CN111218515A - 多组织器官和细胞类型的衰老标记及卡路里限制在延缓机体衰老中的应用 - Google Patents

多组织器官和细胞类型的衰老标记及卡路里限制在延缓机体衰老中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多组织器官和细胞类型的衰老标记及卡路里限制在延缓机体衰老中的应用。本发明以大鼠为模型进行了多组织单细胞转录组的整合分析，以研究衰老和卡路里限制在哺乳动物单细胞水平上的调控作用，系统地分析了年轻饮食组，年老组和年老限食组的七个组织中的16万个单细胞，并基于高通量单细胞转录组测序技术，建立了首个哺乳动物衰老和CR的多组织器官高通量单细胞转录组图谱，全面系统的从细胞类型组成，细胞和组织特异性差异表达基因，核心调控转录因子以及细胞‑细胞通讯网络等方面评估了衰老和CR对不同组织和细胞类型的作用，揭示了衰老和CR的复杂过程，为今后系统性的研究衰老和CR的分子调控机制提供了基础。

Description

多组织器官和细胞类型的衰老标记及卡路里限制在延缓机体 衰老中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及多组织器官和细胞类型的新型衰老标记及卡路里限制在从多组织细胞和分子水平上延缓机体衰老中的应用。
背景技术
衰老过程伴随着机体多组织的功能下降，并表现出各种慢性疾病的敏感性增加。同时，衰老能够引起不同类型的细胞，组织和器官之间的不同反应，甚至在同一细胞类型内也可能会产生基因表达的异质性。另一方面，近几十年来，越来越多的研究人员对如何干预衰老进行了多方面的探索，在这其中卡路里限制(caloric restriction，CR)被认为是最安全有效延缓衰老的措施之一。由于衰老过程的复杂性，有必要全面比较衰老表型，并在多个器官的不同细胞群体中对其调节的关键因子进行解析。同时，CR作为一种强大的代谢干预手段，如何协同重塑不同组织和细胞类型的衰老进程以及扩展机体的寿命目前还知之甚少。
随着高通量单细胞技术的发展，该技术已利用于单细胞图谱的绘制。但是，到目前为止仍然缺乏全面的多器官衰老细胞图谱，也没有跨组织的CR细胞图谱相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供多组织器官和细胞类型的新型衰老标记物及卡路里限制在从多组织细胞和分子水平上延缓机体衰老中的应用。
本发明首先保护A1和/或A2作为衰老标记物或检测A1和/或A2表达水平的物质的新用途。
本发明保护A1和/或A2作为衰老标记物或检测A1和/或A2表达水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定机体衰老水平的产品中的应用以及在鉴定或辅助鉴定机体衰老水平中的应用；
所述A1为S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1；
所述A2为Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5。
上述应用中，所述A1表达水平与机体衰老水平呈正相关，即提高A1表达水平可促进机体衰老，降低A1表达水平可延缓机体衰老；所述A2表达水平与机体衰老水平呈负相关，即提高A2表达水平可延缓机体衰老；降低A2表达水平可促进机体衰老。
所述检测A1和/或A2表达水平的物质可为利用现有技术中的方法检测所述A1和/或A2表达水平所需的试剂和/或仪器，如利用高通量测序检测所述A1和/或A2表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用定量PCR检测所述A1和/或A2表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用northern杂交技术检测所述A1和/或A2表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用基因芯片检测所述A1和/或A2表达水平所需的试剂和/或仪器。
本发明又保护卡路里限制的新用途。
本发明保护卡路里限制在如下B1)-B15)中任一种中的应用：
B1)减少肝脏组织中脂质含量；
B2)减少棕色脂肪组织中大脂滴数量；
B3)减短白色脂肪组织细胞直径；
B4)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例；
B5)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织中LINE1-ORF1p表达水平；
B6)降低血清中TNF-α含量和/或S100A8含量；
B7)降低主动脉血管中细胞凋亡比例；
B8)增加白色脂肪组织中SMA阳性细胞比例；
B9)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织中中性粒细胞比例；
B10)降低肝脏组织中浆细胞比例；
B11)降低白色脂肪组织和/或肝脏组织中巨噬细胞比例；
B12)增加骨髓中CD3+CD8+双阳性T细胞比例；
B13)增加白色脂肪干细胞中Ybx1表达水平；
B14)下调S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1表达水平；
B15)上调Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5表达水平。
本发明还保护卡路里限制在如下C1)-C15)中任一种中的应用：
C1)通过减少肝脏组织中脂质含量延缓衰老；
C2)通过减少棕色脂肪组织中大脂滴数量延缓衰老；
C3)通过减短白色脂肪组织细胞直径延缓衰老；
C4)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例延缓衰老；
C5)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织中LINE1-ORF1p表达水平延缓衰老；
C6)通过降低血清中TNF-α含量和/或S100A8含量延缓衰老；
C7)通过降低主动脉血管中细胞凋亡比例延缓衰老；
C8)通过增加白色脂肪组织中SMA阳性细胞比例延缓衰老；
C9)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织中中性粒细胞比例延缓衰老；
C10)通过降低肝脏组织中浆细胞比例延缓衰老；
C11)通过降低白色脂肪组织和/或肝脏组织中巨噬细胞比例延缓衰老；
C12)通过增加骨髓中CD3+CD8+双阳性T细胞比例延缓衰老；
C13)通过增加白色脂肪干细胞中Ybx1表达水平延缓衰老；
C14)通过下调S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1表达水平延缓衰老；
C15)通过上调Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5表达水平延缓衰老。
上述应用中，所述减少肝脏组织中脂质含量体现在减少肝脏组织中油红O染色阳性区域。
所述降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例体现在减少白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中SA-β-gal染色阳性区域。
所述LINE1-ORF1p表达水平为LINE1-ORF1p蛋白表达水平。
所述S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1和/或Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5表达水平均为基因表达水平。
上述应用中，所述卡路里限制为60-80％卡路里限制，即每天给予正常饮食所需食物重量的60-80％。进一步的，所述60-80％卡路里限制为连续6-12个月的60-80％卡路里限制，即连续6-12个月每天给予正常饮食所需食物重量的60-80％。更进一步的，所述连续6-12个月的60-80％卡路里限制为连续9个月的70％卡路里限制，即连续9个月每天给予正常饮食所需食物重量的70％。
上述应用中，所述肝脏组织、所述棕色脂肪组织、所述白色脂肪组织、所述肾脏组织、所述血清、所述主动脉血管和所述骨髓为哺乳动物肝脏组织、棕色脂肪组织、白色脂肪组织、肾脏组织、血清、主动脉血管和骨髓。所述哺乳动物包括人类。
本发明还保护如下a1)-a8)中任一所述应用：
a1)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
a2)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控白色脂肪干细胞的单克隆形成能力中的应用；
a3)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控白色脂肪干细胞的细胞增殖能力中的应用；
a4)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力中的应用；
a5)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在制备降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力的产品中的应用；
a6)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力中的应用；
a7)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在制备降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力的产品中的应用；
a8)Ybx1蛋白或Ybx1基因作为靶点在制备延缓衰老的产品中的应用。
上述应用中，所述生物材料包括编码所述Ybx1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。编码所述Ybx1蛋白的核酸分子可为GenBank号为NM_004559.5所示基因序列的第149-1123位所示的DNA分子或GenBank号为NM_031563.3所示基因序列的第124-1092位所示的DNA分子。
上述应用中，所述a1)中，所述细胞具体可为白色脂肪干细胞。
上述应用中，所述抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质为抑制Ybx1基因表达的shRNA。在本发明的一个具体实施例中，所述shRNA的核苷酸序列为序列表中序列1。
本发明还保护一种产品，为如下b1)或b2)：
b1)一种产品，其包括上述检测A1和/或A2表达水平的物质；所述产品的功能为鉴定或辅助鉴定机体衰老水平；
b2)一种产品，其包括上述抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质；所述产品的功能为降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力和/或降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力。
上述应用或产品中，所述降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力体现在减少Ki67阳性细胞数量和/或减少细胞周期中S期细胞数量。
上述应用或产品中，所述LINE1-ORF1p蛋白可为大鼠LINE1-ORF1p蛋白或小鼠LINE1-ORF1p蛋白。所述大鼠LINE1-ORF1p蛋白的氨基酸序列的Gene ID号为108351079。所述小鼠LINE1-ORF1p蛋白的氨基酸序列的Gene ID号为107980437。
所述TNF-α蛋白可为人TNF-α蛋白或大鼠TNF-α蛋白。所述人TNF-α蛋白的氨基酸序列的Gene ID为7124。所述大鼠TNF-α蛋白的氨基酸序列的Gene ID为24835。
所述S100A8蛋白可为人S100A8蛋白或大鼠S100A8蛋白。所述人S100A8蛋白的氨基酸序列的Gene ID为6279。所述大鼠S100A8蛋白的氨基酸序列的Gene ID为116547。
所述Ybx1蛋白可为人Ybx1蛋白或大鼠Ybx1蛋白。所述人Ybx1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_004550.2，其编码基因序列为GenBank号为NM_004559.5所示基因序列的第149-1123位。所述大鼠Ybx1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_113751.3，其编码基因序列为GenBank号为NM_031563.3所示基因序列的第124-1092位。
本发明以大鼠(Rattus norvegicus)为模型进行了多组织单细胞转录组的整合分析，以研究衰老和卡路里限制(caloric restriction，CR)在哺乳动物单细胞水平上的调控作用，系统地分析了年轻饮食组，年老组和年老限食组的七个组织中的16万个单细胞，并基于高通量单细胞转录组测序技术，建立了首个哺乳动物衰老和CR的多组织器官高通量单细胞转录组图谱，同时，结合多组织器官的衰老和干预表型、细胞类型变化的免疫荧光染色、流式分析等实验，全面系统的从细胞类型组成，细胞和组织特异性差异表达基因，核心调控转录因子以及细胞-细胞通讯网络等方面评估了衰老和CR对不同组织和细胞类型的作用，揭示了衰老和CR的复杂过程，为今后系统性的研究衰老和CR的分子调控机制提供了基础。
附图说明
图1为大鼠肝脏组织的油红O染色分析。
图2为大鼠棕色脂肪组织的H&E染色分析和白色脂肪组织的马松染色分析。
图3为大鼠白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肾脏组织和肝脏组织的SA-β-Gal染色分析。
图4为大鼠的白色脂肪组织和棕色脂肪组织中LINE1-ORF1p的免疫印迹分析。
图5为酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中的TNF-α含量。
图6为三组大鼠不同组织中细胞比例的相对变化。
图7为大鼠主动脉的TUNEL染色分析细胞凋亡比例。
图8为免疫荧光染色验证白色脂肪组织的SMA阳性细胞数量变化。
图9为免疫荧光染色验证肝脏组织、棕色脂肪组织和白色脂肪组织的中性粒细胞数量变化。
图10为免疫荧光染色验证肝脏组织的浆细胞数量变化。
图11为免疫荧光染色验证肝脏组织和白色脂肪组织的巨噬细胞数量变化。
图12为流式细胞计数验证骨髓CD3+CD8+双阳性T细胞数量变化。
图13为大鼠7种组织所有细胞类型中出现频率排名前15的差异基因。
图14为酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中S100A8含量。
图15为WB水平验证在人和大鼠脂肪干细胞中Ybx1的敲低效率。
图16为结晶紫染色显示Ybx1敲低之后单克隆形成能力。
图17为Ki67免疫荧光显示Ybx1敲低之后细胞增殖能力。
图18为细胞周期显示Ybx1敲低之后S期细胞数。
图19为RNA测序数据中Ybx1敲低后下调的差异基因的GO分析与细胞周期下调相关的差异基因。
图20为RNA测序数据中Ybx1敲低后上调的差异基因的GO分析与衰老相关分泌表型上调相关的差异基因。
具体实施方式
下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的所有动物实验均获得中国科学院动物保护与利用委员会的批准。下述实施例中的人脂肪干细胞的分离已通过北京协和医学院伦理审查委员会的审查。下述实施例中的实验数据以平均值±标准差表示，用GraghPad Prism 6统计软件分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
下述实施例中的培养基配方如下：
脂肪干细胞培养基：89体积份培养基α-MEM+GlutaMAX(Gibco)，10体积份胎牛血清(Gibco)，1体积份青霉素/链霉素(Gibco)，加入重组人成纤维细胞生长因子(JointProtein Central)，并使其在体系中的浓度为1ng/ml。
293T细胞培养基：89体积份DMEM高糖培养基(Hyclone)，10体积份胎牛血清(Gibco)，1体积份青霉素/链霉素(Gibco)。
下述实施例中的生物材料来源如下：人胚胎肾细胞293T细胞：ATCC，CRL-3216。慢病毒包装载体psPAX2(简称质粒psPAX2)：Addgene产品，#12260。慢病毒包装载体pMD2G(简称质粒pMD2G)：Addgene产品，#12259。pTVTHM载体记载于文献“Conditional suppressionof cellular genes:lentivirus vector-mediated drug-inducible RNAinterference.Wiznerowicz et.al,.J.Virol.(2003)77,8957–8961.；Maintenance ofnucleolar homeostasis by CBX4 alleviates senescence and osteoarthritis.Renet.al,.Cell Reports.2019.26(13):3643-3656.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。大鼠：野生型的SPF级别的斯普拉格-杜勒鼠(Sprague-Dawley，SD)，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，产品名称为SPF级别大鼠；大鼠标准化饲料，购买于南通特洛菲饲料科技有限公司。
实施例1、衰老和CR饮食对寿命和表型特征的影响
一、实验分组与方法
1、实验分组
实验分成三组，年轻随意饮食组(简称年轻组，30只，15雄性和15雌性)，年老随意饮食组(简称年老组，30只，14雄性和16雌性)和年老70％卡路里限食组(简称年老限食组，26只，12雄性和14雌性)，每只大鼠均单笼饲养。每组处理方法具体如下：
年轻组：取2月龄大鼠，每天饲喂充足的大鼠标准化饲料(保证饲料有剩余，不间断)，连续饲喂3个月后进行组织学检测。
年老组：取18月龄大鼠，每天饲喂充足的大鼠标准化饲料(保证饲料有剩余，不间断)，连续饲喂9个月后进行组织学检测。
年老限食组：取17个月龄大鼠，第一周的第一天饲喂200g大鼠标准化饲料，第五天称量剩余的饲料重量，减少的饲料重量(减少的饲料重量＝200g－剩余的饲料重量)除以五，即获得大鼠正常饮食每天所需食物重量；从第二周开始，每天饲喂一次，第二周开始每天饲喂大鼠正常饮食每天所需食物重量的90％；第三周开始每天饲喂大鼠正常饮食每天所需食物重量的80％；第四周开始每天饲喂大鼠正常饮食每天所需食物重量的70％，以70％正常饮食连续饲喂9个月后进行组织学检测。
2、实验方法
1)肝脏中脂质含量检测
取各组大鼠的肝脏组织使用sigma油红染色试剂进行油红O染色分析。具体步骤如下：
1-1)组织进行OCT包埋和冰冻切片。
1-2)切片进行室温干燥和固定，水洗3次后干燥。
1-3)100％丙二醇处理5分钟。
1-4)60℃条件下，用新鲜配置的油红染色液染色8-10分钟。
1-5)85％丙二醇分化2分钟，自来水流水洗。
1-6)苏木素染色，自来水流水洗。
1-7)封片，观察成像。
2)棕色脂肪组织中大脂滴数量检测
取各组大鼠棕色脂肪组织进行H&E染色分析。具体步骤如下：
2-1)对组织进行石蜡包埋并切片。
2-2)切片常规脱蜡至水。
2-3)用配好的苏木素染色液染色5-8分钟。
2-4)自来水洗1分钟，分化30秒，自来水流水洗1分钟。
2-5)伊红染色液1-3分钟。自来水流水洗0.5-1分钟。
2-6)75％、75％、95％、95％、100％乙醇脱水。
2-7)二甲苯透明1分钟。
2-8)中性树胶封固，观察成像。
3)白色脂肪组织细胞直径检测
取各组大鼠白色脂肪组织使用Masson三色染色液试剂盒(Solarbio，G1340)进行Masson染色分析。具体步骤如下：
3-1)对组织进行石蜡包埋并切片。
3-2)切片常规脱蜡至水，在重铬酸钾溶液浸泡过夜后自来水冲洗。
3-3)用配好的Weigert铁苏木素染色液染色10分钟后自来水冲洗。
3-4)丽春红品红染色液染色5-10分钟，水洗。
3-5)磷钼酸水溶液浸染10-15分钟。
3-6)苯胺蓝染液5-10分钟，水洗。
3-7)1％冰醋酸分化液分化2-5分钟，水洗。
3-8)95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次。
3-9)二甲苯透明3次。
3-10)中性树胶封片，观察成像。
4、SA-β-Gal染色分析
取各组大鼠白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肾脏组织和肝脏组织进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色分析。衰老相关β-半乳糖苷酶染色是基于衰老时SA-β-gal(senescence-associated-β-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。具体步骤如下：
4-1)对各种组织进行冰冻切片，厚度为10μm。
4-2)PBS清洗去除OCT。
4-3)2％甲醛+0.2％戊二醛固定，不超过5分钟。
4-4)PBS清洗2次。
4-5)加入染色液，37度避光过夜孵育。染色液配方如下：柠檬酸/磷酸钠缓冲液40mM、K4[Fe(CN)6]·6H2O 5mM、K3[Fe(CN)6]5mM、NaCl 150mM、MgCl2 2mM、X-gal 1mg/ml。
4-6)PBS清洗2次。
4-7)显微镜下观察成像。以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况，并进一步对SA-β-gal染色阳性区域进行定量统计分析。
5、免疫印迹分析(Western blot)检测LINE1-ORF1p蛋白表达量
对各组大鼠白色脂肪组织、棕色脂肪组织提取总蛋白后使用BCA蛋白定量方法进行定量，利用Western-blot检测组织中的LINE1-ORF1p蛋白表达量。Western blot所用抗体为anti-LINE1-ORF1p(Millipore，MABC1152，1:1000)；anti-GAPDH(ab8245，1:3000)。
6、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中的TNF-α含量
使用ELISA试剂盒(Invitrogen，88-7340)通过ELISA方法检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，具体步骤参考试剂盒说明书。
二、实验结果
1、染色分析结果
通过油红O染色、H&E染色和马松染色分析表明：与年轻组相比，年老组肝脏组织中脂质含量(油红O染色阳性区域)增加，而年老限食组相对年老组减少(图1)；与年轻组相比，年老组棕色脂肪组织中大脂滴数量增加，而年老限食组相对年老组减少(图2)；与年轻组相比，年老组白色脂肪组织细胞直径增长，而年老限食组相对年老组减短(图2)。
2、衰老标记物研究结果
通过SA-β-gal染色、Western blot方法和ELISA方法对衰老标记物的研究发现：与年轻组相比，年老组白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肝脏组织、肾脏组织中衰老细胞比例(SA-β-gal染色阳性区域)增加，而年老限食组相对年老组减少(图3)。与年轻组相比，年老组白色脂肪组织、棕色脂肪组织中衰老标记物LINE1-ORF1p蛋白表达量提高，而年老限食组相对年老组降低(图4)。与年轻组相比，年老组血清中TNF-α含量提高，而年老限食组相对年老组降低(图5)。
综上所述，大鼠白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肝脏组织、肾脏组织随年龄增加而衰老，而9个月70％卡路里限制可以延缓衰老。
实施例2、衰老和CR饮食对细胞比例变化的影响与验证
一、实验方法
为了描述衰老和CR过程中动态细胞类型的组成变化，分别比较了年轻组，年老组和年老限食组之间如下七个组织：棕色脂肪组织(BAT)、白色脂肪组织(WAT)、肝脏组织(Liver)、肾脏组织(Kidney)、主动脉(Aorta)、皮肤(Skin)和骨髓(Bone marrow)中每种细胞类型的比例，并通过免疫荧光实验和流式细胞实验对生信数据提示有变化的细胞进行实验验证。具体步骤如下：
1、组织细胞分离与测序
1)白色脂肪、棕色脂肪、肾脏、皮肤、肝脏和血管组织细胞分离与测序
麻醉实施例1中各组大鼠并用生理盐水灌注，同一性别的相同组织在预冷的PBS(Gibco)中混在一起后，快速剪成一立方毫米的大小组织块，然后将不同组织块进行消化处理。白色脂肪组织、棕色脂肪组织和肾脏组织用含有2mg/ml的collagenase I(Gibco)、2mg/ml的collagenase IV(Gibco)和2mg/ml dispase(Gibco)的消化液37℃消化1小时。皮肤组织用含有1mg/ml的collagenase I，1mg/ml的collagenase IV，1mg/ml的dispase和0.125％的trypsin-EDTA(Gibco)的消化液37℃消化60分钟。肝脏组织用含有胶原酶IV(1mg/ml)的消化液在37℃孵育40分钟。血管组织先用20mg/ml的collagenase I 37℃消化10分钟，再用含有2mg/ml的collagenase I，2mg/ml的dispase，2mg/ml的elastase和2.5U/ml的DNase I的消化液37℃消化30分钟。
将以上6种组织用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的高糖培养基DMEM(Gibco)终止消化，1,000rpm、4℃离心5分钟，用红细胞裂解液(BD)37℃重悬5分钟，1,000rpm、4℃离心5分钟，3ml预冷的1×PBS洗两次，细胞重悬液用40-μm细胞筛过滤(BD Falcon)。预冷的1×PBS洗两次，预冷的1×PBS洗两次，然后用含有10％FBS的PBS重悬，PI染色，用流式细胞仪分选活细胞(BD Influx)，然后用50μl含有0.04％BSA的PBS重悬单细胞用于10x Genomics测序。
2)骨髓细胞分离与测序
在冰上含有2％FBS和2mM EDTA的PBS缓冲液中用5ml的注射器收集实施例1中各组大鼠肢骨、股骨和胫骨骨腔内的骨髓，骨髓细胞重悬液用40-μm细胞筛过滤。1,200rpm、4℃离心5分钟。用红细胞裂解液37℃重悬5分钟，3ml预冷的1×PBS洗两次，然后用含有10％FBS的PBS重悬，PI染色，用流式细胞仪分选活细胞(BD Influx)，然后用50μl含有0.04％BSA的PBS重悬单细胞用于10x Genomics测序。
2、大鼠单细胞图谱的建立
1)将10x Genomics测序获得的原始数据与大鼠基因组(Rnor_6.0)进行比较，并通过使用Cell Ranger软件计算每个样品的细胞的barcode和对应的表达矩阵。
2)将Cell Ranger计算获得的单细胞表达矩阵通过Seurat软件包(版本2.3.4)进行过滤，数据归一化，降维，聚类和基因差异表达分析。在进行分析之前使用DropletUtils(版本1.6.1)消除了条形码跳跃(barcode hopping)可能造成的影响。然后通过以下步骤对过滤后的数据进行分析计算：排除检测到少于500个基因的细胞或线粒体基因比率大于10％(肾脏细胞的阈值为50％)的细胞。使用DoubletFinder软件包(版本2.0.2)检测多细胞并通过Seurat软件包进行过滤。通过Seurat的“NormalizeData”功能对数据进行对数归一化。通过Seurat的“FindVariableGenes”功能选择高变异基因。通过Seurat的“RunMultiCCA”和“AlignSubspace”功能纠正批次效应。通过Seurat的“FindClusters”功能对细胞进行聚类。通过Seurat的“RunTSNE”功能对细胞分布进行二维可视化。通过Seurat的“FindAllMarkers”功能中的Wilcoxon秩和检验对每个细胞群进行差异表达分析。通过已报道的标记基因对不同组织中的不同细胞群进行细胞类型鉴定：棕色脂肪(BAT)中基于28,184个细胞鉴定得到13种主要细胞类型，白色脂肪(WAT)基于30,392个细胞鉴定得到16种主要细胞类型，肝脏(Liver)基于18,861个细胞鉴定得到14种主要细胞类型，肾脏(Kidney)基于16,292个细胞鉴定得到22种主要细胞类型，主动脉(Aorta)基于22,922个细胞鉴定得到12种主要细胞类型，皮肤(Skin)基于25,662个细胞鉴定得到16种主要细胞类型，骨髓(Bonemarrow)基于23,857个细胞鉴定得到15种主要细胞类型。
3、细胞比例分析
1)在分析细胞组成变异之前，首先排除了每种组织中总数少于50个细胞的细胞类型(主动脉的中性粒细胞)。
2)计算不同组(年轻组，年老组和年老限食组)中每种类型的细胞数，然后除以同一组中的细胞总数，以获得每种细胞类型在每组中所占的比率。基于这些比率，获得了同一种细胞类型在不同组之间所占的百分比。
3)比较年老组和年轻组之间的差异倍数(Log2FC)(FC，fold change)以识别在衰老过程中有明显改变的细胞类型(|Log2FC|>0.5)。同时比较年老限食组和年老组之间的Log2FC以识别在衰老过程中被CR改变的细胞类型(|Log2FC|>0.5)。并将在衰老过程中改变并在CR后有相反变化的细胞类型定义为“恢复的细胞类型(rescue CT)”。
4、对生信数据提示有变化的细胞进行实验验证
通过TUNEL染色实验、免疫荧光实验和流式细胞实验对几种生信数据提示有显著变化的细胞类型(即在衰老过程中显著升高(Log2FC>0.5)但是在CR后显著降低(Log2FC<-0.5)或在衰老过程中显著降低(Log2FC<-0.5)但是在CR后显著升高(Log2FC>0.5)细胞：主动脉平滑肌细胞、白色脂肪平滑肌细胞、肝脏中性粒细胞、棕色脂肪中性粒细胞、白色脂肪中性粒细胞、肝脏浆细胞、肝脏巨噬细胞、白色脂肪巨噬细胞、骨髓CD8阳性T细胞)进行实验验证。具体步骤如下：
1)TUNEL染色实验
使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行TUNEL染色，具体步骤按照试剂盒说明书进行。用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜获取图像，用ImageJ定量检测阳性细胞百分比。
2)免疫荧光实验
将组织进行OCT包埋，冰冻切片，切片厚度为10μm，冻于-80℃冰箱。使用前室温回温后使用PBS洗一次，5分钟，然后用4％(体积百分含量)的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，使用含有0.4％(体积百分含量)Triton X-100的PBS室温孵育30分钟，继而换用10％(体积百分含量)驴血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4℃孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然后加入对应二抗和染核试剂Hoechst 33342(Thermo FisherScientific)，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后封片。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像。
免疫荧光所用抗体为anti-granulocyte(neutrophil)(ab33760，1:100)、anti-CD68(ab125212，1:300)、anti-syndecan-1(CD138)(ab34164，1:100)等均购自Abcam；anti-SMA(ZM-0003，1:50)和anti-Ki67(ZM0166，1:800)等均购自Zsbio。
3)流式细胞实验
从骨髓中分离的细胞被冷冻在含有10％DMSO和90％FBS(Gibco)的细胞冻存液中。细胞复苏后，CD3+CD8+T细胞经anti-CD3-FITC/anti-CD8-Alexa Fluor 647抗体阳性染色30分钟，PBS洗涤2次。使用7-氨基放线菌素D(7-AAD)在室温下孵育5分钟，排除死亡细胞。使用BD LSRFortessa流式细胞仪(BD，USA)进行分析，使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)对数据进行进一步分析。
二、实验结果
1、细胞类型的比例变化结果
从总体上看，与年轻组相比，年老组中各种细胞类型的比例发生了巨大变化，并且这其中许多能够通过CR得以恢复。例如，皮肤的基底细胞(Krt5+Krt14+上皮干细胞)和棕色脂肪的脂肪细胞干细胞在衰老过程中减少并通过CR得以增加，这表明CR可能遏制了与年龄相关的干细胞耗竭。老年主动脉中平滑肌细胞(SMA+)的减少也能够在一定程度上被CR恢复，这可能与衰老相关的平滑肌细胞凋亡增加有关。在骨髓中，B细胞祖细胞、晚期B细胞祖细胞、未成熟B细胞、CD8阳性T细胞、树突状细胞、成红血球细胞祖细胞和成红血球细胞都会在衰老过程中减少，并通过CR能够有效恢复(图6)。
2、免疫荧光实验和流式细胞实验结果
通过TUNEL染色实验、免疫荧光实验和流式细胞实验对生信数据提示基因表达有变化的细胞进行了实验验证。结果发现：在大鼠主动脉血管中，伴随衰老凋亡细胞在年老组中增加，而在O-CR中(在限食后)下降(图7)。在大鼠白色脂肪组织中，SMA阳性细胞在年老限食组中(在限食后)有所增加(图8)。在大鼠肝脏组织、白色脂肪组织、棕色脂肪组织中，伴随衰老中性粒细胞在年老组中增加，而在年老限食组中(在限食后)下降(图9)。同样的在大鼠肝脏组织中，伴随衰老浆细胞在年老组中增加，而在年老限食组中(在限食后)下降(图10)。在大鼠肝脏组织、白色脂肪组织中，伴随衰老巨噬细胞在年老组中增加，而在年老限食组中(在限食后)下降(图11)。此外，研究发现在骨髓中，伴随衰老CD3+CD8+双阳性T细胞比例在年老组中减少，而在年老限食组中(在限食后)增高(图12)。这些结果均与生信分析数据一致(图6)。
实施例3、衰老和CR饮食关键的差异基因分析及验证
一、实验方法
1、基因差异表达分析
1)使用Seurat软件包的“FindMarkers”功能中的Wilcoxon秩和检验对不同组(年老组/年轻组和年老组/年老限食组)之间的每种细胞类型进行差异表达分析。在进行分析之前，过滤掉不同组之间细胞数量少于3个的细胞类型(主动脉中的B细胞，CD8+T细胞和浆细胞；肾脏中的B细胞，NK细胞和中性粒细胞；棕脂肪中的浆细胞；皮肤中的NKT细胞)。
2)比较年老组和年轻组之间的差异表达基因(DEGs)，以建立衰老相关的DEGs数据集(aging DEGs)(|LogFC|>0.5，adjusted P-value<0.05)。同时比较年老限食组和年老组之间的差异表达基因(DEGs)，以建立CR相关的DEG数据集(CR DEG)(|LogFC|>0.5，adjustedP-value<0.05)。根据上述2个数据集，确定“恢复的差异基因(rescue DEGs)”，即在agingDEGs中显著上调或下调而在CR后分别显著下调或上调的基因。
结果发现：S100a9(Gene ID：94195)，S100a8(Gene ID：116547)，Igkc(Gene ID：500183)，Slpi(Gene ID：84386)，Igh-6(Gene ID：299357)，Ighm(Ensembl_ID：ENSRNOG00000034190)，Serpinb1a(Gene ID：291091)，Sod2(Gene ID：24787)，Lyz2(GeneID：25211)，Il1b(Gene ID：24494)，Hbb-bs(Gene ID：689064)，G0s2(Gene ID：289388)，Eef1a1(Gene ID：171361)，Hba-a2(Gene ID：360504)和Hba-a1(Gene ID：25632)是CR下调恢复频率(在不同细胞类型的差异基因中CR出现显著恢复的细胞类型的次数)最高的15个基因。这其中S100a9，S100a8和Igkc在不同细胞类型的衰老过程中被广泛上调，并且能够在30多种细胞类型中被CR饮食所下调。另一方面，Ybx1(Gene ID：500538)，Rpl23a(Gene ID：360572)，Cebpb(Gene ID：24253)，Timp2(Gene ID：29543)，RT1-Bb(Gene ID：309622)，Rpl37(Gene ID：81770)，Hbb-bs(Gene ID：689064)，Hba-a1(Gene ID：25632)，Rpl14(GeneID：65043)，Dcn(Gene ID：29139)，Gsn(Gene ID：296654)，Hspa1a(Gene ID：24472)，Igfbp6(Gene ID：25641)，Apoe(Gene ID：25728)和Mfap5(Gene ID：362429)是CR上调恢复频率最高的15个基因。这其中Ybx1在衰老过程中广泛下调并且在包括白色脂肪干细胞在内的20多种细胞类型中被CR所恢复(图13)。
2、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中S100A8含量
使用ELISA试剂盒(S100A8：CUSABIO，CSB-EL020641RA)测定各组大鼠血清中的S100A8(Gene ID：116547)含量，实验方法参考试剂盒说明书。
3、Ybx1敲低脂肪干细胞的获得及鉴定
1)原代脂肪干细胞的分离与培养
分别从来源于24岁健康女性(已通过北京协和医学院伦理审查委员会的审查)的白色脂肪组织和来源于3月龄雌性大鼠的白色脂肪组织中分离脂肪干细胞，脂肪干细胞的分离方法与上述白色脂肪细胞分离方法一致，细胞悬液接种到用0.1％胶原酶包被的细胞培养皿中培养，用脂肪干细胞培养基培养。
2)含有敲低Ybx1基因的重组慢病毒的病毒液的制备
2-1)构建重组质粒
将shYbx1-F和shYbx1-R退火得到的序列通过同源重组的方式连接到经过ClaI和Mlu1(NEB)酶切的pLVTHM载体上，即得到敲低Ybx1基因的重组慢病毒质粒shYbx1-pLVTHM。
将shGL2-F和shGL2-R退火得到的序列通过同源重组的方式连接到经过ClaI和Mlu1(NEB)酶切的pLVTHM载体上，即得到对照组慢病毒质粒shGL2-pLVTHM。
shYbx1-F和shYbx1-R序列如下：
shYbx1-F(下划线标注碱基代表酶切位点序列)：CGCGTGCCACGCAATTACCAGCAAATTCAAGAGATTTGCTGGTAATTGCGTGGCTTTTTTGGAAAT；
shYbx1-R(下划线标注碱基代表酶切位点序列)：CGATTTCCAAAAAAGCCACGCAATTACCAGCAAATCTCTTGAATTTGCTGGTAATTGCGTGGCA。
shGL2-F和shGL2-R序列如下：
shGL2-F(下划线标注碱基代表酶切位点序列)：CGCGTGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCTTCAAGAGAGAGGGCGACTTAACCTTAGGCTTTTTTGGAAAT；
shGL2-R(下划线标注碱基代表酶切位点序列)：CGATTTCCAAAAAAGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCTCTCTTGAAGAGGGCGACTTAACCTTAGGCA。
重组慢病毒质粒shYbx1-pLVTHM的表达的shRNA的RNA为CCACGCAAUUACCAGCAAAUUCAAGAGAUUUGCUGGUAAUUGCGUGG(序列1)。
对照组慢病毒质粒shGL2-pLVTHM表达的shRNA的RNA序列为CCUAAGGUUAAGUCGCCCUCUUCAAGAGAGAGGGCGACUUAACCUUAGG。
2-2)制备重组病毒
a、采用Lipo3000转染试剂盒(ThermoFisher)将慢病毒质粒shYbx1-pLVTHM、质粒psPAX2和质粒pMD2G共转染293T细胞(配比为：1个10cm dish 293T细胞：15μg慢病毒质粒shYbx1-pLVTHM、10μg质粒pSPAX2和5μg质粒pMD2G)，培养8小时。
b、更换为新鲜的293T细胞培养基，继续培养48-72小时。
c、收集上清，采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
d、4℃、19400rpm离心2.5小时，弃上清，用原代脂肪干细胞培养基重悬沉淀，即为含有敲低Ybx1基因的重组慢病毒的病毒液(重组shYbx1-pLVTHM慢病毒液)。
按照上述方法，将慢病毒质粒shYbx1-pLVTHM替换为对照组慢病毒质粒shGL2-pLVTHM，得到对照组shGL2-pLVTHM慢病毒液。
3)慢病毒感染
将重组shYbx1-pLVTHM慢病毒液分别进行人脂肪干细胞和大鼠脂肪干细胞感染，连续传代，分别得到Ybx1敲低的人脂肪干细胞(shYBX1 Human ASC)和Ybx1敲低的大鼠脂肪干细胞(shYBX1 Rat ASC)。
将对照组shGL2-pLVTHM慢病毒液分别进行人脂肪干细胞和大鼠脂肪干细胞感染，连续传代，分别得到对照组的人脂肪干细胞(shGL2 Human ASC)和对照组的大鼠脂肪干细胞(shGL2 Rat ASC)。
4)Western blot验证Ybx1敲低效率。
Western blot验证Ybx1敲低的脂肪干细胞和对照组的脂肪干细胞的Ybx1敲低效率。具体步骤如下：
4-1)用RIPA buffer裂解(0.1％SDS，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1％NP-40，0.5％sodium deoxycholate，150mM NaCl和1x蛋白酶抑制剂(Roche))Ybx1敲低的脂肪干细胞和对照组的脂肪干细胞。
4-2)13,000rpm、4℃离心15分钟，用BCA试剂盒进行蛋白定量(Thermo FisherScientific)。
4-3)25μg蛋白样品用于SDS-PAGE电泳，然后再转到PVDF膜(Millipore)。
4-4)一抗4℃过夜孵育，一抗YBX1(ab12148,1:1,000，Abcam)，然后再用偶联HRP的二抗室温孵育1小时。
4-5)曝光，显影。
4、Ybx1敲低脂肪干细胞表型分析
细胞衰老的表型之一为细胞增殖能力减弱。分别取慢病毒感染后连续传两代之后的Ybx1敲低的脂肪干细胞和对照组的脂肪干细胞做结晶紫单克隆染色、ki67免疫荧光染色以及细胞周期检测实验。
1)单克隆形成能力检测
通过结晶紫单克隆染色实验检测Ybx1敲低的脂肪干细胞的单克隆形成能力。具体步骤如下：
1-1)12孔板的细胞培养皿中每个孔各接种2000细胞，培养9天。
1-2)用4％PFA固定30分钟。
1-3)0.2％结晶紫(百浩，中国)染色1小时。
1-4)流水冲洗2分钟，晾干，扫描观察。
2)Ybx1敲低脂肪干细胞的细胞增殖能力检测
通过ki67免疫荧光染色实验检测Ybx1敲低的脂肪干细胞的细胞增殖能力。具体步骤如下：
2-1)重组shYbx1-pLVTHM慢病毒液和shGL2对照组的脂肪干细胞放在细胞爬片上培养，先用4％PFA固定30分钟。
2-2)PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液稀释的0.4％Triton X-100通透25分钟，之后室温下用PBS缓冲液稀释的10％驴血清封闭缓冲液封闭1h，并在4℃下用一抗染色过夜。一抗包括鼠抗Ki67(ZM0166，1:800，Zsbio)。
2-3)用PBS缓冲液充分洗涤，再与相应的二抗在室温下孵育1h。
2-4)先进行Hoechst 33342染色，再用PBS缓冲液洗涤3次，之后用
Figure BDA0002385287110000161
抗褪色固定介质固定，最后使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCSSP5Ⅱ)获得图像。
3)Ybx1敲低脂肪干细胞的S期细胞数检测
通过细胞周期检测实验对Ybx1敲低的脂肪干细胞的S期细胞数进行检测。具体步骤如下：
3-1)重组shYbx1-pLVTHM慢病毒液和shGL2对照组的脂肪干细胞消化为单细胞。
3-2)用70％无水乙醇-20℃过夜固定。
3-3)1000rpm，4℃离心5分钟，用含有0.1％Triton X-100，0.2mg/ml RNase A和0.02mg/ml propidium iodide(PI)的PBS 37℃孵育30分钟。
3-4)流式分选(BD LSRFortessa)。
5、Ybx1敲低脂肪干细胞RNA测序与GO分析
1)对原始测序获得的fastq文件进行质量控制和去接头序列。
2)使用HISAT2软件(版本2.1.0)将测序片段映射到从UCSC下载的人hg19版本的基因组上。
3)使用featureCounts(版本1.6.4)软件计算每个注释基因的表达水平。
4)使用DESeq2(版本1.2.4)软件计算差异表达基因(差异变化倍数大于1.5，且修正后的p值<0.05)。
5)使用自定义脚本计算每个样品中的基因表达水平(FPKM)。
6)GO分析使用Metascape(3.5版)(http://metascape.org)进行GO生物学过程和途径富集分析，对显著富集的结果(P<0.01)使用ggplot2 R软件包进行可视化。
二、实验结果
1、血清中S100a8含量检测结果
通过ELISA方法检测血清S100a8含量，结果表明：与年轻组相比，年老组血清中S100a8含量显著增加，而在年老组中(在限食后)得到恢复(图14)。
2、Ybx1敲低脂肪干细胞的鉴定结果
为了研究Ybx1这一关键基因在调节细胞稳态中的作用，分别敲低了大鼠和人类白色脂肪干细胞的Ybx1，结果显示，在蛋白水平Ybx1通过慢病毒方式，表达水平已被敲低(图15)。
3、Ybx1敲低脂肪干细胞的表型分析结果
结晶紫单克隆染色实验结果表明：与对照组相比，Ybx1敲低脂肪干细胞的单克隆形成能力减弱(图16)。
Ki67染色实验结果表明：与对照组相比，Ybx1敲低后的脂肪干细胞中Ki67阳性细胞数量减少(图17)。
细胞周期分析结果表明：与对照组相比，Ybx1敲低后的脂肪干细胞的细胞周期中的S期细胞数也显著性减少(图18)。
4、RNA测序与GO分析结果
为了进一步探索Ybx1在维持脂肪干细胞中的作用，对Ybx1敲低脂肪干细胞样品及对照组脂肪干细胞样品进行RNA测序。GO分析显示，下调的基因主要与细胞分裂和DNA复制相关，这与观察到的Ybx1敲低后细胞增殖能力的丧失相一致(图19)。此外，上调的基因与趋化性和细胞因子分泌相关，这与观察到的衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretory phenotype，SASP)相关基因的表达上调有关(图20)。这些数据表明，对于白色脂肪干细胞来说，Ybx1是衰老和CR之间的关键调控分子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院动物研究所
<120>多组织器官和细胞类型的衰老标记及卡路里限制在延缓机体衰老中的应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>47
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
ccacgcaauu accagcaaau ucaagagauu ugcugguaau ugcgugg 47

Claims (10)

1.A1和/或A2作为衰老标记物或检测A1和/或A2表达水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定机体衰老水平的产品中的应用；
或，A1和/或A2作为衰老标记物或检测A1和/或A2表达水平的物质在鉴定或辅助鉴定机体衰老水平中的应用；
所述A1为S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1；
所述A2为Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5。
2.卡路里限制在如下B1)-B15)中任一种中的应用：
B1)减少肝脏组织中脂质含量；
B2)减少棕色脂肪组织中大脂滴数量；
B3)减短白色脂肪组织细胞直径；
B4)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例；
B5)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织中LINE1-ORF1p表达水平；
B6)降低血清中TNF-α含量和/或S100A8含量；
B7)降低主动脉血管中细胞凋亡比例；
B8)增加白色脂肪组织中SMA阳性细胞比例；
B9)降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织中中性粒细胞比例；
B10)降低肝脏组织中浆细胞比例；
B11)降低白色脂肪组织和/或肝脏组织中巨噬细胞比例；
B12)增加骨髓中CD3+CD8+双阳性T细胞比例；
B13)增加白色脂肪干细胞中Ybx1表达水平；
B14)下调S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1表达水平；
B15)上调Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5表达水平。
3.卡路里限制在如下C1)-C15)中任一种中的应用：
C1)通过减少肝脏组织中脂质含量延缓衰老；
C2)通过减少棕色脂肪组织中大脂滴数量延缓衰老；
C3)通过减短白色脂肪组织细胞直径延缓衰老；
C4)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例延缓衰老；
C5)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织中LINE1-ORF1p表达水平延缓衰老；
C6)通过降低血清中TNF-α含量和/或S100A8含量延缓衰老；
C7)通过降低主动脉血管中细胞凋亡比例延缓衰老；
C8)通过增加白色脂肪组织中SMA阳性细胞比例延缓衰老；
C9)通过降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织中中性粒细胞比例延缓衰老；
C10)通过降低肝脏组织中浆细胞比例延缓衰老；
C11)通过降低白色脂肪组织和/或肝脏组织中巨噬细胞比例延缓衰老；
C12)通过增加骨髓中CD3+CD8+双阳性T细胞比例延缓衰老；
C13)通过增加白色脂肪干细胞中Ybx1表达水平延缓衰老；
C14)通过下调S100a9和/或S100a8和/或Igkc和/或Slpi和/或Igh-6和/或Ighm和/或Serpinb1a和/或Sod2和/或Lyz2和/或Il1b和/或Hbb-bs和/或G0s2和/或Eef1a1和/或Hba-a2和/或Hba-a1表达水平延缓衰老；
C15)通过上调Ybx1和/或Rpl23a和/或Cebpb和/或Timp2和/或RT1-Bb和/或Rpl37和/或Hbb-bs和/或Hba-a1和/或Rpl14和/或Dcn和/或Gsn和/或Hspa1a和/或Igfbp6和/或Apoe和/或Mfap5表达水平延缓衰老。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述减少肝脏组织中脂质含量体现在减少肝脏组织中油红O染色阳性区域；
或，所述降低白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中衰老细胞比例体现在减少白色脂肪组织和/或棕色脂肪组织和/或肝脏组织和/或肾脏组织中SA-β-gal染色阳性区域。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述卡路里限制为60-80％卡路里限制；
或，所述卡路里限制为连续6-12个月的60-80％卡路里限制。
6.如下a1)-a8)中任一所述应用：
a1)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
a2)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控白色脂肪干细胞的单克隆形成能力中的应用；
a3)Ybx1蛋白或与Ybx1蛋白相关的生物材料在调控白色脂肪干细胞的细胞增殖能力中的应用；
a4)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力中的应用；
a5)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在制备降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力的产品中的应用；
a6)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力中的应用；
a7)抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质在制备降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力的产品中的应用；
a8)Ybx1蛋白或Ybx1基因作为靶点在制备延缓衰老的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述生物材料包括编码所述Ybx1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质为抑制Ybx1基因表达的shRNA；
或，所述shRNA的核苷酸序列为序列表中序列1。
9.如下b1)或b2)所述的产品：
b1)一种产品，其包括权利要求1中所述的检测A1和/或A2表达水平的物质；所述产品的功能为鉴定或辅助鉴定机体衰老水平；
b2)一种产品，其包括权利要求6或7中任一所述的抑制Ybx1蛋白表达和/或活性的物质或抑制Ybx1基因表达的物质或沉默或敲除Ybx1基因的物质；所述产品的功能为降低白色脂肪干细胞的单克隆形成能力和/或降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力。
10.根据权利要求6-8任一所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述降低白色脂肪干细胞的细胞增殖能力体现在减少Ki67阳性细胞数量和/或减少细胞周期中S期细胞数量。
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