CN110279706B - hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用。本发明发现hnRNP C两个同源异构亚型C1和C2在癌细胞的生长中发挥影响作用，hnRNP C1抑制癌细胞生长，hnRNP C2促进癌细胞生长，并进一步发现上调hnRNP C1、或抑制hnRNP C2的表达量或使hnRNP C2表达沉默均能抑制癌细胞生长。本发明利用调控hnRNP C的外显子4的可变剪接来减少hnRNP C2的表达，hnRNP C2的剪接位点及附近的对hnRNP C2的剪接起调控作用序列均可作为减少hnRNP C2表达量和治疗癌症的靶点。本发明为研制抗癌药物提供了新的靶点。

Description

hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中 的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种hnRNPC基因C1和/或C2 亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用。

背景技术

真核生物，包括人的基因都存在于染色体基因组中。但基因组上的基因序列一般不是连续的，而是包含外显子(exon)和内含子(intron)。当基因从基因组上转录下来为前体mRNA(pre-mRNA)时，必须将内含子去除，并将外显子连接在一起才能形成成熟的mRNA，才能指导蛋白质的合成，这个过程称为RNA的剪接(也可称为剪切)。但前体mRNA中内含子和外显子的剪接并不是不变的，有些外显子和内含子可以有多种剪接方式被称为可变剪切(alternative splicing)。比如：有些外显子可能在剪接时不被包括在成熟的mRNA中，称为外显子跳跃(exon skipping)，有些内含子没有被去除，而被保留在成熟的mRNA中，称为内含子保留(intron retention)。一个基因的前体mRNA可以有多种可变剪接方式，这些可变剪接可以单独或同时发生，从而产生数量众多的同源异构mRNA，编码同源异构蛋白，极大地增强了基因组的编码能力。

近年来，随着DNA测序和分析技术的快速进步以及基因组和转录组研究的不断深入，越来越多的研究发现，癌症的发生发展与前体mRNA可变剪接的调控有密切关系。癌症细胞的前体mRNA可变剪接模式与正常细胞往往有很大区别。异常的前体mRNA剪接方式可能使促癌的同源异构蛋白表达水平升高，或产生一些有致癌作用的异常蛋白，或者使抑癌基因失去功能，从而有利于癌症的发生发展。目前在很多癌症中都发现RNA异常剪接是癌症发生的重要原因。比如Fas是一种凋亡相关蛋白,可启动凋亡信号的转导而引起细胞凋亡。Fas的前体mRNA经可变剪接产生两种同源异构mRNA，包含外显子5至7的亚型，具有促进凋亡的作用。而不包含外显子 6的亚型则具有相反功能，可以抑制凋亡的作用，有利于肿瘤细胞生存。如果能够促进外显子6的剪接，则有可能促进癌细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤的目的。但由于基因组有数量非常大的前体mRNA的可变剪接，很多基因可能都参与了癌变过程，对于前体mRNA可变剪接在癌症发生发展中的作用目前还有很多问题亟待解决。

细胞中前体mRNA可变剪切的调节主要由可变剪切因子(splicing factor)进行。核内不均一核糖核蛋白C(下称hnRNP C)是一个重要的前体mRNA剪接调控因子，属于核内不均一核糖核蛋白(heterogenous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)家族。该家族是一组核内RNA结合蛋白，在细胞周期、细胞生长和凋亡相关等基因的表达和前体mRNA的可变剪切中发挥重要作用。目前共发现20多种hnRNP蛋白，其中hnRNP C是主要的成员。HnRNP C有两个同源异构亚型，即C1和C2。这两种亚型是由hnRNP C的外显子4经可变剪接产生。与C1相比，C2多了一段13个氨基酸的特异性序列。有报道认为hnRNP C可以促进miR-21的表达，并进而抑制 miR-21的靶基因PCDC4的表达，有利于癌细胞的转移。但hnRNP C，特别是其亚型C1和C2与癌症的关系和在致癌过程中的作用还很不清楚。

发明内容

为了解决上述问题，本发明经过大量实验、潜心研究，发现了hnRNPC 基因C1和C2亚型与癌症的关系和在致癌过程中的作用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用。本发明所述的hnRNPC1和 hnRNPC2的氨基酸序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了hnRNPC基因C1亚型的编码基因或含有该编码基因的生物材料在制备抗癌药物中的应用，所述生物材料为表达盒、表达载体、质粒、宿主菌或宿主细胞。

本发明提供了hnRNPC基因C1亚型的表达促进剂或促进hnRNPC基因C1亚型表达量上调的方法在制备抗癌药物中的应用。

本发明还提供了hnRNPC基因C2亚型的以下任一所述的应用，

(1)在促进细胞生长中的应用；

(2)在制备促进细胞生长的药物中的应用；

所述细胞包括正常细胞、癌细胞。

本发明提供了hnRNPC基因C2亚型的表达抑制剂在制备抗癌药物中的应用。

所述表达抑制剂为以下任一：

(1)特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的反义寡核苷酸；

(2)特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的siRNA或shRNA；

(3)hnRNPC基因C2亚型逆转录酶抑制剂；

(4)识别并阻碍hnRNPC基因C2亚型特定转录因子的小分子；

(5)破坏与hnRNPC基因C2亚型mRNA结合的蛋白质使mRNA不稳定的寡核苷酸；

(6)抑制hnRNPC基因C2亚型基因可变剪切的寡核苷酸或试剂。

上述(6)中，所述抑制hnRNPC基因C2亚型基因可变剪切的寡核苷酸为可以高效结合到hnRNPC基因外显子4上的C2剪接位点的反义寡核苷酸，或

可以高效结合到所述C2剪接位点上下游序列中对C2的剪接起调控作用的序列；

所述hnRNP C基因外显子4上的C2剪接位点，即： TCTCCGTCCCCTCTACTCAGGTCCGGAACTTTATTATTTA(SEQ ID NO.3)。

本发明的一个实施例中，特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的siRNA序列为5’GAGAUGUACGGGUCAGUAA 3’，其DNA序列为 5’GAGATGTACGGGTCAGTAA 3’(SEQ ID NO.4)。

本发明的一个实施例中，抑制hnRNPC基因C2亚型基因可变剪切的寡核苷酸的序列为5’TAATAAAGTTCCGGACCTGA 3’(SEQ ID NO.5)或5’TAAAGTTCCGGACCTGAGTA3’(SEQ IDNO.6)。

基于本发明的研究，本领域技术人员能够理解，含有以下任一或多种的抗癌药物属于本发明的保护范围：

(1)含有hnRNPC基因C1亚型蛋白或其编码基因或含有其编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、质粒、宿主菌、宿主细胞；

(2)含有使hnRNPC基因C1亚型在机体内表达量上调的试剂；

(3)降低hnRNPC基因C2亚型在机体内表达量的试剂；

(4)抑制或阻断hnRNPC基因C2亚型在机体内表达的试剂。

所述抑制或阻断hnRNPC基因C2亚型在机体内表达的试剂为以下任一或多种：

1)特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的反义寡核苷酸；

2)特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的siRNA或shRNA；

3)hnRNPC基因C2亚型逆转录酶抑制剂；

4)识别并阻碍hnRNPC基因C2亚型特定转录因子的小分子；

5)破坏与hnRNPC基因C2亚型mRNA结合的蛋白质使mRNA不稳定的寡核苷酸；

6)抑制hnRNPC基因C2亚型基因可变剪切的寡核苷酸或试剂。

进一步地，在应用时，所述1)特异靶向hnRNPC基因C2亚型编码基因的反义寡核苷酸可被2'-O-Methyl、Morpholino或硫代修饰。本领域技术人员可根据具体情况自行选择。

基于本发明实施例的贡献，本发明提供的抗癌药物中至少其含有以下任一或多条序列：

5’GAGATGTACGGGTCAGTAA3’ (SEQ ID NO.4) ；

5’TAATAAAGTTCCGGACCTGA 3’ (SEQ ID NO.5) ；

5’TAAAGTTCCGGACCTGAGTA3’(SEQ ID NO.6)。

本发明的有益效果在于，本发明提供了hnRNP C1和C2亚型的新用途，本发明发现hnRNP C1具有抑制癌细胞生长的作用，hnRNP C2具有促进癌细胞生长的作用，并且降低hnRNP C2的表达量，能够有效抑制癌细胞的生长。本发明为研制抗癌药物提供了新的靶点。基于本发明的研究，可以制备含有hnRNP C1或其表达促进剂或hnRNP C2表达抑制剂的药物用于对包括口腔癌在内的各类癌症的预防和治疗，效果显著，临床应用价值巨大。

附图说明

图1为hnRNP C2在口腔癌细胞中表达水平要显著高于正常细胞。

T1是原代培养的口腔癌细胞；CAL 27是口腔癌细胞系；N1-N3是原代培养的口腔黏膜上皮细胞。用western杂交和hnRNP C特异性抗体检测C2 和C1的表达水平。C2/C1是C2和C1表达量(条带强度)的比值。Actin 是肌动蛋白，作为上样量的对照。

图2是hnRNP C2在口腔癌组织中表达水平要显著高于正常组织。

A图中，正常组织为口腔黏膜正常组织。肿瘤组织是口腔癌患者的肿瘤组织。用特异性抗hnRNP C2或抗总hnRNP C的抗体，以免疫组织化学的方法检测hnRNP C2和总hnRNP C的蛋白表达水平。A图说明，口腔癌组织中C2的表达水平显著高于正常组织。B图和C图为用免疫组织化学法检测了76个肿瘤组织和10个正常组织中C2和总C的表达，然后给每个样本C2和总C染色记分。用Mann-Whitney U-test法分析肿瘤组织与正常组织的C2的表达差异(B图)和C2与总C表达量比值的差异(C图)。

图3是C2与总C表达量比值与患者生存时间的关系。

根据口腔癌患者的肿瘤组织中C2与总C表达量比值的大小，将患者分为高(33名患者)和低(32名患者)两组。用Kaplan-Meier法分析两组患者的生存时间的差别，p值为0.04。

图4是降低C2的表达可以抑制口腔癌细胞的生长。

其中A图将20nM的针对C2的特异性siRNA转入CAL 27或T1细胞中，设立非特异性siRNA(NS)作为对照。96小时后细胞计数。B图为 Western杂交显示C2的表达水平在特异性siRNA处理后显著降低。

图5是C2可以促进细胞生长，而C1抑制细胞生长。

A图为在正常细胞NIH 3T3中用慢病毒载体稳定转染T7短肽标记的hnRNP C2或hnRNP C1(即：T7-hnRNP C1和T7-hnRNP C2)，设定载体转染的细胞为对照。将同样数量的细胞接种24孔板，6天后计数。B图为 Western杂交显示C2和C1在细胞中的过表达。

图6C1可以抑制口腔癌细胞的生长。

A图为在CAL27细胞中用慢病毒载体稳定转染T7短肽标记的hnRNP C2或hnRNP C1，设定载体转染的细胞为对照，将同样数量的细胞接种24 孔板，7天后计数。B图为Western杂交显示C2和C1在细胞中的过表达。

图7证实C2可以促进肿瘤的发生和发展。

在正常细胞MEF 3T3中用慢病毒载体稳定转染T7短肽标记的hnRNP C2或hnRNP C1(即：T7-hnRNP C1和T7-hnRNP C2)，设定载体转染的细胞为对照，将这些细胞分别接种到裸鼠的皮下，观察肿瘤的形成和生长。 A图为肿瘤体积的变化。B图为在接种细胞后第37天分离肿瘤并称重。C 图为分离的各组肿瘤。D图为Western杂交显示C2和C1在所接种的肿瘤细胞中的过表达。

图8寻找可以高效结合到外显子4上的C2剪接位点的反义寡核苷酸。 A图为包含人hnRNP C外显子4的前体mRNA的一个质粒表达系统(迷你基因质粒，SEQ ID NO.7)。序列下方的横线表示反义寡核苷酸。方框代表外显子，方框间的实线代表内含子，虚线代表前体mRNA的剪接方向。B 图为将迷你基因质粒和经硫代修饰的反义寡核苷酸一起转染293细胞，用western杂交和抗GFP抗体检测C1-GFP或C2-GFP的融合蛋白的表达。

图9反义寡核苷酸可以有效地抑制C2的表达和口腔癌细胞的生长。合成2'-O-Methyl和硫代修饰的AC11和AC14号反义寡核苷酸，转染CAL 27癌细胞后，分别用RT-PCR(A)和western杂交(B)检测C2的表达。 (C)48小时后细胞计数结果，NC是非特异性反义寡核苷酸。

图10是降低C2的表达可以抑制乳腺癌细胞的生长。

其中A图将20nM的针对C2的特异性siRNA转入MDA-MB-231乳腺癌细胞中，设立非特异性siRNA(NS)作为对照。转染2天和4天后细胞计数。B图为Western杂交显示C2的表达水平在特异性siRNA处理后显著降低。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别说明，本发明实施例中所用的生物材料、试剂、仪器、设备均为市售可得。

本发明实施例所述的hnRNP C1和C2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示。

本发明实施例涉及的细胞CAL 27细胞、T1口腔癌细胞、MDA-MB-231 乳腺癌细胞、NIH 3T3细胞、非肿瘤细胞MEF 3T3、均为在非专利文献已公开的细胞，公众可以获得。

实施例1 hnRNP C1和C2在口腔癌细胞和正常口腔黏膜上皮细胞中的表达差异

本实施例检测了hnRNP C1和C2在口腔癌细胞和正常口腔黏膜上皮细胞中的表达。CAL 27细胞是口腔癌细胞系。T1是发明人用酶消化法从口腔癌组织中分离纯化的原代培养的口腔癌细胞。N1、N2和N3是从正常牙龈组织分离的原代培养口腔上皮细胞。

(1)用SDS上样缓冲液处理细胞获得细胞总蛋白。用总蛋白进行 western检测发现在癌症细胞中hnRNP C2的表达水平显著高于C1(见图1)，说明了C2与口腔癌有关。

(2)利用免疫组织化学方法检测了口腔癌组织和正常口腔黏膜组织中 hnRNP C2和总的hnRNP C蛋白的表达水平。

C2的特异性抗体是针对其13个氨基酸的特异性序列的。由于C1只比 C2少13个氨基酸，所以没有C1特异性的抗体，本实施例用可以同时识别 C2和C1的抗体来检测总的hnRNP C蛋白的表达水平，间接反映C1的表达水平。

从武汉大学口腔医院获得口腔癌患者癌组织(76例)和正常黏膜组织 (10例)样本切片，然后用美国DaKo公司的EnVision FLEX免疫组织化学试剂盒、美国Abcam公司的兔单克隆抗hnRNP C2抗体和美国Santa Cruz 公司的小鼠抗总hnRNP C抗体进行免疫组织化学染色，用显微镜拍照记录染色结果。

对染色结果进行分析，根据每个细胞的细胞核被DAB染成黄棕色的强弱分别记为0到3级；然后计算每一级的细胞数量占整个视野的细胞总数的百分比，然后将各级的百分比乘以相应的级数再相加，得到样本的染色记分，代表表达水平。每个样本都有hnRNP C2和总的hnRNP C染色记分结果。把hnRNP C2染色记分除以总的hnRNP C染色记分得到了C2与总的C的表达量的比值。用Mann-WhitneyU-test法分析肿瘤组织与正常组织的 C2的表达差异。结果发现口腔癌组织中C2的表达水平显著高于正常组织 (图2的A和图2的B)，并且口腔癌组织中C2与总的C的表达量的比值也是显著高于正常组织的(图2的A和图2的C)。

(3)本实施例分析了口腔癌患者的生存时间与C2与总的C的表达量的比值的关系，发现C2与总的C的表达量比值高的患者的生存时间显著低于比值低的患者，平均生存时间分别为29.7个月(C2/C比值高的患者的生存时间)和46.8个月(C2/C比值低的患者的生存时间)，详见图3。这些结果说明了hnRNP C2在口腔癌组织中高表达，并且C2在总的hnRNP C蛋白中的比例与患者的预后有显著负相关。

实施例2 hnRNP C2促进细胞生长，hnRNP C1抑制癌细胞生长

在CAL 27和T1口腔癌细胞中转染只针对hnRNP C2的特异性siRNA (序列为5’GAGAUGUACGGGUCAGUAA 3’)，抑制细胞中hnRNP C2的表达，结果发现口腔癌细胞的生长受到了显著的抑制(图4)，说明口腔癌细胞的生长需要hnRNP C2。

在正常细胞NIH 3T3中用慢病毒载体(来源于pLVX-IRES-PURO质粒， Clontech公司)稳定转染T7短肽(序列是MASMTGGQQMG，以方便对过表达的蛋白进行检测)标记的hnRNPC2或hnRNP C1(即：T7-hnRNP C1 和T7-hnRNP C2)，设定载体转染的细胞为对照，发现过表达hnRNP C2 可以显著促进正常细胞的生长(图5)。说明hnRNP C2具有促进细胞生长的作用，对肿瘤细胞的生长是有利的。

在CAL 27细胞中用慢病毒载体分别稳定转染T7短肽标记的hnRNP C2、hnRNP C1，设定载体转染的细胞为对照，发现hnRNP C1可以显著抑制CAL 27口腔癌细胞的生长(图6)，说明hnRNP C1有抑癌作用。

为了进一步了解hnRNP C2和C1在癌症发生发展中的作用。本发明在小鼠胚胎成纤维细胞MEF 3T3(该细胞不是肿瘤细胞，但可以在裸鼠的皮下生长形成一些肿瘤样组织)中用慢病毒载体稳定转染T7短肽标记的 hnRNP C2或hnRNP C1(即：T7-hnRNP C1和T7-hnRNPC2)，设定载体转染的细胞为对照，将这些细胞分别接种到裸鼠的皮下，观察肿瘤的形成和生长，结果发现，与对照细胞和hnRNP C1过表达的细胞相比，hnRNP C2 过表达显著促进了肿瘤的形成和生长，见图7的A图，以及hnRNP C2过表达显著增加了所形成的肿瘤的体积，见图7的B-C图，说明hnRNP C2 具有原癌基因的功能。见图7的D图显示C2和C1在所接种的肿瘤细胞中的过表达。

实施例3反义寡核苷酸可抑制hnRNP C2的剪接

确定hnRNP C基因外显子4的C2剪接位点，即：TCTCCGTCCCCTCTACTCAGGTCCGGAACTTTATTATTTA，下划线标记的是C2的序列，非下划线部分的是内含子的序列。

HnRNP C2和C1是由hnRNP C前体mRNA的外显子4经可变剪接产生。因此本实施例采用反义寡核苷酸的方法来抑制hnRNP C2的剪接，并促进hnRNP C1的剪接。首先制备了包含人hnRNP C外显子4的前体mRNA 的一个质粒表达系统(下称为迷你基因质粒，见图8的A图)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

该质粒表达系统是用引物5’-GCAGAGCCAAAAGTGAACCGAG-3’ (SEQ ID NO.8)和5’-CCCGTTGAAAGTCATAGTCCAAGTC-3’(SEQ ID NO.9)扩增hnRNP C基因的外显子4，内含子4和外显子5序列，然后克隆到pEGFP-N1质粒。外显子5的末端与绿色荧光蛋白(GFP)基因的开放阅读框架融合。所得的质粒表达系统可以转录产生包含hnRNP C外显子4，内含子4和外显子5的前体mRNA和表达hnRNP C部分氨基酸与绿色荧光蛋白的融合蛋白。该系统在细胞中可以模拟hnRNP C基因的外显子4的可变剪接，表达C1-GFP或C2-GFP亚型。

针对hnRNP C2的5端剪接位点(5’splice site)设计了一系列反义寡核苷酸：

ac2(SEQ ID NO.10):5’agttataaataataaagttc 3’

ac3(SEQ ID NO.11):5’gttataaataataaagttcc 3’

ac4(SEQ ID NO.12):5’ttataaataataaagttccg 3’

ac5(SEQ ID NO.13):5’tataaataataaagttccgg 3’

ac6(SEQ ID NO.14):5’ataaataataaagttccgga 3’

ac7(SEQ ID NO.15):5’taaataataaagttccggac 3’

ac8(SEQ ID NO.16):5’aaataataaagttccggacc 3’

ac9(SEQ ID NO.17):5’aataataaagttccggacct 3’

ac10(SEQ ID NO.18):5’ataataaagttccggacctg 3’

ac11(SEQ ID NO.19):5’taataaagttccggacctga 3’

ac12(SEQ ID NO.20):5’aataaagttccggacctgag 3’

ac13(SEQ ID NO.21):5’ataaagttccggacctgagt 3’

ac14(SEQ ID NO.22):5’taaagttccggacctgagta 3’

ac15(SEQ ID NO.23):5’aaagttccggacctgagtag 3’

ac16(SEQ ID NO.24):5’aagttccggacctgagtaga 3’

ac17(SEQ ID NO.25):5’agttccggacctgagtagag 3’

ac18(SEQ ID NO.26):5’gttccggacctgagtagagg 3’

ac19(SEQ ID NO.27):5’ttccggacctgagtagaggg 3’

ac20(SEQ ID NO.28):5’tccggacctgagtagagggg 3’

ac21(SEQ ID NO.29):5’ccggacctgagtagagggga 3’

ac22(SEQ ID NO.30):5’cggacctgagtagaggggac 3’

ac23(SEQ ID NO.31):5’ggacctgagtagaggggacg 3’

ac24(SEQ ID NO.32):5’gacctgagtagaggggacgg 3’

ac25(SEQ ID NO.33):5’acctgagtagaggggacgga 3’

ac26(SEQ ID NO.34):5’cctgagtagaggggacggag 3’

ac27(SEQ ID NO.35):5’ctgagtagaggggacggaga 3’

同时设计了一个非特异性的反义寡核苷酸(NS)作为对照，其序列是：ACTCTATCTGCACGCTGACT。

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成了这些反义寡核苷酸，各个反义寡核苷酸的每个碱基都做了硫代修饰。经硫代修饰的反义寡核苷酸在细胞的中的稳定性好，但与靶mRNA结合后还存在RNase H效应，会导致靶 mRNA的降解，通常不单独用于调控靶mRNA可变剪切。但是可以提示反义寡核苷酸与靶RNA的结合能力。将这些反义寡核苷酸分别与前述制得的迷你基因质粒一起转染细胞，发现AC11(5’TAATAAAGTTCCGGACCTGA 3’)和AC14号(5’TAAAGTTCCGGACCTGAGTA 3’)反义寡核苷酸可以很好地抑制C1-GFP或C2-GFP亚型的表达(图8的B图)，说明这两个反义寡核苷酸可以很好地结合靶RNA。

然后合成2'-O-Methyl和硫代修饰的AC11和AC14号反义寡核苷酸(这种反义寡核苷酸不会降解靶RNA，而可以抑制hnRNP C2的剪接，并促进 hnRNP C1的剪接)。

1)逆转录

取1μg RNA样本进行DNA酶处理，加1μL 10×DNase buffer (Thermofisher公司)和1μL DNaseI(1U/μL)(Thermofisher公司)，加无RNA酶水补足体积至10μL。混均后，室温静置10min。然后加入1μL 25mM EDTA溶液，65℃10分钟，中止DNA酶的作用。取出9μL处理好的RNA样本，加1μL Random Primers(Promega公司)和无RNA酶水4μL， 70℃孵育5min后，立即取出置冰上。再加入1.25μL dNTPs(Thermofisher 公司)、0.125μL RNase inhibitor(Promega公司)、5μL 5×MMLV buffer (Promega公司)、1μLMMLV逆转录酶(Promega公司)和无RNA酶水3.625μL。混匀后置37℃60min，完成逆转录，得到cDNA。

2)RT-PCR

取1μL cDNA，加12.5μL 2×Premix Taq DNA聚合酶混合物(Takara 公司)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)和9.5μL无RNA 酶水。检测hnRNP C第四个外显子可变剪接的引物序列是： 5’-GGAGAGGATGGCAGAATGATTGCTG-3’(SEQ ID NO.36)和5’-GGCACTACAGCCCGAGCAATA-3’(SEQ ID NO.37)。检测内对照 GAPDH的引物序列是：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO.38)和5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ IDNO.39)。反应参数是：94℃2min，经35个循环(94℃20秒，59℃30秒，72℃1分钟) 后72℃7分钟。反应完成后在2％的琼脂糖凝胶中电泳观察反应产物。

利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，将反义寡核苷酸转染CAL 27细胞，终浓度为40nM。48小时后，用0.25％的胰酶-EDTA (Thermofisher公司)消化细胞计数，结果发现，C2特异性反义寡核苷酸可以显著地抑制CAL 27细胞的生长(图9的C图)。提取细胞总蛋白，然后进行western杂交检测，方法同上。结果发现，C2的反义寡核苷酸可以显著地抑制C2亚型mRNA和C2蛋白表达(图9的A和B图)，并抑制了CAL 27细胞的生长(图9的C图)。

实施例4用siRNA抑制C2的表达可以抑制口腔癌细胞的生长

根据Genbank数据库中hnRNP C的基因序列，确定hnRNP C基因外显子4的C2的特异性序列，即： 5’CGGAGATGTACGGGTCAGTAACAGAACACCCTTCTCCGTCCCCTCTACTCAG 3’(SEQ IDNO.40)，下划线标记的是C2特异性序列，设计特异性针对C2的siRNA，序列为5’GAGATGTACGGGTCAGTAA 3’。由苏州吉玛公司合成了该siRNA。

利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，将siRNA 转染CAL27细胞或口腔癌原代培养细胞，终浓度为20nM。48小时后再转染一次，96小时时，用0.25％的胰酶-EDTA(Thermofisher公司)消化细胞计数，结果发现，C2特异性siRNA可以显著地抑制CAL 27细胞和T1细胞的生长(图4的A图)。

提取细胞总蛋白，然后进行western杂交检测。将蛋白质样本在10％的 SDS-PAGE胶(Thermofisher公司)中分离，用Western转印仪(Biorad公司)在60V电压下经2个小时转移到硝酸纤维素膜(Pall公司)上。将膜用5％脱脂牛奶封闭膜1个小时，与小鼠抗hnRNP C抗体(Santa Cruz公司， 1:1000稀释)孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(Sigma公司，1:10000)孵育1小时，用发光底物(Thermofisher)和X线胶片检测hnRNP C2和C1蛋白的表达水平。结果发现，C2的siRNA可以显著地抑制C2蛋白的表达(图4的B图)。

实施例5抑制C2的表达同样显著抑制了乳腺癌细胞的生长

利用脂质体转染剂Lipofecatmin 3000(Thermofisher公司)，将实施例 4的siRNA转染MDA-MB-231乳腺癌细胞，终浓度为20nM。2天后再转染一次，4天时，用0.25％的胰酶-EDTA(Thermofisher公司)消化细胞计数，结果发现，C2特异性siRNA可以显著地抑制MDA-MB-231细胞的生长(图10A)。提取细胞总蛋白，然后如实施例4一样进行western杂交检测。结果发现，C2的siRNA可以显著地抑制C2蛋白的表达(图10B)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉大学

<120> hnRNPC基因C1和/或C2亚型作为药物靶标在筛选抗癌药物中的应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 293

<212> PRT

<213> hnRNP C1(human Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Ser Asn Val Thr Asn Lys Thr Asp Pro Arg Ser Met Asn Ser

1 5 10 15

Arg Val Phe Ile Gly Asn Leu Asn Thr Leu Val Val Lys Lys Ser Asp

20 25 30

Val Glu Ala Ile Phe Ser Lys Tyr Gly Lys Ile Val Gly Cys Ser Val

35 40 45

His Lys Gly Phe Ala Phe Val Gln Tyr Val Asn Glu Arg Asn Ala Arg

50 55 60

Ala Ala Val Ala Gly Glu Asp Gly Arg Met Ile Ala Gly Gln Val Leu

65 70 75 80

Asp Ile Asn Leu Ala Ala Glu Pro Lys Val Asn Arg Gly Lys Ala Gly

85 90 95

Val Lys Arg Ser Ala Ala Glu Met Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Leu Asp

100 105 110

Tyr Asp Phe Gln Arg Asp Tyr Tyr Asp Arg Met Tyr Ser Tyr Pro Ala

115 120 125

Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Ile Ala Arg Ala Val Val Pro Ser Lys

130 135 140

Arg Gln Arg Val Ser Gly Asn Thr Ser Arg Arg Gly Lys Ser Gly Phe

145 150 155 160

Asn Ser Lys Ser Gly Gln Arg Gly Ser Ser Lys Ser Gly Lys Leu Lys

165 170 175

Gly Asp Asp Leu Gln Ala Ile Lys Lys Glu Leu Thr Gln Ile Lys Gln

180 185 190

Lys Val Asp Ser Leu Leu Glu Asn Leu Glu Lys Ile Glu Lys Glu Gln

195 200 205

Ser Lys Gln Ala Val Glu Met Lys Asn Asp Lys Ser Glu Glu Glu Gln

210 215 220

Ser Ser Ser Ser Val Lys Lys Asp Glu Thr Asn Val Lys Met Glu Ser

225 230 235 240

Glu Gly Gly Ala Asp Asp Ser Ala Glu Glu Gly Asp Leu Leu Asp Asp

245 250 255

Asp Asp Asn Glu Asp Arg Gly Asp Asp Gln Leu Glu Leu Ile Lys Asp

260 265 270

Asp Glu Lys Glu Ala Glu Glu Gly Glu Asp Asp Arg Asp Ser Ala Asn

275 280 285

Gly Glu Asp Asp Ser

290

<210> 2

<211> 306

<212> PRT

<213> hnRNP C2(human Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Ser Asn Val Thr Asn Lys Thr Asp Pro Arg Ser Met Asn Ser

1 5 10 15

Arg Val Phe Ile Gly Asn Leu Asn Thr Leu Val Val Lys Lys Ser Asp

20 25 30

Val Glu Ala Ile Phe Ser Lys Tyr Gly Lys Ile Val Gly Cys Ser Val

35 40 45

His Lys Gly Phe Ala Phe Val Gln Tyr Val Asn Glu Arg Asn Ala Arg

50 55 60

Ala Ala Val Ala Gly Glu Asp Gly Arg Met Ile Ala Gly Gln Val Leu

65 70 75 80

Asp Ile Asn Leu Ala Ala Glu Pro Lys Val Asn Arg Gly Lys Ala Gly

85 90 95

Val Lys Arg Ser Ala Ala Glu Met Tyr Gly Ser Val Thr Glu His Pro

100 105 110

Ser Pro Ser Pro Leu Leu Ser Ser Ser Phe Asp Leu Asp Tyr Asp Phe

115 120 125

Gln Arg Asp Tyr Tyr Asp Arg Met Tyr Ser Tyr Pro Ala Arg Val Pro

130 135 140

Pro Pro Pro Pro Ile Ala Arg Ala Val Val Pro Ser Lys Arg Gln Arg

145 150 155 160

Val Ser Gly Asn Thr Ser Arg Arg Gly Lys Ser Gly Phe Asn Ser Lys

165 170 175

Ser Gly Gln Arg Gly Ser Ser Lys Ser Gly Lys Leu Lys Gly Asp Asp

180 185 190

Leu Gln Ala Ile Lys Lys Glu Leu Thr Gln Ile Lys Gln Lys Val Asp

195 200 205

Ser Leu Leu Glu Asn Leu Glu Lys Ile Glu Lys Glu Gln Ser Lys Gln

210 215 220

Ala Val Glu Met Lys Asn Asp Lys Ser Glu Glu Glu Gln Ser Ser Ser

225 230 235 240

Ser Val Lys Lys Asp Glu Thr Asn Val Lys Met Glu Ser Glu Gly Gly

245 250 255

Ala Asp Asp Ser Ala Glu Glu Gly Asp Leu Leu Asp Asp Asp Asp Asn

260 265 270

Glu Asp Arg Gly Asp Asp Gln Leu Glu Leu Ile Lys Asp Asp Glu Lys

275 280 285

Glu Ala Glu Glu Gly Glu Asp Asp Arg Asp Ser Ala Asn Gly Glu Asp

290 295 300

Asp Ser

305

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctccgtccc ctctactcag gtccggaact ttattattta 40

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagatgtacg ggtcagtaa 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taataaagtt ccggacctga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaagttccg gacctgagta 20

<210> 7

<211> 727

<212> DNA

<213> 迷你基因质粒中hnRNP C外显子4，内含子4和外显子5(ArtificialSequence)

<400> 7

gcagagccaa aagtgaaccg aggaaaagca ggtgtgaaac gatctgcagc ggagatgtac 60

gggtcagtaa cagaacaccc ttctccgtcc cctctactca ggtccggaac tttattattt 120

ataactgcat tgtgtccatc agtgggcatc ttctctttct gttttctggg tgtggggagg 180

tttaagtgta ctgtgtttta tctgtgtata aataaggttt tattattttt gtgttaatat 240

gtctcttttt tgccctagag aaaatttcta gagaattaaa aatccctgag gtttttgcta 300

ttgatattaa agagtagttt gatatttata gcataacctg aaatacttat acaggatcgt 360

tgagcttcta agacactaga gagtaagaga gggtagaagt gtggtataag aatgcttagt 420

ttaccattct gtttttcagt gtttagttta gctatgtcgt atgtggaaat cttagcgaat 480

tttaacctga atttccaatt tgaccgctac atttccagtg gtctaaggtg attggaattg 540

agtgatttat tgtatgaatg attggggatc attcagtgct aatcttgttg atctatttgt 600

tgtggtttat ttggcatggt tctcccctca cctgacattg tgaattagta gaaacatttc 660

caaattaacc cttttcggta tttatttttc agctcctctt ttgacttgga ctatgacttt 720

caacggg 727

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagagccaa aagtgaaccg ag 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccgttgaaa gtcatagtcc aagtc 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agttataaat aataaagttc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttataaata ataaagttcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttataaataa taaagttccg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tataaataat aaagttccgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ataaataata aagttccgga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taaataataa agttccggac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaataataaa gttccggacc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aataataaag ttccggacct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ataataaagt tccggacctg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taataaagtt ccggacctga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aataaagttc cggacctgag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ataaagttcc ggacctgagt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taaagttccg gacctgagta 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaagttccgg acctgagtag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aagttccgga cctgagtaga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agttccggac ctgagtagag 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttccggacc tgagtagagg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttccggacct gagtagaggg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tccggacctg agtagagggg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccggacctga gtagagggga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cggacctgag tagaggggac 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggacctgagt agaggggacg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gacctgagta gaggggacgg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acctgagtag aggggacgga 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cctgagtaga ggggacggag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ctgagtagag gggacggaga 20

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggagaggatg gcagaatgat tgctg 25

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggcactacag cccgagcaat a 21

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 40

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cggagatgta cgggtcagta acagaacacc cttctccgtc ccctctactc ag 52

Claims (1)

1.一种hnRNPC基因C1亚型的表达促进剂在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述癌为乳腺癌和/或口腔癌。

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