CN111141904B

CN111141904B - 一种鉴定、分选、清除衰老细胞的方法和应用

Info

Publication number: CN111141904B
Application number: CN202010014832.4A
Authority: CN
Inventors: 纪俊峰; 刘洋; 陈祥宁
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111141904A

Abstract

本发明公开了一种鉴定、分选、清除衰老细胞的方法和应用。利用免疫荧光、免疫组化或Western blot或定量PCR技术通过检测细胞中的CLDN1鉴定衰老细胞；利用磁珠‑抗体复合物或流式细胞术识别细胞中的CLDN1分选衰老活细胞；将CLDN1 shRNA或siRNA注射到衰老细胞的附近环境中或者衰老细胞内，注射后诱导衰老细胞发生细胞凋亡进而清除衰老细胞。本发明的衰老细胞杀伤手段非常新颖有效，通过基因沉默手段清除衰老细胞对抗衰老药物靶点开发具有重要意义，填补了目前衰老细胞杀伤手段极为有限的空缺。

Description

一种鉴定、分选、清除衰老细胞的方法和应用

技术领域

本发明涉及了一种衰老细胞的处理方法，尤其是涉及了一种鉴定、分选、清除衰老细胞的方法和应用。

背景技术

细胞衰老是个体衰老和衰老相关疾病发生发展的重要诱因。而现阶段常用的检测衰老细胞的方法仅有SA-β-gal化学染色法，通过将体外的细胞固定杀死后，给予β-半乳糖苷酶的显色底物X-gal进行化学染色，对于组织而言其特异性差，假阳性强，适用于体外培养的细胞，并且需要将活细胞杀死才可鉴定，因此也无法获得能够体外培养的活的衰老细胞，所以该方法的应用受到了一定的限制。目前还没有一种能准确灵敏地鉴定和分选衰老活细胞的方法。

而衰老细胞的体内堆积会造成局部炎性环境和器官功能恶化，促进肿瘤和心血管疾病、糖尿病等代谢系统疾病、阿尔兹海默症等神经退行性疾病、肝硬化、肾脏疾病、关节炎、皮肤老化等一系列衰老相关疾病的发生发展，而清除衰老细胞被证明可以减缓衰老相关疾病发生发展以及延长哺乳动物寿命。目前国外专利有使用一些临床中使用的化疗药杀伤衰老细胞的例子，尽管有一定疗效，但其特异性差、毒副作用高，所以该方法的应用受到了一定的限制。目前还没有一种能安全稳定杀伤衰老细胞的手段。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供了一种利用CLDN1(Claudin1)抗体SEQ ID No.3和mRNA SEQ ID No.1-2表达对衰老活细胞鉴定的方法；以及抗体介导的衰老活细胞分选分离的方法；以及一种利用CLDN1(Claudin1)基因沉默SEQ ID No.5-9诱导衰老细胞发生细胞凋亡，进而清除衰老细胞的方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案包括以下步骤：

一、一种鉴定衰老细胞的方法：利用免疫荧光、免疫组化或Western blot或定量PCR技术通过检测细胞中的CLDN1鉴定衰老细胞。

方法包括以下步骤：

1)取人/小鼠组织的石蜡切片、冰冻切片和细胞蛋白裂解液中的一种和如SEQ IDNo.3/SEQ ID No.4的CLDN1抗体共孵育，磷酸盐缓冲液清洗2-3次；

2)用Western blot方法或免疫荧光或免疫组化成像检测步骤1)中CLDN1的表达，若存在CLDN1蛋白的表达，则该细胞为衰老细胞。否则该细胞不为衰老细胞。

衰老细胞鉴定：组织石蜡切片、冰冻切片、原代分离的人或小鼠的细胞皆可通过CLDN1蛋白抗体进行免疫荧光、免疫印迹的方式对衰老细胞鉴定。亦可通过qPCR和测序的手段检测如SEQ ID No.1/SEQ ID No.2的CLDN1 mRNA水平异常提高对衰老细胞鉴定。衰老的细胞会经受活性氧提高和DNA损伤，而CLDN1蛋白和mRNA的表达水平因此在衰老细胞中显著上调，年轻细胞则CLDN1表达程度很低，进而实现快速鉴定，相比SA-β-gal对衰老细胞进行固定处死后化学染色，此方法更加快速灵敏，并且可实现活细胞水平鉴定。

二、一种分选衰老细胞的方法：利用磁珠-抗体复合物或流式细胞术识别细胞中的CLDN1分选衰老活细胞。

方法包括以下步骤：

1)取如SEQ ID No.3/SEQ ID No.4的CLDN1抗体磁珠复合物或如SEQ ID No.3/SEQID No.4的CLDN1抗体中的一种和人/小鼠组织单细胞悬液共孵育15分钟，磷酸盐缓冲液清洗2-3次；

2)用磁珠分选仪或流式细胞仪分选步骤1)中CLDN1阳性和阴性群体；分选的阳性群体为衰老细胞，阴性群体为年轻细胞。

衰老细胞分选：取人或小鼠组织的单细胞悬液(如果细胞是体外培养贴壁生长的，则用0.2％的EDTA溶液消化15分钟，消化后磷酸盐缓冲液清洗2-3遍)，200g离心3分钟，使细胞沉淀，弃去上清中的磷酸盐缓冲液，细胞沉淀与一份CLDN1磁珠分选或流式分选抗体溶液室温共孵育15分钟，随后用磷酸盐缓冲液再清洗2-3遍，随后通过磁珠分选设备或流式细胞分选仪对衰老活细胞进行分选，分选出的CLDN1阳性群体为衰老细胞，阴性群体为年轻细胞。磁珠分选出的经磷酸盐缓冲液清洗2-3次后，细胞可进行体外培养，免疫荧光成像、基因检测和免疫印迹蛋白等体外检测测定。

三、一种清除衰老细胞的方法：利用CLDN1基因沉默清除衰老细胞。

方法包括以下步骤：将如SEQ ID No.5-7的CLDN1 shRNA或如SEQ ID No.8-9的siRN注射到衰老细胞的附近环境中或者衰老细胞内，注射后诱导衰老细胞发生细胞凋亡进而清除衰老细胞；其中包含的基因沉默序列为CLDN1基因序列中任一连续的15-25个碱基序列部分，该碱基序列部分仅在CLDN1基因序列中存在，但不存在于除CLDN1以外所有哺乳动物的原始DNA中。

基因沉默清除衰老细胞：将CLDN1特异的shRNA或siRNA输送到衰老细胞富集部位，CLDN1基因表达被沉默后，衰老细胞发生凋亡，进而实现衰老细胞的杀伤。“CLDN1特异”指：任一连续的15-25个碱基序列部分仅在CLDN1基因序列中存在，但不存在于除CLDN1以外所有哺乳动物的原始DNA中。

本发明提出了CLDN1基因在鉴定、分选、清除衰老细胞中的应用，并且还具有在制备鉴定、分选、清除衰老细胞中的应用。

本发明发现了CLDN1和衰老细胞之间的联系，进而利用这一发现建立利用CLDN1进行鉴定、分选、清除衰老细胞的技术方案。

本发明在鉴定衰老细胞方法、分选衰老细胞方法和清除衰老细胞方法中所采用的CLDN1抗体、CLDN1蛋白、CLDN1抗磁珠复合物是由选自如SEQ ID No.3序列中的至少20个氨基酸序列以上构成(该氨基酸序列形成至少一个抗原决定簇)，如SYPTPRPYPKPAPSSGKDYV。因人、鼠CLDN1蛋白序列保守、结构类似，因而具有相同的抗原决定簇的抗体可通用。

所述CLDN1的碱基序列部分具体规律为：取自CLDN1 mRNA序列中任意连续的15-25个碱基，该15-25个碱基不存在于其他基因中，具体序列例如为。5`-GCCACAGCATGGTATGGCAAT-3`。

本发明的衰老细胞杀伤手段非常新颖有效，通过基因沉默手段清除衰老细胞对衰老药物靶点开发具有重要意义，丰富了目前衰老细胞杀伤手段的空白，能够清除衰老细胞促进组织功能恢复。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明方法简单有效，特异性好，无明显毒副作用，本发明填补了衰老活细胞鉴定分离的技术空缺，并解决了现有衰老细胞杀伤方法毒副作用大、特异性差的问题。

附图说明

图1是本发明实施例1的衰老细胞鉴定实验情况图。

图2是本发明实施例2的衰老活细胞的分选实验情况图。通过磁珠分选或流式分选仪对衰老细胞进行活细胞分选并进行体外培养。

图3是本发明实施例3清除人和小鼠衰老细胞的实验情况图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

步骤如下：

(A)衰老细胞CLDN1 mRNA表达鉴定

1)经患者以及伦理相关部门通过，取年轻男性包皮环切手术切除的皮肤组织，剪碎，用0.25％dispaseII酶消化包皮皮肤组织，获得真皮组织，随后用0.1％胶原I酶消化真皮组织获得的皮肤成纤维细胞，即为原代年轻细胞。采用公认的年轻细胞提取的方式。年轻、衰老的组织细胞。细胞体外培养中，通过不断传代，细胞倍增40-50次之后，逐渐生长停滞，表现细胞衰老特征，即为衰老细胞。前述年轻细胞和衰老细胞使用总RNA抽提试剂盒TRIZOL对细胞进行RNA抽提，随后使用反转录试剂盒对mRNA进行反转录，获得cDNA；

2)取cDNA使用任意CLDN1 qPCR检测引物对步骤1)中的cDNA进行荧光定量qPCR分析。

通过荧光定量qPCR分析发现，CLDN1表达在年轻细胞中较低，几乎无表达，CLDN1表达在衰老细胞中表达极高。CLDN1表达程度能够指示细胞衰老程度。

(B)衰老细胞CLDN1蛋白表达Western鉴定

1)取(A)中年轻和衰老细胞，使用RIPA裂解液对细胞进行总蛋白抽提，并使用BCA定量试剂盒对蛋白定量。

2)20μg总蛋白进行15％的SDS-PAGE蛋白电泳，随后CLDN1抗体SEQ ID No.3孵育，并使用辣根过氧化物酶ECL化学发光显影。随后进行化学发光成像拍摄。

通过实验发现衰老细胞中CLDN1蛋白表达程度极高，而年轻细胞极低，由此CLDN1阳性程度可以指示细胞衰老程度。

(C)衰老细胞CLDN1蛋白表达的免疫荧光鉴定

1)取(A)中年轻细胞和衰老细胞，分别用4％多聚甲醛固定，随后经PBS洗3次，加入一份5μg/mL抗体稀释在磷酸盐缓冲液溶液中，共10μLCLDN1荧光抗体SEQ ID No.3，冰箱4度避光保湿孵育过夜，随后显微镜镜检。镜检结果情况是衰老细胞的CLDN1的荧光强度极高，而年轻细胞的CLDN1荧光几乎没有。

由此根据CLDN1荧光强度能够说明衰老细胞能够被标记出CLDN1抗体荧光。

(D)年轻人、老年人脂肪组织的CLDN1蛋白表达的免疫荧光鉴定

1)经患者以及伦理相关部门通过，取医院提供的年轻脂肪标本(年龄低于55岁认为是年轻标本)以及衰老脂肪标本(年龄大于70岁认为是衰老标本)石蜡病理切片，修复抗原按照常规石蜡切片抗体染色步骤(梯度石蜡-二甲苯-酒精-水溶液脱蜡、修复抗原。10μL5μg/mL CLDN1荧光抗体过夜孵育。)；

2)镜检1)中石蜡切片CLDN1抗体荧光结果。并使用ImageJ软件分析总体荧光强度，年轻标本和衰老标本各3例，取自不同人，即年轻标本和衰老标本生物学重复都为3。

实验结果显示年轻标本中CLDN1荧光信号极低，衰老标本中CLDN1很高。由此发现，年轻标本相比衰老标本的CLDN1阳性显著上调，由此说明了老年人脂肪中CLDN1阳性显著上调，指示衰老细胞比例显著上调。

(E)衰老相关疾病-骨关节炎的小鼠模型中，病理性衰老组织和其对照假手术组织的石蜡切片CLDN1免疫组化染色

1)取骨关节炎手术造模小鼠以及对照假手术小鼠的膝关节软骨石蜡切片。造模-切片制备实验步骤按照常规石蜡切片操作进行。.

2)按照常规石蜡切片抗体染色步骤(梯度石蜡-二甲苯-酒精-水溶液脱蜡、修复抗原，10μL 5μg/mL CLDN1抗体4度过夜孵育)

3)使用DAB免疫组化染色试剂盒对2)中切片染色，并显影拍照。

实验结果显示骨关节炎手术造模小鼠的膝关节软骨石蜡切片中CLDN1荧光信号相比对照假手术的膝关节软骨组显著提高，而已知发生关节炎的关节中会有细胞衰老发生。由此发现，关节炎手术造模的小鼠，膝关节软骨的CLDN1阳性显著上调，由此说明了CLDN1在衰老相关疾病模型骨关节炎的关节软骨中，可以指示衰老细胞。

(F)衰老相关疾病-骨关节炎的人临床病例样本中，病理衰老组织和对照组织石蜡切片的CLDN1免疫荧光鉴定

1)从医院经病人和志愿者以及伦理部门批准同意，取骨关节炎患者手术中脱落的极少量关节软骨组织，以及其他无关节炎患者其他关节手术中脱落的极少量关节软组织。

3)对2)中切片荧光显微镜拍照。

实验结果显示骨关节患者的膝关节软骨中CLDN1荧光信号相比对照无关节炎患者的膝关节软显著提高，而已知发生关节炎的关节中会有细胞衰老发生。由此发现，关节炎患者的膝关节软骨CLDN1阳性显著上调，由此说明了CLDN1在衰老相关疾病骨关节炎的关节软骨中，可以指示衰老细胞。

图1中：

人的衰老皮肤和年轻皮肤细胞经qPCR检测其mRNA表达水平如图1(A)所示，可见CLDN1的mRNA SEQ ID No.1在衰老细胞中异常高表达，生物学重复为3，具有统计学意义(**p<0.05)。P53和P21是两个细胞周期阻滞的细胞内标志物，用来指示衰老细胞的细胞周期阻滞。

Western blot方法检测结果如图1(B)所示，衰老的人的皮肤CLDN1蛋白异常升高，并且P53、P21异常升高，并且可以检测到衰老细胞DNA双键损伤细胞核标志物γH2AX蛋白，佐证CLDN1的特异性。

免疫荧光成像方法的检测结果如图1(C)所示，结果显示在人的衰老皮肤细胞中可以检测到CLDN1异常升高，标尺为100μm，免疫荧光成像结果的荧光密度统计生物学重复为3，具有统计学意义(**p<0.05)。

免疫荧光成像方法的检测人脂肪组织石蜡切片CLDN1表达结果如图1(D)所示，结果显示衰老(70岁以上捐赠者)相比年轻(55岁以下捐赠者)临床脂肪组织石蜡切片中可以检测到CLDN1异常升高，标尺为100μm，免疫荧光成像结果的荧光密度统计生物学重复为5，具有统计学意义(**p<0.05).

免疫组化成像方法的检测小鼠膝关节软骨石蜡切片中CLDN1表达结果如图1(E)所示，衰老相关性疾病骨关节炎的小鼠模型中，关节软骨发生细胞衰老已为公认，在衰老的小鼠关节炎造模手术后4周，可见CLDN1表达也显著上调。标尺长度50μm.

免疫荧光成像方法检测人膝关节软骨石蜡切片中CLDN1表达

实验结果如图1(F)所示，在衰老相关性疾病骨关节炎的临床病人关节软骨中同样可见CLDN1表达显著上调。标尺长度50μm。

实施例2分选衰老细胞

步骤如下：

(A)通过CLDN1流式分选衰老细胞

1)取年轻细胞和衰老细胞混合，PBS洗3遍，随后200g离心3分钟，弃去上清。留下细胞沉淀。

2)细胞沉淀和一份CLDN1荧光抗体SEQ ID No.3室温共孵育15分钟，随后PBS洗3遍，过200目细胞筛获得单细胞悬液。

3)通过流式细胞分选方式对单细胞悬液进行分选处理，分选可得CLDN1阳性和阴性细胞群体，可进行后续实验，但应注意流式细胞分选对衰老细胞损伤较大，后续培养困难，如需后续培养，实施例2(B)中的磁珠分选较好。

(B)通过CLDN1磁珠分选衰老细胞

1)取(A)中年轻细胞和衰老细胞混合，PBS洗3遍，随后200g离心3分钟，弃去上清。留下细胞沉淀，过200目细胞筛获得单细胞悬液。

2)取可结合抗体的磁珠与一份CLDN1荧光抗体SEQ ID No.3以及1)中单细胞悬液室温共孵育15分钟，随后PBS洗2-3遍，移液器缓慢吹散此步骤中的细胞-抗体-磁珠混合物，获得细胞悬液。磁珠-抗体-细胞复合物原理上可紧密结合。

3)通过磁力装置进行磁珠分选，对2)中细胞悬液进行分选处理获得CLDN1阳性和阴性细胞群体，进行后续实验。

实验中发现经传统SA-β-gal染色可见3)中分选的CLDN1阳性细胞中SA-β-gal阳性比例极高，而CLDN1阴性细胞则几乎没有。同时经Western blot检测蛋白表达，可见CLDN1阳性细胞群体中细胞衰老相关的细胞周期阻滞因子P21和DNA损伤标志γH2AX表达显著提高。由此CLDN1阳性细胞衰老比例提高明显，使用磁珠分选可很好的从年轻衰老混合细胞群体中，富集分选衰老细胞，并可进行后续培养和实验。

图2中：

人年轻、衰老皮肤细胞的流式细胞分选实验结果如图2(A)所示，可见明显分群，衰老细胞CLDN1荧光密度显著提高。

磁珠分选原理如图2(B)所示，磁珠-抗体-目的蛋白高表达的细胞复合物在磁场下贴壁。

磁珠分选的细胞实验结果如图2(C)所示，CLDN1磁珠分选后，CLDN1阳性和阴性的细胞分别体外培养，随后收细胞蛋白做Western blot鉴定，结果显示CLDN1阳性的细胞衰老程度较CLDN1阴性细胞显著升高。

CLDN1磁珠分选前，分选后CLDN1阳性，以及分选后CLDN1阴性细胞的细胞衰老传统化学染色实验结果如图2(D)所示，SA-β-gal染色结果显示CLDN1阳性细胞SA-β-gal阳性(细胞被染成蓝绿色)比例显著提高，统计结果具有显著性。

磁珠分选可获得衰老活细胞并后续培养，结果也证实了CLDN1作为衰老细胞标志物，在衰老活细胞鉴定中弥补了传统SA-β-gal染色无法实现的空缺。

实施例3以CLDN1为靶点清除人和小鼠的衰老细胞

步骤如下：

1)按照通用步骤制备shRNA，取0.5OD/mL的CLDN1 shRNA和对照plko各5μL加入培养基中与正常的人成纤维细胞(Norm)和衰老的成纤维细胞(Sen)共培养12小时，随后更换新鲜培养基。5日以后，进行Western blot和凋亡特异的Annexin-V流式细胞术检测。结果显示两条序列不同的CLDN1shRNA(sh1,sh2)均可降低CLDN1蛋白表达，并同时可以提高衰老细胞的细胞凋亡标志物c-casp3的蛋白表达图3(A)，以及细胞凋亡标记Annexin-V阳性比例图3(B)。即CLDN1的shRNA可对CLDN1进行沉默，而对照空白shRNA则对CLDN1表达无影响，并且不影响细胞凋亡。

两条独立的shRNA(sh1：SEQ ID No.5,sh2：SEQ ID No.6)具体序列为sh1:5`-GCCACAGCATGGTATGGCAAT-3`；sh2:5`-GCAGAAGATGAGGATGGCTGT-3`。

2)为了进一步验证CLDN1的shRNA在体内可以针对性沉默衰老细胞的CLDN1并且清除衰老细胞。在J.Kirkland报道的衰老细胞移植导致运动机能衰退的研究模型中进一步验证体内效果。根据J.Kirkland的参考文献[Nature medicine,2018,24(8)]对小鼠的脂肪前体细胞标记了荧光染料DIR，并对衰老和正常细胞进行了腹腔移植。在移植细胞后的第3日和第4日，分两次，分别对衰老细胞移植(sen)和对照正常细胞移植(norm)的小鼠腹腔注射200μL0.5OD/mL的shRNA(sh)SEQ ID No.7和对照空白shRNA(ct)。结果显示，细胞移植后的第10日(D10)，移植衰老细胞并注射CLDN1 shRNA的实验组(sen sh)，相比移植衰老细胞并注射对照shRNA的实验组(sen ctr)可见明显的衰老细胞DIR荧光信号降低。移植正常细胞注射shRNA(norm sh)相比移植正常细胞注射对照空白shRNA(norm ctr)组荧光信号则无明显变化，图3(C-D)。

说明CLDN1 shRNA能够清除移植的衰老细胞，而对正常细胞无清除效果。对照空白shRNA对衰老细胞无清除效果。

并且参考J.Kirkland的报道,清除腹腔移植的衰老细胞可以缓解衰老细胞移植带来的运动能力衰退，借助J.Kirkland报道的实验模型，在衰老细胞移植后一个月，对前述小鼠的运动能力进行测试。可见由于衰老细胞移植带来的疲劳转棒保持时间、握力、悬挂耐力，在衰老细胞移植并清除后都有改善，图3(E-G)。

图3中：

CLDN1 shRNA处理正常和衰老的人成纤维细胞后第五日，检测CLDN1和细胞凋亡标志c-casp3的蛋白表达实验结果如图3(A)所示，在人的皮肤细胞中，对正常细胞(norm)和衰老细胞(sen)进行CLDN1基因沉默，可见细胞凋亡响应因子c-casp3在衰老细胞进行CLDN1基因沉默后表达显著上调，而正常细胞无细胞凋亡明显激活。从中可见CLDN1 shRNA能够显著降低CLDN1蛋白表达，实现对CLDN1的基因到蛋白水平的沉默，并激活衰老细胞凋亡。

CLDN1 shRNA处理正常和衰老的人成纤维细胞后第五日，检测细胞凋亡特异的Annexin-V细胞凋亡标志物实验结果如图3(B)所示，在人的皮肤细胞中，对正常细胞(norm)和衰老细胞(sen)进行CLDN1基因沉默，可见Annexin-V细胞凋亡标志物在在衰老细胞进行CLDN1基因沉默后表达显著上调，而正常细胞无细胞凋亡明显激活。进一步佐证CLDN1shRNA可以启动衰老细胞的细胞凋亡。

移植荧光标记的正常或衰老细胞并注射对照shRNA或CLDN1 shRNA的小鼠在细胞移植后第1日和第10日的小动物荧光成像实验结果如图3(C)所示，小鼠腹腔移植带有荧光标记的衰老细胞后，注射CLDN1 shRNA可显著降低其腹腔的荧光信号强度，即可以通过CLDN1 shRNA对衰老细胞进行清除。norm:正常细胞移植处理；ct:空白shRNA对照处理；sen:衰老细胞移植处理；sh:CLDN1基因沉默处理。D1为衰老或正常细胞移植后第一日荧光成像。D10为衰老细胞或正常细胞移植后第10日成像。

图3(C)的结果也进行了定量统计，每组的荧光强度统计结果如图3(D)所示，结果显示，sen sh：衰老细胞移植并腹腔注射CLDN1 shRNA的小鼠腹腔移植细胞的荧光强度相比sen ct：衰老细胞移植并腹腔注射空白对照shRNA的小鼠显著降低，几乎和norm ct：正常细胞移植并注射空白对照shRNA的小鼠以及norm sh:正常细胞移植并注射CLDN1 shRNA的荧光强度持平。第一日D1每组荧光强度统计，以及第十日D10每组荧光强度统计。每组生物学重复为7，**p<0.01。

在衰老细胞移植后一个月，小鼠运动疲劳转棒能力检测实验结果如图3(E)所示，sen sh：衰老细胞移植并腹腔注射CLDN1 shRNA的小鼠疲劳转棒坚持时间相比sen ct：衰老细胞移植并腹腔注射空白对照shRNA的小鼠有一定程度改善，几乎和norm ct：正常细胞移植并注射空白对照shRNA的小鼠以及norm sh:正常细胞移植并注射CLDN1 shRNA的疲劳转棒表现持平，说明运动能力改善回复到正常状态。每组生物学重复为7，*p<0.05**p<0.01。

在衰老细胞移植后一个月，小鼠握力检测实验结果如图3(F)所示，sen sh：衰老细胞移植并腹腔注射CLDN1 shRNA的小鼠握力相比sen ct：衰老细胞移植并腹腔注射空白对照shRNA的小鼠有一定程度改善，几乎和norm ct：正常细胞移植并注射空白对照shRNA的小鼠以及norm sh:正常细胞移植并注射CLDN1 shRNA的握力表现持平，说明运动能力改善回复到正常状态。每组生物学重复为7，*p<0.05**p<0.01

在衰老细胞移植后一个月，小鼠悬挂耐力检测实验结果如图3(G)所示，sen sh：衰老细胞移植并腹腔注射CLDN1 shRNA的小鼠悬挂耐力相比sen ct：衰老细胞移植并腹腔注射空白对照shRNA的小鼠有一定程度改善，虽然无统计学差异，但具有恢复的趋势。每组生物学重复为7，*p<0.05，ns为无统计学差异。但具有回复趋势。

由此可看出，本发明方法简单有效，特异性好，可清除衰老细胞并且能够缓解因衰老细胞移植带来的运动机能衰退。因基因沉默尤其是小干扰RNA在临床上具有应用前景，此方法较小分子药物有更高的特异性和应用场景多样性。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

本发明中的序列为：

SEQ ID No.1；

名称：人CLDN1 mRNA序列

来源：人源基因

5`-ATGGCCAACGCGGGGCTGCAGCTGTTGGGCTTCATTCTCGCCTTCCTGGGATGGATCGGCGCCATCGTCAGCACTGCCCTGCCCCAGTGGAGGATTTACTCCTATGCCGGCGACAACATCGTGACCGCCCAGGCCATGTACGAGGGGCTGTGGATGTCCTGCGTGTCGCAGAGCACCGGGCAGATCCAGTGCAAAGTCTTTGACTCCTTGCTGAATCTGAGCAGCACATTGCAAGCAACCCGTGCCTTGATGGTGGTTGGCATCCTCCTGGGAGTGATAGCAATCTTTGTGGCCACCGTTGGCATGAAGTGTATGAAGTGCTTGGAAGACGATGAGGTGCAGAAGATGAGGATGGCTGTCATTGGGGGTGCGATATTTCTTCTTGCAGGTCTGGCTATTTTAGTTGCCACAGCATGGTATGGCAATAGAATCGTTCAAGAATTCTATGACCCTATGACCCCAGTCAATGCCAGGTACGAATTTGGTCAGGCTCTCTTCACTGGCTGGGCTGCTGCTTCTCTCTGCCTTCTGGGAGGTGCCCTACTTTGCTGTTCCTGTCCCCGAAAAACAACCTCTTACCCAACACCAAGGCCCTATCCAAAACCTGCACCTTCCAGCGGGAAAGACTACGTGTGA-3`

SEQ ID No.2；

名称：鼠CLDN1 mRNA序列

来源：鼠源基因

5`-ATGGCCAACGCGGGGCTGCAGCTGCTGGGTTTCATCCTGGCTTCTCTGGGATGGATCGGCTCCATCGTCAGCACTGCCCTGCCCCAGTGGAAGATTTACTCCTATGCTGGGGACAACATCGTGACCGCTCAGGCCATCTACGAGGGACTGTGGATGTCCTGCGTTTCGCAAAGCACCGGGCAGATACAGTGCAAAGTCTTCGACTCCTTGCTGAATCTGAACAGTACTTTGCAGGCAACCCGAGCCTTGATGGTAATTGGCATCCTGCTGGGGCTGATCGCAATCTTTGTGTCCACCATTGGCATGAAGTGCATGAGGTGCCTGGAAGATGATGAGGTGCAGAAGATGTGGATGGCTGTCATTGGGGGCATAATATTTTTAATTTCAGGTCTGGCGACATTAGTGGCCACAGCATGGTATGGAAACAGAATTGTTCAAGAATTCTATGACCCCTTGACCCCCATCAATGCCAGGTATGAATTTGGCCAGGCCCTCTTTACTGGCTGGGCCGCTGCCTCCCTCTGCCTTCTGGGAGGTGTCCTACTTTCCTGCTCCTGTCCCCGGAAAACAACCTCTTACCCAACACCACGGCCTTATCCCAAGCCAACACCTTCTAGTGGGAAAGACTATGTGTGA-3`

SEQ ID No.3；

名称：人源CLDN1抗体蛋白序列

来源：人源蛋白氨基酸序列

MANAGLQLLGFILAFLGWIGAIVSTALPQWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATRALMVVGILLGVIAIFVATVGMKCMKCLEDDEVQKMRMAVIGGAIFLLAGLAILVATAWYGNRIVQEFYDPMTPVNARYEFGQALFTGWAAASLCLLGGALLCCSCPRKTTSYPTPRPYPKPAPSSGKDYV

SEQ ID No.4；

名称：鼠源CLDN1抗体蛋白序列

来源：鼠源蛋白氨基酸序列

MANAGLQLLGFILASLGWIGSIVSTALPQWKIYSYAGDNIVTAQAIYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQATRALMVIGILLGLIAIFVSTIGMKCMRCLEDDEVQKMWMAVIGGIIFLISGLATLVATAWYGNRIVQEFYDPLTPINARYEFGQALFTGWAAASLCLLGGVLLSCSCPRKTTSYPTPRPYPKPTPSSGKDYV

SEQ ID No.5；

名称：人CLDN1 shRNA序列

来源：人体基因

5`-GCCACAGCATGGTATGGCAAT-3`

SEQ ID No.6；

名称：人CLDN1 shRNA序列

来源：人体基因

5`-GCAGAAGATGAGGATGGCTGT-3`

SEQ ID No.7；

名称：鼠CLDN1 shRNA序列

来源：鼠基因

5`-GCAGATACAGTGCAAAGTCTT-3`

SEQ ID No.8；

名称：人CLDN1 siRNA序列

来源：人体基因

5`-CAGTGGAAGATTTACTCCTATGCTG-3`

SEQ ID No.9；

名称：鼠CLDN1 siRNA序列

来源：鼠基因

5`-CAGTGGAAGATTTACTCCTATGCTG-3`。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种鉴定、分选、清除衰老细胞的方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 人源基因(Human)

<400> 1

atggccaacg cggggctgca gctgttgggc ttcattctcg ccttcctggg atggatcggc 60

gccatcgtca gcactgccct gccccagtgg aggatttact cctatgccgg cgacaacatc 120

gtgaccgccc aggccatgta cgaggggctg tggatgtcct gcgtgtcgca gagcaccggg 180

cagatccagt gcaaagtctt tgactccttg ctgaatctga gcagcacatt gcaagcaacc 240

cgtgccttga tggtggttgg catcctcctg ggagtgatag caatctttgt ggccaccgtt 300

ggcatgaagt gtatgaagtg cttggaagac gatgaggtgc agaagatgag gatggctgtc 360

attgggggtg cgatatttct tcttgcaggt ctggctattt tagttgccac agcatggtat 420

ggcaatagaa tcgttcaaga attctatgac cctatgaccc cagtcaatgc caggtacgaa 480

tttggtcagg ctctcttcac tggctgggct gctgcttctc tctgccttct gggaggtgcc 540

ctactttgct gttcctgtcc ccgaaaaaca acctcttacc caacaccaag gccctatcca 600

aaacctgcac cttccagcgg gaaagactac gtgtga 636

<210> 2

<211> 636

<212> DNA

<213> 鼠源基因(Rat)

<400> 2

atggccaacg cggggctgca gctgctgggt ttcatcctgg cttctctggg atggatcggc 60

tccatcgtca gcactgccct gccccagtgg aagatttact cctatgctgg ggacaacatc 120

gtgaccgctc aggccatcta cgagggactg tggatgtcct gcgtttcgca aagcaccggg 180

cagatacagt gcaaagtctt cgactccttg ctgaatctga acagtacttt gcaggcaacc 240

cgagccttga tggtaattgg catcctgctg gggctgatcg caatctttgt gtccaccatt 300

ggcatgaagt gcatgaggtg cctggaagat gatgaggtgc agaagatgtg gatggctgtc 360

attgggggca taatattttt aatttcaggt ctggcgacat tagtggccac agcatggtat 420

ggaaacagaa ttgttcaaga attctatgac cccttgaccc ccatcaatgc caggtatgaa 480

tttggccagg ccctctttac tggctgggcc gctgcctccc tctgccttct gggaggtgtc 540

ctactttcct gctcctgtcc ccggaaaaca acctcttacc caacaccacg gccttatccc 600

aagccaacac cttctagtgg gaaagactat gtgtga 636

<210> 3

<211> 211

<212> PRT

<213> 人源蛋白氨基酸序列(Human)

<400> 3

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1 5 10 15

Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile

20 25 30

Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu

35 40 45

Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys

50 55 60

Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr

65 70 75 80

Arg Ala Leu Met Val Val Gly Ile Leu Leu Gly Val Ile Ala Ile Phe

85 90 95

Val Ala Thr Val Gly Met Lys Cys Met Lys Cys Leu Glu Asp Asp Glu

100 105 110

Val Gln Lys Met Arg Met Ala Val Ile Gly Gly Ala Ile Phe Leu Leu

115 120 125

Ala Gly Leu Ala Ile Leu Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile

130 135 140

Val Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu

145 150 155 160

Phe Gly Gln Ala Leu Phe Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu

165 170 175

Leu Gly Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser

180 185 190

Tyr Pro Thr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Pro Ala Pro Ser Ser Gly Lys

195 200 205

Asp Tyr Val

210

<210> 4

<211> 211

<212> PRT

<213> 鼠源蛋白氨基酸序列(Rat)

<400> 4

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Trp Ile Gly Ser Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Lys Ile

20 25 30

Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Ile Tyr Glu

35 40 45

Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys

50 55 60

Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Asn Ser Thr Leu Gln Ala Thr

65 70 75 80

Arg Ala Leu Met Val Ile Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ile Ala Ile Phe

85 90 95

Val Ser Thr Ile Gly Met Lys Cys Met Arg Cys Leu Glu Asp Asp Glu

100 105 110

Val Gln Lys Met Trp Met Ala Val Ile Gly Gly Ile Ile Phe Leu Ile

115 120 125

Ser Gly Leu Ala Thr Leu Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile

130 135 140

Val Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Leu Thr Pro Ile Asn Ala Arg Tyr Glu

145 150 155 160

Phe Gly Gln Ala Leu Phe Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu

165 170 175

Leu Gly Gly Val Leu Leu Ser Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser

180 185 190

Tyr Pro Thr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Pro Thr Pro Ser Ser Gly Lys

195 200 205

Asp Tyr Val

210

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人体基因(Human)

<400> 5

gccacagcat ggtatggcaa t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人体基因(Human)

<400> 6

gcagaagatg aggatggctg t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 鼠基因(Rat)

<400> 7

gcagatacag tgcaaagtct t 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人体基因(Human)

<400> 8

cagtggaaga tttactccta tgctg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 鼠基因(Rat)

<400> 9

cagtggaaga tttactccta tgctg 25

Claims

1.一种鉴定衰老细胞的方法，其特征在于：利用免疫荧光、免疫组化或Western blot或定量PCR技术通过检测细胞中的CLDN1鉴定衰老细胞。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定衰老细胞的方法，其特征在于：方法包括以下步骤：

1）取人/小鼠组织的石蜡切片、冰冻切片和细胞蛋白裂解液中的一种和如SEQ ID No.3人源CLDN1肽段/SEQ ID No.4鼠源CLDN1肽段的CLDN1抗体共孵育，磷酸盐缓冲液清洗2-3次；

2）用Western blot方法或免疫荧光或免疫组化成像检测步骤1）中CLDN1的表达，若存在CLDN1蛋白的表达，则该细胞为衰老细胞。

3.一种分选衰老细胞的方法，其特征在于：利用磁珠-抗体复合物或流式细胞术识别细胞中的CLDN1分选衰老活细胞。

4.根据权利要求3所述的一种分选衰老细胞的方法，其特征在于：方法包括以下步骤：

1）取如SEQ ID No.3人源CLDN1肽段/SEQ ID No.4鼠源CLDN1肽段的CLDN1抗体磁珠复合物或如SEQ ID No.3人源CLDN1肽段/SEQ ID No.4鼠源CLDN1肽段的CLDN1抗体中的一种和人/小鼠组织单细胞悬液共孵育15分钟，磷酸盐缓冲液清洗2-3次；

2）用磁珠分选仪或流式细胞仪分选步骤1）中CLDN1阳性和阴性群体；分选的阳性群体为衰老细胞，阴性群体为年轻细胞。