CN112716926B - 一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用。小豆蔻素是一种具有良好的生物活性的植物提取物，本发明发现其具有通过上调Nrf2来抑制髓核细胞炎症反应的功效，且用药剂量低，抗炎及抗氧化效果明显的特点。相比西药，小豆蔻素作为一种中药，其抗炎作用比较缓和，可以为椎间盘退变疾病综合治疗提供一种替代治疗药物。

Description

一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用。

背景技术

下腰痛(Low back pain, LBP)是一种常见的临床疾病，流行病学资料显示，近80%的人类在一生中至少经历过一次 LBP 发作，而IVDD被认为是其最主要的原因。然而，目前临床上尚无针对椎间盘退变的治疗药物。

椎间盘退变是一种多因素过程，如异常受力、局部营养缺乏以及先天基因异常等，而炎症是椎间盘退变的重要发病机制之一，其中炎症因子介导的髓核细胞细胞外基质(Extracellularmatrix, ECM）合成代谢紊乱是椎间盘退变过程中极为关键的一环。因此，近年来针对炎症因子介导的髓核细胞细胞外基质降解、流失的研究已成为治疗椎间盘退变的重要途径，以期从根本上解决椎间盘退变的问题。

小豆蔻素(Cardamonin)又称三角豆蔻、印度豆蔻、豆蔻，是从姜中分离的一种查尔酮类化合物，香气浓烈，味辣微苦。小豆蔻素在多项药理学研究中展示出了良好的生物活性，例如抗炎，抗氧化和抗肿瘤活性等。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用。

本发明所采取的技术方案如下：一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，所述小豆蔻素的结构式为：

。

进一步的，所述药物通过上调Nrf2抑制髓核细胞炎症反应。

一种治疗及延缓椎间盘退行性病变药物，其包含小豆蔻素，所述小豆蔻素的结构式为：

。

进一步的，所述药物包括药用载体，所述药用载体选自长循环脂质体或环糊精纳米。

进一步的，所述药物的剂型为片剂、乳剂或胶囊。

进一步的，所述药物中小豆蔻素用量为20 mg/kg体重。

本发明的有益效果如下：小豆蔻素是一种具有良好的生物活性的植物提取物，本发明发现其具有通过上调Nrf2来抑制髓核细胞炎症反应的功效，且用药剂量低，抗炎及抗氧化效果明显的特点。相比西药，小豆蔻素作为一种中药，其抗炎作用比较缓和，可以为椎间盘退变疾病综合治疗提供一种替代治疗药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1是小豆蔻素作用24小时及48小时的CCK8药物毒性试验对照图；

图2是小豆蔻素在缓解IL-1β介导的髓核细胞炎症相关蛋白inos和COX2影响的试验对照图；

图3是小豆蔻素在缓解IL-1β介导的髓核细胞炎症相关蛋白影响的qPCR试验对照图：A为iNOS和COX-2在mRNA水平的表达情况；B为TNF-α和IL-6在mRNA水平的表达情况；

图4是小豆蔻素在缓解IL-1β对髓核细胞炎性指标影响的ELISA的试验对照图：A为PGE2、Nitrite在细胞外的表达水平；B为TNF-α和IL-6在细胞外的表达水平；

图5是小豆蔻素在IL-1β的作用下改善髓核细胞外基质合成代谢的情况图；A为在髓核细胞中评估II型胶原(Collagen II)、蛋白聚糖(Aggrecan)、MMP13、ADAMTS-5在蛋白水平的表达情况；B为Collagen II ,MMP13在蛋白水平表达情况的荧光图；C为小豆蔻素在IL-1β的作用下Collagen II、Aggrecan、MMP13、ADAMTS-5蛋白表达情况的灰度值比值统计图；

图6是小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中验证其对NF-κB通路影响的蛋白质印迹试验对照图；A为NF-κB信号通路在蛋白水平的表达情况；B为p65入核情况的细胞免疫荧光试验对照图；C为p65和Lamin B灰度值比值的统计图；D为IκBα与GAPDH灰度值比值的统计图；

图7是小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中验证其对Nrf2/HO-1通路影响的蛋白质印迹试验对照图；A为Nrf2/HO-1信号通路在蛋白水平的表达情况；B为Nrf2入核情况的细胞免疫荧光试验对照； C为HO-1和GAPDH灰度值比值的统计图；D为IκBα与Lamin B灰度值比值的统计图；

图8是沉默Nrf2对小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中Nrf2及NF-κB通路影响的Western blot试验对照图；A是沉默Nrf2对小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中Nrf2及NF-κB通路影响的蛋白质水平表达情况；B为灰度值比值统计图；

图9是沉默Nrf2对小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中ADAMTS5和MMP13的蛋白质印迹试验对照图；A蛋白水平的表达情况图；B是灰度值比值统计图；

图10是沉默Nrf2对小豆蔻素在IL-1β刺激下的髓核细胞中PGE2、Nitrite、TNF-α、IL-6的ELSIA试验对照图；

图11是小豆蔻素对大鼠尾椎椎间盘退变针刺模型的治疗效果的X线试验对照图；0W、4W、8W分别指建立针刺模型后饲养0周、4周、8周；

图12为椎间盘高度指数(DHI)统计图；

图13是小豆蔻素对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的磁共振T2像试验对照图；

图14是小豆蔻对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的Pfirrmann分级统计图；

图15是小豆蔻素对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的H&E染色对照图；

图16是大鼠尾椎H&E染色的组织学评分统计图；

图17是小豆蔻素对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的S&O染色对照图；

图18是小豆蔻素对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的组织免疫组化检测Collagen II、MMP13、Nrf2表达水平的试验对照图；

图19是小豆蔻素对针刺诱导大鼠尾椎椎间盘退变模型的治疗效果的组织免疫组化检测Collagen II、MMP13、Nrf2阳性点表达水平的统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

1、材料和试剂

细胞培养试剂(Life technologies产品)：DMEM/F12细胞基础培养基(10567-014，Gibco，Invitrogen，Grand Island，NY)，胎牛血清，胰酶，100U/ml青霉素/链霉素(双抗)。其他细胞培养试剂：II型胶原酶(Gibco)。

组织学试剂(北京索莱宝)：苏木精、伊红；多聚甲醛、石蜡、无水乙醇、二甲苯、中性树脂。细胞增殖检测试剂盒Cell Couming KIT-8(CCK- 8，Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan)。

免疫印迹及免疫荧光试剂：Aggrecan, Collagen II, ADAMTS5, GAPDH andLamin B1(Abcam，Cambrige，UK)，inos, COX-2, IκBα, p65, Nrf2, HO-1 and MMP13 werepurchased from ProteinTech (Wuhan, China)，DAPI Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂 (中杉金桥)，Goat anti-rabbit(Alexa Fluor488，Invitrogen)，蛋白定量试剂盒BCAProtein Assay Kit)，免疫组化内源性过氧化物酶阻断剂，酶标山羊抗兔IgG聚合物（中杉金桥）。

RNA干扰试剂：转染试剂(LipofectamineTM 2000，Life technologies)，Opti-MEMI Reduced Serum Medium(Life technologies)。

细胞培养相关耗材：60mm、100mm培养皿（SORFA），细胞计数板（BIO-RAD）管；15ml、50ml离心管(Corning)；6孔及12孔细胞培养板(SORFA)；移液管等(Corning)。

3、实验方法

(1) 大鼠髓核细胞获取及培养

取4周龄成年SD大鼠尾巴，去皮。用无菌手术刀片切开椎间隙，用无菌显微镊夹取胶冻状髓核组织，置于预先加好PBS的中皿保存。每次共提取4根大鼠尾巴，提取每根尾巴中7个节段的髓核。获取全部髓核组织后，去除当中的杂质如韧带，纤维环等，再用无菌显微剪将其剪碎成1mm×1mm×1mm大小，转移到15ml离心管，离心，去上清液，再次用无菌的PBS洗一次，离心，弃去上清液。最后向15ml离心管中加入0 .2％II型胶原酶(Vetec)10ml，在37℃细胞培养箱内消化4小时。消化完成后，离心，去上清液，再用无菌PBS重悬，再次离心，获得最终的髓核碎片沉淀，最后加入含体积浓度15％FBS的DMEM/F12培养基混悬细胞，均匀铺到2个底面积为25cm²的培养瓶内。髓核细胞贴壁需要一周时间，期间无需更换培养基，贴壁后，2-3天换一次培养基。DMEM/F12培养基组成为84％的DMEM/F12基础培养基(GIBCO)+15％的FBS(Hyclone)+1％的青霉素链霉素混合液(索莱宝)。

(2)细胞活力测定

CCK8法测定药物细胞毒性：取选取步骤(1)中前3代髓核细胞以8～6×10³个/孔的细胞量接种于96孔板内，待细胞贴壁后予以分组：共7组，组1至组7，每孔总体积为100μL，基础培养基为配制液；其中组1为对照组(小豆蔻素浓度为0μM)，组2小豆蔻素浓度12.5μM，组3小豆蔻素浓度25μM，组4小豆蔻素浓度50μM，组5小豆蔻素浓度100μM，组6小豆蔻素浓度200μM，组7小豆蔻素浓度300μM。培养24h后，每孔加入现配的CCK8反应液100μL：基础培养基：CCK8工作液＝9∶1的比例配制。在37℃培养箱内孵育2h，用酶标仪测得各孔的吸光度值。

(3)药物处理

取部分步骤(1)的前3代髓核细胞，用15％FBS的DMEM/F12培养基混悬细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，接种细胞到6孔板内，每孔1ml，放入37℃，5％CO2培养箱培养过夜，待细胞密度达80％，换成基础培养基培养18h使细胞同步化。取出6孔板，放在超净工作台上，吸尽培养液，进一步分成4组，组1为对照组，加入1ml100％的基础培养基，组2加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml），体外模拟椎间盘退变中的炎症环境，组3加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml，小豆蔻素浓度为25μM)，组4加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml，小豆蔻素浓度为50μM)，组5加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml，小豆蔻素浓度为100μM)。在37℃下作用24小时，取上清液用于ELISA试剂盒检测炎症因子，细胞沉底用于分离全细胞蛋白及细胞RNA进行后续Western blot及qPCR，以检测髓核细胞在炎症刺激和小豆蔻素作用下其细胞内功能蛋白的表达变化情况。

（4）Western blot步骤

用BCA法测定上述蛋白的浓度，根据测定结果取蛋白提取上清液加入Loadingbuffer与水，使蛋白量定量为30μg/20μL，100℃加热10min使蛋白变性。在SDS-PAGE凝胶的每个孔道内上样量为20μl的配置好的蛋白液，先电泳，后用PVDF膜进行转膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗涤5min×3次后，孵inos抗体(1∶1000，ProteinTech)、Collagen II抗体(1∶1000，Abcam)、Aggrecan抗体(1∶1000，Abcam)、MMP13抗体(1∶1000，ProteinTech)、LaminB1抗体(1∶1000，Abcam)、ADAMTS5抗体(1∶1000，Abcam)、COX2抗体(1∶1000，ProteinTech)、IκBα 抗体(1∶1000，ProteinTech)、, p65抗体(1∶1000，ProteinTech)、Nrf2抗体(1∶1000，ProteinTech)和, HO-1抗体(1∶1000，ProteinTech)，GAPDH 抗体（1:5000，Abcam）作为一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤PVDF膜5min×3次，辣根过氧化酶标记的二抗(二抗：TBST＝1：1000，Bioworld)室温孵育2h，TBST洗涤5min×3次，ECL系统显影。GAPDH作为内参，Image Iab 3 .0采集条带灰度值，取目的条带吸光度与内参条带比值作为相对表达量。

(5)细胞免疫荧光

将步骤(1)得到的前三代髓核细胞播种于6孔板玻片，分组：组1加入100％的基础培养基作为对照组，组2加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml），体外模拟椎间盘退变中的炎症环境，组3加入1ml基础培养基混合液（IL-1β浓度为10ng/ml，小豆蔻素浓度为100μM)，通过细胞免疫荧光检测各组collagen II、MMP13、p65、Nrf2等蛋白的表达情况。用PBS洗涤5分钟×3次，再用4％细胞组织固定液固定15min。用PBS洗涤5min×3次后加入0.5％的TRITON X-100处理 10min。用PBS洗涤5min×3次，再用10％的山羊血清封闭30min。吸干封闭液，滴加collagen II抗体(1∶100，Abcam)、MMP13抗体(1∶100，ProteinTec)、p65抗体(1∶100，ProteinTec)，Nrf2抗体(1∶100，ProteinTec) 4℃过夜。次日，PBS洗涤5min×3次后，用细胞绿色荧光二抗(1∶200，Bioworld)37℃水浴锅避光孵育1h。用PBS洗涤5min×3后，再用DAPI Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片，取玻片于荧光显微镜下观察并拍摄。

(6)实时荧光定量PCR

取步骤(4)作用24h后的细胞沉淀用RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒提RNA，并测定浓度。用PrimeScriptTM逆转录试剂盒进行反转录，用SYBR(上海生工)试剂盒进行试验，并且统计数据，进行表达差异分析。

目的基因引物序列：

COX-2(F)，SEQ ID NO .1：5’-GAGAGATGTATCCTCCCACAGTCA-3’；

COX-2(R)，SEQ ID NO .2：5’-GACCAGGCACCAGACCAAAG-3’；

iNOS(F)，SEQ ID NO .3：5’-CCTTACGAGGCGAAGAAGGACAG-3’；

iNOS(R)，SEQ ID NO .4：5’-CAGTTTGAGAGAGGAGGCTCCG-3’；

IL-6(F)，SEQ ID NO .5：5’-GACAGCCACTCACCTCTTCA-3’；

IL-6(R)，SEQ ID NO .6：5’-TTCACCAGGCAAGTCTCCTC-3’；

TNF-α(F)，SEQ ID NO .7：5’-GTCAGATCATCTTCTCGAACC-3’；

TNF-α(R)，SEQ ID NO .8：5’-CAGATAGATGGGCTCATACC-3’。

(7)ELISA检测细胞炎症因子

取步骤(4)作用24h后获得的上清液，按照试剂盒(R&D Systems，Inc .，Minneapolis，MN，USA)操作步骤加入试剂，并用酶标仪检测吸光度。

(8)siRNA转染步骤

以IipofectamineTM2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染按比例调整。

I)于24孔培养板中接种适量密度细胞，加入不含抗生素培养基，当细胞贴壁并细胞密度达到30-50%进行转染步骤。

培养基，使转染时的细胞密度能够达到30～50％。

II)配置siRNA-lipo2000混合液：

①稀释siRNA：将1 .25μl20μmol的siRNA储存液用不含血清培养基Opti-MEM稀释至50μL，轻轻混匀，室温孵育5min；②稀释lipo2000：将1μllipo2000用Opti-MEM 稀释至50μl，同样混匀并室温孵育5min；③将上述稀释的①与②混匀，室温孵育20min。注意：整个过程中，动作轻微，切勿剧烈震荡，易破坏脂质体结构以及影响siRNA-lipo2000工作液的配置效果。

III)将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基的培养孔中，轻轻混匀；

IV)37℃,5%CO2培养箱中培养,培养时间根据实验目的进行调整。

V)细胞转染结束后在24-72h内采用Western blot对siRNA进行沉默效果检测。

动物模型建立步骤

(1)取4周龄SD雄性大鼠，2％(w/v)戊巴比妥(40mg/kg)腹腔注射，指端触诊判断针刺节段(Co7/8)，(27G)穿刺针刺入椎间盘正中并横穿整个纤维环(AF)层，针刺深度约为4mm，且穿刺针留置于椎间盘中1分钟，拔出穿刺针，消毒穿刺部位，即椎间盘退变模型建立完成。36只SD雄性大鼠进行分组：组1(对照组，图7中Control)，组2(单纯椎间盘退变组，图7中IVDD)，组3(椎间盘退变+和小豆蔻素治疗组，IVDD+CAR)。在IVDD手术后，给予大鼠每天20mg/kg的小豆蔻素行灌胃治疗，对大鼠进行日常监测以确保他们存活，并允许所有动物自由活动，并定期喂食食物和水。

(2)分别在步骤 (1)针刺模型建立后第0、4及第8周，进行大鼠尾椎X线及磁共振检测，并用DHI、Pfirrfmann分级法评估椎间盘退变情况。

(3)在步骤 (2)针刺模型建立后第0、4及第8周取椎间盘组织进行HE、SO染色观察椎间盘髓核组织的退变情况。

(4)在步骤 (2)针刺模型建立后第0、4及第8周取椎间盘组织进行组织免疫组化试验评估椎间盘髓核组织退变情况。

2、实验结果：

(1)小豆蔻素对髓核细胞活力的影响

通过CCK试剂盒检测，结果显示12.5、25、50、100μm小豆蔻素作用下，24h及48小时内髓核细胞吸光值与0μm组(无小豆蔻素组)无显著统计学差异，表明12.5、25、50、100μm小豆蔻素对细胞无显著毒性；而24及48h后200,、300μm小豆蔻素组髓核细胞吸光值显著低于0nM组，表明200、300μm小豆蔻素作用24及48h具有一定的髓核细胞毒性。通过本实验，确定了小豆蔻素对髓核细胞的安全浓度，即0～100μm(图1)。

（2）小豆蔻素抑制髓核细胞中IL-1β诱导的炎症介质的表达。

通过Western blot、qPCR以及ELISA试验，小豆蔻素可以降低在IL-1β刺激下髓核细胞细胞炎症因子的含量，证实了小豆蔻素确实具有抗炎作用(图2-4)。

（3）小豆蔻素可防止NP细胞被IL-1β诱导的ECM降解

通过Western blot、免疫荧光试验，表明小豆蔻素可以减少细胞外基质的炎性降解(图5)。

(4)小豆蔻素可以通过抑制NF-κB信号通路的激活来起到抗炎作用，这一结果也在p65的细胞免疫荧光试验中得以验证(图6)。

另外，小豆蔻素可以通过上调Nrf2从而抑制NF-κB信号通路的激活来起到抗炎作用(图7)。

（5）为了探究小豆蔻抑制NF-κB通路、炎症反应和基质降解是通过Nrf2。我们运用小干扰RNA建立了髓核细胞的Nrf2沉默模型。然后检测了髓核细胞在Nrf2有无沉默以及是否在IL-1β情况下的NF-κB通路相关蛋白p65，炎症因子PGE2、Nitrite、TNF-α、IL-6和基质降解代谢相关蛋白ADAMTS5和MMP13的表达情况。我们发现SIRT3沉默会减轻小豆蔻对炎症刺激下的NF-κB通路的抑制作用（图8）。在IL-1β环境下，沉默Nrf2会逆转小豆蔻素对基质基质降解的保护作用（图9）。同样的，利用ELISA试剂盒，我们也发现了沉默Nrf2同样会抑制小豆蔻的抗炎作用，促使炎症因子的释放（图10）。这些结果证明了小豆蔻素是通过Nrf2来发挥抗炎，抑制基质降解的作用。

基于小豆蔻素外内实验对髓核细胞的保护作用，我们进行了体内实验。我们发现，予以针刺模型大鼠IVDD小豆蔻素处理后，可以有效改善椎间隙高度以及椎间盘的Pfirrmann分级(图11-14)。另外，我们通过H&E、S&O染色发现小豆蔻素还可以有效改善退变椎间盘的形态以及组织学评分(图15-16)。同时，我们还通过组织免疫组化验证了小豆蔻素确实可以缓解椎间盘内细胞外基质的炎症性降解，以及促进Nrf2的表达(图17-19)。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院）

<120> 一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

gagagatgta tcctcccaca gtca 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

gaccaggcac cagaccaaag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<400> 8

cagatagatg ggctcatacc 20

Claims (5)

1.一种小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，所述小豆蔻素的结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，其特征在于：所述药物通过上调Nrf2抑制髓核细胞炎症反应。

3.根据权利要求1所述的小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，其特征在于：所述药物包括药用载体，所述药用载体选自长循环脂质体或环糊精纳米。

4.根据权利要求1所述的小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型为片剂、乳剂或胶囊。

5.根据权利要求1所述的小豆蔻素在制备治疗及延缓椎间盘退行性病变药物中的应用，其特征在于：所述药物中小豆蔻素用量为20 mg/kg体重。

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