CN114480600A - 一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法：分离患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液，进行单细胞转录组测序，最后用CellChat软件分析细胞间的通讯方式。本发明提供的分析方法充分考虑了配体‑受体相互作用的已知结构组成，将细胞通讯与细胞功能通路相结合，再结合单细胞转录组测序进行全面分析，为寻找原发性干燥综合征相关疾病的治疗靶点及探究细胞通讯与细胞生物学功能之间的调控机制提供了全新的思路。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法。
背景技术
原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome，pSS)是一种以淋巴细胞增殖及进行性外分泌腺体损伤为特征的慢性炎症性自身免疫病，患者血清中存在多种自身抗体，发病率为0.5％～1.0％，其中90％以上为女性。临床表现为口干、眼干、关节疼痛、疲乏等不适症状，约有1/3的患者存在肺、肾、神经系统、血管或淋巴系统等多系统的损害，其确切的病因及发病机制仍不十分清楚，属于难治性疾病。
细胞通讯是指由一个细胞发出的信号通过介质传递到另一个细胞并产生相应反应的过程，是多细胞生物分化、发育和器官形成等生理活动的重要功能基础，同时也在各类疾病的发生发展中扮演重要角色。细胞微环境是由相邻的细胞和非细胞成分共同构成的局部生态系统。正常组织的细胞微环境处于平衡状态，而出现感染等异常状况时进入前炎症状态，随后可发展为炎症状态，严重时可发展成急性炎症状态。在组织局部炎症的发展过程中，免疫系统介导的细胞通讯网络可产生状态转换，通过细胞间的信号传递激活或抑制相应的细胞功能，从而影响炎症的发展。迄今为止，尚不清楚原发性干燥综合征患者外周血免疫细胞之间如何相互作用以及细胞通讯参与的病理过程。
近年来，随着单细胞测序技术的不断发展，使得人们可获得单细胞水平的基因表达信息，其中包含大量介导细胞间通讯的配体和受体的表达信息。因此如何从单细胞测序数据中准确提取出细胞间的通讯信息成为当前生物信息学领域的研究热点，当前已经开发了几种方法用于在单细胞转录组测序(scRNA-seq)数据中推断细胞间的通讯关系，例如SingleCellSingalR，iTALK和NicheNet，但这些方法只使用一个配体/受体基因对，常常忽略了许多受体中的多亚基复合物的作用，例如，来自TGF-β途径的可溶性配体通过Ⅰ型和Ⅱ型受体的异聚复合物发出的信号。基于以上问题，开发的CellPhoneDB v2.0可以预测两个细胞群之间的信号相互作用，但是，并未考虑其他重要的信号辅助因子，包括可溶性激动剂、拮抗剂以及刺激性和抑制性的膜结合型共受体。
因此有必要提供一种将细胞通讯和信号功能通路相结合的分析方法，以研究原发性干燥综合征患者外周血中免疫细胞的细胞通讯变化对该疾病发展带来的影响。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，能够将细胞通讯和细胞功能通路的分析相结合，对单细胞转录组测序数据进行分析，进而研究原发性干燥综合征患者外周血中免疫细胞的细胞通讯变化。
根据本发明的一个方面，提出了一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，包括以下步骤：
S1：分离原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液；
S2：对步骤S1所述的单细胞悬液进行单细胞转录组测序；
S3：加载经步骤S2所述单细胞转录组测序得到的表达数据，利用分析软件导入综合性配体受体数据库，对所述表达数据进行预处理，以识别所述细胞中过表达的配体和受体之间的相互作用；推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯；通过可视化输出、社交网络分析工具、模式识别方法和学习方法中的至少一种对细胞通讯进行定量表征和比较。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明进行细胞通讯分析时使用的分析软件为CellChat，这一分析软件充分考虑了配体-受体相互作用的已知结构组成，例如多聚体配体-受体复合物、可溶性激动剂和拮抗剂、刺激性和抑制性膜结合型共受体，解决了相关技术中没有考虑配体和受体以外的其他重要信号辅因子的问题；另外，利用以上分析软件进行分析，操作简单，将细胞通讯与细胞功能通路的研究相结合，再结合单细胞转录组测序可对原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞之间的通讯方式进行全面分析，以明确细胞通讯变化对疾病发展带来的影响，为寻找原发性干燥综合征相关疾病的治疗靶点以及探究细胞通讯与细胞生物学功能之间的调控机制提供了全新的思路。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1采用离心法制备所述单细胞悬液，具体方法包括：将收集的抗凝外周血样本置于离心机中，3000～3500rpm，离心5～8min，移去上层血浆，保留血细胞；在离心管中加入磷酸盐缓冲液(PBS)，再加入与所述PBS等体积的血细胞，混匀制成混合液；在另一个离心管中加入人淋巴细胞分离液，吸取所述混合液缓慢加入所述人淋巴细胞分离液的上方，保持液面分界清晰，置于离心机中，2000～2500rpm，离心20～25min，吸取中间白膜层置于装有所述PBS的离心管中，混匀，于4～6℃条件下，1300～1500rpm离心5～8min，弃去上清，收集底层细胞，用所述PBS清洗，得所述单细胞悬液。
在本发明的一些优选的实施方式中，将收集的抗凝外周血样本置于离心机中，3000rpm，离心5min。
在本发明的一些优选的实施方式中，将所述混合液加入所述人淋巴细胞分离液中，置于离心机中，2000rpm离心20min，吸取中间白膜层置于装有所述PBS的离心管中，混匀，于4℃条件下，1300rpm离心5min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中首先将所述单细胞悬液、凝胶微珠和油分别加入芯片的不同小室中。
在本发明的一些实施方式中，所述凝胶微珠上依次连接有测序引物、barcode序列、UMI序列和多聚T序列。
在本发明的一些实施方式中，所述测序引物用于上机测序。
在本发明的一些实施方式中，所述barcode序列用于区分所述凝胶微珠。
在本发明的一些实施方式中，所述UMI序列为包含随机碱基的序列，用于区分DNA样本。
在本发明的一些实施方式中，所述多聚T序列与mRNA的多聚A尾巴结合，作为逆转录引物。
在本发明的一些实施方式中，在加入所述单细胞悬液、所述凝胶微珠和所述油后，运行仪器，经由微流体双十字交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠。
在本发明的一些实施方式中，收集所述油滴包裹的凝胶珠并混合，所述凝胶微珠在每个油滴内自动溶解释放大量的所述barcode序列，细胞释放所述mRNA，所述mRNA与逆转录酶、所述凝胶微珠上的多聚T序列及dNTP接触，发生逆转录反应，产生用于测序的带有所述barcode序列和所述UMI序列的cDNA一链，再以SMART扩增方式形成所述cDNA的二链。
在本发明的一些实施方式中，以所述cDNA为模板进行PCR扩增后，对扩增产物进行末端修复、加A、接头连接，构建含有P5和P7接头的cDNA文库。
在本发明的一些实施方式中，文库构建完成后，采用Illumina测序平台进行测序，之后进行数据分析。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中所述综合性配体受体数据库是手动建立的数据库，充分考虑了配体-受体相互作用的已知结构组成，例如多聚体配体-受体复合物，可溶性激动剂和拮抗剂，以及刺激性和抑制性膜结合型共受体。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中对所述表达数据进行预处理的方法为：先在一个细胞组中识别过表达的配体或受体，然后将所述表达数据投射到蛋白-蛋白相互作用网络上，如果所述配体或所述受体过表达，则识别过表达的所述配体和所述受体之间的相互作用。
在本发明的一些实施方式中，所述一个细胞组包括一个表达所述配体的细胞和一个表达所述受体的细胞。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯的具体方法为：为每个所述相互作用中的配体-受体对从所述细胞组中的一个细胞到另一个细胞的通信分配一个概率值，对通信概率建立质量互作模型，通过计算与每个信号通路相关的所有配体-受体相互作用的通信概率，来推断所述每个信号通路水平上的通信概率，进而推断所述信号通路水平的细胞通讯网络，再通过计算链路的数量或汇总通信概率来计算细胞间的聚合通信网络。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3中所述的可视化输出包括单个配体-受体介导的细胞互作可视化或配体-受体层级的可视化中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述可视化输出的形式包括细胞互作数量与强度分析统计图、层次图、网络图、和弦图或热图中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3所述社交网络分析工具用于利用网络分析中的中心性度量来确定给定信号网络内的主要信号源和目标，以及中介和影响因子。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3所述模式识别方法包括传入模式识别和传出模式识别。
在本发明的一些实施方式中，所述传出模式识别用于预测信号源细胞间的相互协调及与一些信号通路协调以驱动通信的方式。
在本发明的一些实施方式中，所述传入模式识别用于预测接收信号的细胞间相互协调及与一些信号通路协调以响应传入信号的方式。
在本发明的一些实施方式中，步骤S3所述学习方法包括通过定义相似性度量并从功能和拓扑角度进行学习，来对信号通路进行分组，或通过跨数据集的多个网络的联合学习来描述保守的、特定上下游的信号通路中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述定义相似性度量是指：CellChat能够量化所有重要信号通路之间的相似性，然后根据它们的细胞通信网络相似性对它们进行分组，所述相似性包括功能相似性或结构相似性，可根据二者中的至少一种方式进行分组。
高度的功能性相似性表明主要的发送者和接收者是相似的，可以解释为两个信号通路或两个配体-受体对表现出相似和/或冗余的作用。功能相似性分析要求两个数据集之间具有相同的细胞群组成。
结构相似性用于比较它们的信号网络结构，而不考虑发送方和接收方的相似性。
在本发明的一些实施方式中，所述跨数据集的多个网络的联合学习是指：比较每个信号通路的总体信息流，来识别保守的和细胞特定的信号通路，所述信息流中包括推断网络中所有细胞组之间的通信概率之和，即网络中的总权重。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例和对比例的细胞通讯网络的交互作用总数和交互作用强度统计分析示意图；
图2为本发明实施例和对比例中外周血免疫细胞间CD30信号通路网络的交互作用示意图；
图3为本发明实施例和对比例中外周血免疫细胞间TGFβ信号通路网络的交互作用示意图；
图4为本发明实施例和对比例中健康组和疾病组分泌细胞的传出通讯模式及推断的靶细胞传入通讯模式示意图；
图5为本发明实施例和对比例中健康组和疾病组在功能和结构相似性分组上的差异示意图；
图6为本发明实施例和对比例中健康者和患者信号网络的总体信息流示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，离心、扩增等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征或方法包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征或方法可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例分析了原发性干燥综合征患者外周血中免疫细胞的细胞通讯方式，具体过程为：
(1)采集原发性干燥综合征患者的外周血：募集原发性干燥综合征患者。
纳入标准为：①能够积极参与试验，基本信息齐全；②出现泛酸、嗳气、吞咽困难、腹胀、关节炎、眼干、口干、淋巴结肿大等症状。
排除标准：①合并精神方面疾病；②合并器官功能异常、肝肾疾病、恶性肿瘤疾病。
根据《2016年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟原发性干燥综合征分类标准》、《原发性干燥综合征诊疗规范》诊断。
所有患者均签署知情同意书，采集6例患者的外周血5mL。
(2)外周血单个核细胞的分离：将收集到的患者的抗凝外周血样本置于离心机中，3000rpm离心5min，移去上层血浆，将血细胞保存在-80℃冰箱里备用；在15mL离心管中加入与血细胞等体积的PBS后，将血细胞加入离心管中，充分混匀，制成混合液；在新的15mL离心管中加入人淋巴细胞分离液(与上述混合液等体积)，吸取混合液沿管壁缓慢加于人淋巴细胞分离液的上方，保持液面分界面清晰，避免混合液进入人淋巴细胞分离液的下层，将离心管置于离心机中，于室温下2000rpm离心20min，用吸管小心吸取中间白膜层置于事先加好PBS的离心管中，充分混匀，于4℃，1300rpm条件下离心5min，弃去上清，收集底层细胞，再用PBS清洗一次，尽可能地去除杂质，得单细胞悬液。
(3)组装芯片并将单细胞悬液、Master Mix和水加入芯片：配制Master Mix，组装芯片，放入芯片架，向用不到的小室内加入50％甘油；混合单细胞悬液、Master Mix和水，将单细胞悬液、Master Mix、水的混合液、凝胶微珠和油分别加入芯片的不同小室中。其中，凝胶微珠上连接有测序引物、10×barcode序列、UMI序列和包含30nt碱基的多聚T序列，测序引物用于上机测序，barcode序列用于区分凝胶微珠，UMI序列为包含随机碱基的序列，用于区分DNA样本，多聚T序列与mRNA的多聚A尾巴结合，作为逆转录引物。
(4)运行Chromium Controller及文库构建：运行Chromium Controller，经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠(GEM)，其中90～99％的GEM不含有细胞，剩下的大部分GEM含有一个细胞。凝胶微珠在每个油滴内自动溶解释放大量的10×barcode序列，细胞释放mRNA，mRNA与逆转录酶、凝胶微珠上的多聚T序列及dNTP接触，发生逆转录反应，产生用于测序的带有10×barcode序列和UMI序列的cDNA一链，再以SMART扩增方式形成cDNA二链；
cDNA片段化，油滴破碎，磁珠法纯化cDNA一链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物片段化，通过末端修复、加A和接头连接，构建含有P5和P7接头的cDNA文库。
(5)Illumina测序平台测序：采用Illumina测序平台的双端测序模式对样本进行高通量测序，利用FastQC软件对预处理数据进行质量控制分析。
(6)单细胞转录组测序数据过滤及比对：先过滤带接头的序列，去除含有＞5％的无法确定碱基信息的序列，过滤低质量序列，以人类基因组GRCh38为参考，使用TopHat2程序进行比对，分析测序数据与GRCh38比对的序列数、区域分布情况等。
(7)CellChat细胞通讯分析：加载CellChat R包，导入经单细胞转录组测序得到的表达数据，创建一个Cell Chat对象，导入综合性配体受体数据库；对表达数据进行预处理，先在一个细胞组(一个表达配体的细胞和一个表达受体的细胞构成一个细胞组)中识别过表达的配体或受体，然后将基因表达数据透射到蛋白-蛋白相互作用网络上，如果配体或受体过表达，则识别过表达的配体和受体之间的相互作用；为每个相互作用分配一个概率值，通过计算与每个信号通路相关的所有配体-受体相互作用的通信概率，来推断每个信号通路水平上的通信概率，进而推断该信号通路水平的细胞通讯网络，再通过计算链路的数量或汇总通信概率来计算细胞间的聚合通信网络；
对细胞间的互作关系进行展示，首先统计分析细胞互作数量与强度，检查每种细胞发出的信号，然后通过层次图、网络图和热图进行可视化，以显示各个配体-受体对对信号通路的贡献；
最后，通过模式识别方法、定义相似性度量并从功能和拓扑角度进行学习，来对信号通路进行分组，通过跨数据集的多个网络的联合学习来描述保守的、特定上下游的信号通路。
对比例1
本对比例分析了健康受试者外周血中免疫细胞的细胞通讯方式，与实施例1的区别在于本对比例收集的是6例健康受试者的外周血，具体过程与实施例的过程相同。
试验例
本试验例利用CellChat软件对比分析了实施例1中原发性干燥综合征患者和对比例1中健康受试者外周血中免疫细胞的细胞通讯方式。
数据集包括6例原发性干燥综合征患者和6例健康受试者的单细胞转录组测序数据，包含62,831个细胞，这些细胞鉴定为19个细胞类型，包括活化CD4+T细胞、CD4+CD8+T细胞、CD14+单核细胞、早期细胞、巨噬细胞、MAIT细胞、记忆B细胞、巨核细胞、单核DC细胞、单核细胞、幼稚B细胞、幼稚CD4+T细胞、幼稚CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞、pDC细胞、浆细胞、效应记忆CD8+T细胞和Treg细胞。
经CellChat分析发现，如图1所示，原发性干燥综合征患者外周血免疫细胞的细胞通讯网络的交互作用数量低于健康者，交互作用强度高于健康者。
我们发现CD30和TGFβ信号网络存在明显差异，在图2中，CD30信号网络中，激活的CD4+T细胞、CD4+幼稚T细胞和CD8+幼稚T细胞是健康组中控制通讯的最显著影响因素，然而原发性干燥综合征患者组的CD30信号网络不同，只有CD8+幼稚T细胞是控制该通讯的最显著影响因素驱动。
在TGFβ信号网络中(图3)，几个细胞群(CD4+幼稚T细胞、CD8+幼稚T细胞、CD8+TEM T细胞、NKT细胞、MAIT细胞、NK细胞、CD14+单核细胞、单核细胞DC、pDC细胞、巨噬细胞)是TGFβ配体的最主要来源。其中单核-DC细胞在原发性干燥综合征疾病组和健康组中都是主要的信号发送者、介导者和影响者，这表明它在细胞间通讯中发挥着至关重要的作用。
CellChat还用于探索单个信号通路的细胞通讯，一个核心问题是多个细胞亚群和信号通路如何协调功能。该分析的应用揭示了信号输入和输出的五种模式(图4)，我们发现疾病组和健康组之间细胞通讯模式上存在一些差异。在健康组中，信号模式分析显示活化的CD4+T细胞、CD4+幼稚T细胞、CD8+幼稚T细胞以模式#3为特征，代表多种信号通路，包括IL-2、IL-6、LT、CD30、CD40和FLT3；初始B细胞、记忆性B细胞、早期pro细胞和浆细胞的特征为模式#5，代表BMP、IGF、MK和KIT等信号通路。然而，在pSS疾病组中，信号输出模式显示活化的CD4+T细胞、CD4+幼稚T细胞、CD8+幼稚T细胞、CD4+CD8+T细胞、幼稚B细胞和记忆性B细胞以模式#2为特征，代表多种途径，包括IL-2、LT、CD30、OX40、CD40和FLT3等。CD8+TEM T细胞、NKT细胞、MAIT细胞、NK细胞和MK细胞以模式#3为特征，代表CCL、CXCL、COMPLEMENT和PAR等信号通路。此外，传入的通信模式(如图4中的热图所示)也存在显著差异。在pSS患者中，信号基因TWEAK、OX40、NT的表达水平显著升高，BMP、CSF3、NPR2的表达水平显著降低(顶部条形图表示热图中显示的值列的总和，显示每种细胞类型中所有50个信号基因的总体表达水平。右边的条形图表示热图中行的总和，显示了所有19种细胞类型中每个信号基因的总体表达水平，使用wilcox检验对数据进行比较)。
另外，所有重要信号通路之间的相似性可以通过CellChat进行量化，随后，CellChat根据它们的细胞通信网络相似性(包括结构和功能相似性)对它们进行分组，功能和结构相似性分组显示了四组信号通路(图5，将信号通路投射到二维流形上，每个点代表一个信号通路的通信网络，网点大小与整体通信概率成正比，不同的颜色代表不同的信号通路组)。功能相似性(图5上)揭示了发送者和接受者细胞群之间的相似性，而结构相似性(图5下)在推断发送者和接受者细胞如何利用给定信号通路的一般模式中起着重要作用。在此，我们比较了pSS疾病组和健康组在功能和结构相似性分组方面的差异。接下来，我们通过推断网络中所有细胞组对之间的通信概率之和，比较pSS疾病组和健康组之间每个信号通路的信息流(图6)。图6中，通过汇总通讯网络中的所有通信概率来计算患者和健康者信号网络的总体信息流。结果表明，与健康者相比，pSS患者的某些通路显著改变了其信息流：(1)关闭(CSF3、CD137、BMP、NPR2、PRL)，(2)减少(如KIT、VEGF、IGF、FGF、TNF、VISFATIN等)，(3)打开(TWEAK、OX40、NT)，或(4)增加(如IL10、TRAIL、APRIL、PAR、GRN、BAFF和ACTIVIN等)。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种基于原发性干燥综合征患者免疫细胞的细胞通讯分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分离原发性干燥综合征患者外周血中的免疫细胞，制成单细胞悬液；
S2：对步骤S1所述的单细胞悬液进行单细胞转录组测序；
S3：加载经步骤S2所述单细胞转录组测序得到的表达数据，利用分析软件导入综合性配体受体数据库，对所述表达数据进行预处理，以识别所述细胞中过表达的配体和受体之间的相互作用；推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯；通过可视化输出、社交网络分析工具、模式识别方法或学习方法中的至少一种对细胞通讯进行定量表征和比较。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤S3中对所述表达数据进行预处理的方法为：先在一个细胞组中识别过表达的配体或受体，然后将所述表达数据投射到蛋白-蛋白相互作用网络上，如果所述配体或所述受体过表达，则识别过表达的所述配体和所述受体之间的相互作用。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述一个细胞组包括一个表达所述配体的细胞和一个表达所述受体的细胞。
4.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，步骤S3中，推断所述表达数据中细胞状态特定的信号通讯的具体方法为：为每个所述相互作用中的配体-受体对从所述细胞组中的一个细胞到另一个细胞的通信分配一个概率值，对通信概率建立质量互作模型，通过计算与每个信号通路相关的所有配体-受体相互作用的通信概率，来推断所述每个信号通路水平上的通信概率，进而推断所述信号通路水平的细胞通讯网络，再通过计算链路的数量或汇总通信概率来计算细胞间的聚合通信网络。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤S3中所述的可视化输出包括单个配体-受体介导的细胞互作可视化或配体-受体层级的可视化中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述可视化输出的形式包括细胞互作数量与强度分析统计图、层次图、网络图、和弦图或热图中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤S3所述模式识别方法包括传入模式识别和传出模式识别；
所述传入模式识别用于预测接收信号的细胞间相互协调及与一些信号通路协调以响应传入信号的方式；
所述传出模式识别用于预测信号源细胞间的相互协调及与一些信号通路协调以驱动通信的方式。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤S2中首先将所述单细胞悬液、凝胶微珠和油分别加入芯片的不同小室中；所述凝胶微珠上依次连接有测序引物、barcode序列、UMI序列和多聚T序列。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，在加入所述单细胞悬液、所述凝胶微珠和所述油后，运行仪器，经由微流体双十字交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠；收集所述油滴包裹的凝胶珠并混合，在所述油滴内合成cDNA，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行末端修复、加A、接头连接，完成cDNA文库的构建。
10.根据权利要求9所述的分析方法，其特征在于，在完成所述cDNA文库的构建后，进行测序和数据分析。
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