说明书进行。简单流程如下：
1)引物设计与合成：构建载体的引物由睿博兴科生物科技有限公司合成；其中，所用引物的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-TTCTAGAGCGGCCGCGGATCCATGGCCAGCAACGTTACCAAC-3’(SEQ IDNO.4)；
下游引物：5’-GAAGCGTGCAGAATGGGATCCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGAGTCATCCTCGCCATTG-3’(SEQ ID NO.5)；
2)插入片段PCR扩增：提取HT29细胞总RNA，逆转录成cDNA作为PCR模板，利用PrimeSTAR Max Premix(TAKARA公司)扩增目的基因；
3)制备线性化载体：对慢病毒质粒空载PLVX-puro(购自Takara公司)的BamH I位点进行单酶切，通过DNA纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物；
4)重组反应：取线性化克隆载体50ng、PCR扩增产物25ng、5X CE II Buffer2μL、Exnase I 1μL、加ddH2O至10μL，混匀，置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min；
5)反应产物转化、涂板：将冷却的反应液加入到100μL感受态DH5α细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，冰水浴孵育2min，加入500μL LB培养基，37℃摇菌30min，取100μL菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，将平板倒置，于37℃过夜培养；
6)克隆鉴定：挑取单克隆，摇菌保种后，利用质粒小提试剂盒抽提质粒，测序鉴定。获得质粒PLVX-puro-hnRNPC-WT。
上述hnRNPC(NM_031314.2)的cDNA序列为：
ATGGCCAGCAACGTTACCAACAAGACAGATCCTCGCTCCATGAACTCCCGTGTATTCATTGGGAATCTCAACACTCTTGTGGTCAAGAAATCTGATGTGGAGGCAATCTTTTCGAAGTATGGCAAAATTGTGGGCTGCTCTGTTCATAAGGGCTTTGCCTTCGTTCAGTATGTTAATGAGAGAAATGCCCGGGCTGCTGTAGCAGGAGAGGATGGCAGAATGATTGCTGGCCAGGTTTTAGATATTAACCTGGCTGCAGAGCCAAAAGTGAACCGAGGAAAAGCAGGTGTGAAACGATCTGCAGCGGAGATGTACGGGTCAGTAACAGAACACCCTTCTCCGTCCCCTCTACTCAGCTCCTCTTTTGACTTGGACTATGACTTTCAACGGGACTATTATGATAGGATGTACAGTTACCCAGCACGTGTACCTCCTCCTCCTCCTATTGCTCGGGCTGTAGTGCCCTCGAAACGTCAGCGTGTATCAGGAAACACTTCACGAAGGGGCAAAAGTGGCTTCAATTCTAAGAGTGGACAGCGGGGATCTTCCAAGTCTGGAAAGTTGAAAGGAGATGACCTTCAGGCCATTAAGAAGGAGCTGACCCAGATAAAACAAAAAGTGGATTCTCTCCTGGAAAACCTGGAAAAAATTGAAAAGGAACAGAGCAAACAAGCAGTAGAGATGAAGAATGATAAGTCAGAAGAGGAGCAGAGCAGCAGCTCCGTGAAGAAAGATGAGACTAATGTGAAGATGGAGTCTGAGGGGGGTGCAGATGACTCTGCTGAGGAGGGGGACCTACTGGATGATGATGATAATGAAGATCGGGGGGATGACCAGCTGGAGTTGATCAAGGATGATGAAAAAGAGGCTGAGGAAGGAGAGGATGACAGAGACAGCGCCAATGGCGAGGATGACTCTTAA(SEQ ID NO.3)。
(2)定点突变
在质粒PLVX-puro-hnRNPC-WT的基础上，设计表达260位丝氨酸突变成丙氨酸的hnRNPC-S260A质粒。选择Mut Expression II Fast Mutagenesis Kit V2定点突变系统构建所需突变质粒。具体方法如下：
1)设计引物向质粒引入单碱基突变，引物序列如下：
上游引物：5’-CAGATGACgCTGCTGAGGAGGGGGACCTACTG-3’(SEQ ID NO.6)；
下游引物：5’-CTCAGCAGcGTCATCTGCACCCCCCTCAGACT-3’(SEQ ID NO.7)；
2)使用PrimeSTAR Max Premix对目标质粒进行扩增，扩增循环数应小于30，反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测，如目标质粒正确扩增，则继续后续实验；
3)扩增产物用Dpn I消化，去除甲基化模板质粒；
4)重组反应：取5μL Dpn I扩增产物、2μL 5×CE II Buffer、1μL Exnase I、加ddH2O至10μL，配置完重组体系后，后续操作同上述步骤(1)的载体构建一致，获得突变质粒PLVX-puro-hnRNPC-S260A。
(3)稳定细胞株构建
慢病毒载体包装，具体步骤如下：
1)取对数期的293T细胞(购自ATCC)以50％的密度接种到6cm细胞培养皿(购自康宁公司)中，培养12h；
2)将目的质粒PLVX-puro-hnRNPC-WT(2ug)和PLVX-puro-hnRNPC-S260A(2ug)与空载慢病毒PLVX-puro(2ug)这3个质粒分别与包装质粒PSPAX2(Addgene公司，2ug)和PMD2G(Addgene公司，2ug)混合组成三质粒系统，然后依次加入5μL P3000试剂(LifeTechnologies公司)和5μL Lipo3000(Life Technologies公司)，在500ul的Opti-MEM培养基(Gibco公司)中混匀，静置20min；
3)将293T细胞的DMEM培养基(购自Gibco公司)换成Opti-MEM培养基，并加入上述步骤2)混合好的Opti-MEM培养基，置于培养箱中培养6h；
4)换新鲜的1640完全培养基培养48h，后收上清离心去除细胞碎片，并用0.45μM滤器过滤彻底去除碎片；
5)将过滤后的上清加入到提前1天以30％的密度接种好结肠癌HT29细胞的6孔板中，感染24h，去除含病毒培养基换成新鲜1640培养基(购自Gibco公司)；48h后加入嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选，每两天换一次液，筛选一周后换成1640培养基培养，扩大，利用免疫印迹实验筛选目标蛋白能够成功表达的细胞株，获得稳定细胞株：hnRNPC-WT(PLVX-puro-hnRNPC-WT+PSPAX2+PMD2G，即过表达hnRNPC-WT的HT29细胞株)，hnRNPC-S260A(PLVX-puro-hnRNPC-S260A+PSPAX2+PMD2G)，及对照(PLVX-puro+PSPAX2+PMD2G)。保种备用。
hnRNPC-S260A(hnRNPC的260为S突变为A)蛋白序列为：
MASNVTNKTDPRSMNSRVFIGNLNTLVVKKSDVEAIFSKYGKIVGCSVHKGFAFVQYVNERNARAAVAGEDGRMIAGQVLDINLAAEPKVNRGKAGVKRSAAEMYGSVTEHPSPSPLLSSSFDLDYDFQRDYYDRMYSYPARVPPPPPIARAVVPSKRQRVSGNTSRRGKSGFNSKSGQRGSSKSGKLKGDDLQAIKKELTQIKQKVDSLLENLEKIEKEQSKQAVEMKNDKSEEEQSSSSVKKDETNVKMESEGGADDAAEEGDLLDDDDNEDRGDDQLELIKDDEKEAEEGEDDRDSANGEDDS(SEQ ID NO.1)。
hnRNPC-S260A(TCT突变为GCT)核酸序列为：
ATGGCCAGCAACGTTACCAACAAGACAGATCCTCGCTCCATGAACTCCCGTGTATTCATTGGGAATCTCAACACTCTTGTGGTCAAGAAATCTGATGTGGAGGCAATCTTTTCGAAGTATGGCAAAATTGTGGGCTGCTCTGTTCATAAGGGCTTTGCCTTCGTTCAGTATGTTAATGAGAGAAATGCCCGGGCTGCTGTAGCAGGAGAGGATGGCAGAATGATTGCTGGCCAGGTTTTAGATATTAACCTGGCTGCAGAGCCAAAAGTGAACCGAGGAAAAGCAGGTGTGAAACGATCTGCAGCGGAGATGTACGGGTCAGTAACAGAACACCCTTCTCCGTCCCCTCTACTCAGCTCCTCTTTTGACTTGGACTATGACTTTCAACGGGACTATTATGATAGGATGTACAGTTACCCAGCACGTGTACCTCCTCCTCCTCCTATTGCTCGGGCTGTAGTGCCCTCGAAACGTCAGCGTGTATCAGGAAACACTTCACGAAGGGGCAAAAGTGGCTTCAATTCTAAGAGTGGACAGCGGGGATCTTCCAAGTCTGGAAAGTTGAAAGGAGATGACCTTCAGGCCATTAAGAAGGAGCTGACCCAGATAAAACAAAAAGTGGATTCTCTCCTGGAAAACCTGGAAAAAATTGAAAAGGAACAGAGCAAACAAGCAGTAGAGATGAAGAATGATAAGTCAGAAGAGGAGCAGAGCAGCAGCTCCGTGAAGAAAGATGAGACTAATGTGAAGATGGAGTCTGAGGGGGGTGCAGATGACGCTGCTGAGGAGGGGGACCTACTGGATGATGATGATAATGAAGATCGGGGGGATGACCAGCTGGAGTTGATCAAGGATGATGAAAAAGAGGCTGAGGAAGGAGAGGATGACAGAGACAGCGCCAATGGCGAGGATGACTCTTAA(SEQ ID NO.2)。
如图4所示，构建的稳定株细胞中全蛋白形式的hnRNPC表达量基本一致，突变株中的p-hnRNPC-S260A表达量显著低于hnRNPC野生型组，说明S260位点的突变细胞株构建成功。
5、提取上述步骤4(3)中构建的过表达hnRNPC-WT，hnRNPC-S260A及对照PLVX-puro的HT29细胞株的细胞裂解液，按照步骤2中的免疫印迹分析方法检测干性分子指标ALDH1(武汉Proteintech Group公司)、OCT4(武汉Proteintech Group公司)和SOX2(武汉Proteintech Group公司)。
结果如图5所示，免疫印迹实验检测干性分子指标ALDH1、OCT4和SOX2在过表达hnRNPC-WT的HT29细胞株中表达上调，过表达hnRNPC-S260A，则无法促进ALDH1、OCT4和SOX2表达上调。
6、体外实验评估Ser260位点突变前后，hnRNPC调控CRC细胞干性的能力变化情况
(1)肿瘤球形成实验，具体步骤如下：
肿瘤干细胞球培养，采用无血清悬浮培养的方法进行，方法如下：对贴壁细胞(上述步骤4(3)构建的稳定细胞hnRNPC-WT，hnRNPC-S260A)进行消化处理及细胞计数，将细胞按照1000个/孔的密度，平铺到超低吸附6孔板中。每孔加入3mL无血清培养液DMEM/F12(含1％B27、25ng/mL bFGF、20ng/mL EGF)，每天水平摇晃6孔板2次，隔4天半量换液。于37℃细胞培养箱连续培养8天，观察肿瘤球形成数量；同时以过表达空载PLVX-puro质粒的稳定细胞株为对照，构建方法见4(3)。
(2)克隆形成实验，具体步骤如下：
将细胞按500个/孔的密度分散铺于六孔板中，每孔加入2mL1640完全培养基，3～4天换液；37℃细胞培养箱连续培养12天；去除培养上清，PBS洗两次；每孔加入500μL无水甲醇固定5min；1％(w/v)结晶紫染色5min；PBS洗两次去除背景及非特异染色；晾干，观察形成克隆的数目及大小，统计结果，实验重复3次。
结果如图6所示，过表达hnRNPC-WT后，与对照组比，细胞的瘤克隆形成与肿瘤球形能力明显增强。而hnRNPC发生突变后促进肿瘤克隆形成与肿瘤球形能力均消失。以上结果表明hnNRPC的S260位点被磷酸化是其维持结肠癌干性所必须的，在促进CRC细胞干性中发挥关键作用。
7、体内实验验证p-hnRNPC-S260对肿瘤发展的作用
本研究采用的雌性BALB/c Nude mice免疫缺陷鼠(6周龄)购自北京维通利华实验动物有限公司。
将稳定过表达野生型hnRNPC的CRC细胞株(构建方法同上述步骤4(3)，即稳定细胞株hnRNPC-WT)，以及突变型hnRNPC的CRC细胞株(构建方法同上述步骤4(3)，稳定细胞株hnRNPC-S260A)在裸鼠皮下进行注射(2×106个细胞/只)，每2天观察并记录小鼠肿瘤的体积的变化情况。通过外科手术方式取下小鼠实体瘤测量肿瘤体积、重量、生存率等指标，利用生物统计学手段探究p-hnRNPC与肿瘤发生发展之间的联系。
结果如图7所示，将对照组(构建方法同上述步骤4(3)，以过表达空载PLVX-puro质粒的稳定细胞株为对照)、hnRNPC野生型及hnRNPC突变型的稳定细胞株分别进行裸鼠皮下成瘤实验，结果显示过表达野生型hnRNPC能够显著增强HT29细胞肿瘤形成能力，过表达hnRNPC-S260A则不能，提示p-hnRNPC-S260对肿瘤的发生发展有重要的促进作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为结直肠癌干性标记物的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hnRNPC-S260A
<400> 1
Met Ala Ser Asn Val Thr Asn Lys Thr Asp Pro Arg Ser Met Asn Ser
1 5 10 15
Arg Val Phe Ile Gly Asn Leu Asn Thr Leu Val Val Lys Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Ala Ile Phe Ser Lys Tyr Gly Lys Ile Val Gly Cys Ser Val
35 40 45
His Lys Gly Phe Ala Phe Val Gln Tyr Val Asn Glu Arg Asn Ala Arg
50 55 60
Ala Ala Val Ala Gly Glu Asp Gly Arg Met Ile Ala Gly Gln Val Leu
65 70 75 80
Asp Ile Asn Leu Ala Ala Glu Pro Lys Val Asn Arg Gly Lys Ala Gly
85 90 95
Val Lys Arg Ser Ala Ala Glu Met Tyr Gly Ser Val Thr Glu His Pro
100 105 110
Ser Pro Ser Pro Leu Leu Ser Ser Ser Phe Asp Leu Asp Tyr Asp Phe
115 120 125
Gln Arg Asp Tyr Tyr Asp Arg Met Tyr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Ile Ala Arg Ala Val Val Pro Ser Lys Arg Gln Arg
145 150 155 160
Val Ser Gly Asn Thr Ser Arg Arg Gly Lys Ser Gly Phe Asn Ser Lys
165 170 175
Ser Gly Gln Arg Gly Ser Ser Lys Ser Gly Lys Leu Lys Gly Asp Asp
180 185 190
Leu Gln Ala Ile Lys Lys Glu Leu Thr Gln Ile Lys Gln Lys Val Asp
195 200 205
Ser Leu Leu Glu Asn Leu Glu Lys Ile Glu Lys Glu Gln Ser Lys Gln
210 215 220
Ala Val Glu Met Lys Asn Asp Lys Ser Glu Glu Glu Gln Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Asp Glu Thr Asn Val Lys Met Glu Ser Glu Gly Gly
245 250 255
Ala Asp Asp Ala Ala Glu Glu Gly Asp Leu Leu Asp Asp Asp Asp Asn
260 265 270
Glu Asp Arg Gly Asp Asp Gln Leu Glu Leu Ile Lys Asp Asp Glu Lys
275 280 285
Glu Ala Glu Glu Gly Glu Asp Asp Arg Asp Ser Ala Asn Gly Glu Asp
290 295 300
Asp Ser
305
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccagca acgttaccaa caagacagat cctcgctcca tgaactcccg tgtattcatt 60
gggaatctca acactcttgt ggtcaagaaa tctgatgtgg aggcaatctt ttcgaagtat 120
ggcaaaattg tgggctgctc tgttcataag ggctttgcct tcgttcagta tgttaatgag 180
agaaatgccc gggctgctgt agcaggagag gatggcagaa tgattgctgg ccaggtttta 240
gatattaacc tggctgcaga gccaaaagtg aaccgaggaa aagcaggtgt gaaacgatct 300
gcagcggaga tgtacgggtc agtaacagaa cacccttctc cgtcccctct actcagctcc 360
tcttttgact tggactatga ctttcaacgg gactattatg ataggatgta cagttaccca 420
gcacgtgtac ctcctcctcc tcctattgct cgggctgtag tgccctcgaa acgtcagcgt 480
gtatcaggaa acacttcacg aaggggcaaa agtggcttca attctaagag tggacagcgg 540
ggatcttcca agtctggaaa gttgaaagga gatgaccttc aggccattaa gaaggagctg 600
acccagataa aacaaaaagt ggattctctc ctggaaaacc tggaaaaaat tgaaaaggaa 660
cagagcaaac aagcagtaga gatgaagaat gataagtcag aagaggagca gagcagcagc 720
tccgtgaaga aagatgagac taatgtgaag atggagtctg aggggggtgc agatgacgct 780
gctgaggagg gggacctact ggatgatgat gataatgaag atcgggggga tgaccagctg 840
gagttgatca aggatgatga aaaagaggct gaggaaggag aggatgacag agacagcgcc 900
aatggcgagg atgactctta a 921
<210> 3
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hnRNPC
<400> 3
atggccagca acgttaccaa caagacagat cctcgctcca tgaactcccg tgtattcatt 60
gggaatctca acactcttgt ggtcaagaaa tctgatgtgg aggcaatctt ttcgaagtat 120
ggcaaaattg tgggctgctc tgttcataag ggctttgcct tcgttcagta tgttaatgag 180
agaaatgccc gggctgctgt agcaggagag gatggcagaa tgattgctgg ccaggtttta 240
gatattaacc tggctgcaga gccaaaagtg aaccgaggaa aagcaggtgt gaaacgatct 300
gcagcggaga tgtacgggtc agtaacagaa cacccttctc cgtcccctct actcagctcc 360
tcttttgact tggactatga ctttcaacgg gactattatg ataggatgta cagttaccca 420
gcacgtgtac ctcctcctcc tcctattgct cgggctgtag tgccctcgaa acgtcagcgt 480
gtatcaggaa acacttcacg aaggggcaaa agtggcttca attctaagag tggacagcgg 540
ggatcttcca agtctggaaa gttgaaagga gatgaccttc aggccattaa gaaggagctg 600
acccagataa aacaaaaagt ggattctctc ctggaaaacc tggaaaaaat tgaaaaggaa 660
cagagcaaac aagcagtaga gatgaagaat gataagtcag aagaggagca gagcagcagc 720
tccgtgaaga aagatgagac taatgtgaag atggagtctg aggggggtgc agatgactct 780
gctgaggagg gggacctact ggatgatgat gataatgaag atcgggggga tgaccagctg 840
gagttgatca aggatgatga aaaagaggct gaggaaggag aggatgacag agacagcgcc 900
aatggcgagg atgactctta a 921
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物
<400> 4
ttctagagcg gccgcggatc catggccagc aacgttacca ac 42
<210> 5
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物
<400> 5
gaagcgtgca gaatgggatc ctcacttgtc atcgtcgtcc ttgtagtcag agtcatcctc 60
gccattg 67
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物
<400> 6
cagatgacgc tgctgaggag ggggacctac tg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物
<400> 7
ctcagcagcg tcatctgcac ccccctcaga ct 32

Claims (4)

1.检测hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化的试剂在制备检测结直肠癌干性的试剂盒、试纸或芯片中的应用。
2.hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化作为靶点在制备调控结直肠癌干性的药物中的应用，其特征在于，所述的调控通过如下任一种方式实现：
M1：促进hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化，以增加结直肠癌干性；
M2：抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化，以降低结直肠癌干性；
方式M1中所述的促进hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化为通过在细胞内过表达hnRNPC的方法实现；
方式M2中所述的抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化通过如下任一种方法实现：
（I）通过试剂或药物抑制hnRNPC蛋白的S260位点磷酸化；
（II）将hnRNPC蛋白的第260位丝氨酸突变为丙氨酸；
（III）在细胞内过表达hnRNPC蛋白突变体；其中，hnRNPC蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：方法（III）中所述的hnRNPC蛋白突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.hnRNPC蛋白突变体、hnRNPC蛋白突变体的编码基因、以及含有hnRNPC蛋白突变体编码基因序列的重组表达载体或重组宿主细胞中的至少一种在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，其特征在于：
所述的hnRNPC蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的hnRNPC蛋白突变体的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
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EP2295976A1 (en) * 2003-03-08 2011-03-16 Auvation Ltd Markers for colorectal cancer
AU2009270793A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Oragenics, Inc. Compositions for the detection and treatment of colorectal cancer
EP3978928A1 (en) * 2008-11-14 2022-04-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
US10221459B2 (en) * 2014-05-13 2019-03-05 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating cancer harboring PIKC3A mutations
CN109613254B (zh) * 2018-11-06 2022-04-05 上海市公共卫生临床中心 一种用于肿瘤治疗和诊断的靶点标志物pdia2
CN110279706B (zh) * 2019-06-27 2022-12-02 武汉大学 hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用

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